Tema 3. REPLICACIÓN DEL ADN PDF

Tema 3. REPLICACIÓN DEL ADN 1. Introducción 2. Características 3. Enzimas y factores implicados 4. Replicación procariota (E. coli) -Iniciación: Inicio, ensamblaje del Primosoma y entrada de la Holoenzima: ADN...

Tema 3. REPLICACIÓN DEL ADN 1. Introducción 2. Características 3. Enzimas y factores implicados 4. Replicación procariota (E. coli) -Iniciación: Inicio, ensamblaje del Primosoma y entrada de la Holoenzima: ADN pol III -Elongación: ADN PolIII, ADN PolI y ligasa -Terminación 5. Replicación en Eucariotas 6. Síntesis de los telómeros 7. Replicación en virus 8. La replicación del ADN como diana terapéutica 1 Internal use  INTRODUCCIÓN DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR 2 Internal use  REPLICACIÓN: Características q Cada cadena servirá de molde para formar la cadena hermana q Mecanismo básicamente idéntico en todos los organismos 3 Internal use  REPLICACIÓN DEL ADN Características principales de la síntesis de ADN: ü Es semiconservativa ü La zona donde comienza se llama punto de origen ü Avanza de forma bidireccional ü Progresa en dirección 5´ → 3´ ü Es semidiscontinua ü Muchas enzimas implicadas 4 Internal use  Experimento de Messehson y Stahl la replicación es SEMICONSERVATIVA 5 Internal use  La replicación comienza en un punto: Origen de Replicación lazo que puede salir el exámen. pregunta en Origen de replicación IMPORTANTE , Punto único en procariotas Ambas hebras se replican al mismo tiempo Internal use  La replicación es bidireccional Horquilla de replicación ü activa en ambos extremos del lazo ↳ Sburbuja horquilla de replicación 7 Internal use  La replicación progresa en dirección 5´→ 3´ Síntesis en la misma dirección a la Hebra conductora dirección del movimiento de la o continua horquilla De pocos cientos a pocos miles de SEMIDISCONTINUA nucleótidos Síntesis en dirección opuesta Hebra retardada o a la dirección del movimiento discontinua de la horquilla 8 Internal use  Enzimas y factores proteicos implicados en la replicación IMPORTANTE exámen , REPLISOMA (sistema ADN replicasa): conjunto de enzimas y proteínas que participan en la replicación PROTEÍNA FUNCIÓN POLIMERASA Polimerización y corrección de errores HELICASA Separación de cadenas, rotura de puentes de H, gasto de ATP TOPOISOMERASA Rompe superenrollamientos, eliminan tensiones en el ADN SSBs (proteínas de unión al Estabiliza las cadenas separadas ADN) PRIMASA Sintetiza primers o cebadores LIGASA Sella cortes o “mellas” 1 Internal use 0  Enzimas y factores proteicos implicados en la replicación Requerimientos de la reacción de replicación: üSustratos: dATP, dGTP, dCTP y dTTP üCofactores: Mn2+ o Mg2+ üMolde o plantilla üCebador: 3’ –OH libre (molécula de RNA emparejado con la hebra progenitora de forma complementaria y antiparalela) 1 Internal use 1  Necesidad de un cebador o primer q La polimerasa no es capaz de incorporar el primer nucleótido q Cebador o primer → oligonucleótido de ARN ü sintetizado por la enzima primasa ü proporciona extremo 3´OH a la polimerasa q Procesividad ® número de nucleótidos que es capaz de añadir la polimerasa antes de disociarse 1 Internal use 2  REPLICACIÓN DEL CROMOSOMA DE E. coli q 3 Fases (diferentes reacciones y enzimas implicadas) v INICIACIÓN v ELONGACIÓN v TERMINACIÓN 1 Internal use 3  INICIACIÓN PROTEÍNAS QUE PARTICIPAN EN EL INICIO DE LA REPLICACIÓN 1 Internal use 4  INICIACIÓN q Estructura del origen de replicación de E. coli (oriC) ü245 pb üPosee secuencias consenso muy conservadas evolutivamente Zona DUE Sitios R (DNA unwinding unión a DnaA Sitios I Sitios IHF y FIS element) unión a DnaA unión a factores que estimulan iniciación Zona de ADN DnaA es una proteína clave “relajante” en el proceso de inicio de la replicación 1 Internal use 5  INICIACIÓN 3. DnaC-ATP ayuda a DnaB (helicasa) a Fase previa- INICIO unirse al ADN: apertura de anillo hexamérico de DnaB 2. Desnaturalización del ADN en zona DUE dependiente de DnaA 1. Ocho moléculas de 4. Unión de 2 helicasas en DnaA unidas a ATP se hebras desnaturalizadas 1 unen a zonas R e I de oriC Internal use 6  Factores implicados en la INICIACIÓN Elimina los superenrollamientos Sintetiza los primers, Estabilizan las hebras PRIMOSOMA después se suelta sencillas Avanza dirección 5’®3’ separando las dos hebras q Única etapa regulada ü Metilación del ADN de oriC por la metilasa Dam 1 ü Interacción con la membrana plasmática 7 ü Lenta hidrólisis del ATP por proteína DnaA ® forma activa (ATP)/inactiva (ADP) Internal use  VISTA GENERAL ELONGACIÓN q La ADN polimerasa III añade desoxirribonucleótidos al cebador o primer Hebra conductora: síntesis CONTINUA Hebra rezagada: síntesis DISCONTINUA en fragmentos de Okazaki Varios primers en 1 8 hebra rezagada Internal use  DIRECCIÓN DE AVANCE DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN DIRECCIÓN DE SÍNTESIS DE LA HEBRA REZAGADA ü Un único dímero de ADN polimerasa III sintetiza ambas hebras a la vez. 1 Internal use 9  ADN polimerasa III de E. coli NÚCLEO DE POLIMERASA NÚCLEO DE POLIMERASA ABRAZADERA β ABRAZADERA β ABRAZADERA β (abierta) üComplejo de carga de la abrazadera: une dos núcleos de polimerasa üAbrazaderas β (dímeros de subunidades β): impiden disociación de la polimerasa → aumenta procesividad 2 Internal use 0  ADN polimerasa III de E. coli NÚCLEO DE POLIMERASA COMPLEJO DE CARGA DE LA ABRAZADERA (COMPLEJO γ) ü El “complejo de carga de la abrazadera” o “complejo γ” carga las subunidades β en la hebra rezagada en cada fragmento de Okazaki. 2 Internal use 1  ADN polimerasa III de E. coli Abrazaderas β: estructura dimérica circular que rodea el ADN. Se desliza a lo largo del ADN 2 Internal use 2  ELONGACIÓN üUn lazo en la hebra rezagada aproxima los dos puntos de polimerización üCada núcleo (core) de la polimerasa sintetiza una hebra distinta üEl cebador del fragmento de Okazaki anterior se aproxima a las subunidades núcleo üEl primosoma se forma de nuevo para la síntesis de un nuevo primer, una vez formado la primasa se disocia https://www.youtube.com/watch?v=I9ArIJWYZHI 2 Internal use 3 2 Internal use 4 https://www.youtube.com/watch?v=IjVLhoyfGAM Internal use  Ø El fragmento de Okazaki 1 ya está sintetizado, y la Pol III de la hebra retardada está sintetizando el fragmento de Okazaki 2 Ø La primasa se asocia temporalmente a DNA B para sintetizar un nuevo primer 3 (en verde) para el fragmento de Okazaki 3 Ø El complejo de carga de la abrazadera coloca una nueva abrazadera en el nuevo primer 3 para el fragmento de Okazaki 3 Ø El core de pol III continua con la síntesis del fragmento de Okazaki 2 y al acabarla se encuentra con el primer (en verde) del fragmento de Okazaki 1 Internal use  Ø La nueva abrazadera está en el primer 3 Ø La abrazadera que ha participado en la síntesis del fragmento 2 se disocia Ø La abrazadera ocupa su posición en el core de la pol III y comienza la síntesis del fragmento de Okazaki 3 https://www.youtube.com/watch?v=I9ArIJWYZHI Internal use  ELONGACIÓN Complejo cargador de la abrazadera b (clamp loader) b üCompletada la síntesis del Abrazadera fragmento de Okazaki, la desechada replicación se detiene y el núcleo se separa de la abrazadera , que es deshechada y retenida por el complejo cargador de la abrazadera, hasta que llegue el siguiente fragmento de Okazaki Es b quien marca donde 2 está el nuevo fragmento de 8 Okazaki Internal use  ELONGACIÓN ü La hidrólisis de 3 moléculas de ATP permite el cierre de la abrazadera β abierta 2 Internal use 9  ELONGACIÓN: etapa final üADN pol I elimina ribonucleótidos del cebador y los reemplaza por término desoxirribonucleótidos · importante (actividad exo- nucleasa 5´→ 3´) ü TRASLADO DE LA MELLA ~ en evadriotas üADN ligasa sella la mella 3 Internal use 0  Actividad exonucleasa 5´→ 3´ de la ADN pol I: TRASLADO DE LA MELLA O CORTE Fragmento de ADN o ARN a reemplazar ü Polimerización en extremo 3´OH (actividad polimerasa) ü Degradación en extremo 5´P (actividad exonucleasa 5´→ 3´) üEl corte o mella se traslada ü La polimerasa se disocia. La mella queda a la espera de que otro enzima la selle. 3 Internal use 1  ADN polimerasa I: Tiene dos funciones: -Maduración de los fragmentos de Okazaki -Reparación del ADN q ADN polimerasa I ® 3 actividades diferentes: qFragmento pequeño: Exonucleasa 5’->3’ qFragmento Klenow: Exonuclease 3’->5’ y Polimerasa 5’->3’ 3 Internal use 2  Fragmento grande (Klenow) de la ADN pol I Ø Eliminación del dominio que contiene la actividad exonucleasa 5’®3’ Ø Se obtienen por tratamiento enzimático Ø Conserva actividad de polimerización y de corrección de errores (exonucleasa 3’ ® 5’) Centro activo. En azul oscuro, hebra molde 3 Internal use 3  Corrección de errores: fragmento Klenow Centro activo de la ADN polimerasa La actividad exonucleasa se localiza por delante de la actividad polimerasa en el desplazamiento de la E a lo largo Centro activo de la del ADN exonucleasa 3´ → 5´ v Ej. de corrección de errores por la actividad exonucleasa 3’®5’ Una forma tautomérica imino de la citosina se aparea con A y se incorpora a la cadena en crecimiento 3 Internal use 4  Errores en el apareamiento q Gran fidelidad de la polimerasa ® 1 error de cada 104 ó 105 nucleótidos incorporados Geometría de los pares de bases incorrectos es muy diferente a la de los pares de bases A-T y G-C. Formas tautoméricas enol e imino → 3 5 apareamientos erróneos. Internal use  Tautómero: isómeros naturales de las BN que se diferencian en la posición del grupo funcional: -A y C: amino-imino -G y T: ceto-enol Si la actividad Exonucleasa (3’->5’) de la polimerasa no actúa, se fija la mutación Internal use  Mecanismo de reacción de ADN ligasa ü El fosfato debe ser activado por adenilación ü Las ligasas de bacterias utilizan NAD+ como fuente del grupo activador AMP. Estado Adenilado-Activado Se adenila la ADN ligasa (AMP-enzima) El AMP se transfiere desde la enzima al 5’P de la mella (estado activado: adenilado) El –OH 3’ de la mella ataca el P en 5’ y libera el AMP, formando un enlace fosfodiéster que sella la mella Internal use  TERMINACIÓN ü Las dos horquillas se encuentran en una región terminal ü Múltiples copias de la secuencia Ter § Unión a proteínas Tus ® Complejo Tus-Ter ® Detiene la horquilla de replicación § Evitan la sobrerreplicación Dos grupos de secuencia Ter con orientaciones opuestas 3 Internal use 8  TERMINACIÓN ü La replicación entre las horquillas deja los dos cromosomas circulares encadenados o catenados Corta transitoriamente las dos hebras de uno de los cromosomas 3 Internal use 9  E. coli tiene 5 polimerasas ü ADN polimerasa I ® funciones de limpieza en la replicación, recombinación y reparación ü ADN polimerasa II ® implicada en un tipo de reparación ü ADN polimerasa III ® enzima principal de la replicación 4 ü ADN polimerasa IV y V ® implicadas en reparaciones Internal use 0 4 Internal use 1  REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL 4 Internal use 2  REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL 1- Modelo de desplazamiento de hebra: ARNpol mt: Síntesis de un ARN cebador 1º cambio conformacional molécula de ADN TFAM, TFBM Topoisomerasa I ADN Polimerasa γ Helicasa mt Twinkle Topoisomerasa I mtSSB ADN hebra sencilla + mtSSB -transcribe fragmento en LSP -transición ARN-ADN en OH ü ARNpol mt + ADN hebra sencilla -ARN cebador precursor se escinde (endonucleasa) ü ADNpol γ Elongación hebra naciente ADN Internal use  REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL 1- Modelo de desplazamiento de hebra Ori H (OH) (en bucle D) Ø Orígenes de la Replicación Ori L (OL) Ø Replicación continua de ambas cadenas a partir de Ori H y Ori L Internal use  REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS Ø Similar en muchos aspectos a la bacteriana. § Es semiconservativa § Bidireccional § Semidiscontinua. Ø Se produce en la fase S del ciclo celular y desde diferentes puntos fijos. Ø Los replicones en la eucromatina se inician antes que en la heterocromatina; Ø Los orígenes de replicación =ARS: (secuencias de replicación autónomas, equivalente al OriC de E. coli) no están bien definidos. Ø El número de replicones utilizados en cualquier ciclo está estrictamente controlado (y sólo se disparan una vez por ciclo celular) Ø En el desarrollo embrionario se activan más orígenes que en células 4 5 adultas que presentan un crecimiento más lento. Internal use  ADN eucariota: mayor tamaño y de organización más compleja (cromatina) La velocidad en eucariotas 50 nucleótidos/s = 1/20 de la velocidad de E. coli En eucariotas muchos orígenes de replicación 4 Internal use 6  INICIACIÓN DE LA REPLICACIÓN EN ENSAMBLAJE DEL COMPLEJO EUCARIOTAS PRE-REPLICATIVO. Al origen de replicación se unen a diferentes ATPasas: -ORC: origin recognition complex -CDC6: cell division cycle (ATPasa análoga a DnaC)) -MCM: varias proteínas del mantenimiento, forman un complejo hexámero (MCM2 a MCM7) (análogas a DnaB) -CDT1 requerida por complejo MCM2-7as las p En levaduras 16 cromosomas. Hay unos 400 orígenes de replicación CDC6 y CDT1 se separan del complejo mediante hidrólisis de ATP 4 Internal use 7  REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS Varias polimerasas en la Horquilla de replicación eucariota horquilla de replicación eucariota. Son menos procesivas, pero actúan con más fidelidad: § ADN pol α: actividad primasa § ADN pol δ. Asociada a PCNA (β). Actividad exonucleasa 3´-5´ correctora de pruebas. Síntesis de las hebras conductora y rezagada § ADN pol ε, reemplaza a ADN pol δ en reparación del ADN. La proteina RP-A recubre el ADN de cadena sencilla Se requiere una abrazadera (PCNA) su complejo de carga (RFC) La terminación de la replicación requiere la síntesis de los telómeros (extremos 4 del cromosoma). Internal use 8  COMPARATIVA DE LOS FACTORES EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS 4 Internal use 9  Elongación: DNA Polimerasas Eucariotas Las células eucariotas tienen muchas polimerasas que actúan con alta fidelidad, a excepción de la b Pueden actuar en replicación y reparación de DNA dañado 5 Internal use 0  Síntesis de TELÓMEROS al terminar la replicación eucariota “Problema de replicación de los extremos” Los cromosomas se acortarían en cada división 5 Internal use 1  Telomerasa No hay molde disponible para el apareamiento del cebador ® No se puede replicar ® los cromosomas se acortarían en cada generación celular Telomerasa ® incorpora telómeros ØFormada por ARN + proteínas Muchas copias en tándem Tx Gy x e y ® 1-4 Ax Cy Más larga que la complementaria ® ADN cadena sencilla en 3’ ADN 5’ TTTTGGGGTTTTG- OH(3’) 3’ ü150 nucleótidos ü1,5 copias repetición telomérica CyAx ® molde para TxGy del telómero Internal use  TERMINACIÓN: REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS La Telomerasa se compone de: -Componente ribonucleotídico. -Componente proteico. http://www.uam.es/personal_ pdi/ciencias/jhermoso/ch08_t elomerase_000.html 5 Internal use 3 La región de cadena sencilla está protegida por proteínas de unión específicas (eucariotas inferiores) Eucariotas superiores ® Lazo T Proteínas de ü El extremo de cadena sencilla plegado y unión a ADN apareado con una secuencia complementaria dúplex telomérico en la región de doble cadena del telómero ü Protegen el extremo 3’ del cromosoma de las nucleasas y E reparadoras de roturas Factores de unión a repeticiones TRF1 y TRF2 teloméricas Formación del lazo Micrografía D electrónica de un lazo D Internal use  Posibles estructuras teloméricas: Quadruplex de Guanina (extremo 3´de cadena rica en G) Bucle T (Por inserción del extremo 3´ de la cadena rica en G, y generación de bucle D) 5 Internal use 5 Telomerasa – Envejecimiento ØPerdida de la telomerasa ® acortamiento gradual de los telómeros ® muerte de la línea celular ØHombre üCélulas germinales ® actividad telomerasa §Mantienen la longitud de sus telómeros üCélulas somáticas ® carecen de telomerasa §Los telómeros se acortan gradualmente ü­Longitud de los telómeros ® ¯Edad del individuo Internal use  Viral replication: Baltimore Classification system dsDNA: deben entrar en el núcleo del huesped (polimerasas huésped) Excepto: Adenovirus y Herpes virus (replicasas propias) y Poxvirus (no replica en el núcleo) http://www.mcb.uct.ac.za//tutorial/i.html ssDNA: replican en el núcleo. Pasan a dsDNA durante la replicación. Polimerasas del huésped http://www.mcb.uct.ac.za//tutorial/ii.html dsRNA (genoma segmentado): poco conocida. A partir de cada hebra http://www.mcb.uct.ac.za//tutorial/iii.html ssRNA (sentido +): Replican en el citosol y pueden ser utilizados directamente por los ribosomas para la síntesis de proteínas. http://www.mcb.uct.ac.za/tutorial/v.html ssRNA (sentido -): En el citosol. No puede ser leído directamente por el ribosoma. Necesita una RNA Polimerasa dependiente de RNA para obtener la cadena complementaria ssRNA (sentido +): La transcriptasa reversa convierte el RNA+ en DNA. Este DNA viaja al núcleo donde puede integrarse en el genoma del huésped por acción de la integrasa. Internal use Retrovirus ADN polimerasa dependiente de ARN presente en ciertos virus ARN ® Retrovirus El genoma ARN monohebra penetra en la célula huésped La transcriptasa inversa sintetiza un ADN complementario al ARN vírico: se genera dúplex ARN-ADN Luego degrada el ARN del híbrido ARN-ADN y lo reemplaza por ADN El ADN viral se integra en el genoma de la célula huésped Internal use  Transcriptasa inversa Cataliza 3 reacciones diferentes 1. Síntesis de ADN dependiente de ARN 2. Degradación de ARN Diferentes sitios activos 3. Síntesis de ADN dependiente de ADN Máxima actividad con ARN propio (podrían usar otros) Requiere un cebador ® ARNt ü Secuencia en 3’ complementaria al ARN vírico Síntesis ADN dirección 5’ ® 3’ No exonucleasa 3’ ® 5’ correctora de pruebas ü 1 error cada 20.000 nucleótidos añadidos ü ­Tasa de mutación ® nuevas cepas Internal use  Retrovirus y cáncer Algunos retrovirus contienen un gen que provoca que la célula crezca anormalmente ® Oncogén Genoma del virus del sarcoma de Rous (virus del sarcoma de las aves) Codifica una proteína quinasa específica de tirosina. Interviene en la división celular, interacciones intercelulares y comunicación intercelular , (mismo gen en eucariotas) Asociado al genoma de este virus , este oncogén se expresa a niveles muy elevados División celular no regulada y cáncer Internal use  Aciclovir: fármaco inhibidor de polimerasas Virus del herpes simplex Guanina unida a un anillo incompleto de ribosa q Inhibe replicación en varias etapas: üEs sustrato de la timidina quinasa vírica que lo fosforila ü El compuesto fosforilado es inhibidor competitivo de la polimerasa del herpes. Tiene mayor afinidad por polimerasa vírica que celular. üAdemás, carece de extremo 3`OH ® si se incorpora al ADN actúa como terminador. 6 Internal use 1 6 Internal use 2