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Transportadores ABC Características ▪ Los transportadores ABC (ATP-Binding Cassette): superfamilia de proteínas transportadoras de membrana con variedad de sustratos y funciones diversas. ▪ Presentes en todos los filos: de procariotas a humanos ▪ Son las...

Transportadores ABC Características ▪ Los transportadores ABC (ATP-Binding Cassette): superfamilia de proteínas transportadoras de membrana con variedad de sustratos y funciones diversas. ▪ Presentes en todos los filos: de procariotas a humanos ▪ Son las ATPasas más abundantes. Muy abundantes en procariotas (1-2% de DNA codificante). Son muy numerosos en plantas (120 tipos) y en animales (40-70). En humanos 48 genes codifican para proteínas ABC, de las cuales 44 son transportadores ABC. ▪ Acoplan la unión de ATP-Mg2+, su hidrólisis, y la liberación de ADP/fosfato a cambios conformacionales que llevan a la translocación de sustratos a través de las membranas. ▪ Funcionan como: Importadores, Exportadores, Extrusores y en algún caso como canales regulados por ATP. ▪ Transportan iones, nutrientes, vitaminas (cofactores de enzimas), retinal, péptidos, proteínas, lípidos, esteroles, hormonas, fármacos... ▪ Participan en el catabolismo de lípidos, destoxificación xenobióticos, etc., y su malfunción está asociada a muchas enfermedades en humanos. ▪ La sobreexpresión de algunos de ellos contribuye a la resistencia a antibióticos de patógenos y a multidrogas de células tumores, lo que les hace altamente relevantes. 34 Tema 5: ATPasas  Transportadores ABC organización ▪ Todos consisten en la combinación de 4 dominios nucleares: 2 TMD (transmembrane domain, que une y transporta sustratos) +2 NBD (nucleotide binding site, que une e hidroliza ATP). ▪ Hay transportadores ABC bacterianos en que los 4 dominios son diferentes polipéptidos (un cuarto de molécula), y en otros 1 TMD y 1NBD están fusionados (media molécula), formando homo y heterodímeros. ▪ En eucariotas los transportadores ABC pueden formar homo Paumi et al., (2009) Microbiol Mol Biol y heterodímeros, pero es más habitual que los 4 dominios Rev 73, 577 estén formados por un solo polipéptido, bien en orientación directa (TMD1-NBD1-TMD2-NBD2) o invertida (NBD1- TMD1-NBD2-TMD2). ▪ Conjunto característico de motivos altamente conservados en el NBD que permite identificar proteínas ABC. En cambio, las secuencias de TMD son muy variables, reflejando la diversidad química de los sustratos translocados. ▪ Pueden tener dominios adicionales reguladores exta- (ECD) o intra- (RD) celulares, o dominios TM N-terminal (TMD0s). ▪ Puede interaccionar con otras proteínas para poder llevar a cabo su función transportadora. Tema 5: ATPasas 35  Transportadores ABC Características de los Transportadores Estructura y características generales del transporte ABC Estructura de dos exportadores ABC en conformación outward and inward-facing ▪ El transporte es insensible a la diferencia de potencial electroquímico transmembrana (los protonóforos o ionóforos no inhiben el transporte). ▪ Transporte sensible a vanadato, que sustituye al fosfato y dificulta que el ADP que se formado por hidrólisis del ATP abandone el NBD y sea sustituido por ATP. ▪ NBDs: se aproximan con la unió de 2 ATPs y, tras su hidrólisis, se alejan tras la liberación de Pi, lo que induce cambios conformacionales en los TMDs. ▪ TMDs: contienen múltiples hélices que al rotar en respuesta a cambios en los NBDs cambian el espacio de exposición del sitio de unión (OF: outward-facing, IF: inward-facing) de los sustratos. e i e i Ernst et al (2010) FEBS J 277, 540 36 Tema 5: ATPasas  Transportadores ABC Características y estructura Dr. Kaspar Locher ETH (Eidgenössische Technische Hochschule) Zurich, Switzerland, https://locherlab.ethz.ch/research/abc-transporters.html “Hemos determinado las primeras estructuras cristalinas de alta resolución de los transportadores ABC, revelando distintos pliegues de proteínas y sugiriendo mecanismos básicos de acoplamiento de la hidrólisis de ATP a la translocación del sustrato. Utilizamos la espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) para estudios cristalográficos de los estados intermedios de la reacción de transporte que pueden quedar atrapados con diversos agentes.” Tema 5: ATPasas 37  Transportadores ABC Características y estructura: Dominio NBD (nucleotide binding domain) ▪ Es el motivo común a todos los transportadores ABC: 30-40 % de identidad de secuencia entre los distintos miembros de la familia. ▪ Dominio NBD: unos 200 aa, y contiene los siguientes motivos: ✓ Caja Walker A (o vuelta P) + vuelta A + vuelta Q, unen a los fosfatos α y β, a la adenina y al Mg2+. ✓ Caja Walker B que proporciona el residuo de glutamato conservado favorece el ataque nucleofílico del fosfato γ del ATP vía una molécula de agua. ✓ Motivo firma (signature)= Motivo LSGGQ que contribuye a la unión de ATP. ▪ Los motivos Walker A y el dominio firma que unen un ATP pertecen a dos NBD diferentes Thomas y Tampé (2020) Annu Rev Biochem 89, 605 Tema 5: ATPasas 38  Transportadores ABC Características y estructura: Dominio NBD ▪ Los dominios NBDs muestran una simetría rotacional cabeza-tallo, de forma que en la unión de un ATP participa la secuencia Walker A de un dominio NBD1 y la secuencia “signature” (LSGGQ) del otro dominio NBD2 (girando 180˚ se pueden superponer los dos dominios). ▪ De esta forma se unen 2 ATPs en la interfase del sándwich entre 2 NBDs. ▪ En ausencia de nucleótido queda un hueco al que puede acceder el H2O. ▪ Cuando el ATP se une a la interfase entre los dos NBDs, ésta se cierra y el nucleótido queda encerrado. ▪ Durante un único ciclo de transporte se consumen dos moléculas de ATP, lo que está de acuerdo con la cooperatividad positiva observada para la unión e hidrólisis del ATP en algunos transportadores ABC. 39 Tema 5: ATPasas Transportadores ABC importadores Características y estructura: TMD ▪ Al contrario que los NBDs, los TMDs varían considerablemente Tipo I Tipo II en secuencia primaria, longitud, arquitectura y número de segmentos TM. Tipo III Thomas y Tampé (2020) ▪ Se han encontrado 7 tipos (energy-coupling Annu Rev Biochem 89, distintos de arquitectura, asociada factor, ECF) 605 a diferentes funciones fisiológicas: ✓Tipos I-III: funcionan como importadores de sustratos de procariotas ✓Tipo IV y V: funcionan casi exportadores exclusivamente como exportadores en procariotas y eucariotas ✓Tipo VI: Extractores ✓Tipo VII: Bombas de eflujo tripartitas mecanosensoras. Tipo IV Tipo V (Exportador tipo II) (Exportador tipo I) Tema 5: ATPasas 40  Transportadores ABC Importadores = baja Importadores = alta afinidad por sustrato afinidad por sustrato Exportadores= alta Exportadores= baja afinidad por sustrato afinidad por sustrato Mecanismo de transporte y Hélices de acoplamiento (coupling helices, CH) ▪ Los TMDs de los importadores y exportadores ABC (excepto los de tipo III) oscilan entre dos conformaciones: 1) Abierta hacia dentro (inward-facing; IF) 2) Abierta hacia fuera (outward-facing; OF) ▪ En el estado de reposo los dominios NBDs en estado exportador Sav1866 con abierto y el TMD inward-facing (IF). análogo de ATP unido, en conformación OF. ▪ la unión de dos moléculas de ATP genera la adopción del estado cerrado para el dímero NBD. ▪ Esta conformación fuerza la apertura del dominio TM Hollenstein et al por el lado opuesto (OF), en parte gracias al movimiento (2007) COSB 17, 412 de las hélices de acoplamiento (CH): se aproximan más de 10 Å tras la unión de ATP al NBD. ▪ El cambio de afinidad por el sustrato en IF y OF es lo que determina la dirección de transporte: Los importadores reciben los sustratos en el estado OF y los liberan en el estado IF. Los exportadores al contrario. ▪ Los TMDs también pueden adoptar conformaciones importador ModBC libre de cerradas u ocluídas. nucleótidos, en conformación IF Tema 5: ATPasas 41  Transportadores ABC inward-facing binding substrate protein MalG MalF Importadores periplasm ▪ Los transportadores tipo I-III son importadores de procariotas. cytoplasm ▪ Para los tipo I y II el transporte del sustrato es MalK MalK inward-facing pre-translocation dependiente de una proteína periplásmica pre- translocation Maltose ADP adicional de unión a sustrato (sustrate binding binding protein protein, SBP), que captura y lleva el sustrato hidrofílico a la parte externa del maltose ATP hydrolysis transportador ABC apropiado. ▪ En bacterias grampositivas, la SBP posee un ADP ADP Pi segmento transmembrana. Post-hydrolysis Outward-facing ▪ El transportador de maltosa (MalFGK2), tipo I, están compuestos de 2 subunidades Outward/facing integrales de membrana homólogas (MalF y MalG) y dos copias de la NBD (MalK2). maltose ▪ Muestra un sitio de unió para maltosa bien definido en el TMD MalF. 42 Tema 5: ATPasas  Transportadores ABC Exportadores ▪ Los exportadores tienen una estructura común de 12 hélices TM, que en los exportadores tipo I se proyectan en el citoplasma, de forma que los dominios NBD quedan a unos 25 Å de la membrana. ▪ La primera estructura descrita de un exportador ABC fue la de Sav1866 del patógeno Staphylococcus aureus , proteína involucrada en resistencia a múltiples fármacos. ▪ y revela una topología intrincada en donde las hélices TM de cada dominio TMD están enrolladas unas sobre otras. ▪ Esta estructura de Sav1866 fue capturada en una conformación con el ATP unido, y presenta una cavidad central encarada hacia el exterior. ▪ Esta cavidad es amplia, con mucha superficie potencial para unir diversos tipos de moléculas. ▪ En la orientación OF la cavidad es relativamente Dawson y Locher (2006) hidrofílica, con poca afinidad por sustratos Nature 443, 180 hidrofóbicos, por lo que estos sustratos serían repelidos y expulsados al exterior. ▪ Esta estructura ha servido para modelar transportadores de ABC humanos. Tema 5: ATPasas 43 Transportadores ABC Human Genome Organization (HUGO) Transportadores ABC de humanos http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm A Tipo V B ABCB1 Tipo IV C ABCC1 ABCC7 D ½ peroxisoma metabolismo de los ácidos grasos de cadena muy larga E un gen conservado relacionado con factores de elongación de eucariotas y puede formar parte del complejo de preiniciación de la traducción No F El mejor caracterizado es ABCF1 que media la activación de la quinasa Transp. a eIF2 asociada con el ribosoma. G Tipo V Tema 5: ATPasas 44  Transportadores ABC Distribución celular y órgano/tejido de los transportadores ABC humanos. distribución en de todos los transportadores distribución de los transportadores ABC en una célula humana. ABC en órganos humanos. 45  Transportadores ABC Breast Cancer Resistance Protein (ABCG2 o BCRP) Resistencia a multidrogas Glicoproteína P (P-gp, ABCB1 o MDR1) Multidrug Resistance Associated Protein-1 (ABCC1 o MRP1) Tres subfamilias de transportadores ABC participan en la resistencia de los tumores a fármacos: a) La subfamilia de la glicoproteina P (MultiDrug Resistance, MDR) es la segunda más larga de proteínas ABC y sus miembros poseen orientación directa y son transportadores completos (1 polipéptido) que contienen 1200 aa. Adoptan un plegamiento tipo IV (exportador tipo I) b) Las Multidrug Resistance associated Proteins (MRPs) poseen generalmente un dominio transmembrana Nt (TMD0) con 200 aa hidrofóbicos, que comprende 5 TM. Adoptan un plegamiento tipo IV (exportador tipo I) c) Los del grupo ABCG, como Brest Cancer Resistance Protein, BCRP, son proteínas ½. Adoptan un plegamiento tipo V (exportador tipo II) Tema 5: ATPasas 46  Transportadores ABC a) Resistencia a multidrogas: MDR ▪ Los MDR reducen la concentración intracelular de compuestos citotóxicos a niveles sub-tóxicos. ▪ Poseen orientación directa y son transportadores completos (1 polipéptido) que contienen 1200 aa. Suelen localizarse en la membrana plasmática donde funcionan como bombas de salida que transportan compuestos grandes anfipáticos, neutros o débilmente catiónicos. ▪ Pueden ser extremadamente versátiles con un rango de especificidad muy amplio. ▪ En patógenos puede contrarrestar los efectos de medicamentos y comprometer tratamientos contra infecciones de protozoos, hongos y bacterias. ▪ También limitan la efectividad de tratamientos contra el cáncer. 47 Tema 5: ATPasas  Transportadores ABC b) Resistencia a multidrogas en eucariotas: MRP ▪ Algunos MRPs están implicados en el transporte de conjugados de glutatión (GSH) u otros aductos, tanto de compuestos endógenos como de xenobióticos. ▪ El proceso tiene varias fases: Fase 0 (incorporación) Fase 1 (activación/oxidación) Fase 2 (conjugación) donde el derivado activado se conjuga con GSH, glucosa, ácido glucurónico o sulfato mediante transferasas como la GST. Fase 3 (transporte) Fase 4 (excreción) donde los conjugados son transportados fuera del citosol a compartimentos intracelulares o al exterior celular mediante los transportadores MRPs ▪ Los conjugados transportados son modificados o degradados para dar derivados inactivos. ▪ Algunos miembros (MRP1 y MRP2) contribuyen al control de los niveles intracelulares de glutatión oxidado (GSSG) jugando un papel esencial en la respuesta antioxidante cuando los niveles de la glutatión reductasa son limitantes. ▪ MRP1 se induce por estrés oxidativo. La sobreexpresión conjunta de una glutatión-S-transferasa y MPR1 produce resistencia a la acción citotóxica de varios Homolya et al., (2003) BioFactors 17, 103 fármacos. 48 Tema 5: ATPasas  Transportadores ABC c) Resistencia a multidrogas: ABCG ▪ Los transportadores ABCG2 (BCRP) protegen varios tejidos de compuestos tóxicos. ▪ También contribuyen a la resistencia a múltiples fármacos de las células cancerosas y tienen un fuerte impacto en la farmacocinética de los fármacos administrados Taylor et al., Nature 2017 Tema 5: ATPasas 49  Transportadores ABC Farmacorresistencia: Evasión y quimiosensibilizadores ▪ Para resolver los problemas asociados con la farmacorresistencia, se pueden usar medicamentos que no sean sustratos de los transportadores ABC: Estrategia de evasión. ▪ Las estrategias para encontrar compuestos quimiosensibilizadores pasan por: ✓ Inhibidores competitivos de los sustratos (fármacos) exportados. ✓ Moduladores no competitivos (Ej: Ab-antiABCG2) ✓ La inhibición efectiva no tiene por qué tener como diana el transportador mismo, sino que se puede diseñar contra el targeting, inhibiendo la localización del transportador. También se puede inhibir la transcripción de la bomba. ▪ Las capacidades solapantes de muchos transportadores ABC que confieren resistencia a un compuesto dado, donde se incluyen transportadores de las subfamilias MDR y MRPs. Ej: hay al menos 4 transportadores que confieren resistencia a las antraciclinas que son componentes del tratamiento de linfomas y leucemias infantiles. Una excepción es el taxol. ▪ Hay dificultades para encontrar inhibidores comunes a varios transportadores. Además, algunos tienenfunciones que no se esperaban, como el transporte de nucleótidos cíclicos por MRP4 y MRP5, lo que hace presagiar dificultades en el uso de inhibidores de estas bombas. Tema 5: ATPasas 50  Transportadores ABC El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística: CFTR (ABCC7) ▪ Canal de Cl- regulado por ATP localizado en la superficie luminar (membrana apical) de muchos epitelios secretores. ▪ En CFTR hay un dominio llamado regulador (R) ▪ R une las dos mitades homólogas, dando la siguiente organización de dominios: TMD1-NBD1- R-TMD2-NBD2. ▪ R posee secuencias dianas de quinasas. Su fosforilación por PKA, PKC, etc, es necesaria para la dimerización de NBD su fosforilación es. ▪ La unión de ATP a NBD2 induce un heterodímero NBD1-NBD2 y se abre el canal. ▪ La disrupción del dímero por hidrolisis y liberación de ADP y Pi conduce al cierre del canal. Tema 5: ATPasas Li y Naren (2010) Integr Biol 2, 161 51  Transportadores ABC El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ▪ Enfermedad genética autosómica recesiva ▪ Afecta al cromosoma 7→Gen regulador de CFTR= Cystic Fibrosis Transmembrane conductance regulator ▪ Afecta a 1 de 2000-10000 personas (1 de 25 portadora) ▪ La mutación más importante que provoca fibrosis quística es la delección de la fenilalanina 508, aunque se conocen más de 1600 mutaciones. ▪ Dicha mutación se encuentra en el dominio NBD1. Localización: Superficie apical o luminal de las células de los epitelios secretores (sistema exocrino): Intestino Páncreas Riñón Glándulas sudoríparas Tracto reproductivo masculino Diarrea Exceso secretora CFTR Fibrosis Defecto quística Tema 5: ATPasas 52  Transportadores ABC Sistemas de extractores multicomponentes (Tipo VI) ▪ Los lipopolisacáridos (LPS) son extraídos de la monocapa periplásmica de la membrana interna y llevados a la membrana externa por transportadores ABC junto a componentes adicionales que forman ensamblajes supramoleculares. ▪ El complejo se cree que crea un túnel continuo que extrae las moléculas de LPS. Figura: a) Estructura de rayos X del extractor de LPS LptB2FGC en complejo con LptC, LptA y LptDE de Vibrio cholerae. Sistemas de mecanotransducción transperiplásmica (Tipo VII) ▪ Las bacterias Gram-negativas utilizan bombas de eflujo tripartitas para extraer sustancias tóxicas, incluyendo antibióticos y factores de virulencia. ▪ Uno de ellos es la bomba de eflujo multidroga MacAB-TolC. Figura: b) Reconstrucción de Cryo-EM de la bomba de eflujo multidroga MacAB-TolC. ▪ La bomba MacAB-TolC opera probablemente por un mecanismo de mecanotransducción que expele las moléculas sustrato a través de ciclos de expansión y compresión dirigidos por cambios conformacionales en MacB. Tema 5: ATPasas 53