PCR PDF

H4: PCR Het PCR-principe (Polymerase Chain Reaction) kan als volgt samengevat worden: Ontwikkeling van PCR: ○ In 1983 introduceerde Mullis voor het eerst een primerpaar in een polymerase-reactie. ○ Het doel was aanvankelijk om dNTP’s uit een staal te verwij...

H4: PCR Het PCR-principe (Polymerase Chain Reaction) kan als volgt samengevat worden: Ontwikkeling van PCR: ○ In 1983 introduceerde Mullis voor het eerst een primerpaar in een polymerase-reactie. ○ Het doel was aanvankelijk om dNTP’s uit een staal te verwijderen. ○ Mullis ontdekte dat zijn methode kopieën van het geprimede DNA produceerde, die exponentieel toenamen door opeenvolgende cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie. Denaturatie en de temperatuur: ○ In de denaturatiestap wordt de temperatuur verhoogd tot 94°C, zodat dubbelstrengs DNA (dsDNA) smelt naar enkelstrengs DNA (ssDNA). ○ Het DNA-polymerase denatureert echter bij hoge temperaturen, waardoor Mullis steeds nieuw polymerase-enzym moest toevoegen. Dit maakte de techniek arbeidsintensief en duur. De oplossing met Taq-polymerase: ○ In 1988 werd Taq-polymerase, een thermostabiel enzym, geïntroduceerd, wat de techniek vereenvoudigde en het huidige PCR-protocol mogelijk maakte. ○ Dit leidde tot de moderne PCR, die een revolutie teweegbracht in moleculaire biologie. Het PCR-proces: ○ Denaturatie: De temperatuur wordt verhoogd tot 94°C om het dsDNA in ssDNA te splitsen. ○ Annealing: Primers binden (annealen) aan de specifieke DNA-strengen: De sense (forward) primer bindt aan de ene DNA-streng. De antisense (reverse) primer bindt aan de complementaire DNA-streng. De optimale annealingstemperatuur hangt af van de lengte en samenstelling van de primers. ○ Verlenging: Het DNA-polymerase verlengt de primers van 5' naar 3' richting, bij een temperatuur van 72°C (de optimale temperatuur voor Taq-polymerase). Bij grotere DNA-fragmenten duurt de polymerisatiestap langer. Exponentiële amplificatie: ○ Door herhaalde cycli van denaturatie, annealing en polymerisatie wordt het gewenste DNA-fragment exponentieel vermenigvuldigd. ○ Elke nieuwe DNA-streng dient als template in de volgende cyclus. ○ Een typische PCR-reactie omvat ongeveer 30 cycli. dNTPs: De bouwstenen voor de verlenging van de nieuwe DNA-strengen door het polymerase. Het DNA-polymerase en zijn eigenschappen kunnen als volgt worden samengevat: Taq-polymerase: ○ Oorsprong: Geïsoleerd uit de thermofiele bacterie Thermus aquaticus, die leeft in warme waterbronnen en geisers. ○ Thermostabiliteit: Het is thermostabiel en functioneert optimaal rond 72°C, wat de temperatuur bepaalt voor de polymerisatiestap in PCR. ○ Polymerasesnelheid: 1 tot 2 kb per minuut bij optimale temperatuur. ○ Nadeel: Het heeft geen proofreading-activiteit, wat resulteert in een foutpercentage van 1 fout per 9.000 nucleotiden. ○ A-overhangs: Het creëert 3' A-overhangs wanneer het de template bereikt, wat nuttig is voor cloneren met TA-cloning vectoren. Pfu-polymerase: ○ Oorsprong: Geïsoleerd uit Pyrococcus furiosus. ○ Replicatiegetrouwheid: Het heeft proofreading-activiteit, waardoor het slechts 1 fout per 1.300.000 nucleotiden maakt. ○ Polymerasesnelheid: Trager dan Taq, slechts 0,5 tot 1 kb per minuut, vanwege de proofreading-activiteit. ○ Geen A-overhangs: Bij gebruik van Pfu ontstaan geen A-overhangs. Keuze van polymerase: ○ De keuze voor Taq of Pfu hangt af van de snelheid van de PCR, de replicatiegetrouwheid of de noodzaak voor A-overhangs bij het cloneren. Hot start polymerasesystemen: ○ Hot start polymerase systemen worden gebruikt om aspecifieke priming te voorkomen. ○ Problemen bij lage temperatuur: Aspecifieke priming kan optreden, waarbij primers binden aan niet-doel-DNA of zelf dimeren vormen. Dit verlaagt de specificiteit van de PCR en verbruikt dNTP's, waardoor de efficiëntie afneemt. ○ Oplossing voor hot start: DNA-polymerase wordt pas actief na het bereiken van een bepaalde temperatuur, waardoor aspecifieke bindingen worden voorkomen. Manuele hot start: Het enzym wordt pas toegevoegd nadat de reactie is verhit (onpraktisch). Fysieke barrière: Het DNA en de primers worden gescheiden van het polymerase door een waslaagje dat bij hogere temperaturen smelt. Geavanceerde hot start-systemen: Sommige systemen gebruiken antilichamen of polypeptiden die het enzym blokkeren en bij verhitting de blokkade verwijderen. Andere systemen bevatten covalent gemodificeerde DNA-polymerases, die pas bij verhitting actief worden na de hydrolyse van de covalente binding. De primers en hun rol in PCR: Keuze van primers: ○ De sense (forward) en antisense (reverse) primers hybridiseren aan de complementaire DNA-strengen. ○ Het DNA-polymerase verlengt de primers vanaf het vrije 3'-uiteinde door toevoeging van dNTP's. ○ De te amplificeren DNA-sequentie (amplicon) moet bekend zijn om de primers correct te ontwerpen. Ontwerp van primers: ○ De annealingtemperatuur van de sense en antisense primers moet gelijk zijn om specifieke hybridisatie te garanderen. ○ Lengte van primers: Tussen 17 en 30 nucleotiden. Lange primers hebben een hogere annealingtemperatuur en zijn specifieker. ○ GC-gehalte: Ideaal tussen 50-60%. Hoe hoger het GC-gehalte, hoe hoger de annealingtemperatuur. ○ De annealingtemperatuur ligt 5°C lager dan de Tm (smeltpunt) van de primer. Formules voor Tm: ○ Twee formules worden gebruikt, afhankelijk van de lengte van de primer (meer of minder dan 20 nucleotiden). Te vermijden factoren: ○ Repetitieve sequenties en identieke basenstrekken moeten worden vermeden om problemen zoals slipped strand mispairing te voorkomen. ○ Vermijd primers die makkelijk primerdimeren of hairpins vormen bij hoge temperaturen, omdat dit de PCR-efficiëntie en -specificiteit verlaagt. Labelen van primers: ○ Een primer kan een label aan het vrije 5'-uiteinde krijgen, wat de markering van het PCR-product mogelijk maakt. Mismatches in primers: ○ Mismatches ontstaan wanneer enkele basen van de primer niet correct baseren met de template. Dit beïnvloedt de Tm-berekening. ○ Speciaal voor mismatches: Er wordt een andere formule gebruikt om de Tm te berekenen, rekening houdend met GC%, primerlengte en percentage mismatches. Toepassingen van mismatched primers: ○ Interne mismatch primers worden gebruikt om mutaties in het PCR-product in te voeren. ○ Mismatches aan het 5’-uiteinde voegen extra sequenties toe aan het PCR-fragment, vaak RE-herkenningssites voor clonering. ○ Mismatches aan het 3’-uiteinde verhinderen dat de primer wordt verlengd door het DNA-polymerase, omdat het polymerase niet kan binden zonder perfecte complementariteit op het 3'-uiteinde. De template voor PCR: Doelwit-DNA: ○ Het doelwit (template) voor een PCR-reactie is DNA. Verschillende typen DNA kunnen dienen als template: Genomisch DNA Mitochondriaal DNA Bacterieel DNA Viraal DNA Plasmides YACs (Yeast Artificial Chromosomes) en BACs (Bacterial Artificial Chromosomes). ○ De extractiemethoden variëren afhankelijk van het type DNA. RNA als indirecte template: ○ RNA kan ook gebruikt worden als template in PCR, maar alleen indirect. Dit gebeurt via een reverse transcriptase-reactie (RT), waarbij RNA wordt omgezet naar DNA. ○ Deze techniek wordt gebruikt voor de detectie van mRNA of viraal RNA. ○ Voorbeeld: De Amplicor HIV-1 Monitor gebruikt deze techniek voor het kwantificeren van HIV-1 virustiters. Protocol bij RNA-template: ○ RNA-extractie: Het RNA wordt eerst geïsoleerd. ○ Reverse transcriptie (RT): Het RNA wordt omgezet naar DNA. ○ PCR-reactie: De omgezette DNA-template wordt gebruikt in PCR. Detectie van PCR-product: ○ Eén van de PCR-primers is gelabeld met biotine aan het 5'-uiteinde. ○ Het PCR-product wordt gedetecteerd in een cupje gecoat met een capture probe die complementair is aan de gelabelde strand van het PCR-product. ○ Na een wasstap wordt een conjugaat toegevoegd: streptavidine geconjugeerd met een enzym. Streptavidine bindt sterk aan biotine. ○ Het enzym zet een chromogeen substraat om, wat resulteert in een detecteerbare kleur. Kwantificatie: ○ Deze techniek maakt kwantificatie mogelijk van virustiters over een dynamisch bereik van 400 tot 750.000 virussen/mL. Inhibitoren in PCR: Wat zijn inhibitoren? ○ Inhibitoren zijn verbindingen die het PCR-proces verstoren, waardoor er weinig of geen PCR-product wordt gevormd. ○ Ze werken voornamelijk door het remmen van de werking van DNA-polymerase of door binding aan nucleïnezuren, waardoor ze niet beschikbaar zijn voor amplificatie. Oorzaken van inhibitie: ○ Inhibitoren kunnen afkomstig zijn van: Het staal waaruit het DNA werd geëxtraheerd. De reagentia die gebruikt worden in de isolatiemethode.  Voorbeelden van inhibitoren uit het staal: ○ Hemoglobine (uit bloed) ○ Galzouten (uit stoelgang) ○ Ureum (uit urine) ○ Polysachariden (uit zuivelproducten) ○ Oplossing: Een geschikte isolatiemethode kan deze inhibitoren zoveel mogelijk verwijderen. Voorbeelden van reagentia die de PCR beïnvloeden: ○ EDTA en Chelex: Binden divalente kationen zoals Mg²⁺, wat essentieel is voor de werking van Taq-polymerase. ○ Non-ionische detergenten (zoals Tween-20 en Triton X100): Remmen PCR bij concentraties boven 5%. ○ Ionische detergenten (zoals SDS): Remmen de PCR-reactie al bij zeer lage concentraties (boven 0,01%). ○ Proteasen (zoals proteinase K): Hydrolyseren eiwitten, inclusief DNA-polymerase, en zorgen zo voor inactivatie. Oplossingen bij aanwezigheid van inhibitoren: ○ Extra zuiveringsstap om de hoeveelheid inhibitor te verlagen. ○ Minder DNA-extract toevoegen aan de PCR-reactie (door verdunningen van het extract te gebruiken). ○ Hulpstoffen zoals BSA (boviene serumalbumine) kunnen inhibitoren binden en inactiveren. ○ Gebruik een robust DNA-polymerase of verhoog de hoeveelheid DNA-polymerase. Interne controle in PCR: ○ Interne controle: Een PCR wordt ontwikkeld om minstens één amplicon te leveren, afkomstig van een interne controle. Deze controle wordt samen met het diagnostische amplicon geamplificeerd. ○ Bij afwezigheid van een PCR-product kan dit wijzen op inhibitie of een probleem met de extractie (zoals geen DNA in het extract). ○ Exogeen DNA toevoegen: In sommige gevallen wordt een vast hoeveelheid exogeen DNA aan alle extracten toegevoegd, zodat de amplificatie van het exogene amplicon gelijk verloopt, tenzij inhibitoren aanwezig zijn. Dit wordt vaak gebruikt in kwantitatieve PCR's. Belangrijk: Een PCR zonder product kan duiden op inhibitie en de afwezigheid van het diagnostische amplicon heeft dan geen diagnostische waarde. Contaminatie in PCR: Gevoeligheid voor contaminatie: ○ PCR is een zeer gevoelige techniek door de exponentiële vermeerdering van een doelwitfragment. Dit maakt de reactie ook kwetsbaar voor contaminatie. Oorzaken van contaminatie: ○ Staalname: Contaminatie kan optreden tijdens het verzamelen van het staal. ○ Overdracht tussen stalen: Contaminatie kan van staal op staal plaatsvinden.  ○ Wetenschapper op staal: Verontreiniging kan ook van de onderzoeker zelf komen. ○ De grootste zorg is de contaminatie van pre-PCR-staal (dat nog de PCR-reactie moet ondergaan) met post-PCR-staal (dat al PCR-product bevat, wat als template kan dienen voor verdere amplificatie). Preventie van contaminatie: ○ Gescheiden ruimtes voor pre- en post-PCR-stappen moeten altijd worden gebruikt. ○ Decontaminatiemaatregelen: UV-lichtbestraling van werkruimtes voor de PCR-reactie. Uracil-N-glycosylase (UNG): Een enzym dat DNA met uracilbasen hydrolyseert. Het PCR-product wordt afgebroken als dUTPs in plaats van dTTPs worden gebruikt in de reactie, maar het template-DNA blijft intact. Controles in PCR: ○ Positieve controle: Dit moet altijd positief zijn, tenzij inhibitoren aanwezig zijn. ○ Negatieve controle: Dit moet altijd negatief zijn, tenzij er sprake is van contaminatie. Het Amplicon in PCR: Grootte van het amplicon: ○ Hoe kleiner het te amplificeren fragment, des te efficiënter de PCR verloopt. ○ Klassieke PCR: Versterkt meestal fragmenten van 200-1500 bp. ○ Kwantitatieve PCR (qPCR): Versterkt doorgaans kleinere fragmenten van 50-150 bp. ○ Grote amplicons (>2000 bp): Hiervoor zijn speciale kits en protocollen beschikbaar op de markt. Analyse van de PCR-producten: Soorten analyse: ○ Er wordt onderscheid gemaakt tussen technieken die de lengte van het PCR-product bepalen en diegenen die de sequentie van het PCR-product analyseren. ○ Een puntmutatie flankeert een primerpaar en beïnvloedt de sequentie, maar niet de lengte van het PCR-product. Lengteanalyse van PCR-producten: ○ Agarosegel elektroforese met ethidiumbromide: Een bp-ladder wordt geladen in een aparte laan om de lengte van het PCR-product te schatten. Positieve controles kunnen worden gebruikt voor vergelijking, vooral als de fragmenten slechts 10-30 bp in lengte verschillen.  Kleine verschillen in lengte (bijvoorbeeld tussen 100 en 120 bp) zijn gemakkelijker zichtbaar dan grotere verschillen (bijvoorbeeld tussen 1000 en 1020 bp). ○ Capillaire gel elektroforese: Bij deze methode wordt één primer gelabeld, zodat het PCR-product ook gelabeld is. Een bp-ladder wordt toegevoegd aan elk staal. Computerprogramma’s kunnen de ampliconlengte tot op 1 nucleotide nauwkeurig schatten. Technieken voor mutatie-analyse: ○ SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), HA (Heteroduplex Analyse) en DGGE (Denaturerende Gradiënt Gelelektroforese) worden gebruikt om PCR-producten snel te screenen op mutaties. ○ Deze technieken worden vaak ingezet om patiëntenpopulaties te screenen op mutaties in kandidaatgenen. ○ De analyse toont welke patiënten afwijkende PCR-producten vertonen, maar voor de precieze mutatie is sequentie-analyse nodig. PCR-ASO en PCR-RFLP analyses: ○ PCR-ASO-analyse: Vergelijkbaar met de ASO dot blot, maar het vertrekpunt is nu een PCR-product. ○ PCR-RFLP-analyse: Vergelijkbaar met klassieke RFLP, maar het vertrekpunt is ook een PCR-product. Sequentie-analyse: ○ De ultieme methode voor het analyseren van de sequentie van een PCR-product is sequentie-analyse. Gespecialiseerde PCR’s: 1. Mutagenese PCR Doel van mutagenese PCR: Mutagenese PCR wordt gebruikt om opzettelijke mutaties (zoals puntmutaties, inserties of deleties) in een specifiek DNA-segment in te brengen. Dit gebeurt door het gebruik van primers met minstens één opzettelijke mismatch, die de gewenste mutatie introduceren. Strategieën voor mutagenese PCR: ○ 5’-add-on-mutagenese: Bij deze strategie bevat de primer extra nucleotiden aan het 5'-uiteinde die niet aanwezig zijn in het doelwit-DNA. Deze extra nucleotiden worden geïntegreerd in het PCR-product, waardoor het uiteindelijke PCR-product de mutatie bevat. ○ Site-specifieke mutagenese: Deze methode introduceert mutaties in het midden van het PCR-product door twee parallelle PCR-reacties. PCR A gebruikt primer 1 en 1M, terwijl PCR B primer 2 en 2M gebruikt.  De primers 1M en 2M bevatten een interne mismatch die de mutatie veroorzaakt. De PCR-producten van PCR A en B worden gemengd, gedenatureerd en gereneerd, wat leidt tot de vorming van heteroduplex-strukturen. Het DNA-polymerase kan inwerken op de 3’-uiteinden van de heteroduplexen, waardoor een volledig dubbelstrengs DNA-molecuul ontstaat. Dit molecuul dient als template voor een nieuwe PCR-reactie, wat resulteert in een mutatie in het midden van het PCR-product. Voorbeeld: Mutatie van factor V (G-20210-A) ○ Een speciaal PCR-protocol is ontwikkeld om het onderscheid te maken tussen wild-type factor V en factor V met de G-20210-A mutatie, die wordt geassocieerd met een verhoogd risico op thrombose. ○ Primers: De sense primer is ongeveer 500 bp stroomopwaarts van de mutatie. De antisense primer is achter de mutatie geplaatst en bevat een interne mismatch. Door deze mismatch in de antisense primer wordt een HindIII-restrictie-site toegevoegd in het PCR-product van de mutatie. ○ Resultaat van PCR en restrictie-enzym digestie: Het PCR-product wordt gedigesteerd met HindIII. Homozygoot wild-type geeft een fragment van 406 bp. Homozygoot mutatie geeft een fragment van 383 bp. Heterozygoot geeft beide fragmenten van 406 en 383 bp. De aanwezigheid van een extra HindIII-site in zowel wild-type als mutante PCR-producten dient ter controle dat de digestie correct is uitgevoerd. 2. ARMS (Amplification Refractory Mutation System) ARMS is een techniek die gebaseerd is op de concepten van competitive oligonucleotide priming, en maakt gebruik van primers met een 3'-mismatch, die niet door het DNA-polymerase verlengd worden. Het systeem maakt het mogelijk om primers te ontwerpen die specifiek binden aan ofwel wild-type ofwel mutant doelwit-DNA, afhankelijk van de aanwezigheid van een specifieke mutatie. Basisprincipes van ARMS: 3'-Mismatch: ○ Primers met een mismatch aan het 3'-uiteinde zullen niet effectief binden of verlengd worden door het polymerase. Dit zorgt ervoor dat primers alleen werken voor het specifieke doel-DNA dat perfect complementair is aan de primer. Mutatie-specifieke primers: ○ Door twee verschillende sets primers te ontwerpen — eentje die alleen werkt met het wild-type DNA en de andere die alleen werkt met het mutant DNA — kan men specifieke PCR-producten genereren afhankelijk van de aanwezigheid van de mutatie. Voorbeeld: G-2343-T Mutatie in JAK2 De G-2343-T mutatie in het JAK2-gen is van belang voor de diagnose en prognose van leukemie. ARMS kan worden toegepast om deze mutatie te detecteren met de volgende primers: JAK-FI-1 (Sense primer): ○ Deze primer bindt uitsluitend aan wild-type DNA. Het 3'-uiteinde van de primer bevat een G-base, die perfect complementair is aan de wild-type sequentie, maar een mismatch vormt met het mutant DNA. ○ Deze primer vormt een primerpaar met JAK-RO-1, wat een PCR-product van 224 bp oplevert bij wild-type DNA. JAK-RI-1 (Antisense primer): ○ Deze primer bindt uitsluitend aan mutant DNA. Het 3'-uiteinde van de primer bevat een A-base, die complementair is aan het gemuteerde T, maar geen binding aangaat met wild-type DNA. ○ Deze primer vormt een primerpaar met JAK-FO-1, wat een PCR-product van 199 bp oplevert bij mutant DNA. Fluorescente detectie: Fluorescerende labels (FAM): ○ Zowel JAK-FI-1 als JAK-RI-1 zijn gelabeld met een fluorescerende probe (FAM), waardoor de PCR-producten na de amplificatie geanalyseerd kunnen worden met behulp van capillaire elektroforese. Toepassing van ARMS: In de praktijk wordt alle 4 primers gecombineerd in één enkele PCR-reactie. Hierdoor is het mogelijk om beide mutaties tegelijkertijd te detecteren, en biedt de PCR een interne controle, omdat altijd een PCR-product wordt verkregen, ongeacht de aanwezigheid van de mutatie. Het product van JAK-FO-1 en JAK-RO-1 vormt een PCR-product van 370 bp, dat echter niet fluorescerend gelabeld is en dus niet gedetecteerd zal worden in de capillaire elektroforese, maar wel als controle dient voor de PCR-reactie. Samenvatting van Primernaamgeving: F = Forward R = Reverse O = Outer I = Internal Deze techniek is krachtig voor het detecteren van specifieke mutaties en wordt veel gebruikt voor genetische diagnostiek, vooral bij het identificeren van mutaties zoals de G-2343-T mutatie in JAK2.  3. Multiplex PCR Multiplex PCR is een techniek waarbij meer dan twee primers worden gebruikt om meerdere PCR-producten tegelijkertijd te amplificeren in één enkele reactie. Het biedt de mogelijkheid om verschillende doelwitten (bijvoorbeeld verschillende genen of verschillende regio’s binnen een gen) te amplificeren, wat het een krachtige methode maakt voor genetische diagnostiek en analyse. Toepassing van Multiplex PCR: Klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten Een veelgebruikte toepassing van multiplex PCR is in de klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten. Het TCR-gen (T-cell receptor) ondergaat reorganisaties tijdens de maturatie van T-lymfocyten. Deze reorganisatie resulteert in een variatie van het TCR-gen bij een normale, polyclonale populatie van T-lymfocyten. Dit betekent dat elke T-lymfocyt in een gezonde populatie een uniek TCR-gen heeft. Polyclonale populatie: ○ Bij een gezonde, polyclonale populatie vertonen de T-lymfocyten veel variaties in het TCR-gen. Monoclonale populatie: ○ Wanneer een T-lymfocyt na de reorganisatie abnormaal snel prolifereert, ontstaat een monoclonale populatie, waarbij veel T-lymfocyten hetzelfde TCR-gen dragen. Dit is kenmerkend voor aandoeningen zoals leukemie. Multiplex PCR voor Klonaliteitsdiagnostiek: De multiplex PCR voor klonaliteitsdiagnostiek maakt gebruik van meerdere primers: Sense primers worden gebruikt voor verschillende variabele domeinen in het TCR-gen. Een antisense primer wordt gericht op het constante domein van het TCR-gen. Door deze combinatie van primers kunnen verschillende regio’s van het TCR-gen tegelijkertijd geanalyseerd worden. Het resultaat van de PCR hangt af van de aard van de T-lymfocytenpopulatie: Polyclonale populatie: ○ In een polyclonale populatie wordt een verscheidenheid aan PCR-producten geproduceerd, die verschillen in lengte. De resulterende amplicons zullen een reeks van verschillende lengtes vertonen, die samen een Gauss-curve geven wanneer ze geanalyseerd worden met capillaire elektroforese (een grafiek met regelmatige pieken die overeenkomen met een bp-ladder). Monoclonale populatie: ○ In een monoclonale populatie is één specifieke PCR-product sterk oververtegenwoordigd. Dit resulteert in een scherpe, enkele piek op de capillaire elektroforese (met de regelmatige pieken afkomstig van de bp-ladder). Dit wijst op een abnormale proliferatie van T-lymfocyten met een identieke reorganisatie in hun TCR-gen. Samenvatting: Multiplex PCR maakt het mogelijk om meerdere doelwitten tegelijk te amplificeren, wat efficiëntie verhoogt in diagnostische tests. Bij klonaliteitsdiagnostiek van T-lymfocyten wordt multiplex PCR gebruikt om te bepalen of een T-lymfocytenpopulatie monoclonaal of polyclonaal is, wat belangrijk is voor de diagnose van ziekten zoals leukemie. De resultaten van multiplex PCR worden geanalyseerd via capillaire elektroforese, waar polyclonale populaties een verscheidenheid aan amplicons tonen, terwijl monoclonale populaties zich manifesteren als een enkele dominante piek. Nested PCR Nested PCR is een techniek waarbij twee opeenvolgende PCR-reacties worden uitgevoerd om de gevoeligheid en specificiteit van de PCR te verhogen. Het proces omvat de volgende stappen: Werking van Nested PCR: 1. Eerste PCR-ronde (traditionele PCR): ○ In de eerste ronde wordt een klassieke PCR uitgevoerd met een primerpaar dat gericht is op een breed doelwit. ○ Deze PCR produceert een initiële hoeveelheid van het PCR-product (de amplicon), maar deze is mogelijk vervuild met niet-specifieke producten of bevat een lage concentratie van het specifieke doelwit. 2. Tweede PCR-ronde (Nested PCR): ○ In de tweede ronde wordt het PCR-product van de eerste ronde gebruikt als het doelwit-DNA. ○ Voor deze tweede PCR gebruikt men twee nieuwe primers die binnen het doelwit van de eerste PCR liggen, en die specifiek aan het PCR-product van de eerste ronde binden. De primers van de eerste ronde flankeren de primers van de tweede ronde, wat zorgt voor een meer gerichte amplificatie van het gewenste fragment. Voordelen van Nested PCR: Verhoogde gevoeligheid: Door twee opeenvolgende PCR-rondes uit te voeren, wordt de kans vergroot dat een zeer lage hoeveelheid doelwit-DNA gedetecteerd kan worden, omdat de hoeveelheid van het targetproduct exponentieel toeneemt. Verhoogde specificiteit: Omdat er twee verschillende primerparen worden gebruikt (één voor elke ronde), wordt de kans op amplificatie van niet-specifieke producten verkleind. Dit verbetert de nauwkeurigheid van de PCR, vooral wanneer het doelwit-DNA zich in een complexe mengsel bevindt. Toepassing: Nested PCR wordt vaak gebruikt in gevallen waarin:  Lage hoeveelheden DNA aanwezig zijn, zoals bij moeilijk te verkrijgen monsters (bijvoorbeeld voor DNA-extracties uit klinische monsters of oude monsters). Hoge specificiteit vereist is, zoals in gevallen van mutatieanalyse of pathogene detectie, waarbij slechts een klein aantal doelwitten moeten worden geïdentificeerd uit een complexe achtergrond van DNA. Samenvatting: Nested PCR is een krachtige techniek die gevoeligheid en specificiteit verhoogt door het uitvoeren van twee opeenvolgende PCR-reacties met verschillende primers. Dit maakt het mogelijk om zelfs lage hoeveelheden doel-DNA betrouwbaar te amplificeren, terwijl de kans op vervuiling of niet-specifieke amplificatie wordt verminderd. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) MLPA is een PCR-methode die het mogelijk maakt om 45 verschillende targets in één enkele PCR-reactie te detecteren. Dit gebeurt door probe-amplificatie, wat verschilt van andere PCR-technieken die staal-DNA amplificeren. De geamplificeerde probes hebben specifieke lengtes, zodat ze na capillaire elektroforese als afzonderlijke pieken verschijnen. Werking van MLPA: 1. Ontwikkeling van halfprobes: ○ Voor elk target-DNA worden twee halfprobes ontwikkeld: een upstream en een downstream halfprobe. ○ Upstream-halfprobe: Het 5'-uiteinde is niet complementair aan de targetsequentie, het 3'-uiteinde wel complementair. ○ Downstream-halfprobe: Het 3'-uiteinde is niet complementair aan de targetsequentie, het 5'-uiteinde wel complementair. ○ De upstream halfprobe bevat een upstream primerbindingsplaats (identiek voor alle upstreamprobes). ○ De downstream halfprobe bevat een downstream primerbindingsplaats (identiek voor alle downstreamprobes) en een stuffersequentie die afhankelijk van het target korter of langer is, en zorgt voor een specifieke lengte van alle probes. 2. Hybridisatie en ligatie: ○ De halfprobes hybridiseren met het target-DNA. ○ Een ligase-enzym verbindt het vrije 3’-uiteinde van de upstreamprobe met het vrije 5’-uiteinde van de downstreamprobe, maar dit gebeurt alleen als de halfprobes perfect complementair zijn aan de targetsequentie. ○ Dit maakt MLPA geschikt voor kwantitatieve analyses, aangezien de ligatie-afhankelijkheid van de target-DNA-moleculen het aantal geligeerde probes bepaalt. 3. PCR-amplificatie: ○ De geligeerde probes dienen als het doelwit voor PCR met één primerpaar, waarbij één van de primers fluorescerend gelabeld is.  ○ Het PCR-product is een mengsel van geamplificeerde probes die fluoresceren en door hun grootte te onderscheiden zijn. 4. Capillaire elektroforese en analyse: ○ Na PCR wordt het mengsel gescheiden via capillaire elektroforese. ○ Het elektroferogram toont piekpatronen die het resultaat zijn van de geamplificeerde probes. ○ De pieken kunnen vergeleken worden met die van een controlestaal om zowel de aan- en afwezigheid van pieken als de piekoppervlakte te analyseren. Toepassingen van MLPA: Kwalitatief: Detectie van mutaties door het gebruik van wild-type probes. Bij mutaties worden pieken gehalveerd (heterozygoot) of verdwijnen ze (homozygoot). Kwantitatief: Toepassingen zoals de HER2-amplificatie bij borsttumoren of het syndroom van Down. ○ Bijvoorbeeld, een MLPA-kit voor HER2-amplificatie bevat 40 probesets, waarvan 3 gericht zijn op het HER2-gen. ○ Na hybridisatie en ligatie worden de probes geamplificeerd met generieke fluorescent-gelabelde primers en geanalyseerd via capillaire elektroforese. ○ In het elektroferogram wordt de fluorescentie uitgezet tegen de fragmentlengte en wordt de oppervlakte onder elke piek softwarematig verwerkt om de amplificatie te kwantificeren. Samenvatting: MLPA is een krachtige techniek die via probe-amplificatie in één PCR-reactie meerdere targetsequenties kan detecteren. Het proces omvat hybridisatie, ligatie van probes, PCR-amplificatie en capillaire elektroforese. Deze techniek wordt veel toegepast in zowel tumordiagnostiek als klinische genetica, voor zowel kwantitatieve als kwalitatieve toepassingen.