TP Microbiologie S3 - Pr. KASSA Soulaimane PDF

Séance Séance de TP Microbiologie de TP MicrobiologieS3 S3 Pr. KASSA Soulaimane Pr. KASSA Soulaimane  OBJECTIFS GÉNÉRAUX L’objectif principalement est l’apprentissage de t(techniques de base en microbiologie à savoir : 1. Monter un po...

Séance Séance de TP Microbiologie de TP MicrobiologieS3 S3 Pr. KASSA Soulaimane Pr. KASSA Soulaimane  OBJECTIFS GÉNÉRAUX L’objectif principalement est l’apprentissage de t(techniques de base en microbiologie à savoir : 1. Monter un poste de travail 2. Ensemencer à l’aide de : ❖ Pipettes (Pasteur ou graduées) ❖ Anse de platine 3. Observer et être capable de décrire les microorganismes en microscopie (culture) 4. Isoler les souches par 2 méthodes : ❖ sur un milieu usuel ❖ sur 2 milieux sélectifs 5. Utiliser quelques milieux d’identification Afin d’atteindre ces objectifs pratiques, il est nécessaire de maitriser, au préalable, quelques notions indispensables à la compréhension de la démarche en microbiologie : Les milieux de culture La stérilisation Le montage du poste de travail  I- LES MILIEUX DE CULTURE Un milieu de culture doit absolument contenir en quantités suffisantes tous les nutriments nécessaires à la croissance des microorganismes. Les nutriments sont composés d'une ou de plusieurs sources de Carbone, d'Azote, de Sels Minéraux. 1.1. Composition chimique : a) Source de carbone : Le carbone exigé par la majorité des bactéries (hétérotrophes) est d'origine organique, c'est- à-dire des molécules contenant du carbone, de l'hydrogène et de l'oxygène (ex: glucides, lipides, protéines, etc...). La forme inorganique du carbone (ex: CO2) est assimilée par les bactéries autotrophes b) Source d'azote : Pratiquement, toutes les bactéries sont capables d'assimiler l'ammoniac (NH3) ou les sels d'ammonium. Quelques-unes peuvent utiliser les nitrates (NO3*), les nitrites (NOz) ou même l'azote organique (exemple: acides aminés).Toutes ces formes d'azote sont dites combinées. D'autres bactéries peuvent fixer l'azote atmosphérique gazeux (N2); elles n'ont pas besoin d'apport d'azote combiné dans le milieu  c) Sels minéraux : Les bactéries ont aussi besoin, pour croître, d'ions minéraux tels que : P, S, Na, K, etc; ils sont apportés dans le milieu sous forme de sels d) Facteurs de croissance : Certaines bactéries, dites auxotrophes, ont besoin de certains facteurs de croissance (Acides aminés, bases azotées, vitamines) pour leur développement. Elles sont incapables de les synthétiser. 1.2. Classification des milieux de culture: Les milieux de culture peuvent être classés soit en fonction de la composition ou de l'utilisation ou encore de leur état liquide ou solide.  ❖ Classification selon la composition : On distingue trois types: les milieux naturels, synthétiques et semi-synthétiques. a) Milieux naturels : Ils sont préparés à partir d'extraits de produits naturels divers (viande, lait, légumes, etc.) de composition riche, complexe et mal définie. Ils permettent le développement de presque toutes les bactéries. On les utilise généralement quand les espèces sont inconnues. Exemples : bouillon nutritif et gélose nutritive b) Milieux synthétiques : Ils sont préparés à partir de composés simples (sucres et sels minéraux) de composition exactement définie. Ils sont utilisés pour étudier les propriétés métaboliques des bactéries. c) Milieux semi-synthétiques : Ils sont préparés à partir de milieux synthétiques additionnés d'un produit naturel.  ❖ Classification selon l'utilisation: On distingue de nombreuses utilisations des milieux selon l'objectif de la culture : a) Milieux usuels : dits de base, car ils sont d'un emploi général permettant la culture de nombreux germes (bouillon nutritif et gélose nutritive). b) Milieux sélectifs : Ils permettent de sélectionner certaines espèces bactériennes parce qu'ils renferment des inhibiteurs qui bloquent les autres microorganismes. Ils permettent l'Isolement. c) Milieux d'enrichissement : dans lesquels on rajoute certains produits naturels (sang, sérum, foie, lait, etc...). Ils sont nécessaires pour enrichir et isoler certaines bactéries qui se trouvent en quantité très faible dans le milieu. d) Milieux d'identification : permettent la mise en évidence des caractères biochimiques utilisés pour l'identification des bactéries grâce à des réactions caractéristiques de l'espèce. e) Milieux de conservation : dans le but de conserver les bactéries en état de vie ralentie sans modifier leurs propriétés.  ❖ Classification selon l'état liquide ou solide ou semi-solide du milieu de culture : Tous les milieux de culture sont liquides jusqu'au moment où on leur rajoute un gélifiant pour les solidifier. L'agar agar est un polysaccharide extrait d'algues rouges qui possède 3 propriétés : Un pouvoir gélifiant : On l'incorpore à tout milieu liquide dans une proportion convenable (1 à 2%) pour avoir un milieu solide sans changer ses propriétés nutritives. Non dégradable par la plupart des bactéries En chauffant, il devient liquide à partir de 80°C. En refroidissant, il se solidifie à partir de 40°C.Il en découle un intervalle de température entre 80°C et 40°C où le milieu est en surfusion. Cette phase a plusieurs applications en microbiologie. Par exemple: La gélose nutritive (GN) : c'est un milieu solide obtenu par addition d'agar au bouillon nutritif.  II- LES FACTEURS PHYSICO-CHIMIQUES Les éléments énergétiques et constitutifs nécessaires à la croissance bactérienne doivent être fournis dans certaines conditions physico-chimiques, de température, de pH, de pression osmotique.et autres. Ces facteurs peuvent favoriser ou inhiber la croissance bactérienne. a) Température : Une bactérie est en général capable de croître dans un intervalle de température plus ou moins large. Il est limité par une valeur minimale en dessous de laquelle il n'y a plus de développement et une valeur maximale au-dessus de laquelle la croissance s'arrête. La croissance est meilleure dans un intervalle de température optimal. Température Optimale 0°C à 20° C20 à 40°C 45 à 65°C Groupes de bactéries Psychrophiles Mésophiles Thermophiles NB: Certains microorganismes (archéobactéries) peuvent se développer dans des températures supérieures à 100°C.  b) pH : Le potentiel Hydrogène (pH) traduit la concentration en H° dans un milieu. C'est un facteur très important qui influence beaucoup la croissance des bactéries. En fonction du pH optimal, de croissance on distingue trois groupes bactériens : pH optimal pH moins de 6 pH = 7 pH plus de 8 Groupes de bactéries Acidophiles Neutrophiles Alcalinophiles c) Pression osmotique : La pression osmotique d'un milieu traduit la concentration totale des ions et molécules en solution, ce qui exerce une pression sur la membrane hémiperméable. Cette dernière ne résiste pas mécaniquement à de fortes pressions sauf pour certaines bactéries. Par conséquent, tous les milieux de culture contiennent une quantité de NaCI de 5%. Aussi, les solutions bactériennes se font dans de l'eau stérile additionnée de 9 pour mille de NaCi (9 g-1**) ; il s'agit de l'eau physiologique stérile.  d) Besoins en oxygène : Plusieurs groupes bactériens peuvent être distingués en fonction de leurs besoins en 02 : Besoin en O2 O2 O2 est faible Présence/ Présence/ O2 toxique indispensable absence d’O2 en absence d’O2 utilisant O2 sans l’utiliser Type de Aérobies strictes Micro aérophiles Aéro-anaérobies Anaérobies Anaérobies bactéries facultatives aérotolérantes strictes Applications : Tous les facteurs physico-chimiques sont étudiés pour répondre aux objectifs de la cultures. Ils sont utilisés dans la classification, la conservation et la sélection/enrichissement des microorganismes.  III- LES TECHNIQUES DE STERILISATION La stérilisation est la réalisation de l'asepsie ou absence totale de germes. En microbiologie, toutes les manipulations doivent être réalisées stérilement et à l'abri de toute contamination. Les contaminants sont constitués par l'ensemble des germes qui arrivent à croître dans un milieu sans les avoir ensemencés. Ils peuvent provenir de l'air des instruments ou du manipulateur (doigts, cheveux…) Il faut donc stériliser tous les milieux, les récipients et les instruments, comme il faut toujours procéder à une désinfection des locaux de travail avant et après les manipulations. En pratique, la stérilisation fait appel à des facteurs physiques et chimiques et ne se fait qu’à partir d'un barème de stérilisation.  a) Stérilisation à la chaleur : Agent thermique Très utilisée en laboratoire pour stériliser les milieux, les récipients et détruire les germes d'un milieu après utilisation. On distingue 2 modes de stérilisation à la chaleur : Type de chaleur Chaleur humide Chaleur sèche Matériel de Autoclave (fig 1 et fig 2) Four de Pastour (fig 3) Flamme du bec Bunsen stérilisation (fig 4) Matériel à stériliser -Milieux de cultures -Verrerie -Anse de platine -Eau physiologique -Flacons vides -Zone d’asepsie -Substances non -Pipettes -Ouverture des tubes et thermolabiles flacons Barème de 120 C/20min/2bars 180 C/ 30min Le temps de porter stérilisation Température/temps/pressi l’anse au rouge on vapeur  b) Stérilisation par filtration: Agent mécanique Elle consiste à faire passer le liquide à stériliser à travers une membrane poreuse qui laisse passer la solution tout en bloquant à sa surface les germes microbiens présents (Fig. 5 et Fig. 6). Le diamètre des pores est choisi convenablement (0,2 à 0,45 micromètre). On l'utilise obligatoirement quand les milieux contiennent des substances altérables par la chaleur (substances thermolabiles) et ne peuvent donc pas être autoclavées.  c) Stérilisation par les rayons Ultraviolets : Agent physique Ces radiations produites par des lampes spéciales présentent des propriétés germicides et sont utilisées pour la stérilisation de l'air dans les locaux de travail qui peuvent être rendus stériles. d) Stérilisation ou désinfection par les substances chimiques : Certaines substances chimiques sont utilisées en microbiologie soit pour empêcher le développement des germes microbiens dans les milieux (substances bactériostatiques) soit pour détruire les germes (substances bactéricides). Par exemple : les gaz : tels l'oxyde d'éthylène, le formaldéhyde, l'ozone :utilisés surtout en industrie pour désinfecter les locaux. - Les substances liquides: la plus utilisée en microbiologie est l'eau de Javel, on utilise également le formol et l'alcool pour lé petit matériel et les surfaces de travail. - Les antibiotiques: surtout utilisés pour la conservation de certains produits ou rajoutés à des milieux sélectifs pour inhiber certaines espèces. N.B. : il faut distinguer la désinfection ou destruction partielle des germes, de la stérilisation ou destruction totale des germes.  IV- LES MANIPULATIONS STERILES Le poste de travail : Un poste de travail bien organisé doit comprendre (Fig. 7) : ❖ au centre : un bec Bunsen allumé environ 15 min avant la manipulation, destiné à favoriser une désinfection locale de l'air et à flamber certains instruments. ❖ à gauche: le matériel sur lequel le travail est effectué. les récipients (erlenmeyers, flacons) contenant les milieux de culture et les solutions stériles placés quand c'est nécessaire dans un bain-marie réglé à 45°C. des portoirs à tubes vides ou contenant des solutions stériles et des milieux à ensemencer. ❖ à droite: les instruments avec lesquels le travail est effectué. un fil de platine ou de Nichrome (alliage Nickel-Chrome) terminé en boucle fermée appelée anse, qu'on utilise pour les prélèvements des suspensions bactériennes. Une boîte contenant des pipettes graduées ou des pipettes Pasteurs stériles. Une pince en bois adaptée à tenir des lames et des tubes. ❖ Derrière le bec Bunsen : - Un récipient à large ouverture contenant de l'eau de Javel, destiné à recueillir obligatoirement les pipettes et les lames utilisées.