Virologia 2024 PDF

-Caratteristiche che i virus hanno in comune con gli esseri umani 1. Si riproducono, anche se in maniera peculiare 2. Possono mutare Caratteristiche che i virus non hanno in comune con gli esseri umani 1. Non hanno un’ organizzazione cellulare 2. Non hanno attivita metabolica 3....

-Caratteristiche che i virus hanno in comune con gli esseri umani 1. Si riproducono, anche se in maniera peculiare 2. Possono mutare Caratteristiche che i virus non hanno in comune con gli esseri umani 1. Non hanno un’ organizzazione cellulare 2. Non hanno attivita metabolica 3. Non sempre posseggono un genoma a dsDNA PROPRIETA’ DEI VIRUS → Per esistere in natura devono essere infettanti UN VIRUS ENTRA NELLA CELLULA QUANDO VUOLE REPLICARSI → Devono utilizzare i meccanismi della cellula ospite per produrre i propri componenti, quindi sono privi degli elementi base essenziali per la REPLICAZIONE che trovano negli ospiti → Devono codificare proprie proteine specifiche → La produzione di nuovi virioni avviene per assemblaggio delle componenti virali → Sono inerti nell’ambiente extracellulare → Sono microrganismi di piccole dimensioni dai 20 nanometri (hepatite A) a 360 nanometri (variola virus) TEORIE SULLA NASCITA DEI VIRUS → REGRESSIVA: forme di vita che hanno perso tutto tranne l’ acido nucleico → CELLULARE: aggregati di DNA/RNA sfuggiti dall’ ambiente cellulare per AUTONOMIZZARSI → INDIPENDENTE O DI COEVOLUZIONE: evoluti in parallelo con le altre forme di vita, questa teoria spiegherebbe come riescono ad eludere le difese umane STRUTTURA → CORE → CAPSIDE: struttura proteica che avvolge l’ acido nucleico, protegge da danni chimici , interazione cellula ospite → CAPSOMERI: monomeri del capside → PROTOMERI: compongo i capsomeri → NUCLEOCAPSIDE: core+capside → MATRICE: situata fra capside ed envelope → EVELOPO O PERICAPSIDE: involucro lipoproteico → PEPLOMERI O SPIKE: protuberanze dell’ envelope → VIRIONE: particella completa → VIRUS NUDO→ senza envelope solitamente di piccole dimensioni come il POLIOVIRUS (ssRNA) → VIRUS RIVESTITI→ con envelope come l’ HIV (dsRNA) UNCOATING Subito dopo che il virus penetra all’ interno della cellula esegue un processo definito UNCOATING che consiste in una separazione del GENOMA dai RIVESTIMENTI SUPERFICIALI. Una volta all’ interno della cellula il GENOMA puo iniziare la sua attivita di replicazione se questo e GRANDE (herpes simplex) iniziera a produrre ed a codificare proteine complesse al contrario se il suo genoma e piccolo (EPATITE A) produrra una sola proteina che svolge funzioni multiple. PROTEINE VIRALI → STRUTTURALI: costituiscono il capside(che protegge e crea interazioni e permette il rilascio del genoma), l’ envelope o altre strutture → FUNZIONALI: stabilizzano l’ a.n., enzimi necessari per la replicazione, proteine per esplicare la fisiologia della cellula e proteine di difesa  LIPIDI E CARBOIDRATI VIRALI Lipidi e carboidrati sono caratteristici dei virus che presentano l’ ENVELOPE si tratta infatti di membrane di derivazione cellulare che vengono modificate con glicoproteine. Il doppio strato fosfolipidico viene intervallato da glicoproteine di membrana, alcune di queste vengono definite FUSOGENE, perche in grado di inserirsi nella membrana plasmatica, della cellula ospite, aprendo un varco in modo che l’ envelope si possa fondere con la membrana stessa e liberare il NUCLEOCAPSIDE al suo interno + proteine SPIKES METASTABILITA’ Per metastabilita si intende quel processo che spiega che un virus e STABILE quando la disposizione delle proteine e SIMMETRICA ed e INSTABILE quando le subunita non sono legate COVALENTEMENTE e quindi la struttura puo essere smontata in caso di INFEZIONE VIRALE PER RILASCIARE IL GENOMA SIMMETRIA VIRALE → ELICOIDALE: i protomeri si dispongono lungo un’ asse ELICOIDALE intorno all’ a.n. assumendo una conformazione BASTONCELLARE/FILAMERNTOSA che puo essere RIGIDA(virus mosaico del tabacco) o FLESSIBILE (covid) → ICOSAEDRICA: Tutti i capsidi rotondi hanno un numero preciso di proteine che e sempre un MULTIPLO DI 60 (il piu semplice composto da 60 protomeri e il parovirus) la conformazione icosaedrica e composta sempre da PENTAMERI (ai 12 vertici dell’ icosaedro) e da ESAMERI (che compongono le facce e gli spigoli) → COMPLESSA: forma ovoidale o a mattone, solitamente sono VIRUS ANIMALI DI GRANDI DIMENSIONI con genoma dsDNA, associato ad una proteina e racchiuso in un nucleo BICONCAVO delimitato da una membrana. Sono presenti 2 CORPI LATERALI ELLITTICI tra nucleo ed involucro esterno, l’ involucro esterno e di natura MEMBRANOSA con tubuli di fibre (esempio poxovirus 240-300nm) REGOLE PER L’ ASSEMBLAGGIO L’ assemblaggio avviene SENZA ERRORI, ogni subunita ha CONTATTI IDENTICI con i suoi vicini creando una disposizione SIMMETRICA, queste subunita non sono legate covalentemente in modo da potersi sganciare in caso di infezione VIRUS CON ENVELOPE L’ envelope e un doppio strato lipidico derivato dalla cellula ospite mediante GEMMAZIONE e importante per i virus perche protegge da danni FISICI, CHIMICI ed ENZIMATICI  CLASSIFICAZIONE DEI VIRUS SECONDO LA COMMISIONE INTERNAZIONALE PER LA TASSONOMIA DEI VIRUS ICTV Inizialmente i virus venivano classificati secondo l’ ospite che parassitavano, oggi invece vengono divisi per FAMIGLIE-VIRIDAE, SOTTOFAMIGLIE VIRINAE e GENERE VIRUS, seguendo dei criteri come l’a.n., la simmetria, i capsidi, presenza o meno dell’ enevelope e dimensioni del virione CLASSIFICAZIONE SECONDO BALTIMORE L a sua classificazione va a COMPLESTARE la classificazione classica del ICTV perche va a basarsi sul tipo di genoma I. DNAds II. DNA ss III. RNAds IV. RNAss con RETROTRASCRIZIONE (capacita di sintetizzare una molecola di DNA a partire da RNA tramite trascrittasi inversa, questa avviene nei RETROVIRUS) V. RNA+ VI. RNA- VII. DNA ds con RETROTRASRIZIONE Filamento a polarita positiva (+): immediatamente traducibile Filamento a polarita negativa (-): filamento complementare all’mRNA, necessita di essere copiato LA MAGGIOR PARTE DEI VIRUS SONO A ssRNA (+) TERMINOLOGIA → SPETTRO D’ OSPITE: specie/cellula che puo essere infettata dal virus → SUSCETTIBILITA’: capacita di essere infettati → PERMISSIVITA’: capacita di trascrivere il genoma ed esprimere tutte le proteine virali → INFEZIONE PRODUTTIVA: quando viene prodotta una progenie virale infettante → INFEZIONE ABORTIVA: ciclo non completo con una cellula non permissiva REPLICAZIONE VIRALE 1. ATTACCO DEL VIRUS ALLA CELLULA: contatto iniziale per mezzo di collisioni casuali cio avvien quando un ANTIRECETTORE virale che possiede delle proteine SPIKE interagisce con un RECETTORE cellulare creando così un ATTACCO EFFICIENTE ( questo attacco avviene in un ambiente ricco di ioni ed e indipendente dalla temperatura)→ MA gli anticorpi diretti contro l’antirecettore sono provvisti della capacita di “neutralizzare” la capacita infettante del virus 2. PENETRAZIONE DEL VIRUS NELLE CELLULE ED ESPOSIZIONE DELL’ ACIDO NUCLEICO: richiede, al contrario della prima fase, una PARTECIPAZIONE ATTIVA DELLA CELLULA, si verifica solo a temperature ottimali e quasi ISTANTANEAMENTE dopo l’ attacco → PER I VIRUS NUDI: dopo la traslocazione del virus attraversi la membrana cellulare, mediata da proteine capsidiche, (con recettori di membrana cellulari), si ha il TRASFERIMENTO all’ interno del citoplasma per mezzo di una VESCICOLA ENDOCITA che tramite degli endosomi, avviene una disintegrazione del capside con il RILASCIO DEL GENOMA  → PER I VIRUS CON L’ INVOLUCRO: avviene una fusione dell’ envelope direttamente con la membrana cellulare esterna con successiva liberazione immediata del nucleocapside, tramite proteine fusogene che si inseriscono nella compagine lipidica della membrana cellulare fondendosi con l’ envelope virale ed il NUCLEOCAPSIDE entra cos’ nel citoplasma , il caspside si distacca ed il genoma viene rilasciato tutto cio avviene a pH ACIDO PERCHE’ A QUESTO pH LE PROTEINE FUSOGEE LAVORANO 3. ESPOSIZIONE DELL’ ACIDO NUCLEICO VIRALE: avviene contemporaneamente o subito dopo la separazione dell’ acido nucleico dai componenti 4. REPLICAZIONE: con un PERIODO DI ECLISSI (dopo l’ interazione con una cellula ospite la particella virale infettiva si disintegra e perde la capacita infettiva) e con la SINTESI DELLE PROTEINE VIRALI VIRUS- SPECIFICHE, queste vengono sintetizzate dopo l’ esposizione dell’ acido nucleico secondo delle fasi → PRECOCI : enzimi necessari per la replicazione dell’ a.n. virale e proteine che inibiscono la sintesi macromolecolare della cellula ospite → TARDIVE: dopo la replicazione dell’ a.n., si sintetizzano delle proteine strutturali della progenie virale ed inibitori della sintesi macromolecolare REPLICAZIONE: → NUCLEO: virus a DNA (adenovirus) e virus a RNA (orthomixovirus)→ UTILIZZANO L’ APPARATO DI REPLICAZIONE CELLULARE → CITOPLASMA: virus a DNA(poxovirus) e a RNA(paramixovirus) REPLICAZIONE DELL’ ACIDO NUCLEICO VIRUS DNA REPLICAZIONE VIRUS A DNA ds → HERPES VIRIDAE, ADENOVIRIDAE, POLYOMAVIRISAE, PAPOVIRIDAE Sintesi mRNA nel nucleo della cellula infetta ad opera di una TRASCRITTASI INVERSA Nel nucleo si ha la sede della replicazione del genoma Nel citoplasma avviene la traduzione dei virioni 1. Ingresso 2. Spoilazione CITOPLASMA 3. Il DNA entra nel nucleo 4. Replicazione DNA virale NUCLEO 5. Trascrizione del DNA virale NUCLEO 6. Traduzione mRNA virale CITOPLASMA 7. Le proteine virali entrano nel nucleo 8. Assemblaggio NUCLEO 9. Uscita → POXVIRIDAE ✓ Al contrario di quanto avviene nella maggior parte dei virus a DNAds i poxvirus si replicano interamente nel CITOPLASMA della cellula ospite. Una delle proteine virali prodotte e una DNA polimerasi che replica il genoma virale 1. Ingresso (il virus presenta già una trascrittasi virus specifica) 2. Spoilazione→ esposizione dell’ RNA polimerasi e dsDNA 3. La RNA polimerasi trascrive i geni PRECOCI→ mRNA→ traduzione della DNA polimerasi e delle proteine della replicazione→ replicazione DNA TARDIVI→ mRNA→ traduzione delle proteine necessaria per la costruzione del capside 4. Assemblaggio proteine precoci 5. Acquisizione del pericapside ed uscita REPLICAZIONE VIRUS ssDNA → PARVOVIRIDAE ✓ Sono virus in grado di replicarsi autonomamente e virus la cui replicazione DIPENDE dalla presenza di una COINFEZIONE con adenovirus o herpesvirus 1. Ingresso 2. Produzione del genoma virale nel nucleo cellulare 3. DNA-polimerasi cellulare sintetizza la catena complementare del DNA virale (che è monocatenaria) andando così a formare degli intermedi bicatenari di DNA 4. La molecola bicatenaria è poi tagliata, da proteine virus specifiche endonucleasi virali , in modo da avere due catene complementari, una di nuova sintesi e un'altra originale 5. Le due catene verranno poi separate da proteine virali 6. Dopo la creazione della forma intermedia bicatenaria, la RNA-polimerasi della cellula ospite è in grado di trascrivere in mRNA le sequenze del genoma virale contenenti le informazioni per le proteine non-strutturali (compresa quella che opererà il taglio citato in precedenza) e strutturali (del capside) , questi mRNA vengono trasportati nel citoplasma e tradotti (dai ribosomi cellulari) nelle varie proteine virali. La citotossicità dei Parvovirus è dovuta proprio a queste proteine. REPLICAZIONE VIRUS grapped dsDNA → HEPADNAVIRIDAE ✓ Virus a doppia elica con intermedio a RNA ✓ Il virus che causa l’ epatite B e l'esempio piu conosciuto. Ha un genoma a DNA bicatenario circolare, ma parzialmente incompleto (in alcune zone il genoma e interrotto). A causa di questa particolarita, il ciclo replicativo fa uso degli enzimi di riparazione cellulare per completare il DNA; esso viene poi trascritto e nei nuovi capsidi si trova mRNA; esso viene riportato a DNA da un enzima proprio del virus (trascrittasi inversa, simile a quello dei retrovirus). A questo punto il virus puo gemmare dalla cellula acquisendo il pericapside glicolipidico, che viene prodotto in sovrabbondanza rispetto al numero dei capsidi da rivestire. 1. DNA circolare incompleto 2. Riparazione della catena DNA + interrotta 3. DNA circolare 4. Trascrizione DNA in RNA genomici (traduzione→ proteine dell’ envelope→ ) e progenomici (trascrizione→proteine core RT→ assemblaggio e retrotrascizione ad opera di una trascrittasi inversa RT) 5. DNA circolare 6. Progenie virale REPLICAZIONE ACIDO NUCLEICO VIRUS RNA RIBOVIRUS A GENOMA POSITIVO ssRNA+ → ASTROVIRUS, CALCIVIRUS, PICORNAVIRUS, CORONAVIRUS, FLAVIVIRUS E TOGAVIRUS (tutto nel citoplasma) 1. Ingresso e spoilazione 2. Traduzione, una volta all’ interno della cellula ospite il genoma a SSRNA+ funge direttamente da mRNA 3. Replicazione del genoma, il genoma virale viene tradotto dai ribosomi della cellula ospite producendo proteine virali, per la sintesi del genoma dall’ mRNA viene sintetizzata una copia di RdRP producendo ssRNA- 4. Traduzione delle proteine strutturali virali, i nuovi genomi virali vengono utilizzati per produrre altri mRNA virali i quali verranno tradotti in proteine dai ribosomi della cellula ospite 5. Assemblaggio RIBOVIRUS A GENOMA NEGATIVO ssRNA- → CON UNA MOLECOLA: PARAMYXOVIRUS, RHABDOVIRUS, FILOVIRUS → CON PIU’ MOLECOLE: ORTHOMYXOVIRUS, ARENAVIRUS, BUNUAVIRUS 1. Ingresso e spoilazione 2. Trascrizione inversa, una volta all’ interno dell’ ospite il genoma a ssRNA- funge da stampo per la sintesi di un mRNA complementare a ssRNA+ tramite una RdRp 3. L’ mRNA+ viene utilizzato come modello per la produzione delle proteine virali 4. Lo stampo prodotto a ssRNA+ permette la replicazione del genoma a ssRNA- 5. Assemblaggio dei virioni 6. Rilascio RIBOVIRUS A GENOMA DIPLOIDE → RETROVIRUS (HIV) ✓ I retrovirus a genoma diploide sono un gruppo di virus che contengono un genoma a ssRNA che viene convertito a dsDNA ad opera di una trascrittasi inversa 1. Ingresso 2. Spoilazione 3. Trascrizione inversa con RdRp 4. Gformazione dsDNA chiamato DNA PROVIRALE 5. Integrazione del DNA virale nel DNA cellulare tramite l’ INTEGRASI 6. Il virus a DNA viene trascritto in ssRNA dall’ apparato di trascrizione cellulare fungendo da mRNA per la sintesi di proteine virali 7. Sintesi del genoma, il DNA provirale presente nel genoma cellulare viene replicato insieme a quello cellulare e trasmesso alle cellule figlie 8. Assemblaggio e rilascio RIBOVIRUS A dsRNA → REOVIRUS 1. Ingresso 2. Spoilazione 3. I segmenti del genoma virale dsRNA vengono trascritti in mRNA a ssRNA tramite RdRp 4. Traduzione mRNA tramite i ribosomi cellulari 5. RdRp trascrive il genoma dsRNA in un filamento mRNA 6. Assemblaggio e maturazione 7. Rilascio  ASSEMBLAGGIO DEI VIRIONI Raggruppamento dei componenti neoformati in un particolare sito della cellula. → NEL CITOPLASMA: picornavirus, poxvirus e reovirus → NEL NUCLEO: adenovirus e parvovirus Il CAPSIDE e relativamente piccolo, infatti, per impacchettare il genoma bisogna superare i problemi delle FORZE ELETTROSTATICHE NEGATIVE che pongono resistenza all’ impacchettamento nel momento dell’ AVVOLGIMENTO vi e inoltre la presenza di specifiche SEQUENZE NUCLEOTIDICHE CHE PERMETTONO DI INCAPSIDARE IL GENOMA VIRALE E NON QUELLO CELLULARE Con ENVELOPE→ i siti di assemblaggio sono presenti nelle MEMBRANE CELLULARI (plasmatica, apparato di Golgi e membrana nucleare come nell’ HERPRES) dove il virus viene racchiuso in un VACUOLO o in una VESCICOLA Il capside puo avere una simmetria ELICOIDALE o ICOSAEDRICA e puo essere assemblato PRIMA che il virus LASCI LA CELLULA o al momento della FLUORIUSCITA CLASSI DI PROTEINE VIRALI → DELLA MATRICE: internamente al virione con lo scopo di legare il NUCLEOCAPSIDE DELL’ ENEVELOPE → GLICOPROTEINE: ancorate all’ envelope attraverso un dominio transmembrana → PROTEINE CANALE: formano un canale proteico che attraversa l’ enevelope permettendo al virus di variare la permeabilita di membrana (con canali ionici)ed hanno quindi il compito di modificare il MICROAMBIENTE del VIRIONE MATURAZIONE DEI VIRIONI COMPLETI Stadio in cui un virus diventa INFETTANTE e dove si hanno delle modificazioni: → STRUTTURALI: nella particella virale vi sono dei tagli proteolitici delle proteine del capside → CONFORMAZIONALI: nelle proteine durante l’ assemblaggio ad opera di PROTEASI importante sia per la particella virale che per la cellula MATURAZIONE E FUORIUSCITA VIRUS CON ENVELOPE 1. Proteine glicosilate si inseriscono in una zona di membrana 2. Traslocano le proteine cellulari in periferia 3. Migrazione del nucleocapside virale 4. Ancoraggio come nel caso del TOGAVIRUS della proteina M 5. Avviluppo del nucleocapside (si aggroviglia) 6. Estroflessione della membrana cellulare per gemmazione del virione con ENVELOPE 7. Liberazione finale con RILASCIO che puo: danneggiare la cellula, essere liberato senza alterare la cellula (rabbia) o puo essere scarsamente dannoso come i RETROVIRUS che acquisiscono infettivita dopo la gemmazione LA DURATA DEL CICLO REPLICATIVO VARIA IN BASE ALLA GRANDEZZA DEL VIRUS DA 6-7h (picornaviridae) ad un massimo di 24h per virus piu grandi TECNICHE PER LO STUDIO DEI VIRUS La coltura puo avvenire in modo: → DIRETTA: tramite identificazione dell’ acido nucleico o di proteine specifiche → INDIRETTA: tramite gli effetti patologici che hanno effetto su colture cellulari o su organismi viventi  DOVE AVVIENE LA COLTIVAZIONE? → Su cellule SENSIBILI e PERMISSIVE → Cellule con uno SPETTRO D’ AZIONE RISTRETTO La coltivazione viene quindi effettuata su ANIMALI DA LABORATORIO: solitamente di usa il TOPOLINO NEONATO tramite inoculazione INTRACEREBRALE o INTRAPERITONEALE e la manifestazione della moltiplicazione virale e evidenziata da MORBOSI o MORTE Per i virus che non si propagano in colture cellulare Patogeni delle membrane virali Oncogeni virali Sviluppo di vaccini CONTRO: infezione naturale, elevati costi e considerazioni etiche UOVA EMBRIONATE DI POLLO: la manifestazione della moltiplicazione virale avviene tramite la MORTE DELL’ EMBRIONE che avviene tramite la comparsa di potere EMOAGGLUTINANTE nei liquidi embrionali o di lisi sulla membrana CORION-ALLONTOIDEA Per una varieta di tessuti differenziati o in via di differenziamento Usati per propagare il VIRUS INFLUENZALE Lì inoculazione avviene e nelle cavita: amniotica, allontoidea e nella membrana corion-allontoidea COLTURE CELLULARE: Metodo piu usato in virologia Importante per l’ isolamento la propagazione e l’ identificazione STORIA: ✓ 1949: venne dimostrato che il poliovirus poteva essere riprodotto in tessuti embrionali ✓ 1952: prima linea di cellule stabilizzate le HELA (cellule tumorali) ✓ 1955: sviluppo di un terreno nutritivo per il mantenimento delle cellule PRO: possono essere clonate, vivono in un ambiente controllato e preciso CELLULE PRIMARIE: prelevate da un organo o un tessuto ma che sopravvivono poche ore CELLULE DEDIFFERENZIATE: sopravvivono in coltura per piu passaggi CONTINUE: immortalizzate PORZIONI D’ ORGANO: efficaci perche si va in contro ad infezioni naturali ma la coltura non rispecchia l’ ambiente in vivo con le risposte del SISTEMA IMMUNITARIO VANTAGGI E SVANTAGGI DELLE COLTURE Le colture hanno consentito di eseguire studi sul ciclo replicativo e sulle interazioni VIRUS-CELLULA OSPITE, per interpretare il meccanismo con cui i virus tumorali esprimono la loro funzione oncogena bisogna EFFETTUARE UNA DIAGNOSI E PRODURRE DEGLI ANTIVIRALI→ IL TIPO DI COLTURA UTILIZZATA PER UN VIRUS DIPENDE DALLA SENSIBILITA’ DELLE CELLULE VERSO QUEL DETERMINATO VIRUS VANTAGGI: SVANTAGGI: → Sistemi semplici e riproducibili → Sistemi semplificati rispetto al vivo → Analisi di meccanismi cellulari-molecolari → Condizioni diverse rispetto a quelle in vivo → Economia → Difficolta di correlare le concentrazioni in vitro → Possibilita di svilupparsi in un ambiente sterile con quelle in vivo → Assenza di inibitori → Le sostanze inoculate possono interagire con il → Risultati rapidi terreno di coltura → Maggiore sensibilita ai virus → I parametri ambientali possono essere controllati  COLTURE IN VITRO VS IN VIVO → Passaggio da architettura 3D a 2D → In vitro si selezionano pochi tipi cellulari → Metabolismo in vitro costante → In vitro non ci sono sistemi di regolazione che sono presenti in vivo ovvero regolazione NERVOSA ed ENDOCRINA GRAFICO DEL LIMITE DI HAYFLICK Hayflick concluse che una cellula potrebbe replicarsi solo 40-60 volte prima di subire la morte ovvero l’ APOPTOSI, questa limitata capacita replicativa della cellula poteva essere correlata all’ INVECCHIAMENTO CELLULARE ovvero l’ INVECCHIAMENTO UMANO COLTURE CELLULARI Le colture cellulari sono sospensioni cellulari allestite DISINTEGRANODIL TESSUTO D’ ORIGINE con ENZIMI PORTEOLITICI come la TRIPSINA associati ad AGENTI CHELANTI. Queste colture cellulari si coltivano in COLTURE ADERENTI O SOSPENSIONI TERRENO DI COLTURA Il terreno di coltura deve essere sterile e possedere un caratteristico pH di 7.4 I terreni di coltura contengono: Per il mantenimento della PRESSIONE OSMOTICA → Glucosio → Amminoacidi → Vitamine → Coenzimi → Sali Per il mantenimento del pH → Bicarbonato di sodio Come indicatore → ROSSO FENOLO Tutte le colture si mettono ad incubare a 37°C con il 5% di CO2  SIERO ANIMALE Siero sanguigno formato da PLASMA ovvero la fase liquida del sangue priva di FATTORI DI COAGULAZIONE , contiene quindi: → Vitamine → Minerali → Supplementi organici → Ormoni → Fattori di crescita FUNZIONI: → Fornisce fattori per la moltiplicazione cellulare → Detossifica il terreno → Contiene dei fattori di adesione al substrato Grazie alla sua VISCOSITA’ protegge la membrana, veicola i lipidi, contiene ferro e molecole organiche, fornisce interazioni cellula-substrato e contiene INIBITORI DELLA TRIPSINA. SVANTAGGI: → Possibile tossicita degli anticorpi → Variabilita da lotto a lotto → Inibitori metabolici → Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti i rispetto ad altri tipi cellulari Per evitare la contaminazione vengono aggiunti ANTIBIOTICI e ANTIMICOTICI (stabili per pochi giorni a 37°C) COLTURA PRIMARIA 1. Prelievo di un campione di cellule (organi, embrione, uova,…) 2. Dissezione meccanica (biopsia) 3. Trattamento TRIPSINA+EDTA per ottenere una sospensione omogenea 4. Centrifugazione della sospensione cellulare dove le cellule vengono risospese 5. Controllo vitalita cellulare COME POSSONO CRESCERE LE COLTURE CELLULARI? MONOSTRATO VS SOSPENSIONE → Monostrato: colture aderenti Cellule che crescono aderendo su un solo strato aderendo ad una superficie solida come il fondo di una piastra di coltura Spesso utilizzate per studiare le interazioni virus-cellula in un ambiente piu fisiologico simile alla situazione in vivo Adatte anche ad esperimenti di morfologia → Sospensione: possono moltiplicarsi anche senza aderire ad un substrato Coinvolgono cellule che crescono liberamente nel mezzo di coltura senza aderire su una superficie solida Sono particolarmente utilizzate per la produzione su larga scala di virus e proteine virali Approccio adatto a coltivare un numero di cellule in modo efficiente per ottenere un alto rendimento in produzione virale  ALLESTIMENTO DELLE COLTURE → Frammentazione del tessuto ( si prelevano cellule di tipo fibroblastico o epiteliale mantenute in vitro) → Trattamento proteolitico → Allestimento della coltura → Conteggio cellulare → Si aspettano 24-48h → Si ottiene la COLTURA PRIMARIA con DIPLOIDIA ( si riferisce ad una coltura cellulare composta da cellule che hanno un numero normale di cromosomi e che sono state prelevate direttamente da un organismo ospite anziche essere state trasformate o modificate in laboratorio quindi CELLULE VICINE ALLO STATO FISIOLOGICO ORIFIGANELE) si usa per la replicazione di PARTICOLARI VIRUS che necessitano di uno STADIO DIFFERENZIALE specifico e per i VACCINI. Questa dura per 30-50 PASSAGGI poi si va in SENESCENZA REPLICATIVA O MORTE → Quando le cellule della coltura primaria cessano di moltiplicarsi → Si prelevano → Dopo 48-72h → Si ottiene la COLTURA SECONDARIA LINEE CELLULARI CONTINUE Unico ceppo di riprodursi illimitatamente in vitro, sono comode e possono essere mantenute in congelatore, un esempio sono le HELA RICONOSCIMENTO DELLA MOLTIPLICAZIONE VIRALE NELLE COLTURE DI CELLULE → ECP: comparsa di effetti citopatici (cambiamenti cellula) Lisi Formazione di inclusioni Formazione di sincizi (come il Paramyxovirus) Vacuolizzazione citoplasmatica (citoplasma-togavirus e nucleo-vaiolo) → COMPARSA DI PROTEINE CODIFICATE DAI VIRUS: emoagglutine del virus influenzale evidenziate mediante ANTISIERI Emoadsorbimento→ identifica antigeni virali a livello della membrana cellulare Emoagglitonazione→ rivela particelle virali o parti di esse nel supernatante sono entrambe proteine in grado di legarsi alla membrana degli eritrociti formando dei ponti fra i diversi eritrociti provocando L’ AGGREGAZIONE → INTERFERENZA → EVIDENZIAZIONE ACIDO NUCLEICO VIRUS-SPECIFICO → FORMAZIONE DI CORPI INCLUSI: strutture prodotte dalla cellula durante la moltiplicazione virale nel nucleo (HPV) nel citoplasma (POXO) e in entrambi (MORBILLO) PURIFICAZIONE ED IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS 1. Si parte da grandi volumi di materiale da analizzare (colture tissutali, liquidi biologici, cellule infettate,..) 2. Le particelle virali vengono concentrate (precipitazione con solfati di ammonio, etanolo, polietilenglicole o con ultrafiltrazione) 3. Separazione del materiale ospite (centrifugazione differenziale, in gradiente di densita, cromatografia su colonna o elettroforesi)  CENTRIFUGAZIONE Le tecniche della centrifugazione sfruttano il diverso comportamento dei componenti di un campione all’ interno di un campo centrifugo Le particelle si separano con una diversa velocita in base a dei parametri: → Forza del campo centrifugo → Dimensione della particella → Densita (della particella e del mezzo) → Forma della particella → Viscosita del mezzo TIPI DI CENTRIFUGAZIONE: → DIFFERENZIALE (in base alla massa) A bassa velocita → sedimentano oggetti grandi come le cellule eucariotiche Viene eliminato il sedimento A media velocita→ sedimentano gli organelli cellulari Eliminiamo il sedimento Ad alta velocita → sedimentano i VIRUS → A GRADIENTE (in base alla densita) La provetta viene riempita con concentrazioni crescenti di saccarosio che vanno dal 20 al 70% Viene aggiunta la sospensione virale La parte virale si stratifica dove la percentuale di saccarosio ha una concentrazione simile a quella propria fisiologica La parte virale viene rimossa dalla provetta CROMATOGRAFIA SU COLONNA → FASE STAZIONARIA: e il materiale adsorbente che riempie la colonna in vetro → FASE MOBILE: eluente che viene fatto scendere (le dimensioni della colonna variano in base al materiale che si deve separare) TIPI DI CROMATOGRAFIA: Scambio ionico Esclusione molecolare Interazione idrofobica Per assorbimento Per affinita QUANTIFICAZIONE VIRALE → TITOLO VIRALE: concentrazione virus in un dato materiale → SCOPO: Ripetere un esperimento Sapere la quantita di virus in una persona infetta per stabilire la terapia Monitorare la terapia  PER CONTARE IL NUMERO DI PARTICELLE VIRALI IN UNA SOLUZIONE SI USANO DUE MODI: → DIRETTO: il piu usato secondo il principio che il TITOLO INFETTANTE e DIRETTAMENTE proporzionale al numero di VIRIONI COMPLETI Placche di citolisi: Test delle placche (plaque test) per determinare il titolo virale. Piastrando diluizioni seriali di un virus su cellule ospiti suscettibili, e possibile determinare il numero di unita capaci di formare placche (PFU) che era presente nel campione originale. In questo campione, a ogni piastra e stata aggiunta una diluizione seriale in base dieci di una preparazione virale. Come e prevedibile, quando il virus viene diluito in base dieci si osserva un numero di placche circa dieci volte minore 1. Cellule batteriche suscettibili vengono mescolate con un campione di fago 2. La miscela viene aggiunta all’ agar fuso (perche ostacola la libera diffusione della progenie virale rilasciata, così che ogni virus distrugga i batteri solo nelle immediate vicinanze) e mescolata rapidamente 3. La miscela in agar e versata su una base di agar nutritivo e lasciata solidificare 4. Dopo una sufficiente incubazione si nota sulla piastra la comparsa di placche a Conta diretta: determina il numero di ASSOLUTO di particelle virali in un campione 1. Vengono aggiunte sferule di lattice nel campione 2. La mistura viene posta su un retino 3. Viene visualizzata al MICROSCOPIO ELETTRONICO 4. Ma non consente di distinguere le particelle infettive (vive) da quelle non infettive (morte) → INDIRETTI Conta indiretta: per diluizione, determinazione della TCID50 (dose tissutale infettante totale 50) 1. Un campione di virus e sottoposto a diluizioni seriali e aliquote sono poste a contatto con monostrati di cellule suscettibili 2. Si valuta poi l’effetto citopatico in ogni combinazione di virus/cellule 3. Si determina la diluizione di virus che causa effetto citopatico nel 50% delle colture equivalenti 4. Il titolo virale si esprime in TCID50/ml. DIAGNOSI DELLE INFEZIONI VIRALI La diagnosi delle infezioni virali e stata molto rallentata dalla mancanza di opportuni mezzi diagnostici. Si basava quindi esclusivamente sulle manifestazioni cliniche, che pero possono essere comuni a malattie causate da virus MOLTO differenti (varicella/morbillo). Presuppone a monte un corretto inquadramento clinico per ridurre lo spettro delle indagini da eseguire per la corretta identificazione del patogeno sospetto. SI BASA SU: INDISPENSABILE QUANDO: → Sintomi clinici → Prospetta un intervento di profilassi o terapia specifica → Conoscenza del virus → Quadro clinico sostenuto da piu virus non correlati → Esami di laboratorio → Necessario seguire particolari categorie di pazienti → Scelta del campione clinico idoneo (immunodepressi) → Prelievo e trasporto del materiale clinico → Controllo di preparazioni commerciali di emoderivati → Individuazione del metodo adeguato → Ricerca di agenti eziologici di gravi o nuove patologie → Terapia → Indagini epidemiologiche su una determinata popolazione METODI DIAGNOSTICI → APPROCCIO DIRETTO: identificazione del virus direttamente nel campione clinico (isolamento virale, ricerca di antigeni virusspecifici o particelle virali, antigeni nucleici virali) → APPROCCIO INDIRETTO: : diagnosi di tipo sierologico (ricerca di anticorpi diretti contro un determinato virus)  METODI DIAGNOSTICI DIRETTI → MICROSCOPIA ELETTRONICA: che permette di analizzare la forma, dimensione e morfologia → IMMUNOSCOPIA ELETTRONICA: permette di evidenziare gli anticorpi legati a metalli pesanti come oro o platino ESEMPIO → COLORAZIONE NEGATIVA Distribuzione dei campioni in un film sottile con acido fosfotungsteno e acetato di uranile, assorbimento dei virus su griglie di ramine che evidenziano le particelle virali luminose su sfondo scuro. La diagnosi arriva entro 15min, ad ALTISSIMA RISOLUZIONE e permette di visualizzare anche la piu piccola parte del virus Vantaggi → Via piu diretta → Elevato grado di specificita a livello di famiglia → Diagnosi rapida Svantaggi → Costi di strumentazione e manutenzione → Necessita di personale esperto → Concentrazione virale nel campione (106-107) (solo una frazione aderisce al vetrino e sopravvive alla colorazione) → Metodo ideale per pochi campioni non automatizzabile → Identificazione solo di famiglia non di genere o specie METODI DIAGNOSTICI INDIRETTI → Rivelazione antigeni virali: necessita di anticorpi specifici (antisieri) utilizzata per Infezioni respiratorie Virus gastroenterici Virus che danno infezioni alla cute o congiuntivite Infezioni da HBV o CMV → IMMUNOFLUORESCENZA: Tecnica impiegata in immunoistochimica per individuare, in un contesto tessutale o cellulare, la presenza di particolari antigeni, mediante impiego dei rispettivi anticorpi resi fluorescenti con fluorocromo (colorante che sotto l’azione di raggi ultravioletti emette luce colorata). La tecnica si basa sulla classica reazione antigene-anticorpo e si utilizza per identificare le cellule infette in un campione clinico. Utilizza anticorpi monoclonali virus-specifici coniugati con una molecola di fluoresceina. Puo essere DIRETTA o INDIRETTA. → IMMUNOPEROSSIDASI: Tecnica simile all’Immunofluorescenza ma utilizza la perossidasi per la marcatura del siero. La reazione si mette in evidenza aggiungendo il substrato della perossidasi. Si utilizza il microscopio ottico → IMMUNOENZIMATICA: Metodiche piu diffuse perche rilevano sia antigeni virali cellulo-associati che antigeni in fase fluida (siero, liquor, sangue) ELISA: → Utilizza enzimi che trasformano molecole non colorate (cromogeni) in colorate→ Misura l’assorbimento della luce direttamente proporzionale alla quantita di sostanza che si sta cercando CLIA: → Utilizza come sostanza di rilevamento una molecola chemiluminescente  Misura l’intesinsita luminosa prodotta→ Metodo piu sensibile dell’ELISA  METODI MOLECOLARI ADDIZIONALI Per virus difficili o impossibili da coltivare come l’ HIV, per virus che crescono lentamente in coltura o per virus con un’ elevata variabilita antigenica → SAGGI DI IBRIDAZIONE → PCR → TMA (transcription mediated amplification) → HC (hybrid capture) → METODI DI SEQUENZIAMENTO → Metodo dei dideossinucleotidi: metodo di Sanger → Metodo del pyrosequenziamento EMOAGGLUTINAZIONE ED EMOADSORBIMENTO PRINCIPIO: alcuni virus sono provvisti di proteine superficiali in grado di legarsi alla membrana degli eritrociti di diverse specie animali→ formando dei ponti fra i diversi eritrociti e → provocando l’ aggregazione in sospensione o l’ emoadsorbimento alle cellule infette SONO TECNICHE NON SPECIFICHE EMOAGGLUTINAZIONE: rileva particelle virali o parti di esse rilasciate nel SUPERNATANTE EMOADSORBIMENTO: identifica antigeni virali espressi a livello delle membrane cellulari CENNI DI IMMUNOLOGIA Per immunologia intendiamo la corretta comprensione dei meccanismi patogenetici di un microrganismo la quale prevede la conoscenza delle contromisure messe in atto dall’ospite per contrastarne la diffusione→ INFLUENZANO L’ ESITO DELL’ INFEZIONE NEL PAZIENTE MECCANISMI DIFENAIVI DELL’ OSPITE ALLE INFEZIONI La RISPOSTA IMMUNE SI DIVIDE IN → INNATA: con delle barriere chimico- fisiche, Risponde in maniera non specificatamente diretta contro un dato patogeno ad una serie di fattori di diversa natura e origine riconosciuti come estranei all’organismo → ADATTIVA: Si fonda sul riconoscimento specifico di fattori «estranei» che poi determina l’istaurarsi della memoria immunologica SISTEMA LINFATICO La responsabilita della risposta immune(soprattutto quella adattiva) e data dal SISTEMA LINFATICO composto dalla LINFA (contenente leucociti e priva di eritrociti) , VASI LINFATICI, ORGANI LINFATICI PRIMARI (timo e midollo osseo) E SECONDARI (linfonodi, tonsille, milza, placche del Peyer e linfonodi) FUNZIONI: 1. Far fluire l’eccesso di liquido interstiziale 2. Trasportare i lipidi introdotti con l’alimentazione 3. Veicolare le risposte immunitarie OMEOSTASI→ capacita che ha l’organismo di autoregolarsi mantenendo costante il proprio ambiente interno, nonostante le variazioni di condizione che possano interessare l’ambiente esterno, Il mantenimento dell’omeostasi necessita di una continua azione di difesa dai patogeni (batteri, virus,..) a cui siamo esposti e da una vasta gamma di “danni” prodotti da ferite, radiazioni, tossine… Questo genere di difesa viene chiamato immunita ed e affidata principalmente al sistema linfatico come la temperatura corporea umana mantenuta costante a circa 35°C dal SISTEMA IMMUNITARIO.  CELLULE DEL SISTEMA IMMUNITARIO Sono i LEUCOCITI o GLOBULI BIANCH che dal MIDOLLO OSSEO possono migrare in vari distretti corporei tramite il circolo linfatico o il circolo sanguigni. I globuli bianchi si dividono in base alla presenza di granuli nel citoplasma: → LEUCOCITI GRANULARI Neutrofili Eosinofili Basofili → LEUCOCITI NON GRANULARI Linfociti→ T, B e NK → SI OCCUPANO DELL’ IMMUNITA’ ADATTIVA Monociti LINFOCITI T: → CTL: linfociti T citotossici (CD8+): coinvolti nell’ eliminazione di cellule infettate da virus , patogeno intracellulari e cellule tumorali → TH: linfociti T helper (CD4+): quando vengono attivati, in seguito ad interazione con molecole di cellule sconosciute che presentano l’ antigene APC) attivano altre popolazioni cellulari come i macrofagi e i linfociti B IMMUNITA’ INNATA (Distingue il “self” dal “non-self”) Permette un primo contenimento di eventuali patogeni in attesa che maturi una risposta specifica da parte dell’immunita adattativa. Cellule coinvolte del sangue della categoria dei LEUCOCITI: → Macrofagi → Monociti → Neutrofili → Cellule dendritiche Queste cellule sulla loro superficie o nel loro COMPARTIMENTO ENDOCITICO presente all’ interno presentano dei RECETTORI chiamati PATTERN-RECIGNITION RECEPTORS ovvero i PRR che riconoscono dei motivi molecolari nei patogeni chiamati PAMP ovvero PATHOGEN-ASSOCIATED MOLECULAR PATTERNS (alcuni esempio LPS, LIPOPROTEINE, PEPTIDOGLICANO, FALAGGELLINA, ACIDI LIPOPROTEICI e dsRNA) PRR La stimolazione di questi recettori attiva una cascata di segnali che porta alla differenziazione e alla maturazione di cellule del sistema immunitario, alla secrezione di citochine e pone le basi per un’efficiente risposta adattativa. → TLR: proteine di membrana (cellulare o endosoma) → RIG-I E RLR: proteine citoplasmatiche con attivita RNA-elicasica → DAI: proteine citoplasmatiche con attivita DNA/RNA elicasica → NOD NLR: proteine citoplasmatiche che mediano l’apoptosi cellulare in caso di infiammazione  INTERFERONE Descritto per primo da Isaac e Lindemann come fattore capace di “interferire” con la replicazione dei virus. E una componente fondamentale della risposta innata essendo la prima difesa attiva nei confronti dell’infezione MECCANISMO: 1. Attiva la difesa antivirale delle cellule bersaglio 2. Attiva la risposta immunitaria L’IFN e una difesa molto importante ma contemporaneamente e la causa dei sintomi come malessere, mialgie, brividi e febbre (sintomi non specifici simil-influenzali) che si associano a molte infezioni virali. Appartengono alla grande classe di proteine note come citochine, molecole utilizzate per la comunicazione tra le cellule per attivare le difese protettive del sistema immunitario che aiutano a combattere i patogeni Piu di venti distinti geni e proteine IFN sono stati identificati negli animali divisi in tre classi: di tipo I,tipo II e tipo III→ gli IFN appartenenti a tutte e tre le classi sono importanti per combattere le infezioni virali e per la regolazione del sistema immunitario. COME I PRR COMUNICANO L’ AVVENUTA INFEZIONE?? PRR→ si al suo PAMP→ dopo il legame inizia una cascata di segnalazioni→ questa cascata modifica l’ espressione genica→ si attivano 2 fattori di trascrizione → IRF3 e NFkB → che servono a produrre l’IFNβ, una citochina→ la produzione di IFNβ e il modo con cui la cellula infetta comunica la presenza di un virus alle cellule vicine→ IFNβ induce l’espressione di numerosi geni (tramite la via di segnalazione JAK/STAT) tra cui IFNα, per amplificare la risposta antivirale FAGOCITOSI I LISOSOMI sono delle inclusioni granulari presenti nelle cellule fagocitiche contenenti varie sostanze battericide: perossido d’idrogeno, lisozima, proteasi, fosfatasi, nucleasi e lipasi. La membrana del fagocita che avvolge la cellula estranea distaccandosi forma un fagosoma che penetrando nel citoplasma si fonde con i lisosomi a formare il fagolisosoma. PROCESSO DI ATTIVAZIONE DEI MACROFAGI Il rilascio delle citochine da parte dei linfociti promuove una differenziazione funzionale del macrofago. In seguito a fagocitosi il macrofago espone frammenti batterici sulla propria superficie designandoli come bersaglio per i linfociti T, quest’ ultimi riconoscono i frammenti alieni mediante l’ ausilio di molecole recettoriali e promuovono la proliferazione e l’ espansione dei linfociti B. IMMUNITA’ ADATTIVA La risposta immune innata e adattativa differiscono in 2 aspetti fondamentali: SPECIFICITA’ e DURATA. La risposta immune adattativa conferisce maggiore specificita alla risposta immune, e la risposta che fornisce dura tutta la vita. FUNZIONI: → Prevenire lì infezione di nuove cellule (da parte di virioni liberi) → Eliminare selettivamente le cellule gia infettate  TIPI DI IMMUNITA’ ADATTIVA → IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (linfociti T citotossici ed helper): Lo stimolo per iniziare la CMI e la rilevazione di un antigene estraneo (derivato da tossine, patogeni,..) da parte di una cellula T. Quando questo avviene, la cellula T produce segnali (chemochine, citochine) che attraggono altre cellule del sistema immunitario nel sito di infezione e ne aumentano la risposta. Questo permette l’attivazione di vari processi che portano ad attaccare la cellula infettata dal virus, limitandone la replicazione e quindi eliminando il virus. Questa e la RISPOSTA INFIAMMATORIA che avviene in seguito ad un’infezione. → IMMUNITA’ UMORALE (linfociti B) ANTIGENI ED IMMUNOGENI ANTIGENI: l'antigene (Ag) e una molecola( o una struttura molecolare) che puo legarsi a uno specifico anticorpo o recettore dei linfociti T (possono essere proteine, peptidi, saccaridi, lipidi o acidi nucleic) RECETTORI→I recettori dell'antigene sono prodotti dalle cellule del sistema immunitario in modo che ogni cellula abbia una specificita per un singolo antigene. ESPOSIZIONE AD UN ANTIGENE→ Dopo l'esposizione a un antigene, solo i linfociti che riconoscono quell'antigene vengono attivati ed espansi, un processo noto come selezione clonale. LEGAME ANTICORPO-ANTIGENE→ Nella maggior parte dei casi, un anticorpo puo reagire e legarsi solo a un antigene specifico, in alcuni casi, tuttavia, gli anticorpi possono reagire in modo incrociato e legare piu di un antigene. SELF E NON SELF→ L'antigene puo provenire dall'interno del corpo («self») o dall'ambiente esterno («non- self» il sistema immunitario identifica e attacca gli antigeni esterni «non-self" e di solito non reagisce agli antigeni «self» grazie selezione negativa dei linfociti T nel timo e dei linfociti B nel midollo osseo. EPITOPO→ e quella piccola parte di antigene che lega l'anticorpo specifico IMMUNOGENI: la maggior parte degli antigeni sono anche immunogeni ossia capaci di indurre una risposta immunitaria CELLULET IN GRADO DI LEGARE L’ ANTIGENE → TCR: Costituiti da proteine che dalla superficie delle cellule T si estendono nell’ambiente extracellulare. I domini variabili interagiscono a formare un sito di legame completo per l’antigene. I TCR possono riconoscere e legare un antigene peptidico solo se questo e prima legato ad una proteina self chiamata complesso maggiore di istocompatibilita (MHC) → MCH’: Il ruolo principale del MHC e quello di agire come molecole che presentano un antigene. Interagiscono sia con l’antigene (epitopo) che con i TCR (T-cell receptors). Permettono ai li nfociti T (helper o citotossici) di riconoscere antigeni estranei. MHC’ DI CLASSE I → Le molecole del MHC hanno il compito di legare peptidi antigenici non-self, derivanti da batteri, virus o protozoi, e di presentarli ai linfociti T, per attivare una risposta immune specifica. I recettori MHC di classe I sono il bersaglio del recettore TCR dei linfociti CD8 + che riconosce antigeni solo se complessati con i recettori MHC (non solubili). N.B. Una cellula normale mostrera peptidi dal normale turnover proteico cellulare sul suo MHC di classe I e i CTL non verranno attivati in risposta ad essi a causa dei meccanismi di tolleranza centrali e periferici Si trovano sulla superficie di tutte le cellule nucleate Costituite da 2 polipeptidi, una catena ancorata alla membrana (α) e una proteina piu piccola chiamata β-2 o microglubulina (β2m) MHC’ DI II CLASSE Si trovano solo sulla superficie dei linfociti B, dei macrofagi e delle cellule dendritiche; tutte cellule in grado di presentare l’antigene (APC). Costituite da due polipeptidi legati non covalentemente chiamati α e β, ancorati alla membrana cellulare e proiettati all’esterno della superficie cellulare  LINFOCITI TC CD8+ NAΪVE → subiscono un'espansione clonale in seguito all'esposizione all'antigene e generano cellule effettrici citolitiche. Le cellule effettrici citolitiche si legano con il TCR alla cellula infetta che verra distrutta rilasciando granuli secretori contenenti molecole citotossiche (perforina, granzimi). Possono anche indurre apoptosi nelle cellule infettate ATTIVAZIONE: Il legame del TCR con la cellula APC stimola la produzione di citochine (interleuchine) da parte della cellula APC che induce il differenziamento del linfocita TH. Questo quindi migra verso uno degli organi linfoidi dove va incontro a ESPANSIONE CLONALE, differenziandosi in cellule effettrici (attivate) che riconoscono tutte lo stesso antigene. Le cellule T attivate vanno in circolo «pattugliando» il corpo e interagendo con l’antigene specifico quando lo incontrano (la risposta immunitaria non si limita al sito da cui ha avuto inizio). La cellula T iniziale non e piu naìve (inesperta). Si generano anche le cellule della memoria. IMMUNITA’ ADATTATIVA: IMMUNITA’ UMORALE ANTICORPO-MEDIATA Come nei linfociti T anche sulla membrana dei linfociti B vi sono dei recettori specifici chiamati BCR che legano gli antigeni liberi, ovvero non legati a MHC. I BCR sono epitopo-specifici e ogni cellule B → 1 cellula B→ 1 epitopo→ lega un anticorpo. I BCR si formano quando le Ig sono legate alla membrana delle cellule B. Linfociti B incontro con antigene→ PLASMACELLULE→ le plasmacellule producono Ig (con la stessa specificità antigenica dei BCR gli ANTICORPI) ANTICORPI CARATTERISTICHE GENERALI: → Stesse caratteristiche strutturali di base: struttura centrale simmetrica composta da due catene leggere identiche e due catene pesanti identiche entrambe costituite da regioni variabili amminoterminali che partecipano al riconoscimento dell'antigene e dalle regioni costanti carbossili-terminali → Variabilita nelle regioni che legano con gli antigeni.  INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO → Il legame Ag/Ab e NON covalente → Dovuto a: 1. Forze elettrostatiche 2. Legami a idrogeno 3. Forze di Van der Waals 4. Legami Idrofobici → Puo essere scisso da: elevata concentrazione salina, pH basso o alto, detergenti ANTIGENI MULTIVALENTI Un antigene possiede normalmente piu di un epitopo, quindi la risposta che indurra sara policlonale, cioe verranno attivati piu cloni linfocitari. All'interno di una molecola antigenica puo vigere una gerarchia nell'immunodominanza degli epitopi, con conseguente attivazione preferenziale di alcuni cloni confronto ad altri. VALENZA DELL’ ANTIGENE→ Il numero di epitopi per molecola definisce la "valenza" dell'antigene e corrisponde al numero massimo di molecole di anticorpi che si possono legare a una molecola di antigene. VALENZA DEGLI ANTICORPI E DELLE INTERAZIONI ANTICORPO-ANTIGENE AFFINITA’→ in generale, la forza con cui due (o piu) molecole interagiscono o si legano. Per i complessi antigene-anticorpo, si riferisce alla forza con cui l'epitopo si lega a un singolo paratopo (sito di legame dell'antigene) sull'anticorpo. AVIDITA’→ forza cumulativa con la quale un anticorpo lega un antigene con piu epitopi= la forza totale di tutte le interazioni non covalenti tra due (o piu) molecole  TIPOLOGIA E RUOLO DEGLI ANTICORPI → IgA: sono di due tipi, si trovano nelle mucose del tratto respiratorio, intestinale e urogenitale , si trovano anche nella saliva e nelle lacrime. Si trovano sottoforma di dimero → IgD: e solo di 1 tipo, si trovano legate alle membrane, si trovano sulla superficie delle cellule b naive. Si trovano sottoforma di monomeri → IgE: e solo di 1 tipo, legano principalmente allergeni per attivare la risposta allergica e sono coinvolte nella protezione contro i vermi e i parassiti. Si trovano sottoforma di monomero → IgG: sono di 4 tipi, costituiscono la maggior parte degli anticorpi circolanti che provvedono all’ immunita umorale, possono attraversare la placenta per fornire una protezione temporanea al feto e al neonato subito dopo la nascita. Si trovano sottoforma di monomero → IgM: e solo di 1 tipo, si trovano in forma legata alla membrana dei linfociti B come BCR sia in forma secreta, rappresentano il primo isotipo che compare a seguito di un infezione. Si trovano sottoforma di monomero CINETICA DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA  INTERAZIONE TRA VIRUS ANIMALI E OSPITI CICLO DI TRASMISSIONE DEL VIRUS La trasmissione virale e un elemento che rientra nell’EPIDEMIOLOGIA, la scienza che definisce e quantifica i fattori che determinano i tassi di incidenza delle malattie. La comprensione delle vie di trasmissioni dei virus e fondamentale per il controllo della diffusione dell’infezione RAPPORTO CON I FATTORI AMBIENTALI→ Le caratteristiche del ciclo di trasmissione di un virus possono variare molto in base alle stagioni. Il virus influenzale e il respiratorio sinciziale mostrano una marcata stagionalita con un picco invernale alle latitudini temperate. Le caratteristiche del virus e della cellula che viene infettata determinano se la cellula sopravvive, muore o resta infettata per sempre La patogenesi di un’infezione e il risultato di un «conflitto» tra le capacita invasive dell’agente infettante e le difese dell’ospite PENETRAZIONE E DIFFUSIONE DEI VIRUS Una volta entrato nell’ ospite il virus deve trovare delle cellule SUSCETTIBILI e PERMISSIVE secondo il TROPISMO ovvero la tendenza di alcuni microrganismi e farmaci a localizzarsi o ad accumularsi prevalentemente in un organo, apparato, tessuto o cellula. → VIA CUTANEA: ossia attraverso la pelle, interessa alcuni virus (HPV) → VIA PARENTALE: ossia attraverso il sangue, un gran numero di infezioni (es. trasmesse da artropodi) o sangue e derivati.  TIPI DI INFEZIONE → INFEZIONE LOCALIZZATA 1. Il virus che si trova nell’ ambiente entra nella cellula 2. Entra mediante un sito di ingresso 3. Si replica nel sito di ingresso e diffonde LOCALMENTE → INFEZZIONE DISSEMINATA O SISTEMICA 1. Il virus nell’ ambiente entra nella cellula 2. Entra in un sito di ingresso 3. Nel sito di ingresso avviene una REPLICAZIONE MODESTA 4. Il virus viene drenato per via linfatica o ematica 5. Finisce in organi bersaglio dove tramite una viremia secondaria continua a replicarsi DANNI DELL’ INFEZIONE VIRALE Una malattia virale risulta essere l’espressione di danni strutturali e/o funzionali che il virus causa DIRETTAMENTE o INDIRETTAMENTE. → EFFETTI DIRETTI: Danno citopatico con conseguente lisi della cellula infetta, il tessuto interessato dall’infezione puo risentire in termini funzionali della lisi cellulare virusmediata. Il decorso della patologia dipende dal tessuto interessato (capacita rigenerative e importanza della funzione svolta). Capacita oncogene intrinseche di alcuni virus che possono avviare o favorire lo sviluppo neoplastico. → EFFETTI INDIRETTI: Danno causato dalla risposta immunitaria dell’ospite (meccanismi immunopatogenetici)→ questi danni possono essere su BASE INFIAMMATORIA, causata da IMMUNOCOMPLESSI CIRCOLANTI o da PROCESSI AUTOIMMUNITARI DANNI PROVOCATI DAL VIRUS ALL’ OSPITE → PATOGENICITA’ o POTENZIALE PATOGENO: capacita di un virus di determinare lesioni in vivo o una malattia clinicamente valutabile→ particolare tipo di potenziale e quello oncogeno. → VIRULENZA: descrive una caratteristica di un singolo isolato virale ed e riferita alla quantita di virus necessaria a determinare un peculiare evento o alla capacita e velocita replicativa (carica virale necessaria per causare un effetto patologico). → PERSISTENZA: Molte infezioni virali si risolvono spontaneamente in seguito alla fase acuta poiche il sistema immunitario una volta attivato elimina il virus efficacemente, alcune infezioni virali invece possono persistere a lungo anche tutta la vita (con manifestazioni sintomatiche o non). Una particolare forma di persistenza e la LATENZA (HIV, virus erpetici). PENETRAZONE E DIFFUSIONE DEI VIRUS  EPIDEMIOLOGIA DELLE INFEZIONI VIRALI EPIDEMIOLOGIA: Studio dei parametri che sono alla base e che spiegano l’incidenza di una malattia in una popolazione (non solo malattie infettive). Ha importanti applicazioni nella comprensione delle dinamiche di popolazione e del successi di strategie di intervento per il controllo delle malattie (es. vaccinazioni). Parametro importante: CONTAGIOSITA’ per stimare la diffusione di un virus. Dipende da vari fattori: via di trasmissione, frequenza di individui suscettibili nella popolazione, variabilita a livello del singolo ospite (genica e comportamentale). La contagiosita si esprime come il tasso di riproduzione di base R0 , ossia il numero medio di nuove infezioni causate da un individuo infetto (sintomatico o non). HERPESVIRIDAE Questa famiglia fa parte della prima classe nella classificazione di Baltimore essendo virus a dsDNA con envelope, include numerosi patogeni eumani di grande rilevanza clinica che possono causare infezioni LITICHE, PERSISTENTU E LATENTI CON PERIODICA RIATTIVAZIONE HERPESVIRUS UMANI  STRUTTURA E COMPOSIZIONE → Virione rotondeggiante → Virione di grandi dimensioni (150-259 nm) → Possiedono la matrice e l’ envelope GENOMA → dsDNA LINEARE di grandi dimensioni (120-200 kpb) → Presenta delle sequenze di basi ripetute sia agli estremi che internamente che dividono il genoma in 2 segmenti (UL, regione lunga e US, regione breve), legati covalentemente → I segmenti sono orientati in maniera differente nelle varie sottofamiglie dando origine a diverse isoforme (isomeri) → Codifica per ca 100 proteine, di cui 30-40 sono strutturali (nucleocapside e pericapside) REPLICAZIONE Il virus inizia l’ infezione tramite la fusione del pericapside con la memebrana della cellula infettata e rilascia nel citoplasma il capside virale. Il capside virale migra verso il nucleo, dove rilascia il DNA che circolarizza dando inizio all’ espressione dei geni E precoci adibiti alla replicazione del DNA virale tramite un meccanismo detto a CERCHIO ROTANTE. Successivamente vengono espressi i geni L tardivi che porteranno alla sintesi delle PROTEINE STRUTTURALI, le quali vengono assemblate insieme al DNA per dare origine ai nuovi capsidi. I capsidi virali di neoformazione, che si trovano nel nucleo, migrano verso la membrana cellulare, dove insieme a proteine tardive (a-TIF nel caso di HVS-1) verranno avvolti nel pericapside e rilasciati all’ esterno per gemmazione dal Golgi. Nel nucleo il DNA virale viene trascritto da una RNA pol-DNA dipendente cellulare con la partecipazione sia di fattori virali che cellulari. I geni virali sono espressi in un processo «a cascata» di regolazione temporale. L’interazione tra questi fattori DETERMINA SE L’INFEZIONE SARA LITICA/PRODUTTIVA, PERSISTENTE O LATENTE. Se l’ infezione e latente→ Le cellule limitano la trascrizione a pochi geni specifici, bloccando la replicazione del genoma virale. Se l’ infezione e produttiva→ il genoma virale e replicato da una DNA polimerasi codificata dal genoma virale (importante bersaglio di farmaci antivirali). TRASCRIZIONE RNA VIRALE Il DNA dei virus erpetici e trascritto in RNA da enzimi cellulari (RNA polimerasi DNA-dipendente). La trascrizione di alcuni geni tuttavia dipende da fattori nucleari della cellula e da proteine virus specifiche. Questo controllo trascrizionale determina sel’infezione della cellula porti alla: → Produzione di nuova progenie virale con successiva morte della cellula (infezione litica)→ il virus neoprodotto si accumula nel citoplasma ed e rilasciato per lisi della cellula → Gemmazione persistente del virus senza morte cellulare (infezione persistente)→ il virus assemblato esce per la via esocitosica e puo passare anche attraverso le giunzioni intercellulari → Infezione latente→ il virus esprime proteine di latenza che inbiscono la replicazione del DNA virale e quindi si instaura una infezione latente. REPLICAZIONE A CIRCOLO ROTANTE Replicazione a circolo rotante con la formazione di CONCATENAMERI (piu genomi equivalenti uniti covalentemente a formare molecole lineari molto lunghe). Il DNA sotto forma di concatenameri viene tagliato durante l’impacchettamento per generare le unita genomiche incapsidate. Il DNA viene replicato ad opera di DNA polimerasi virale (bersaglio farmaci) mediante un meccanismo a circolo rotante perche il DNA lineare presenta ridondanza terminali che ne permettono la circolarizzazione. HERPES SIMPLEX VIRUS HSV-1 E HSV-2 (fanno parte della sottofamiglia alfa- virinae HSV-1, HSV-2 E VZV) → “Herpes” dal greco herpein, “strisciare - insinuarsi” (Ippocrate) (lesioni descritte fin dall’antichita) → HSV: primo a essere identificato nell’uomo, presenta 2 tipi (HSV-1 e HSV-2) → Estremamente diffusi fra la popolazione umana → Crescono rapidamente e hanno elevata attivita citolitica → Induce la formazione di vescicole prima separate e poi unite a grappolo → Responsabili di numerose malattie (gengivo-stomatite, cherato-congiuntivite, encefalite, malattia genitale, infezioni neonatali, ecc) → Responsabili delle infezioni latenti nelle cellule nervose SIMILITUDINI→ HSV-1 e HSV-2 possiedono genomi simili ed omologie nella sequenza, possiedono inoltre determinanti antigenici e tropismo tissutale in comune. La loro reazione avviene in maniera crociate in sierologia. DIFFERENZE→ possiedono delle proteine esclusive per ciascun tipo, HSV-1 si trasmette per via orale e HSV-2 per via genitale, possiedono inoltre un quadro clinico diverso con manifestazioni epretiche orali per HSV-1 ed erpete genitale per HSV-2  VIRUS DELL’ HERPES SIMPLEX HSV Proprieta: i virioni sono costituiti da → CORE che contiene DNA virale → CAPSIDE icosaedrico (62 capsomeri) → MATRICE O TEGUMENTO di natura proteica che avvolge il capside → ENVELOPE che contiene 12 proteine virali Genoma → Il DNA e formato da due segmenti UL e US (con 4 isoforme) → Codifica per 81 proteine tra cui diversi ENZIMI DNA polimerasi-DNA dipendente Deossiribonucleasi Timidina chinasi che fosforila i deossiribonucleotidi necessari per la replicazione Ribonucleotide reduttasi che converte i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi varie proteasi LA DNA POLIMERASI(aciclovir e zovirax) E LA RIBONUCLEOTIDE REDUTTASI SONO BERSAGLI DI FARMACI (perché sono differenti dai loro corrispondenti cellulari) → Tra le proteine tardive abbiamo 8 glicoproteine virali dell’envelope, molte coinvolte nell’escape dal sistema immunitario gD: il piu potente induttore di anticorpi neutralizzanti gC: glicoproteina che si lega alla proteina del complemento C3b diminuendone la concentrazione nel siero e ostacolando le conseguenti reazioni immuni (lisi dei virioni) gE e gI (recettore), si legano alla porzione Fc di IgG. In questo modo le IgG nascondono il virione alla ricognizione del sistema immunitario gG: e specifica per il tipo e permette la discriminazione antigenica tra HSV-1 (gG-1) e HSV-2 (gG-2) CICLO REPLICATIVO INGRESSO DELLA CELLULA BERSAGLIO: Le proteine virali coinvolte sono gC, gB, gD, gH e Gl, il recettore cellulare e rappresentato da proteine di natura glicoproteica (eparansolfati) presenti in un vasto numero di tipi cellulari (ampio tropismo). Ad esempio recettori TNF e Nectine CICLO LITICO 1. Attacco delle proteine virali gC, gD e gH ai recettori della cellula bersaglio 2. Fusione con la membrana citoplasmatica e rilascio del capside nel citoplasma 3. Trasporto del capside ad un poro nucleare per il rilascio del DNA virale nel nucleo della cellula 4. Trascrizione dei geni precoci immediati che promuovono a loro volta la trascrizione dei geni precoci e proteggono il virus dell'immunita innata 5. Trascrizione degli mRNA virali precoci dalle RNA polimerasi due cellulare, che codificano per proteine coinvolte nella replicazione del DNA virale 6. Inizio della replicazione a circolo rotante 7. Sintesi dei concatenamenti lineare (molteplici copie del DNA virale) 8. Trascrizione dei geni tardivi che codificano le proteine strutturali del virus 9. Assemblaggio del virus nel nucleo della cellula ospite e gemmazione della membrana nucleare al reticolo endoplasmatico verso il citoplasma. Qui si associano le proteine della matrice al capside che Gemma nell'apparato di golgi per acquisire il pericapside con le proteine glicosilata 10. Fuoriuscita dei prioni maturi tramite lisi cellulare  LATENZA Le particelle virali possono infettare i neuroni dove sono espresse solo le proteine precocissime, non c'e effetto citopatico, anche se proteine precocissime sono evidenziabili tramite immunofluorescenza. COME MAI SI INTERROMPE LA LATENZA E SI HA RIATTIVAZIONE? avviene sotto stress immunosoppressione, raggi UV o fattori ormonali che permetto al virus di migrare attraverso trasporto anterogrado dal ganglio lungo i nervi periferici. Cio causa una lesione nell'area di cute innervata da un singolo nervo spinale posteriore , chiamata infezione ricorrente nello stesso sito. MECCANISMI PATOGENETICI DELL’ HERPES SIMPLEX HSV-1 E HSV-2 → ALTERAZIONI ANATOMO PATOLOGICHE: ne consegue una risposta infiammatoria dell’ ospite Azione citolitica del virus Necrosi delle cellule → MODIFICAZIONI ISTOPATOLOGICHE Rigonfiamento delle cellule infette Produzione di corpi inclusi intranucleari Condensazione della cromatina nucleare→ degenerazione dei nuclei Formazione di cellule giganti multinucleate → CONTEMPORANEAMENTE ALLA LISI CELLULARE: comparsa di fluido chiaro il liquido vescicolare → GUARIGIONE Riassorbimento del liquido con formazione di croste Nelle mucose le vescicole vengono sostituite da ULCERE poco profonde PATOGENESI HERPES SIMPLEX HSV-1 E HSV-2 L'ingresso del virus avviene tramite contatto diretto attraverso le ferite i virus erpetici infettano cellule epiteliali e mucose o linfociti icone un'INFEZIONE LITICA. Sulla cute e sulle mucose si manifesta con un'area rossastra caratterizzata da vescicole piene di virus il quale e infettivo in ambiente umido. → INFEZIONE LATENTE→ Il virus prodotto nella lesione puo infettare i neuroni tramite i nervi periferici che servono la zona lesa attraverso i nervi tramite trasporto retrogrado migra nel ganglio dove puo rimanere per anni prima di riattivarsi → INFEZIONE PERSISTENTE→ HSV-1 e HSV-2 possono infettare persistentemente macrofagi e linfociti INFEZIONI PRIMARIE HSV-1 L’ infezione avvien attraverso lesione della cute (erpete labiale) che continuano nella mucose (gengivo- stomatite erpetica), nella maggior parte dei casi non si ha manifestazione clinica. Si contrae per contatto diretto o tramite oggetti contaminati. La replicazione del virus avviene nella sede dell’ infezione, vi e un invasione delle terminazioni nervose locali, vi e un trasporto per via assonale ai gangli radicolari dorsali con una fase di latenza nei gangli trigeminali (il nervo del trigemino collega il ganglio di gasser alla branca mascellare, b ranca mandibolare e branca oftalamica). INFEZIONI PRIMARIE HSV-2 HSV-2 e responsabile dell’ erpete genitale, la localizzazione di questo erpete si trova quindi nella cute e nelle mucose genitali, la trasmissione avviene per via sessuale e puo essere contratto anche da un neonato. Durante la replicazione vi e una fase di latenza nei gangli dorsali. DOPO LA RIPRODUZIONE Il virus torna nel sito iniziale di infezione e puo rimanere inapparente o causare lesioni vescicolari che in futuro si rimargineranno senza lasciare la cicatrice.  RICORRENZA E RIATTIVAZIONE La ricorrenza puo essere causata da: → Stress emozionali → Stress fisico → Traumi → Febbre → Ciclo mestruale → Esposizione alla luce solare → Cibi speziati In questo caso il virus migra a ritroso lungo il nervo, causando lesioni a livello cutaneo o mucoso. La riattivazione e solitamente meno importante e di minore durata rispetto agli episodi primari grazie alla MEMORIA IMMUNITARIA ovvero→ IMMUNITA’ ADATTIVA INFEZIONI LATENTI Dipendono dallo stato di integrita del sistema immunitario → Per soggetti sani: infezione facilmente dominata → Per soggetti immunocompromessi: forma sintomatica grave La frequenza delle riattivazioni e CORRELATA dalla gravita dell’ infezione primaria e al numero di neuroni infettati latentemente Le infezioni RICORRENTI rappresentano ulteriori fonti di virus in grado di migrare centripetamente e colonizzare ulteriori neuroni Gli anticorpi circolanti che si riproducono non hanno influenza sull’ evoluzione e frequenza delle manifestazioni cliniche ovvero che la presenza o la riproduzione degli anticorpi non modifica la gravita o la frequenza dei sintomi associati a una malattia. In altre parole, il sistema immunitario potrebbe essere attivo nel produrre anticorpi, ma cio potrebbe non tradursi necessariamente in un cambiamento delle manifestazioni cliniche. EPIDEMIOLOGIA E TRASMISSIONE PER HSV-1 E HSV-2 Il virus HSV e labile ovvero piu suscettibile agli agenti esterni che possono comprometterne l'integrita o la capacita di infettare le cellule ospiti, infatti viene inattivato in ambiente secco, da detergenti e nel tratto gastro intestinale. Questo virus e trasmesso dai liquidi delle vescicole, salive e secrezioni vaginali METODO DI CONTAGGIO HSV-1: il virus penetra attraverso una lesione HSV-2: eliminazione del virus dalla cervice con le perdite vaginali → Contatto orale → Contatto sessuale → Baci → Autoinoculazione → Bicchieri → Madre-feto → Spazzolini → Saliva → Dita → Cute Le infezioni da HSV-1 and -2 una volta acquisite sono per tutta la vita. Anche se il virus entra rapidamente in latenza, l’individuo infettato può infettare altri individui come conseguenza della riattivazione dell’infezione  MALATTIA ORO-FARINGEA L’HSV-1 determina normalmente l’infezione primaria nei bambini tra il 6° mese e il 3° anno di vita. L’infezione primaria con HSV-1 e di solito asintomatica, ma in una percentuale di casi, variabile dal 15 al 20%, si instaura una gengivostomatite con la formazione sulla mucosa orale delle caratteristiche vescicole erpetiche accompagnate da linfoadenite regionale e rialzo febbrile. Il periodo di incubazione e piuttosto breve (variabile da 4 a 12 giorni) e le manifestazioni cliniche durano circa 2-3 settimane. Le malattie ricorrenti, la piu frequente delle quali e l’erpete labiale, sono caratterizzate dalla comparsa di vescicole sulle labbra, e piu precisamente nella zona di confine tra la mucosa labiale e l’epidermide che la circonda. HERPES LABIALE → FASE PRODOMICA: 1° e 2° giorno con formicolio → FASE DELL’ ERITEMA: 2° e 3° giorno con prurito e arrossamento → FASE DELLE VESCICOLE: 4° giorno con comparsa di vescicole acquose → FASE ULCEROSA: 5° e 6° fase ulcerosa → FASE DELLA CROSTA: 8° e 10° giorno con inizio del processo di guarigione CHERATOCONGIUNTIVITE CON INFEZIONE DELLA CORNEA Principalmente associata a HSV-1→ la sede dell’infezione primaria da HSV-1 e localizzata agli occhi. Le lesioni oculari provocano la comparsa di ulcere corneali oppure di vescicole palpebrali. In seguito a ripetuti episodi ricorrenti si puo assistere a un progressivo interessamento dello stroma corneale con comparsa di cicatrici permanenti, opacizzazione della cornea e cecita. INFEZIONI CUTANEE La localizzazione primaria dell’erpete puo interessare in alcuni casi solo la cute, senza cointeressamento delle mucose (eczema erpetico). Vanno ricordate le infezioni delle dita (patereccio erpetico) e le infezioni del corpo (erpete dei gladiatori, così chiamato poiche si contrae durante la lotta)→ le recidive tendono a colpire sempre lo stesso punto e a divenire sempre piu dolorose. HERPES NEONATALE E una malattia devastante che viene contratta in utero ma piu frequentemente durante il parto→ in assenza di risposta immunitaria cellulo-mediata, il neonato non e in grado di contrastare la replicazione e la diffusione del virus, per cui l’HSV invade gli organi profondi quali fegato, polmoni, reni e anche il sistema nervoso. Il decorso e generalmente fatale, ma in caso di risoluzione si manifestano gravi sequele neurologiche permanenti→ circa il 75% dei casi di herpes neonatale e causato da HSV-2. ENCEFALITE ERPETICA L’encefalite da HSV-1 e a esordio acuto accompagnato da febbre elevata, le manifestazioni cliniche sono conseguenza dell’interessamento di un solo lobo temporale, che va incontro a distruzione tissutale con comparsa di pleiocitosi (prevalentemente linfocitica) nel liquido cerebrospinale, anomalie neurologiche focali, attacchi epilettici e altri segni clinici legati all’encefalite virale. Le infezioni da HSV-1 sono le cause piu frequenti di encefalite sporadica, che presenta un elevato indice di mortalita, e in caso di risoluzione si hanno spesso gravi sequele neurologiche. SOGGETTI A RISCHIO DI CONTRARRE INFEZIONI SA HSV → HSV-1 molto comune soprattutto nei bambini → HSV-2 persone attive sessualmente → RISCHIO PROFESSIONALE : medici, infermieri, dentisti, ginecologi, persone a contatto con secrezioni orali e genitali → SOGGETTI IMMUNODEPRESSI E NEONATI  DIAGNOSI → SU CELLULE PRELEVATE DALLE LESIONI: Colorazione istochimica su cellule prelevate alla base della lesione (sincizi e corpi di inclusione Coundry tipo A) Immunofluorescenza con anticorpi tipo –specifici → SU CAMPIONE BIOPTICO PRELEVATO DALLE LESIONI: Isolamento virus dalle lesioni virali mediante crescita in coltura cellulare PCR/Real Time PCR → SIEROLOGICA: Gli anticorpi anti-HSV compaiono entro la prima settimana dell’infezione e possono essere ricercati tramite varie metodiche→ questi anticorpi persistono per tutta la vita del paziente, per cui sono utili per la diagnosi di un’infezione primaria. Le infezioni ricorrenti non sono accompagnate da un significativo aumento del titolo anticorpale. TERAPIA Antibiotici analoghi dei nucleosidi ACYCLOVIR molto selettivi in quanto devono essere fosforilati da TIMIDINA CHINASI virale (TK). Attivi solo sul virus in replicazione e non in latenza, grazie alla sua selettivita, l’ACV non e tossico, e particolarmente efficace nel trattamento delle svariate manifestazioni cliniche della malattia e puo essere utilizzato anche a scopo profilattico. Possono tuttavia insorgere fenomeni di resistenza in seguito a mutazioni nei geni virali codificanti i suddetti enzimi, che causano una diminuita conversione dell’ACV nella sua forma attiva→ Presentano un meccanismo d’azione simile all’ACV il VALACICLOVIR, il PENCICLOVIR e il FAMCICLOVIR, sebbene dotati di proprieta farmacologiche differenti. La VIDARABINA sembra essere efficace contro l’herpes neonatale e l’encefalite erpetica, ma essendo piu tossica dell’ACV il suo impiego e limitato nei casi in cui insorgano forme di resistenza all’ACV. Infine, per il trattamento topico della cheratite erpetica sono stati recentemente approvati la IODEODOXURIDINA, la TRIFLURIDINA e in alcuni Paesi la TROMANTADINA, un derivato dell’AMANTADINA. VIRUS DELLA VARICELLA ZOSTER VZV E un unico agente che causa due sintomi ovvero la VARICELLA e l’ HERPES ZOSTER riguardo alle lesioni, la patogenesi e la patologia ci sono delle somiglianze con l’ HSV PROPRIETA’→ dal punto di vista morfologico e identico all’ HSV le differenze vi sono nelle dimensioni, essendo piu piccolo, lo spettro d’ ospite e piu ristretto essendo che infetta solo CELLULE EPITELIALI , la replicazione possiede una velocita maggiore con formazione di corpi inclusi intranucleari. TRASMISSIONE→ La trasmissione avviene per VIA RESPIRATORIA, il ciclo di replicazione e simile all’ HSV e l’ infezione LATENTE avviene nelle RADICI DORSALI o nei GANGLI DEI NERVI CRANICI. Solo l’ HERPE ZOSTER ha una RIATTIVAZIONE MECCANISMI PATOGENETICI DELLA VARICELLA 1. Penetrazione attraverso vie respiratorie o congiuntiva 2. Attraverso i linfonodi regionali raggiunge il circolo sanguigno 3. Replicazione in cellule endoteliali localizzate nella cute e nelle mucose 4. Formazione di VESCICOLE ovvero dei rigonfiamenti di cellule epiteliali, degenerazione balloniforme, accumulo di liquido interstiziale 5. Si formano corpi EOSINOFILI nei nuclei delle cellule infette 6. La GUARIGIONE CLINICA e rapida e da solo RARAMENTE delle complicazioni come l’ ENCEFALITE ERPETICA  MECCANISMI PATOGENETICI ZOSTER Questo virus si contrae solo in eta adulta anche se i pazienti affetti lo possono trasmettere a bambini suscettibili. Le lesioni cutanee sono identiche a quelle della varicella, sono presenti infiammazioni cutanee dei gangli sensoriali che spesso interessano un solo ganglio→ in generale la distribuzione cutanea delle lesioni corrisponde ad un’ unica RADICE GANGLIARE DORSALE. Il forte declino dell’ immunita causa la riattivazione dove il virus inizia la replicazione in un ganglio e attraverso le terminazioni giunge alla cute IMMUNITA’ E ANTICORPI→ gli anticorpi sono importanti perche permettono di limitare l’ infezione durante la fase viremica, l’ immunizzazione avviene con immunoglobuline specifiche VZIG e conferisce protezione se somministrate entro 5 giorni. L’ immunita cellulo-mediata e IMPORTANTE per controllare il decorso dell’ infezione e la risoluzione della malattia→ negli anziani sono piu numerosi gli episodi di ricorrenza. D’ altra parte negli adulti una risposta immunitaria troppo energica puo provocare un danno cellulare piu esteso e un quadro clinico piu grave. GUARIGIONE→ La guarigione dalla varicella e rapida ma il virus persiste in forma latente per tutta la vita nelle radici dorsali dei gangli nervosi dai quali puo riattivarsi e dare origine ad una manifestazione secondaria (herpes-zoster)→ da qui viene rilasciato lungo l’intera via nervosa e infetta la cute (rash cutaneo) MANIFESTAZIONI CLINICHE VARICELLA E HERPES ZOSTER VARICELLA: → Malattia non grave dell’infanzia → Forma subclinica: rara → Incubazione: 1-3 sett. → Eritema maculo-papulare prima al tronco poi al viso, arti e mucose del cavo orale → Vescicole si trasformano in pustole (12-14 gg) e poi croste → Complicanza: polmonite interstiziale in adulti, specie se compromessi (15-25%) ZOSTER → Riattivazione in uno o piu gangli sensoriali con infezione nella zona innervata → Gangli interessati: cervicale, toracici e lombo-sacrali → Le vescicole limitate in un dermatomero → Es.: zoster oftalmico con complicazione di nevralgia posterpetica → Forma disseminata: in pazienti immunocompromessi → FUOCO DI S. ANTONIO TERAPIA E PROFILASSI → Prevista solo in pazienti immunocompromessi con infezione da VZV o da zoster → Non e previsto trattamento per bambini → La DNA polimerasi del virus VZV e molto meno sensibile ai farmaci rispetto all’enzima di HSV → Disponibile un vaccino costituito da virus vivo attenuato DIAGNOSI ED IMMUNITA’ ISOLAMENTO: Viene effettuato direttamente dal liquido delle vescicole in colture cellulari → EFFETTO CITOPATICO: sincizi con cellule giganti multinucleate e corpi intranucleari → Vengono utilizzati anticorpi fluorescenti diretti per osservazione da raschiamento delle lesioni → Si usa la PCR per ricercare il DNA virale nel liquido delle vescicole, nelle croste, nel materiale bioptico e per rilevare il titolo anticorpale si usa l’ immunofluorescenza diretta, ELISA IMMUNITA’: l’ infezione da VARICELLA conferisce immunita per tutta la vita mentre l’ immunita per lo ZOSTER si puo avere in presenza di anticorpi neutralizzanti verso la varicella  CMV, HHV-6, HHV-7(fanno parte della sottofamiglia beta-virinae) CITOMEGALOVIRUS O HHV-5 → Come mai si chiama così? Le cellule che infetta appaiono ingrossate con una voluminosa inclusione nucleare e citoplasmatica. → Chi infettano? Numerosi vertebrati e sono strettamente SPECIE-SPECIFICI → Come è l’ infezione? Quasi sempre asintomatica ed e molto diffusa, quella primaria si acquisisce nella prima infanzia (La diffusione dell'infezione asintomatica puo essere influenzata da vari fattori, tra cui la virulenza del patogeno, le caratteristiche dell'ospite e le misure di prevenzione adottate nella comunita) → Durata? L ’infezione attiva si puo mantenere per lunghi periodi con eliminazione del virus attraverso la saliva e le urine → Tipo di infezione? Infezione di tipo OPPORTUNISTICO perche causa raramente sintomi in ospiti immunocompromessi, ma e causa di gravi malattia in persone immunodeficienti come i pazienti affetti da AIDS o i neonati PROPRIETA’ DEL VIRUS → Herpesvirus con diametro maggiore (fino a 250 nm) → Genoma piu grande (240 Kbp) → Capside isosaedrico di 162 capsomeri → Tegumento elettrodenso (capacita di questo strato di essere ben visibile al microscopio elettronico) → Envelope con le glicoprotine gB e gH che servono da antirecettori → Si replica solo in fibroblasti umani molto lentamente (8 – 14 giorni) → Effetto citopatico caratteristico(alterazioni o danni che un virus puo causare alle cellule ospiti durante il processo di infezione): tipiche inclusioni intranucleari (come altri herpes) e inclusioni citoplasmatiche, “occhio di civetta” → In circolazione diversi ceppi geneticamente differenti, ma sufficientemente imparentati → Non interrompe le sintesi macromolecolari dell’ospite, ma stimola la sintesi di DNA e RNA cellulari, quindi le cellule non sono uccise → Latenza dopo infezione primarie serbatoio di virus→ cellule endoteliali, leucociti del sangue periferico (monociti in particolare) cellule del midollo osseo, nei trapiantati anche nel rene  EPIDEMIOLOGIA Il CMV è tramesso per: → Via congenita (trasmissione di un'infezione da madre a figlio durante la gravidanza, il parto o attraverso il latte materno) Tipo di infezione per categorie: → Via orale → Via sessuale NEONATI → In seguito a trasfusioni → Transplacentare → In seguito a trapianti d’ organo → Intrauterina → Secrezioni cervicali → Infezione perinatale (infezione che colpisce il neonato durante il periodo che comprendente la fase finale della gravidanza, il travaglio Il CMV può essere presente in : del parto e le prime ore o settimane dopo la nascita.) → Urine BAMBINI → Sangue → Secrezione corporea → Gargarizzato → Latte materno → Saliva → Saliva → Lacrime → Lacrime → Feci → Urine → Liquido seminale → Liquido amniotico ADULTI → Secrezioni vaginali e cervicali → Trasmissione sessuale → Tessuti utilizzati per trapianti → Trasfusioni di sangue → Trapianto d’ organi CENNI DI PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE RIATTIVAZIONE: si ha dopo l’ infezione primaria nelle cellule ematiche mononucleate, si puo osservare a qualsiasi eta. Nei trapianti d’ organo si ha il fenomeno del RIGETTO mentre nelle donne in gravidanza e silente e raramente la RIATTIVAZIONE porta un danno fetale  DIAGNOSI 1. ISOLAMENTO → virus instabile, per cui per l’isolamento necessario un insemenzamento rapido su fibroblasti embrionali umani → isolato da: saliva, liquido di lavaggio bronco-alveolare, urina, ecc. → effetto citopatico lento (10-14 gg): foci di infezione con cellule rigonfie, trasparenti, grandi inclusioni intranucleari 2. TECNICHE RAPIDE → dimostrazione diretta di antigeni virali nei leucociti del sangue (antigene pp 65 del tegumento) → impiego di anticorpi monoclonali diretti contro antigeni immediati precoci (p72/p86) in fibroblasti → Sonde di DNA e PCR: per identificazione diretta del virus nei tessuti e fluidi → Ricerca di anticorpi: test di neutralizzazione, ELISA, fissazione del complemento DIAGNOSI INFEZIONI CONGENITE→ Eliminazione con le urine di grandi quantita di virus Dimostrazione diretta di virus nei sedimenti urinari Ricercando antigeni specifici con EIA o osservazione al ME HHV-6 → Quando fu isolato per la prima volta? Nel 1986 da cellule linfoblastoidi periferiche in pazienti affetti da disordini linfoproliferativi in corso di AIDS → Cosa lo differenzia dagli altri herpesvirus? Tramite caratteri biologici, antigenici e organizzazione del genoma → Il virus e essenzialmente T-linfotropo (ha un’ affinita per le cellule T del sistema immunitario provocando sincizi e uccisione delle cellule) → Il virus infetta anche monociti e cellule NK → Caratteristiche del genoma? DNA e di circa 160-170 Kbp e composizione media di 43-44% di G+C → Similitudini con CMV? L’arrangiamento genetico del genoma assomiglia a quello del CMV → Quante varianti ci sono? Identificate due distinte varieta HHV-6A e HHV-6B → Dove è presente il virus? Se il virus presente nella saliva sono infettate le cellule dell’orofaringe → Quali cellule vengono infettate in maniera latente? Non noto → Qual’ è il recettore cellulare per il virus? Il CD46 umano, una glicoproteina che appartiene ad una famiglia di regolatori dell’attivazione del complemento → È un virus molto diffusivo? L’infezione e estremamente diffusa (oltre il 90% degli adulti possiede anticorpi) → Quando si acquisisce? L’infezione si acquisisce nella prima infanzia → Responsabile della Roseola infantum o Esantema subitum (VI malattia) (variante HHV6B) → Correlazioni? Forse ruolo in sclerosi a placche e epatite a cellule sinciziali giganti → Si può riattivare? L’infezione si puo riattivare in seguito a deficit immunitario in particolare in AIDS HHV-7 → Prima identificazione? Nel 1990 nelle cellule mononucleate del sangue periferico di un soggetto sano → Dove è presente? Nella saliva umana → Qual’ è il recettore cellulare per il virus? Il virus ha stretto tropismo per i linfociti T CD4+→ la molecola di CD4 rappresenta il recettore specifico → Quando si acquisisce? L’infezione si acquisisce nella prima infanzia → È un virus molto diffusivo? L’infezione e diffusa, oltre il 90% dei soggetti adulti ha anticorpi → La patologia della prima infanzia non e chiara, sintomatologia clinica indistinguibile dalla Roseola infantum → Si può riattivare? Riattivazione frequente, ma silente  EBV O HHV-4 e KSHV O HHV-8(sottofamiglia gamma-herpesvirinae) VIRUS DI EPSTEIN-BARR O HHV-4 → Quando fu scoperto? Nel 1964 da Epstein e Barr analizzando in microscopia elettronica delle biopsie linfonodali prelevate da adolescenti centroafricani con linfoma di Burkitt. → È un virus molto diffuso? Si essendo un virus ubiquitario, oltre il 90% della popolazione adulta e sieropositiva per EBV. → Genoma? Genoma grande (184 kpb codificante circa 75-80 proteine) PATOLOGIE CORRELATE 1. MONONUCLEOSI INFETTIVA Responsabile della MONONUCLEOSI INFETTIVA, una malattia tipica dei giovani adulti. Di solito nell’infanzia e asintomatica. MANIFESTAZIONI CLINICHE→ La malattia si manifesta con febbre, faringite, ingrossamento dei linfonodi, splenomegalia, alterazioni delle funzioni epatiche. TRASMISSIONE→ EBV viene trasmesso attraverso le secrezioni faringee, spesso tramite scambio di saliva: Bacio (adolescenti/adulti) o con contatti all’interno della famiglia o negli asili (spesso attraverso oggetti: posate, piatti, bicchieri, giocattoli, etc.) E il risultato di una “guerra civile” tra le cellule infettate da EBV e le cellule T ad azione protettiva. Periodo di incubazione 30-40gg colpisce bambini, adolescenti e adulti. COMPLICANZE NEUROLOGICHE : meningoencefalite asettica la sindrome di Guillan-Barre 2. LINFOMA DI BURKITT→ cofattori malaria e predisposizione genetica, tumore dei ragazzi africani in AREE MALARICHE, le cellule tumorali presentano sequenze di DNA che esprimono Ag VIRALI COME L’ EBNA1 che possono causare traslocazione cromosomiale PATOGENESI: A. Attivazione policlonale dei linfociti B, proliferazione e immortalizzazione B. Blocco della differenziazione a plasmacellula C. Attivazione policlonale dei linfociti B, soppressione dei linfociti T D. Traslocazione cromosomica, attivazione c-myc CON CELLULA TUMORALE E. L’ oncogene c-myc presente sul cromosoma 8 viene trasferito al cromosoma 14 in prossimita dei geni che codificano per le catene pesanti delle immunoglobuline 3. LINFOMA DI HODKIN 4. CARCINOMA NASOFARINGEO→ predisposizione genetica ed alimentazione ma piu diffuso in Cina 5. LEUCOPACHIA ORALE CAPELLUTTA→ lesioni della bocca , un infezione opportunistica che si puo verificare in malati di AIDS o persone che hanno subito un trapianto 6. DISORDINI LINFOPROLIFERATIVI INSOTTI DA EBV→ linfomi in pazienti senza cellule T, malattia linfoproliferativa legata al cromosoma X, disordini linfoproliferativi post trapianto PTLD PROPRIETA’ DEL VIRUS La sede di entrata del virus sono le cellule epiteliali della faringe, dove si instaura un’infezione produttiva→ da qui il virus viene trasmesso ai linfociti B, dove instaura un’infezione non produttiva (latenza). Dopo l’infezione primaria, puo dar luogo a un’infezione persistente che puo durare alcuni anni. Il soggetto infetto anche se asintomatico funziona da sorgente di infezione. Il genoma virale e presente in forma circolare episomiale all’interno del nucleo (virus il cui materiale genetico si puo mantenere autonomamente all'interno della cellula ospite come un episoma, senza integrarsi nel genoma cellulare. Questa caratteristica permette al virus di persistere nella cellula ospite senza necessariamente causare una replicazione virale attiva o danni cellulari) RECETTORE CELLULARE PER L’ EBV→ CD21: espresso principalmente sulla superficie dei linfociti B, che sono un tipo di cellula del sistema immunitario coinvolta nella produzione di anticorpi. L'EBV e noto per infettare i linfociti B. Quando il virus entra in contatto con le cellule bersaglio, si lega al recettore CD21 con il corecettore MHC II presenti sulla superficie dei linfociti B delle cellule dell’ epitelio oro- e naso-faringe, cellule dendritiche follicolari, cellule della cervice uterina ANTIRECETTORE VIRALE→ glicoproteine dell’envelope PATOGENESI ED IMMUNITA’ La malattia da EBV risulta o da una RISPOSTA IMMUNITARIA IPERATTIVA (mononucleosi infettiva) o dalla MANCANZA DI UNA RISPOSTA IMMUNITARIA EFFICACE (linfoma, leucoplachia orale capelluta) L’ infezione produttiva delle cellule B e delle cellule epiteliali dell’ orofaringe e delle tonsille, promuove la liberazione del virus nella saliva per trasmettere il virus ad altri ospiti e stabilisce una viremia per diffondere il virus ad altre cellule B nel tessuto linfatico e sangue L’infezione da EBV presenta tre potenziali decorsi che lo differenziano da altri herpesvirus: 1. Replica in linfociti B o nelle cellule epiteliali delle cripte tonsillari permissive per la sua replicazione 2. Va incontro a un’infezione latente nei linfociti B in presenza di linfociti T CD8+ immunocompetenti che controllano la sua replicazione 3. Puo immortalizzare i linfocitiB. Il genoma di EBV codifica per 75-80 proteine espresse in relazione al tipo di infezione. Normalmente EBV, una volta entrato in un linfocita B quiescente, va incontro a latenza prima di iniziare un ciclo litico, mantenendosi in forma episomale con proprieta simili al DNA cromosomale. Durante le fasi iniziali dell’infezione, nelle cellule permissive EBV esprime un potente fattore trascrizionale, ZEBRA, che attiva la trascrizione dei geni virali immediati precoci che controllano il ciclolitico. L’attivazione del programma litico in vivo inizia quando, tramite meccanismi non ancora chiariti, vengono espressi due geni immediati precoci (IE, immediate early) designati BZLF1 e BRLF1, che codificano per proteine ad attivita trascrizionale che regolano l’espressione di geni virali precoci (E, early). In seguito alla sintesi della DNA polimerasi vengono espressi i geni tardivi per le proteine strutturali, tra cui quelle che costituiscono il recettore virale. Queste proteine, nelle prime fasi dell’assorbimento, legano il recettore cellulare CD21 e le molecole di classe II del complesso maggiore di istocompatibilita (MHC). Le proteine virali prodotte durante un ciclo litico sono suddivise in 3 gruppi: antigene precoce (EA), antigene del capside virale (VCA) e antigene di membrana. EBV è un mitogeno per le cellule B→ Le proteine del virus attivano la replicazione dei linfociti B prevenendo anche l’apoptosi. I linfociti T citotossici controllano l’infezione da EBV, ma in soggetti immunodepressi (anche pazienti sottoposti a trapianti) EBV puo immortalizzare i linfociti B. Questo fenomeno, insieme ad altri fattori predisponenti puo causare lo sviluppo di linfomi. Dopo la guarigione dell’ infezione viene prodotto un ANTICORPO contro AG nucleari EBNA EBV E TUMORI L’EBV e classificato dall’International Agency for Research on Cancer come agente di tipo 1: agente cancerogeno nell’uomo. In vitro puo infettare ed immortalizzare i linfociti B. La capacita trasformante dell’EBV e tipicamente legata all’espressione delle proteine di latenza: → 6 proteine a localizzazione nucleare EBNA – 1, 2, 3A, 3B, 3C e LP → 3 proteine localizzate sulla membrana LMP1, LMP2A, LMP2B  DIAGNOSI → La diagnosi si basa attualmente: sulla dimostrazione di anticorpi contro le proteine virali precoci, nucleari o del capside virale (ELISA o immunofluorescenza su linfociti paziente) ricerca del genoma con PCR (PCR quantitativa) Non e attualmente disponibile un vaccino efficace Gli antivirali efficaci contro altri herpesvirus non hanno dimostrato alcuna efficacia nella progressione della malattia PREVENZIONE E CONTROLLO → Nessun trattamento (la mononucleosi e benigna soprattutto nei bambini) → Nessun vaccino e disponibile → L’ immunita e duratura dopo l’ infezione KSHV HERPES VIRUS ASSOCIATO AL SAROMA DI KAPOSI O HHV-8 → Prima identificazione? Identificato per l