UD 3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos PDF

# **UD 3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos** ## **Contenidos** - Pretratamiento de las muestras biológicas. - Técnicas de extracción y purificación de ADN en sangre, biopsias y tejidos. - Extracción y purificación de ARN. - Sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos. - Cal...

# **UD 3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos** ## **Contenidos** - Pretratamiento de las muestras biológicas. - Técnicas de extracción y purificación de ADN en sangre, biopsias y tejidos. - Extracción y purificación de ARN. - Sistemas automáticos de extracción de ácidos nucleicos. - Calidad y concentración del ADN obtenido. # **3.1. Extracción y purificación: la primera etapa** - Los ácidos nucleicos se encuentran confinados en el interior de las células, bien en el interior del núcleo, bien en el seno del citoplasma o bien en orgánulos celulares como mitocondrias y cloroplastos. ## **Membranas y paredes celulares:** - Las membranas celulares son las estructuras que limitan a la célula y además le permiten tener relación con el medio exterior. Químicamente están constituidas por una bicapa lipídica en cuyo seno se encuentra dispersa una gran variedad de proteínas. - La pared celular, peculiaridad común a bacterias, levaduras, hongos y células vegetales es una capa que recubre la membrana celular y proporciona rigidez y protección a las células. Químicamente, su composición es variable según el tipo de organismo de que se trate. - De esta manera, membranas y paredes constituyen una verdadera barrera que se deberá vencer si queremos tener acceso a los ácidos nucleicos. Por esto su análisis y manipulación mediante técnicas de biología molecular comporta, en la mayor parte de los casos, una primera etapa de extracción y purificación. - Con la extracción conseguimos hacer accesibles los ácidos nucleicos a los reactivos y enzimas que se emplean en las diversas técnicas; con la purificación, eliminamos las sustancias y elementos que pueden interferir en ellas. - La obtención de ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica se suele llevar a cabo mediante un único protocolo técnico continuado, que se puede dividir en tres fases: ## **Fases de purificación:** 1. Pretratamiento de la muestra. 2. Extracción de los ácidos nucleicos. 3. Purificación de los ácidos nucleicos. # **3.2. Pretratamiento de las muestras biológicas** - Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra biológica. Pero, dada la gran diversidad y variabilidad del posible material de partida -sangre, tejidos, biopsias, etc.-, en muchas ocasiones se requiere un pretratamiento específico de la muestra biológica concreta, que permita obtener las suspensiones celulares sobre las que se realizará la extracción y purificación de los ácidos nucleicos. ## **Las suspensiones celulares están formadas por células libres y agregados celulares que flotan dispersos en el seno de un medio líquido:** - A continuación abordaremos los pretratamientos más habituales de las muestras con que se trabaja en biología molecular: - Sangre. - Cultivos celulares. - Tejidos animales o vegetales frescos. - Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. - Otras muestras como esputos, células de la mucosa oral, bacterias y levaduras. ## **3.2.1. Sangre** - La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los ácidos nucleicos de un individuo, purificándolos a partir de uno de sus componentes celulares, los leucocitos. Muchos de los componentes sanguíneos interfieren en las técnicas de biología molecular. Por ejemplo, el grupo hemo de la hemoglobina es un potente inhibidor de la PCR, por lo que un objetivo común en los distintos pretratamientos es la eliminación de la hemoglobina por medio de la lisis de los hematíes. ### **Consideraciones sobre la obtención y conservación de la muestra** - Para la obtención de ácidos nucleicos en una muestra de sangre, lo ideal es partir de sangre total anticoagulada con EDTA, pero la heparina y el citrato sódico también se pueden usar como anticoagulantes. ### **La sangre es un tejido formado por:** - Un componente celular constituido por: - Hematíes. Células sin núcleo ni mitocondrias cuyo interior está ocupado por la hemoglobina (proteína que contiene hierro). Su función principal es el transporte de los gases respiratorios. - Leucocitos. Células nucleadas de mayor tamaño que los hematíes. Intervienen en el proceso de defensa del organismo. Hay diferentes tipos que según su morfología y función pueden ser: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. - Plaquetas. Fragmentos celulares sin núcleo. Intervienen en la coagulación sanguínea. - Un componente líquido o plasma, que es una mezcla compleja de múltiples elementos. ### **La extracción de ácidos nucleicos es conveniente realizarla en las 24 horas siguientes a la obtención de la muestra, pero en caso contrario, se puede conservar en refrigeración a 4 °C durante cinco días. Sin embargo, si se van a aplicar técnicas que requieren moléculas intactas de ADN sin fragmentar, como el Southern blot, la sangre no debería almacenarse en nevera más de tres días, porque en un periodo más largo se produce una leve degradación y fragmentación del ADN.** ### **Lisis de los hematíes** - El pretratamiento más habitual en muestras de sangre consiste en: - **La lisis de los hematíes.** Consiste en romper los hematíes con una solución o tampón de lisis en la proporción 1:3, es decir, un volumen de sangre por tres volúmenes de solución de lisis. Actualmente hay muchas soluciones de lisis comerciales, la mayoría de ellas basadas en fenómenos osmóticos y/o en detergentes suaves. - **Centrifugado de la muestra.** Una vez producida la lisis de los hematíes, se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento o pellet y un sobrenadante. ### **Solución de lisis de eritrocitos estándar (ósmosis):** - Cloruro de amonio (NH4CI): 150 mM. - Bicarbonato potásico (KHCO3); 10 mM. - EDTA: 1mM. ### **Solución de lisis de eritrocitos con detergente:** - Tris-HCI: 10 mM, pH 8. - Triton X-100: 1%. - Sacarosa: 11%. ### **Eliminación del sobrenadante:** - Consiste en eliminar la fracción líquida sobrenadante con una pipeta pasteur. Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina, liberada por la rotura de los hematíes. ### **Conservación del sedimento:** - Entonces continuaremos el proceso de extracción de los ácidos nucleicos. En el sedimento habrán quedado los leucocitos. ### **Obtención de células mononucleadas de sangre periférica:** - La sangre se puede utilizar también como material de partida para detectar, aislar y estudiar ácidos nucleicos de algunos retrovirus que infectan linfocitos, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o los virus linfotrópicos humanos de células T (HTLV). - En estos casos interesa aislar las células mononucleadas de sangre periférica o PBMC (de la terminología inglesa peripheral blood mononuclear cell), es decir, linfocitos y monocitos, antes de extraer los ácidos nucleicos. Esto se consigue mediante una centrifugación en gradiente de densidad que requiere un medio de separación. - Se procede de la siguiente manera: - Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre. - A continuación se centrifuga durante 20-30 minutos a 400-800 x g, dependiendo del reactivo usado. Durante la centrifugación: - La polisucrosa (polisacárido componente del medio de separación) causa agregación de los hematíes facilitando su rápida sedimentación. - Los granulocitos, con una densidad mayor que el medio de separación, sedimentan también en el fondo del tubo. - Las células mononucleadas, sin embargo, tienen una densidad menor que el medio de separación y permanecen en la interfase entre este y el plasma. - Una vez eliminado el plasma sobrenadante, la capa de células mononucleadas se aspira cuidadosamente con una pipeta pasteur, se transfiere a un tubo limpio y se lava con tampón o solución salina para eliminar restos de plasma y plaquetas. - A partir de las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción de ácidos nucleicos. ### **Medio de separación para la extracción de PBMC:** - El medio de separación utilizado en la extracción de PBMC es una mezcla de dos componentes: - **Ficoll:** polisacárido sintético hidrofílico muy ramificado producido por la copolimerización de sucrosa y epiclorhidrina. - **Diatrizoato sódico.** - Este medio tiene una viscosidad baja, una densidad de 1,077 g/ml y una osmolalidad adecuada para mantener la viabilidad celular. En el mercado hay varias marcas comerciales basadas en esta mezcla (Ficoll-paque®, Histopaque®, Lymphoprep®, etc.). ## **3.2.2. Cultivos celulares** - Los cultivos celulares son métodos de obtención de células *in vitro* mediante siembras controladas en medios adecuados. - Son un buen material de partida para realizar estudios genómicos y de expresión génica en determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos. - El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de seguir con la extracción de los ácidos nucleicos. - Se dan principalmente dos situaciones: ### **Cultivos en suspensión:** - Si las células crecen en suspensión en el medio de cultivo se procede de la siguiente manera: - Recolectar en un tubo. - Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación. - Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de iniciar la extracción y purificación de ADN y/o ARN. ### **Cultivos en monocapa:** - Si las células crecen en monocapa adherida a la pared del frasco de cultivo hay dos posibilidades: - Utilizar el propio frasco para continuar el proceso de extracción. Para ello: - Retirar del frasco el medio de cultivo. - Lavar la monocapa con tampón o solución salina. - Iniciar *in situ*, en el propio frasco, el proceso de extracción. - Pasar la monocapa a un tubo. Para esto: - Despegar la monocapa de células de la pared del frasco. Para ello se puede proceder de dos maneras: - De forma mecánica con raspador. - Por medios enzimáticos. Tras retirar el medio de cultivo del frasco y lavar la monocapa con tampón o solución salina, se incuban las células con una solución de tripsina al 0,05-0,25%. - Recolectar las células en un tubo. - Lavar las células antes de continuar con la extracción. ## **3.2.3. Tejidos animales o vegetales frescos** - La obtención de ácidos nucleicos a partir de tejidos frescos animales o vegetales requiere un pretratamiento previo de homogeneización. - La homogeneización es el tratamiento mecánico o químico al que se somete un tejido para liberar las células que lo integran. - La cantidad de tejido que se va a procesar dependerá del tipo de tejido, del método de homogeneización y del procedimiento de extracción y purificación de ácidos nucleicos. - Por ejemplo, para tejidos animales, cantidades entre 10 y 25 mg de tejido suelen bastar para obtener entre 10 y 40 µg de ADN. En el caso de tejidos vegetales suelen requerirse cantidades un poco mayores, entre 100 mg y 1 g, para obtener el mismo rendimiento. ### **Homogeneización mecánica:** - La homogeneización mecánica consiste en someter al tejido a una acción trituradora o abrasiva para desmenuzarlo. - Según la manera de proceder puede ser automatizada o manual. ### **Homogenización mecánica automatizada:** - La homogenización del tejido se consigue usando varias máquinas o elementos mecánicos. Se procede de la siguiente manera: - El tejido se corta primero en pequeños fragmentos y luego se homogeneíza por la acción mecánica que proporcionan instrumentos como los trituradores mecánicos, por la adición de agentes abrasivos y agitación, por esferas de vidrio o cerámica que colisionan violentamente contra la muestra mediante un movimiento de oscilación o por sonicación. - Una vez que el tejido ya está homogeneizado, se transfiere a un tubo limpio para iniciar la extracción. ### **Homogeneización mecánica manual con mortero:** - Es un método que minimiza el problema de la degradación. Se procede de la manera siguiente: - Se colocan los fragmentos de tejido en un mortero y se cubren con nitrógeno líquido. La baja temperatura del nitrógeno líquido permite la congelación rápida del tejido y evita la formación de cristales en el interior de las células (con otros sistemas de congelación, estos cristales se forman, provocan la lisis celular y, en consecuencia, la liberación de enzimas y el comienzo de su degradación). - A continuación, con la mano del mortero se pulverizan los fragmentos congelados hasta conseguir un polvo fino y, finalmente, se deja evaporar el nitrógeno líquido. - El polvo obtenido se transfiere a un tubo para iniciar el proceso de extracción. - En algunos protocolos, la homogeneización mecánica se realiza directamente en un tampón de lisis, simultaneándola con el primer paso del proceso de extracción. ### **Homogeneización química:** - La homogeneización química consiste en someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células. - Se suele realizar para muestras pequeñas y cortes de tejido en congelación obtenidos con un criostato. - Se procede de la manera siguiente: - Se añade a la muestra la mezcla de incubación que contienen las proteasas y detergentes para la digestión del tejido. - Se lleva la muestra a la incubadora. Las incubaciones se suelen realizar a temperatura elevada (37-56 °C) durante 12-24 horas. - Pasado el tiempo de incubación, se retira la muestra y se sigue con el proceso de extracción. - Si en la mezcla de incubación se añaden enzimas y detergentes que desestabilizan y rompen las membranas celulares, se puede también simultanear la homogeneización del tejido con el primer paso del proceso de extracción. ## **3.2.4. Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina** - El tejido fijado en formol e incluido en parafina o tejidos FFPE (de la terminología inglesa formaliñe-fixed paraffin-embedded) es un material muy útil para la realización de estudios retrospectivos, aunque la calidad de los ácidos nucleicos recuperados suele ser peor que la de aquellos purificados a partir de tejidos frescos. - Esta pérdida de calidad tiene lugar porque durante el proceso de fijación el ADN se fragmenta y el ARN puede ser parcialmente degradado, según el tiempo que transcurra entre la obtención y la fijación de la muestra. ### **Desparafinización:** - El pretratamiento que se requiere en los tejidos FFPE para la extracción de ácidos nucleicos es la desparafinización. - La desparafinización consiste en la eliminación de la parafina en los tejidos FFPE. - Se procede de la manera siguiente: - Con un microtomo, se obtienen cortes finos (5-10 µm) del tejido. - Se transfieren, aproximadamente 5-10 mg de cortes, a un tubo eppendorf. - Se incuba secuencialmente con xilol u otro agente desparafinante, etanoles de concentración decreciente y agua destilada, tal y como se describe en el DOCUMENTO 3.3. - Finalmente, el tejido desparafinado y rehidratado se somete a una homogeneización química similar a la descrita para tejidos frescos, simultaneándola con el primer paso de la extracción de los ácidos nucleicos que veremos en el APARTADO 3.3. ## **3.2.5. Otras muestras** - Otras muestras habituales para la extracción de ácidos nucleicos son los cultivos de bacterias y levaduras, las células de la mucosa oral y los esputos. ### **Cultivos de bacterias y levaduras:** - El pretratamiento consiste en situar las bacterias y levaduras en un tampón de suspensión. - Según el medio en el que se encuentra el material de partida, se pueden dar dos situaciones: - **Cultivos en medio líquido:** - Se centrifuga el tubo para eliminar el medio de cultivo sobrenadante. - El sedimento se resuspende en el tampón de suspensión. - **Colonias aisladas sobre un medio sólido (placa de agar):** - Se recoge una colonia de la superficie de la placa con un asa de siembra estéril. - Se resuspende la colonia en el tampón de suspensión. ### **Solución tampón de suspensión para bacterias y levaduras (solución GTE):** - TRIS: 25 mM, pH 8. - EDTA: 10 mM. - Glucosa: 50 mM. ### **Células de la mucosa oral:** - En el mercado se encuentran soluciones y kits comerciales para la recogida y conservación de este tipo de células. Existen diversos sistemas de obtención: - **Mediante raspado de la mucosa oral con torunda o cepillo.** En este caso, la muestra tomada directamente del raspado, la torunda o cepillo, se sumerge en una solución conservante para que las células se desprendan. - **Mediante enjuague con una solución conservante.** - **Recolectando directamente saliva.** ### **El pretratamiento de las muestras de células de la mucosa oral, antes de iniciar la extracción, consistirá en centrifugar la suspensión celular y eliminar el sobrenadante.** ### **Esputo:** - El esputo puede usarse como material de partida para detectar o confirmar la presencia de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias. - El pretratamiento consiste en la fluidificación con un agente mucolítico del tipo de la N-acetil-L-cisteína (NALC) en una disolución de citrato sódico. - Si el microorganismo que se quiere detectar es una micobacteria se puede añadir también hidróxido sódico para descontaminar la muestra. ### **Solución mucolítica y descontaminante para esputos:** - N-acetil-L-cisteína (NALC): 0,375 g. - Citrato trisódico 2 H₂O: 14,5 g. - Hidróxido sódico (NaOH): 20,0 g. - Agua destilada: hasta 1000 ml # **3.3. Extracción de ácidos nucleicos** - Una vez realizado el pretratamiento de la muestra de partida dispondremos de la suspensión celular, procariota o eucariota, a partir de la cual procederemos a la extracción de los ácidos nucleicos. - El proceso de extracción implica principalmente dos procesos: ### **Los dos procesos:** - **La lisis celular** para liberar los ácidos nucleicos. - **La inactivación de nucleasas celulares** (ADNasas y ARNasas) para evitar la degradación de los ácidos nucleicos. - Ambos procesos, lisis celular e inactivación de las nucleasas, se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una solución de lisis. ### **Además, en células con pared celular -bacterias, levaduras, hongos y células vegetales- será necesaria aplicar algunas variaciones del tratamiento para vencer la dificultad de lisis que presentan.** ### **El proceso de extracción consiste en la obtención de un lisado celular de aspecto homogéneo en el que los ácidos nucleicos se encuentran libres de las estructuras celulares en las que se mantenían aislados.** ## **3.3.1. La solución de lisis** - La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula que se va lisar y puede incluir detergentes, EDTA, proteasas y agentes caotrópicos. ### **Detergentes:** - Son los componentes principales de la solución de lisis. Su función es desestructurar la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizar las proteínas que se insertan en ella - Así efectúan la lisis celular y la consecuente liberación del contenido citoplásmico y nuclear al medio de reacción. - El dodecil-sulfato-sódico (SDS), un compuesto tensioactivo aniónico, es el detergente más utilizado en las soluciones de lisis celulares, sobre todo para muestras humanas y de animales, en combinación con EDTA ### **EDTA** - El EDTA es un quelante de cationes divalentes, como el calcio y el magnesio. El magnesio es un cofactor de las ADNasas, necesario para su funcionamiento. - En consecuencia, al atrapar los cationes de magnesio que hay en el medio de reacción, el EDTA inhibe la actividad de las ADNasas. ### **Proteasas** - A la solución de lisis se le pueden añadir proteasas -como la proteinasa K- que digieren las proteínas, tanto las de la membrana celular como las citoplásmicas, facilitando la rotura y disolución de las membranas y eliminando las nucleasas. - Su empleo es especialmente útil en muestras de tejidos frescos y FFPE para simultanear la digestión del tejido con la extracción de los ácidos nucleicos. #### **La inactivación de nucleasas es muy importante para obtener una buena cantidad de ácidos nucleicos no fragmentados: ** - La vida media del ARNm en condiciones fisiológicas, es muy corta, ya que es rápidamente degradado por ARNasas citoplasmicas necesarias para evitar que la proteína que codifica se sintetice permanentemente. - Con la lisis celular, la liberación del ADN de las estructuras que lo contienen lo pone en contacto con ADNasas citoplasmicas. ### **Solución de lisis para leucocitos y células animales** - Dodecil-sulfato-sódico (SDS): 2%. - EDTA: 25 mM. - pH: 8,0. ### **Solución de lisis celular con proteinasa K:** - Tris-HCI: 10 mM, pH 8. - NaCl: 400 mM - EDTA: 2 Mm. - SDS: 2%. - Proteinasa K: 0,5 mg/ml. ### **Agentes caotrópicos:** - Otra solución eficaz para inactivar las nucleasas es añadir agentes caotrópicos que desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad, como el isotiocianato de guanidinio, un potente inactivador de las ARNasas, por lo que se recomienda su uso siempre que queramos purificar ARN. ## **3.3.2. Tratamientos en células con pared celular** - La presencia de pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales dificulta la lisis celular. Para degradar esta pared se hacen necesarios otros tratamientos como los tratamientos enzimáticos, los tratamientos mecánicos o el bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB). ### **Tratamiento enzimático:** - Para degradar esa pared se suelen emplear enzimas específicas que digieren los componentes de la pared: - **Lisozima o lisostafin, ** para degradar la pared de bacterias gram positivas. - **Liticasa o zimolasa, ** para células vegetales, levaduras y hongos. ### **Tratamiento enzimático se puede poner en práctica antes de usar la solución de lisis con detergente o bien simultáneamente, incorporando la enzima a la solución de lisis celular.** ### **Tratamiento mecánico:** - En bacterias, una alternativa al tratamiento enzimático específico es la ruptura de la pared por medios mecánicos, como ebullición en agua destilada o tampón, ciclos de congelación-descongelación, sonicación, etc. ### **Tratamiento con CTAB:** - Otra característica común de las células con pared celular es su alto contenido en polisacáridos y derivados polifenólicos. Estos compuestos interfieren en muchos procesos enzimáticos utilizados en técnicas de biología molecular. Por esta razón es frecuente sustituir el SDS por otro detergente iónico, el CTAB, que facilita la eliminación de estos compuestos en el proceso de purificación. ### **Solución de lisis para células vegetales:** - Bromuro de cetil-trimetil-amonio (CTAB): 2% (p/v). - Cloruro sódico (NaCl): 1,4 M. - EDTA: 20 mM. - Tris-HCl: 0.1M, pH 8. ### **Las sales caotrópicas son compuestos que influyen en la organización de las moléculas de agua y en su interacción con macromoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos. De esta forma consiguen, por una parte, aumentar la solubilidad de sustancias apolares, y por otra, modificar las interacciones intramoleculares no covalentes (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofóbicas) que mantienen la estructura secundaria y terciaria de las proteínas, desestabilizándolas.** ### **La siguiente serie, conocida como serie de Hofmeister, da una idea de la intensidad del efecto caotrópico causado por distintas sales:** **CATIONES** - Menos caotrópico: NH4, K, Na, Li, Mg, Ca - Más caotrópico: (NH2)3C (guanidinio) **ANIONES** - Menos caotrópico: SO42-, HPO4, Acetato, Citrato - Más caotrópico: Cl-, NO3, CIO3, |-CIOA, SCN (Isotiocianato) # **3.3.3. Verificación del resultado de la lisis** - Finalizada la fase de extracción, deberemos comprobar que se haya conseguido una solución homogénea que indique que el proceso de lisis celular ha sido eficiente. - Si la lisis celular no resulta suficiente, se deberá prolongar el protocolo hasta conseguir una completa homogeneización de la muestra. Así, por ejemplo, si la lisis no es homogénea, es decir, se observan presencia de grumos, cuerpos celulares, etc., transcurrido el tiempo de incubación estándar del protocolo que se esté realizando, se deberá añadir más solución de lisis y reincubar la muestra, incluso a temperaturas elevadas (37-65 °C). # **3.3.4. Consideraciones en la extracción del ADN** - Cuando se quiere purificar exclusivamente ADN, porque el ARN puede interferir en los estudios posteriores, una vez finalizada la lisis celular y antes de iniciar la purificación, es necesario eliminar el ARN presente en el lisado. Para ello: - Se añade al medio de reacción ARNasa A. - Se incuba a 37 °C durante 15-45 minutos. - Este paso no suele ser necesario en muestras de sangre periférica o médula ósea porque la contaminación por ARN es mínima, pero sí es aconsejable en otro tipo de muestras como saliva, tejidos y raspados celulares # ** 3.4. Purificación de los ácidos nucleicos** - Una vez finalizada la lisis, los ácidos nucleicos se encuentran inmersos en un extracto celular complejo junto con proteínas, sales minerales, componentes celulares solubles y los propios reactivos empleados en la extracción. ### **El proceso de purificación consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado.** - A continuación abordaremos diferentes técnicas de purificación que se basan en algunas de las características fisicoquímicas de los ácidos nucleicos. Estas son: ### **Técnicas de purificación: ** - La purificación con solventes orgánicos. - La precipitación con sales (salting-out). - La cromatografía de intercambio iónico. - La cromatografía de adsorción. - La purificación mediante esferas magnéticas. - La ultrafiltración. ### **También abordaremos algunas técnicas para la purificación de plásmidos y unas consideraciones especiales que se requieren en la purificación del ARN.** ## ** 3.4.1. Purificación con solventes orgánicos** ### **Fundamentación:** - La purificación con solventes orgánicos se basa en la distinta solubilidad de los compuestos que integran el lisado celular en solventes orgánicos. ### **Procedimiento:** - Se puede dividir en cuatro fases: 1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos. 2. Precipitación del ADN. 3. Lavado del ADN. 4. Resuspensión del ADN. ### **I. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos:** - El protocolo más habitual de purificación de ADN genómico utiliza una combinación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, en proporciones 25:24:1. - Se procede de la siguiente manera: - Se mezclan volúmenes iguales de lisado y reactivo y se agita vigorosamente con un vórtex. El lisado proporciona una fase acuosa. El cloroformo disuelve los lípidos y proporciona la fase orgánica a la mezcla. El fenol desnatura y disuelve las proteínas presentes en el lisado y se integra en la fase orgánica. - Se centrifuga. Mediante la centrifugación, la mezcla agitada se separa en dos fases: la acuosa, en la parte superior del tubo, con los ácidos nucleicos, las sales y los componentes hidrosolubles del lisado, y la orgánica en la parte inferior del tubo, con las proteínas y lípidos ### **II. Precipitación del ADN:** - La fase acuosa se transfiere a un tubo limpio y el ADN se precipita añadiendo acetato sódico e isopropanol o etanol al 100% frío. - El ADN es una molécula polianiónica, es decir, tiene una carga fuertemente negativa por los grupos fosfato que se disponen en el exterior de la doble hélice. En un medio acuoso, esta carga neta negativa hace que las moléculas de ADN se repelan entre sí y se rodeen de una capa hidratante de moléculas de agua que las estabilizan. Por esta razón, el ADN es soluble en agua, a pesar del gran tamaño de sus moléculas. - Cuando se añade un alcohol (agente deshidratante) al medio acuoso se elimina la capa hidratante que rodea las moléculas de ADN. La presencia en el medio de reacción de cationes de sodio (proporcionados por el acetato sódico) neutraliza la carga negativa de los grupos fosfato del ADN. Por esta razón, las moléculas de ADN ya no se repelen entre sí y se unen unas a otras formando una maraña visible de finas hebras blanquecinas. - Mediante centrifugación, el ADN precipitado sedimenta en el fondo del tubo y en el sobrenadante quedan todos los contaminantes hidrosolubles que había en el lisado de partida. ### ** III. Lavado del ADN:** - Una vez eliminado el sobrenadante, el pellet de ADN se lava con etanol al 70-95% y se vuelve a centrifugar. El ADN es insoluble en el etanol, permaneciendo en el sedimento, pero los restos de sales y posibles contaminantes que hayan coprecipitado con el ADN son solubles en etanol, por lo que se eliminan con el sobrenadante. ### ** IV. Resuspensión del ADN:** - El etanol interfiere en casi todas las técnicas de biología molecular, por lo que antes de resuspen-der el ADN hay que eliminarlo por completo. Los restos que quedan en las paredes del tubo se pueden eliminar invirtiendo el tubo sobre un material absorbente, como el papel de filtro y el pellet de ADN se dejar secar completamente a temperatura ambiente con el tubo abierto. - Una vez seco, se resuspende en la cantidad adecuada de agua destilada o en un tampón de baja fuerza iónica a pH neutro o ligeramente alcalino, como un tampón Tris-EDTA (TE). - La rehidratación del ADN es un proceso lento. Se puede realizar una incubación inicial a 55-65 °C seguido de una incubación a temperatura ambiente con agitación suave hasta la completa disolución del pellet o una incubación en nevera a 4 °C hasta el día siguiente. # ** 3.4.2. Precipitación con sales (salting-out)** ### **Fundamentación:** - La precipitación con sales se basa en la precipitación de proteínas en presencia de altas concentraciones salinas. - Las elevadas concentraciones salinas generan medios con elevada fuerza iónica. Esto determina un incremento en las interacciones hidrofóbicas entre proteínas, disminuyendo drásticamente su solubilidad en el medio acuoso y provocando su precipitación. ### **Procedimiento:** - Como en el método anterior, el protocolo consta de varias fases: - Precipitación de proteínas. - Precipitación del ADN. - Lavado y resuspensión del ADN. ### **I. Precipitación de proteínas:** - Se añade al lisado un volumen igual de una solución salina concentrada, que actúa como solución precipitante de proteínas y se agita vigorosamente con vórtex durante 20-30 segundos. - A continuación se centrifuga la mezcla, con lo que las proteínas sedimentan en el fondo del tubo como un pellet de color pardo y en el sobrenadante quedan los ácidos nucleicos, sales y componentes hidrosolubles del lisado. ### **II. Precipitación del ADN:** - El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio, se añade un volumen igual de isopropanol y se mezclan por inversión suave del tubo varias veces. - El ADN precipita en forma de maraña de hebras blanquecinas, que se sedimentan mediante centrifugación. ### **III. Lavado y resuspensión del ADN:** - Se elimina el sobrenadante y el ADN se lava con etanol 70-95% y se resuspende en agua destilada o tampón TE como en el método anterior. # **3.4.3. Cromatografía de intercambio iónico** ### **Fundamentación:** - La cromatografía de intercambio iónico se basa en la unión electrostática reversible de iones en solución a grupos funcionales cargados que están unidos covalentemente a una fase estacionaria. - Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta positiva, se habla de intercambiadores aniónicos, ya que van a unir reversiblemente los iones negativos (aniones) que se encuentren en la solución. - Cuando los grupos funcionales de la fase estacionaria tienen carga neta negativa se habla de intercambiadores catiónicos, puesto que van a unir los iones positivos (cationes) presentes en la solución. - Para purificación de ácidos nucleicos se usan matrices de sí