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Synthèse Biologie Moléculaire 2023-2024 CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 1. LES BONS TERMES Biologie moléculaire (biomol) : discipline scientifique dont l'objet est l...

Synthèse Biologie Moléculaire 2023-2024 CHAPITRE 1 : INTRODUCTION 1. LES BONS TERMES Biologie moléculaire (biomol) : discipline scientifique dont l'objet est la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au niveau moléculaire. Principales sous-disciplines : Génétique moléculaire (hérédité des caractères) Génomique (fonction et localisation des gènes) Protéomique (fonction et régulation des protéines) Biotechnologie: C’est l’ensemble des techniques et procédés utilisant des systèmes biologiques en vue de la production de biens et de services. Les fermentations Bio-réacteurs industriels Amélioration végétale Industrie pharmaceutique... ® On fait souvent appel au génie génétique! Génie génétique: C’est un ensemble de techniques, faisant partie de la biologie moléculaire et ayant pour objet l’utilisation des connaissances acquises en génétique pour comprendre, modifier, utiliser ou reproduire le génome (ou une partie de génome) des êtres vivants. 2. LA GÉNÈSE DE LA BIOMOL 1865, Mendel formule ses lois de l'hérédité ; Première loi : Loi d'uniformité des hybrides de première génération Deuxième loi : Loi de disjonction des allèles Troisième loi : Ségrégation indépendante des caractères héréditaires multiples Notion de « matériel génétique » - Réplication - Stockage de l’information - Expression de cette information - Variations Jusqu’en 1944, les protéines sont candidates pour être ce matériel génétique... - Protéines = 50% poids sec d’une cellule - 1924, chromosomes = acide nucléique et protéines - 4 nucléotides vs 22 acides aminés - 1928, L'expérience de Griffith et le « facteur transformant »... ® Streptococcus pneumoniae virulent (S) ou non virulent (R) Quelle est la nature de ce « facteur transformant »? Il ne sait pas mais cela a permis de démonter qu’il y a un facteur transformant. De nos jours, on sait que c’est grâce à la transmission de matériel génétique grâce aux plasmides des bactéries, rendant une bactérie R ® S. 1944, Avery, McLeod et McCarthy trouvent le « facteur transformant » En utilisant de l’ADNase, les plasmides et l’ADN vont se coupler et il y aura transmission d’information, se faisant via l’ADN. L’ADN est le facteur transformant! 1  1944, l’ADN est le matériel génétique. 1953, découverte de la double hélice (Watson et Crick) 1961, Le code génétique est déchiffré par Niremberg 1973 : insertion un gène "étranger" dans une bactérie 1990-2004: projet génome humain - Le génome humain = 3,2.109 paires de base (bp) - Résultat: 14 ans de séquençage, 3.109 $, chromosomes provenant de plusieurs individus et le génome n’est pas totalement décrypté... - En 2008, génome de Watson: 4 mois de séquençage et 1,5.106 $ - Aujourd’hui, il est possible de séquencer le génome humain en 3 jours pour moins de 1000 €! - 2016: projet de synthèse du génome humain (HGP-Write) lancé! 2015-2018: Brésil, lâchers de moustiques Ædes ægypti transgéniques pour combattre l'épidémie de dengue 2019-2020: L’ADN ne serait pas le seul support de l’hérédité... Le génome, seul support de l'hérédité ? Ce dogme central de la biologie serait une impasse, à en croire un biologiste américain. C'est au contraire la cellule tout entière qui transporterait l'information génétique, avec son ARN, ses protéines, ses ions... 2021-...: Voici plus de 10.000 ans qu'aucun mammouth laineux n'a foulé le sol de notre Planète. Mais des ingénieurs et scientifiques espèrent aujourd'hui ressusciter l'espèce. Ou presque. Avec pour ambition que l'animal hybride qui en résultera puisse participer à notre effort pour limiter le réchauffement climatique. CHAPITRE 2 : STRUCTURE DES ACIDES NUCLÉIQUES 1. LES ACIDES NUCLÉIQUES Pourquoi la biomol se focalise-t-elle sur ces acides? Les acides nucléiques sont... - de deux types : l'acide désoxyribonucléique (ADN) et l'acide ribonucléique (ARN) - des macromolécules ou polymères composés d’un enchaînement de monomères, les nucléotides Les nucléotides sont composés de 3 éléments fondamentaux : - un groupe phosphate - un sucre (pentose) formant le nucléoside - une base azotée Les nucléotides sont caractérisés par - La nature du sucre: ribose (→ARN) ou désoxyribose (→ADN) - La nature de la base azotée: PURINES (composée de 2 cycles) ; o Adénine (A) o Guanine (G) PYRIMIDINES (composée d’1 cycle) ; o Uracile (ARN uniquement) (U) o Thymine (ADN uniquement) (T) o Cytosine (C) 2 Pour la nomenclature : A l’EXAM ; savoir redessiner un nucléotide/compléter un brin d’ADN 2. L’ADN Structure primaire de l’ADN (ADN simple brin) - Les nucléotides sont mis bout-à-bout, reliés par des liaisons phosphodiesters - Extrémité phosphate en 5’ - Extrémité -OH en 3’ - 5’-CAG-3’ (sens de synthèse) - Chargé négativement - Soluble dans l’eau - Associé à des cations et protéines cationiques Les brins s'enroulent de manière hélicoïdale (double hélice), ® épaisseur de 2nm Les brins sont complémentaires, liés par les bases (ponts H) - A avec T (2 ponts H) - C avec G (3 ponts H) ® Quantité de A = quantité de T (idem pour G et C) dans l'ADN. ® Les 2 brins sont la matrice l'un de l'autre. Les brins sont anti-parallèles Extrémité 3’ d’un brin est vis à vis de l’extrémité 5’ de l’autre Dénaturation de l’ADN (séparation des 2 brins) Très important pour les applications moléculaires (PCR, séquençage,...) Consiste à déstabiliser et rompre les ponts H entre les bases azotées complémentaires In vitro, la dénaturation de l'ADN se produit ; - par l'action de la température (↑) - par un pH élevé Le processus est réversible (assez rare dans le métabolisme), il y a alors hybridation (appariement des 2 brins, inverse de la dénaturation) 3  Structure tertiaire de l’ADN (compactage) Pourquoi est-ce nécessaire? - Epaisseur = 2 nm - Longueur ADN humain par cellule = 1 à 1,5 m - Au total, +/- 100.109 km d’ADN par adulte (500 x Terre – soleil) Succession de compactages... L’ADN (chargé -) se compacte et s’enroule autour de protéines, les histones (chargé +), pour former la chromatine. Les complexes histone-ADN se compactent par 8 et forment des nucléosomes (« collier de perles »). Les nucléosomes se compactent et forment un solénoïde. Lors de la formation des chromosomes, la chromatine se compacte pour former une chromatide. ® L’ADN n’est présent que sous forme de chromosome (2 chromatides sœurs) que quand il doit se diviser, le reste du temps il est sous forme de chromatine. 3. L’ARN Nature chimique ; - Sucre différent (ribose) - Uracile (U) remplace la thymine (T) Moins stable ® plus réactif (car possède un Structure ; groupement OH en plus (ribose) et la base azotée - Plus court Uracile est plus réactive que la thymine) - Simple brin Fonctions ; Si l’ADN = Dépositaire de l’information génétique, ARN = Expression de cette information génétique et Rôle enzymatique (Ribozymes = enzyme qui n’est PAS une protéine, cas spécial) Les types d’ARN ; - L’ARN messager (ARNm), produit de la transcription d’un gène 3% de l’ARN cellulaire - L’ARN de transfert (ARNt), transporteur d’acides aminés 15 % de l’ARN cellulaire - L’ARN ribosomal (ARNr), constituant du ribosome 80 % de l’ARN cellulaire - Les micro-ARN (mi-RNA), molécules régulatrices -... 4  CHAPITRE 3 : LA RÉPLICATION DE L’ADN Contexte: la division cellulaire schématisée... Mitose = division de donnant 2 cellules filles identiques G1 = croissance de la cellule fille (réplication du cytoplsame et des organites) G2 = préparation des enzymes G0 = ne concerne que certaines cellules qui n’ont plus le droit de se diviser (typique des cellules nerveuses) 1. MÉCANISME RÉPLICATION = mécanisme permettant d'obtenir, à partir d'une molécule d'ADN, deux molécules identiques à la molécule initiale (→ duplication) durant la phase S Mécanisme? 3 modèles sont proposés à l’époque (1950) - La réplication conservative : à partir d'une molécule d'ADN double hélice "mère", on forme une nouvelle molécule d'ADN double hélice totalement néo-formée. - La réplication semi-conservative : Chacun des deux brins de la molécule d'ADN double hélice "mère" sert de matrice pour la formation d'un nouveau brin complémentaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule "mère". - La réplication dispersive : Aucun brin ne reste intact, les nouveaux brins sont constitués à la fois d'ADN de la molécule mère et d'ADN néo-formé. L’expérience de Meselson et Stahl, 1958 ; - E. coli en culture dans un milieu contenant de l'azote lourd (15N = isotope) →les bases azotées de l’ADN sont saturées de 15N Rappel ; isotope = même nbre de protons MAIS nbre ¹ de neutrons donc masse ¹ - E. coli ensuite transféré dans un milieu contenant de l'azote normal (14N) →Si réplication de l’ADN, les nouvelles bases seront saturées de 14N - Extraction d’ADN après 1e, 2e et 3e générations (divisions synchronisées) - Centrifugation de l’ADN sur un gradient salin de densité (CsCl) → Séparation de l’ADN en fonction du poids moléculaire 5  Résultats attendus de l’expérience (Meselson & Stahl, 1958) ; ® La réplication suit le modèle semi-conservatif ! La réplication en détail ; Le matériel requis: - ADN simple brin parental (puisque semi-conservatif!) qui servira de matrice pour la réplication - Nucléotides: les désoxynucléotides triphosphates (dNTP), mélange de dGTP, dCTP, dATP et dTTp ® dNTP ; N veut dire les 4 bases en proportions égales - Des enzymes constituant le réplisome (complexe de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN, ex: l’ADN polymérase) et d’autres protéines associées. Les étapes principales de la réplication: - Initiation - Elongation - Terminaison 2. L’INITIATION 1. Commencer au bon endroit : Origine de réplication (Ori): séquence unique d'ADN permettant l'initiation de la réplication. Spécifique à l’espèce, uni-copie chez les bactéries (1 seule Ori) et multi- copies chez les eucaryotes (plusieurs Ori). Sur l’Ori, une ADN topoisomérase (capable de modifier la structure d’un ADN) spécifique (ex : ADN gyrase chez les bactéries) se fixe autour de l’ADN double brin et commence à dérouler l’hélice (supprime le surenroulement) 2. Obtenir un simple brin d’ADN : Des enzymes de type hélicase coupent les ponts H entre les bases complémentaires et séparent les deux brins d'ADN. Juste près le passage de l’hélicase, des protéines SSB (Single Strand Binding, se liant au simple brin) viennent se fixer temporairement sur l'ADN simple brin pour éviter qu'il ne se referme (fonction de stabilisation ® «annule» l’attraction des ponts H) à Création d’une « fourche de réplication », observable au microscope. 3. Préparer l’ADN pour l’élongation : Condition pour l’élongation: l’ADN polymérase n’est capable que d'allonger une région déjà partiellement double brin... Elle a besoin d'une amorce (primer) pour commencer à travailler. 6  Une primase (ARN polymérase capable de synthétiser une amorce d’ARN de novo, à partir d’une matrice d’ADN) vient synthétiser une amorce ARN complémentaire de +/- 10 bp des 2 côtés. 3. L’ÉLONGATION C’est la synthèse d’ADN double brin à partir des deux brins parentaux séparés (→ duplication) C’est l'ADN polymérase (ex : ADN pol III chez les procaryotes) qui ajoute, à l’extrémité 3' de la molécule en formation, des désoxyribonucléotides (hydrolyse pyrophosphate). Celle-ci peut se fixer grâce à la présence d’une amorce. L’ajout des désoxyribonucléotides se fait grâce à de l’énergie (groupements phosphates) libérée lors de la création phosphodiesters. Or les deux brins d’ADN parentaux sont antiparallèles! → mécanismes de synthèse différents suivant que l’on synthétise le « BRIN AVANCÉ » (leading strand) et le « BRIN RETARDÉ » (lagging strand) 7  Le brin avancé est synthétisé en continu (5’- 3’) Le brin retardé est synthétisé de manière discontinue ® Nécessite continuellement la synthèse d'amorces par la primase et la synthèse de courts fragments (+/- 1000 bp chez les procaryotes) par l’ADN polymérase dans le sens 5’ – 3’ (→Fragments d'Okazaki) ® Le brin retardé est donc constitué d’une chaine de fragments d’Okazaki (ADN et ARN) → il faut retirer l’ARN et lier les fragments - Exonucléase (ex: ADN polymérase I, RNAse H,...) pour extraire les amorces ARN - ADN polymérase (ex: ADN polymérase I,...) pour combler les trous avec des dNTP - ADN ligase pour lier les fragments d’Okazaki (utilisation d’ATP) Pour résumer : 8 4. LA TERMINAISON C’est la rencontre de deux fourches de réplication! Chez les procaryotes Caractéristiques ; - Une origine de réplication - Réplication bi-directionnelle (2 fourches de réplication) - Un site de terminaison Séquences « terminator » (ter) reconnues par des protéines Tus (Terminator utilisation substance) (ce ne sont pas des enzymes, elle ne font pas de « travail ») qui vont bloquer les ADN topoisomérase et hélicase. Intervention d’une topoisomérase type IV pour séparer les 2 chromosomes sur le point de rencontre des 2 fourches. Chez les eucaryotes Plusieurs origines de réplication (tous les 100 à 200 kbp) Réplication bi-directionnelle (2 fourches de réplication) Un signal de terminaison (... ® on n’en sait pas plus) + intervention de la cohésine et des topoisomérases type I et II (action→anaphase) 5. AUTRES DIFFÉRENCES ENTRE PROCARYOTES ET EUCARYOTES? L'ADN des procaryotes est circulaire, celui des eucaryotes est plutôt linéaire Une seule origine de réplication pour les procaryotes, contrairement aux eucaryotes qui en ont une multitude. Réplication rapide et continue chez les procaryotes: ® +/- 1000 bp/s pour l’ADN polymérase III (taux d’erreur très rare) (Ex: E. coli - 20 à 100 min au total) ® ADN Polymérases plus lentes mais avant age des multiples Ori VS réplication lente et discontinue chez les eucaryotes Arsenal de polymérases différent... Il n’existe que 3 ARN polymérase. L’ARN polymérase II est plus efficace que chez les eucaryotes, ce qui fait que les bactéries sont plus résistantes. 9  Les ADN polymérases procaryotes ; Les ADN polymérases eucaryotes ; (il en existe plusieurs) Chez les eucaryotes, il y a une fin à la molécule d'ADN (extrémités de chromosomes)... cela pourrait poser un problème lors de la réplication! - À chaque division d’une cell eucaryote, il y a une perte de matériel génétique car à l’extrémité d’un chromosome, la ligase ne pourra plus se fixer. Cela explique pourquoi on n’est pas éternel. La solution ; les télomères. 6. LES TÉLOMÈRES TÉLOMÈRE : région hautement répétitive, donc a priori non codante, d'ADN à l'extrémité d'un chromosome ® Ce n’est donc pas si grave si l’on perd du matériel génétique faisant partie du télomère car il ne code pour « rien » Fonction: assurent une protection des terminaisons chromosomiques...Pourquoi? À chaque réplication de l’ADN eucaryote, l’ADN polymérase s'avère incapable de copier les derniers nucléotides sur le brin retardé! ® l'absence de télomère signifierait la perte rapide d'informations génétiques nécessaires au fonctionnement cellulaire !! Les télomères agissent comme une horloge biologique régissant la durée de vie des cellules: théorie télomérique du vieillissement. Au plus une cellule se divise, au plus la séquence de nucléotides du télomère est courte. 10  Pourtant, certaines cellules peuvent se dupliquer très longtemps... (ex: cellules germinales, cellules souches ® leurs télomères sont intactes, non raccourcies). Qui gère les télomères? → C’est la télomérase. La télomérase = Enzyme composée de protéines et d'un ARN (comme les ribosomes), possédant une activité reverse-transcriptase (ARN→ADN), ayant pour fonction l’allongement des télomères. Le principe... Pour certains M-O (protozoaires, levures), pour les cellules germinales, souches et cancéreuses... → Télomérase très active, exprimée constamment. Pour les cellules somatiques →Réduction de l’expression de la télomérase au cours de la croissance →La longueur des télomères va dès lors limiter le nombre de divisions possibles →Senescence (quand une celle dégénère)et apoptose lorsque le télomère est trop court Vers un marqueur universel? →Stress et mauvaise hygiène de vie raccourcissent plus rapidement les télomères... →Le dosage de l’activité télomérase dans les tissus pourrait devenir un jour un marqueur prédictif et pronostique de notre santé... La télomérase vient de la synthèse des protéines donc un gène codant pour la télomérase. Certains scientifiques ont réussi à recréer de la télomérase/ rallonger les télomères et la mettre dans certains produits (crèmes,…) 11  CHAPITRE 4 : LA TRANSCRIPTION DE L’ADN 1. CONTEXTE Flux de l’information génétique: de la séquence ADN des gènes vers l’ARN messager vers la protéine (chaîne d’acides aminés) L’ADN des gènes est transcrit en ARN grâce à une ARN polymérase (capable de séparer localement les 2 brins d’ADN et ensuite de les restituer) ADN dépendante (sens de synthèse 5’-3’; NTP: UTP, ATP,GTP et CTP). Structure de l'ARN polymérase II (eucaryote) complexée avec l'ADN matrice (vert) et le brin d'ARN néosynthétisé (jaune). /!\ Brin matrice et brin sens ¹ de brin avancé et retardé ! L’ARN polymérase recopie une portion du brin « sens » de l’ADN en ARN. Brin « sens » et brin « antisens » = brin matrice L’ARN polymérase travaille sur le brin matrice. ARN = séquence du brin « sens » Le brins « sens »et le brin matrice peuvent échanger selon la localisation de la portion de gène à transcrire. → Un seul des 2 brins ADN est transcrit par unité de transcription 12  Gène = séquence d’ADN susceptible d'être transcrite en ARN (en vue d’une éventuelle traduction en protéine) (éventiuelle car par exemple il n’y a pas de transcription pour l’ARNribosomial ou l’ARN de transfert, seul l’ARN messager est traduit) La structure simplifiée du gène Le promoteur : séquence reconnue par l’ARN polymérase comme site d’initiation de la transcription (+/- 30-50 bp) (bp = paire de base) La région transcrite : la matrice à partir de laquelle l’ARNm est synthétisé (ordre de grandeur: 103 bp procaryotes à 106 bp eucaryotes) Le terminateur : séquence signalant la libération de l’ARN polymérase (et de l’ARNm) du gène (longueur variable) Différences entre procaryotes et eucaryotes … 13 2. LA TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES Pas de noyau ® Transcription et traduction se déroulent dans le même compartiment cellulaire Une ARN polymérase Trois phases ; Initiation, Elongation, Terminaison L’ARN polymérase Sous-unités α - Maintiennent le brin « sens » à l'écart - Permettent l’assemblage des autres sous-unités - (Reconnaissent le site promoteur) Sous-unités β, β‘ et ω - Assurent la liaison avec l’ADN - β‘ possède le site actif de la polymérase Sous-unité σ (détachable) - Diminue fortement l'affinité de l'ARN polymérase pour des séquences ADN - Augmente l’affinité pour le site promoteur du gène ® quand l’ARN polymérase possède sa sous-unité s, elle recherche un site promoteur de gène accessible. Si la sous unité s se détache cela devient une enzyme de cœur. Différence entre holoenzyme et enzyme « cœur » (core enzyme) HOLOENZYME - Enzyme « entière » α2ββ’ωσ - Reconnait un site promoteur sur l’ADN ENZYME « CŒUR » - Core enzyme α2ββ’ω - Transcription ARNm enclenchée (ne nécessite pas de site promoteur pour déclencher la transcription) Rem: La polymérase est fonctionnelle (in vitro sur ADN simple brin) sans la sous-unité σ mais ne sera pas spécifique. L’INITIATION ARN polymérase holoenzyme reconnait un site promoteur N1 = première paire de base transcrire Signe + = paire de base après l’ARN polylmérase Signe - = paire de base avant l’ARN polylmérase 14 ® Cette notion de région conservée vient du fait que les 2 boites ( -35 et -10) sont les 2 lieux de fixation de la sous unité s de l’ARN polymérase. Plus précisément, la sous-unité σ se fixe via la boite -35bp ® S’il y a une modification du nombre de nucléotides entre les 2 boites, la transcrption n’aura pas lieu car la sous unité s ne peut pas se fixer, il n’y aura pas de traduction, donc pas de protéine, donc mort de la cellule. Région conservée = région qui n’admet pas de mutation. Ouverture de la double hélice ADN au niveau de la boite de Pribnow (-10bp) Libération de la sous-unité σ au nucléotide +1→l’élongation peut commencer avec la core enzyme 15 L’ÉLONGATION Assurée par le core enzyme de l’ARN polymérase Sens de synthèse 5’-3’; avec des NTP; hybride ADN-ARN de 8 à 12 bp Des topoisomérases (désenroulent les brins d’ADN) précèdent et suivent l’ARN polymérase LA TERMINAISON C’est la libération de l’ARN polymérase et de l’ARNm Deux mécanismes possibles: - Terminaison avec le facteur ρ (ρ-dépendante) - Terminaison spontanée (ρ-indépendante) LA TERMINAISON ρ-DÉPENDANTE - ρ est une hélicase (sépare les 2 brins et casse les ponts H) ATP dépendante (besoin d’énergie pour travailler) - Une fois ρ fixée sur l'ARN elle se dirige vers l'extrémité 3' qui est en cours de synthèse - L’ARN polymérase ralentit sur une séquence ter (sur le site terminateur) - Lorsque ρ a rattrapée l'extrémité 3' au niveau de la polymérase, elle décroche l'ARN. L'ADN se referme et l‘ARN polymérase libère l'ADN. 16 LA TERMINAISON SPONTANÉE - Le site terminateur du gène possède une séquence ADN palindromique riche en GC suivit de A - L'ARN va donc être constituée d'une séquence palindromique (pouvant être lu dans les 2 sens) (C)n (G)n suivit de U. ® Cela forme une conformation en tête d’épingle - Cette extrémité forme une épingle à cheveux stable suivit d'un poly U apparié aux poly dA (hybride ADN-ARN au sein de l’ARN polymérase) - L'appariement entre U et dA est peu stable, l'ARN se décroche de l'ADN de façon spontanée, l'ARN polymérase libère l’ADN qui referme sa double hélice 17 3. LA TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES Présence d’un noyau ® Transcription et traduction sont séparées ARN Polymérases ; - ARN Pol I → ARNr - ARN Pol II → ARNm - ARN Pol III → ARNt Maturation nécessaire de l’ARNpré-m avant traduction - Présence d’ARN excédentaire (introns) - Protection vs exonucléases - Transport L’ARN polymérase II Énorme complexe protéique constitué de min. 12 sous-unités Demande un grand nombre de facteurs de transcription (TF) (interviennent ponctuellement) afin de se lier au promoteur et commencer la transcription Le promoteur du gène (pas de système de sous unité s) L’INITIATION Plus complexe que chez les procaryotes car ARN Pol II ne reconnait pas directement le promoteur du gène... Nécessite plusieurs facteurs généraux de transcription (protéines TF) pour permettre la fixation de l’ARN Pol II sur le site promoteur de l’ADN et l'initiation de la transcription Formation d’un complexe de pré-initiation de la transcription [séquence ADN du promoteur - facteurs de transcription – ARN polymérase] Le complexe de pré-initiation de la transcription ` 18  Ce complexe assure : - Le chargement précis de l'ARN Pol II sur le bon site de démarrage de la transcription (Inr) - L’ouverture de la double hélice ADN au niveau du promoteur - L’activation de l’ARN Pol II par phosphorylation via le TFII-H (activité kinase) L’activation de l’ARN Pol II par phosphorylation Il existe un contrôle sur le complexe de pré-initiation de la transcription via des facteurs protéiques complexes (médiateur) ® Le contrôle sur le complexe de pré-initiation de la transcription via des facteurs protéiques complexes (médiateur et activateur) L’ÉLONGATION Séparation avec le complexe d'initiation Lecture du brin ADN matrice et synthèse ARN dans le sens 5'-3' Utilisation de NTP environnants 19 LA TERMINAISON Mécanisme encore mal connu pour l’ARN Pol II... La terminaison est théoriquement assurée pour l’ARNm par des signaux spécifiques dont le signal de la région terminateur = poly-adénylation 5’-AATAAA-3’ (brin sens) …. ® entraine la terminaison L’ARN pol II semble pourtant transcrire bien au-delà de la fin de la région codante du gène. Complexe protéique interviendrait au niveau d’une séquence consensus dans le terminateur pour libérer l’ARN Pol II La maturation des ARNpré-m Les ARNm ne vont pas direct dans le cytoplasme, il y a d’abord une maturation. ARNpré-m dans le noyau juste après transcription : - Exons : fragments d’un ARNpré-m qui se retrouvent dans l’ARNm cytoplasmique après épissage = ce qui va être exprimé - Introns : fragmnents d’ARNpré-m éliminés au cours de l’épissage ® Notion différente de codant et non-codant ® c’est faux ARNm mature dans le cytoplasme : → Modifications post-transcriptionnelles dans le noyau (mais pas encore de traduction) 1. Addition d'une coiffe protectrice à l'extrémité 5' 2. Poly-adénylation à l'extrémité 3‘ (queue poly-A) n’ont pas un ordre précis 3. L’épissage (excision des introns) 1. Addition d'une coiffe protectrice à l'extrémité 5' Participe au transport des ARNm vers le cytoplasme Est nécessaire pour l’initiation de la traduction Protège l’extrémité 5’ des ARNm contre la dégradation des exonucléases = nucléases attaquants les extrémités 3’ et 5’. Nucléase = enzyme qui permet de détruire des portions d’ARN sans queue ni coiffe (= virus), c’est un système de détection, de protection. Il existe deux types de nucléases, les endonucléases = clivent les acides nucléiques au milieu des acides nucléiques et les exonucléases = clivent la chaîne d'acide nucléique à ses extrémités. ® C’est l’addition d’un GTP méthylé sur le premier nucléotide de l’ARN, par une liaison 5’-5’ triphosphate. L’enzyme exonucléase ne sait donc pas s’y fixer suite à un encombrement stérique = système de protection. 20 2. Poly-adénylation à l'extrémité 3‘ (queue poly-A) Participe à la migration des ARNm dans le cytoplasme Protège les ARNm de la dégradation par exonucléase même fonction que la coiffe Est nécessaire pour l’initiation de la traduction ® C’est l’ajout de 20 à 200 AMP (ne bloque pas l’exonucléase) par la poly- A polymérase, 20 à 30 nucléotides après la séquence terminateur 5’- AAUAAA-3’ L’intérêt de cet ajout est de permettre à l’exonucléase de grignoter la queue poly-A sans qu’il n’y ait de conséquences, c’est une sorte de « bluff ». - Reconnaissance du site de poly-adénylation AAUAAA par des protéines : CstF (cleavage stimulation factor) et CPSF (Cleavage and polyadenylation specificity factor) ® ce sont les 2 facteurs amenés et qui sont resté accroché à l’ARN pol III - Clivage de l’ARN 20-30 bp plus loin (site CA – cytosine, adénosine c’est là où il y aura le clivage) par une endonucléase spécifique - Intervention de la poly-A- polymérase (PAP) qui ajoute des AMP (ATP→AMP + PP) en 3’ : 5’-CAAAA(A)nA-3’ 3. L’épissage Étapes de coupure et ligature qui conduisent à l'élimination des introns grouped'enzymesquiintervientas l'épissage Assuré par le splicéosome = groupe d’enzymes qui intervient dans l’épissage (complexe de ribonucléoprotéines, snRNP) Le principe... (1) Clivage de l'ARN en 5‘-GU de l'intron et formation d'un lasso par liaison 2'-5' entre le G terminal de l'intron et le site de branchement A interne à l'intron (2) Clivage de l’ARN en AG-3’ entre intron et exon, libération du lasso et jonction des 2 exons 21  La réalité est plus complexe : l’épissage alternatif - Processus qui permet à un même gène de générer différents transcrits selon la combinaison des exons qui formeront l'ARN messager mature - Observé pour la 1ère fois en 1977 sur un virus et en 1981 sur un eucaryote (calcitomie = la gestion du calcium – CGRP = gestion de la douleur ® il n‘y a aucun rapport entre leurs 2 fonctions pourtant ils viennent du même gène, cette ¹ est dû à l’épissage alternatif ; on coupe les exons et les introns différemment selon les situations, cela va donc coder pour des protéines ¹, donc des fonctions ¹) - « Un gène peut coder plusieurs protéines différentes » - L’épissage alternatif explique pourquoi 30 000 gènes peuvent fournir plus de 100 000 protéines chez l’humain L’épissage alternatif 22  Finalement, on obtient un ARNm mature ® typique des eucaryotes, pas de maturation chez les procaryotes La transcription de l’ADN en images – Eucaryote La transcription de l’ADN en images – Procaryote 23  CHAPITRE 5 : LA TRADUCTION 1. CONTEXTE Flux de l’information génétique: de la séquence ADN des gènes (chaîne d’acides nucléiques) vers l’ARN messager vers la protéine (chaîne d’acides aminés) Passage d'un langage « acide nucléique » (4 lettres ® AT/UGC) à un langage « acide aminé » (20 lettres) → Nécessité d’un code génétique... Traduction: Interprétation des codons de l'ARNm en acides aminés Comment traduire cet ARNm en protéine (la calcitonine)? 2. LE CODE GÉNÉTIQUE CODE GÉNÉTIQUE = Ensemble de règles permettant de traduire les informations contenues dans le matériel génétique des cellules vivantes (succession de nucléotides) afin de synthétiser les protéines (succession d’acides aminés) →Correspondance entre le génotype et le phénotype d'un organisme Il faut un code à minimum 3 bases pour obtenir au moins 20 combinaisons différentes (43 = 64 combinaisons au total)→ Ces triplets de base sont appelés codons Les principales caractéristiques du code sont ; - Universel: un codon code le même acide aminé pour tous les organismes (sauf rares exceptions chez les organites) ® Important pour la transgénèse /!\ (pour créer un OGM, par exemple insérer un caractère de procaryote à un eucaryote car ces deux organismes ont un code génétique unniversel) - Spécifique: un codon ne code qu'un seul acide aminé (l’inverse n’est pas vrai !) - Dégénéré (redondant): un acide aminé peut être codé par plusieurs codons (64 combinaisons de triplet pour 20 acides aminés) Par exemple ; UGC ® cytséine et cystéine ¬ UGC, UGU - Cadre de lecture « règlementé » et ponctué LA PLUS IMPORTANTE o Les codons successifs codent pour des acides aminés successifs o Lu dans le sens 5’-3’, pas de chevauchement, pas d’espac o 1 codon initiateur : AUG (Met) et 3 codons stop : UAG, UGA, UAA (pas d’aa associé) - Résistant vis-à-vis de certaines mutations … ® moins de risuqe de changer la protéine ® en favorisant la protéine les redondances, s’il y a une mutation, il y a moins de danger donc Résistance 24 ® c’est souvent au niveau de la 3e lettre (base), que les mutations sont permises  L’importance du cadre de lecture : Exemple : Cadre de lecture sur l’ARNm de la calcitonine 1. Recherche du codon initiateur.... 2. Séquençage des codons (triplets) et arrêt si codon stop... 3. Traduction... A l’exam ® séquence à traduire en protéines 25 3. LES PRINCIPAUX INTERVENANTS DE LA TRADUCTION ª ARNm Information, matrice de codons Chez les eucaryotes : ARNm monocistronique (1 ORF) = 1 info pour 1 gène qui va donner 1 peptide. (Se dit d’un ARNm ne possédant qu’un seul cistron et qui donc code une seule chaîne polypeptidique). Chez les procaryotes: Souvent, chaque ARNm peut être lu de plusieurs façons et donner plusieurs produits : l'ARNm est polycistronique (x ORF) (Se dit, chez les procaryotes, d’un ARN messager résultant de la transcription de plusieurs gènes contigus). ª ARNt Interface « clé » entre un codon de l’ARNm et un acide aminé Petits ARN de 75 à 95 nucléotides, structure secondaire en forme de trèfle (formations d‘épingle à cheveux), tertiaire en forme de L inversé Composé de nucléotides classiques (AGCU) et nombreux nucléotides modifiés post transcription (inosine, mG (méthyl-guanine), pseudouridine, mU,...) ® se passe dans le RER ® il existe donc 61 anticodons (64-3 anticodons STOP) Rôle des structures... - L’extrémité 3’ est le bras accepteur: c'est là que se fixe l'acide aminé (5’-CCA- 3’) - La boucle A (contient l’anticodon) interagit avec l'ARNm et reconnaît le codon complémentaire - La boucle D (contient des dihydrouridines) interagit avec la aminoacyl-ARNt synthétase - La boucle TΨ (contient thymidine et pseudouridine) interagit avec le ribosome 26 ARNt : la fixation de l’acide aminé sur le bras accepteur... Remarques : Une aminoacyl-ARNt synthétase pour chaque acide aminé! (20 en tout) Puisque le code est dégénéré, plusieurs ARNt interagissent avec la même aminoacyl-ARNt synthétase 27  ª Ribosomes Complexes ribonucléoprotéiques (RNP) universels (Pro- et Eucaryotes) Fonction: biosynthèse des protéines Assemblage (sur ARNm) - dissociation (dans le cytoplasme) de deux sous-unités asymétriques : - la grande sous-unité (rôle: formation chaîne d’acides aminés) - la petite sous-unité (décodage ARNm) Dans le cytoplamse les deux sous unités sont séparées. Composition des sous-unités pro-/eu- caryotes ® permet d’identifier les organismes ® Rappel ; ribosomes = assemblage de protéines ET de ARNr ® Très peu de mutations sont autorisées car si mutation = problème d’assemblage des 2 sous unités et donc pas de traduction. Ribosome procaryote ; 50S + 30S Ribosome eucaryote ; 60S + 40S Ribosomes : 4 sites de liaison - Site de fixation de l’ARNm (petite sous-unité): permet l’assemblage du ribosome autour de l’ARNm - Site A : réception de l’ARNt chargé d’un acide aminé (amynoacyl ARNt) - Site P : liaison de l’ARNt avec la chaîne peptidique (peptidyl ARNt) - Site E : évacuation de l’ARNt « vide » 4. LES ÉTAPES DE LA TRADUCTION PROCARYOTE ª INITIATION 1. Association des facteurs d’initiation (IF1 et IF3) (protéines qui interviennent momentanément) et de la petite sous-unité ribosomale (30S) → Ce complexe recherche une région riche en purine: le ribosome- binding-site (RBS), appelé aussi site Shine-Dalgarno 28  2. Positionnement correct de la petite sous-unité (le 16S ARNr s’apparie avec le RBS) → Le codon initiateur est correctement placé sous le site P du ribosome 3. Fixation une GTP (énergie) et d’un ARNt – fMet (formylméthionine) via le facteur d’initiation IF2 →Le complexe IF2-GTP-ARNt – fMet se place sur le codon initiateur 4. Fixation de la grande sous-unité (hydrolyse de la GTP en GDP) et libération des facteurs d’initiation → Le ribosome est près pour l’élongation ª ÉLONGATION 1. Reconnaissance du codon: un aminoacyl ARNt adéquat se lie au codon du site A (consommation d’un GTP en GDP) 2. Liaison peptidique entre le nouvel acide aminé et l’extrémité carboxyle du polypeptide en cours de synthèse (consommation d’un GTP en GDP). 29 3. Translocation : Le ribosome avance d’un codon sur l’ARNm (consommation d’un GTP en GDP). Le peptidyl ARNt qui se trouvait sur le site A passe sur le site P. L’ARNt « vide » qui se trouvait sur le site P passe sur le site E et est éjecté...Etc! ª TERMINAISON Reconnaissance du codon stop par un facteur de terminaison (protéine RF pour Releasing Factor). Hydrolyse de la liaison ARNt-polypeptide, la chaîne d’acides aminés est libérée (consom. d’un GTP en GDP). Dissociation du ribosome (consom. d’un GTP en GDP) 5. LES ÉTAPES DE LA TRADUCTION EUCARYOTE ª INITIATION 1. Association des facteurs d’initiation (eIF1, eIF2 et eIF3), de la petite sous- unité ribosomale (40S), d’un GTP et de l’ARNt – Met → Ce complexe recherche eIF4 sur la coiffe 2. Déplacement du complexe facteurs d’initiation – petite sous-unité – GTP – ARNt – Met jusqu’au codon initiateur. Libération de eIF4 3. Fixation de la grande sous-unité (hydrolyse de la GTP en GDP) et libération des facteurs d’initiation → Ribosome prêt pour l’élongation ª ÉLONGATION ® Idem procaryote ª TERMINAISON ® idem procaryotes 30 6. LE COÛT ÉNERGÉTIQUE DE LA SYNTHÈSE PROTÉIQUE Synthèse des aminoacyl ARNt → 1ATP/élément Initiation (IFs, sous-unité, ARNt – Met) → 2GTP et 1 ATP Elongation → 2GTP/acide aminé Terminaison → 2GTP → Coût énergétique très élevé pour la cellule! 7. EFFICACITÉ DE LA SYNTHÈSE PROTÉIQUE Vitesse du ribosome : - 20 acides aminé/s chez les procaryotes - 3 à 5 acides aminé/s chez les eucaryotes → « Pas très rapide » si besoin de grandes quantités de la protéine... Exemple : titine (protéine musculaire), 30 000 acides aminés→2-3 h! Amplification par poly(ribo)somes 31  CHAPITRE 6 : LA RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES 1. CONTEXTE On est parti de cellules au stade Morula – cellules non différenciées pour se différencier en neurone, leucocyte, cellules photoréceptrices (spécialisées dans la réception de photons). Toutes ces cellules possèdent le même matériel génétique mais elles se sont différenciées. Autre exemple ; Même espèce mais fonction différente. Toutes les fourmis de la même espèce de toutes les fourmilières différentes pondent en même temps par exemple. C'est un synchronisation mais on ne sait pas trop comment ® Maitrise de l'expression des gènes. Certaines bactéries sont capables de sporuler si le milieu devient défavorable. L’endospore est une spore de survie qui peut rester dans dizaines d’années. En résumé, que ce soit Différentiation cellulaire, Métamorphose complète, Polymorphisme de caste Sporogenèse → Même matériel génétique mais fonctions et/ou environnements différents → Tout le génome n’est pas nécessaire en continu → Il existe donc une régulation de l’expression des gènes (même génotype mais phénotype différent) 2. RÉGULATION GÉNIQUE DES PROCARYOTES 2.1. Les opérons Définition: Unité d'ADN fonctionnelle regroupant des gènes qui opèrent sous le signal d'un même promoteur de transcription 3 composants principaux : - Le promoteur: séquence ADN qui permet la transcription du gène en ARNm (site de fixation de l’ARN polymérase) - L’opérateur: séquence ADN auquel une protéine régulatrice se lie. Cette liaison permet ou empêche la transcription des gènes de l'opéron - Les gènes structuraux: séquence ADN qui sera transcrite en ARNm polycistronique et sera traduit en polypeptides Extérieur à l’opéron: le gène régulateur qui code pour la protéine régulatrice. 32  Il existe deux types de régulation ; positive et négative. Opérons inductibles (pas exprimés par défaut et l’expression doit être provoquée) et opérons répressibles (exprimés par défaut et l’arrêt de la transcription doit être provoquée) ® il existe 4 types d’opérons (soit positif ou négatif ET inductible ou répressible) EXEMPLE DE L’OPÉRON LACTOSE D’ESCHERICHIA COLI - Si absence de lactose dans le milieu: très faible activité β-galactosidase - Si présence de lactose dans le milieu: très forte activité β-galactosidase → Il s’agit donc bien d’une enzyme inductible (opéron inductible) → F. Jacob et J. Monod : Prix Nobel de médecine 1965 Présentation de l’opéron... Si ABSENCE de lactose: transcription du gène LacI et synthèse du répresseur→fixation du répresseur sur l’opérateur → pas de transcription des gènes structuraux Si PRÉSENCE de lactose : fixation du lactose sur le répresseur→ dissociation du complexe répresseur- opérateur→transcription des gènes structuraux. 33  Le lactose agit comme inducteur des enzymes chargées de sa métabolisation → Opéron inductible – régulation négative Que se passe-t-il si présence de glucose ? si il y a du glucose dans le milieu, la bactérie le prend => elle aura énormément d'ATP et très peu d'AMP si une bactérie est mal, pas de glucose => la cellule continue d'utiliser de l'énergie quand même mais au fur et à mesure on aura beaucoup plus d'AMP Présence du site activateur (site CAP), activé par la fixation du complexe protéine CAP-AMPc Taux d’AMPc inversement proportionnel au taux de glucose Rappel ; ATP devient ADP puis AMP à force de donner de l’énergie Si absence de glucose (AMPc ↑) et présence de lactose: complexe protéine CAP-AMPc fixé sur site CAP et active la transcription. Si présence de glucose (AMPc ↓) et présence de lactose: peu de CAP- AMPc fixé sur site CAP et donc peu d’activation de la transcription. Pour résumer ; 34  EXEMPLE DE L’OPÉRON TRYPTOPHANE D’ESCHERICHIA COLI E. Coli (prototrophe) est capable de synthétiser l’acide aminé tryptophane via l’opéron suivant: Un prototrophe est un organisme vivant capable de proliférer dans un milieu de base (milieu minimum) sans nécessiter la présence de facteurs de croissance particuliers. Il synthétise lui-même les substances nécessaires à sa prolifération. Si la concentration de tryptophane est trop élevée dans la cellule, l’activité des enzymes correspondantes diminue fortement. Il s’agit donc bien d’enzymes répressibles (opéron répressible) car il doit toujours fabriquer des acides aminés. Si à un moment donné, la cellule utilise moins de tryptophane, la concentration de celle-ci va ↗. Si la concentration de trp est élevée: le trp (co-répresseur) active le répresseur → l’ARN polymérase est bloquée. Le tryptophane agit comme répresseur des enzymes chargées de sa biosynthèse → Opéron répressible – régulation négative EXEMPLE DE L’OPÉRON ARABINOSE D’ESCHERICHIA COLI La protéine régulatrice (AraC) est à la fois répresseur et activateur. Si absence d'arabinose (=sucre), AraC agit comme répresseur en créant une boucle dans l'ADN par fixation des opérateurs araO-araI (ARN pol ne peut pas se fixer sur le promoteur) ® à cause de la boucle, l’ARN polymérase ne sait pas se déposer, il n’y a donc pas de transcription. 35  Si présence d'arabinose, le complexe AraC-arabinose agit comme activateur en se fixant sur l'opérateur araI. ® Transcription accentuée si faible concentration en glucose par fixation de CAP-AMPc sur l’opérateur araI (idem opéron lactose). ® Si on ajoute de l’arabinose dans le milieu, Ara C protéines sera plus attiré par l’opérateur aral que par l’opérateur araO (donc pas de boucle formée), l’ARN polymérase est donc libre et la transcription peut commencer. → Opéron inductible – régulation positive et négative GRAND INTÉRÊT POUR LE GÉNIE GÉNÉTIQUE Opérons ou opérateurs insérés dans les plasmides commerciaux pour la production de protéines d'intérêt en grandes quantités. 2.2. Le quorum sensing DÉTECTION DU QUORUM: mécanisme de synchronisation de l'expression (ou de la répression) de gènes particuliers, au sein d'une population bactérienne et en fonction de la densité de cette population. La détection du quorum, ou quorum sensing, est la capacité d'un micro-organisme (bactérie, archée, microchampignon, virus) à détecter et à réagir à la densité de population de ce microbe par des mécanismes de régulation génétique. PRINCIPE: - Utilisation de signaux moléculaires extra-cellulaires dits « auto- inducteurs » (fabriqués de manière constante) sécrétés en permanence - Si faible population : ↘ concentration de l’auto-inducteur, facteur de transcription non lié → pas d’expression du gène 36  - Si forte population: ↗ concentration de l’auto-inducteur, quorum atteint, facteur de transcription lié à l’auto-inducteur ® transcription activée Il y a tellement d’auto inducteurs dans le milieu, qu’il y aura une diffusion facilitée, il va donc entrer dans la bactérie et va induire la transcription du gène. Les bactéries communiquent !! (via des signaux chimiques ® des auto inducteurs) Exemples ; - Bioluminescence (Vibrio fisheri) Vit en milieu marin, cette bactérie ne brille pas seule sauf si elle atteint son quorum (quantité importante de bactérie) La détection du quorum a été observée pour la première fois chez Vibrio fischeri, une bactérie bioluminescente et symbiotique, vivant dans l'organe lumineux de certains céphalopodes comme la sépiole. Quand les vibrions sont sous forme planctonique (à l'état libre), la concentration du signal moléculaire que les bactéries produisent, appelé auto-inducteurs, est faible, et les cellules ne sont pas luminescentes. Au contraire, dans l'organe lumineux de la sépiole, où les vibrions sont très nombreux (environ 1011 cellules par mL), les auto-inducteurs présents à haute concentration sont perçus par la population bactérienne, stimulant ainsi la transcription d'un gène associé à la synthèse de luciférase, un enzyme capable de produire de la lumière à partir d'ATP. - La virulence Par exemple, i est impossible pour une bactérie phytophage seule de traverser la paroi/cuticule/membrane pour atteindre le glucose à l’intéreiur de la plante, pour cela il faut que plusieurs bactéries se mettent en groupe, qu’elle atteingnent leur quorum. - Les biofilms Exemple de digestion coordonnée en milieu marin. ® les bact produisent des autoinducteurs et du gel extracellulaire qui leur permet de capter des nutriments présents dans l’eau. 37 2.3. Les ribo-régulateurs CONTEXTE: Vu jusqu’à maintenant: modèles de régulation génique reposant sur des facteurs capables de réguler positivement ou négativement la transcription de l’ADN en ARNm → permettent d’expliquer l’induction rapide d’une fonction en réponse à un signal externe Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’expliquer l’inhibition rapide d’une fonction car les ARNm et les protéines préalablement produits restent présents dans la cellule même après que le gène ait cessé d’être transcrit Il existe des systèmes d’inhibition spécifique des ARNm et des protéines, activables en réponse à des stimuli endogènes ou à des stress environnementaux → régulation post-transcriptionnelle et post- traductionnelle Quelques modes (3) d’action des ribo-régulateurs (sARN): 1. Les ribo-régulateurs produisents des ARN antisens qui se fixent sur la région RSB de l’ARNm ce qui fait que celui-ci ne sera plus reconnaissable pour être traduit. 2. Clivage des ARNm par des ARN-ase qui détecte les doubles brins et les découpes 3. Induction d’une séquence palindromique et donc formation d’une tête d’épingle non reconnaissable par le ribosome. /!\ Possibilité de réactivation (= phénomène inverse) si un ARN antisens arrive près de la tête d’épingle (celles-ci étant complémentaires va se détacher), ce qui va libérer la région SBS et donc être reconnue par le ribosome. 38  Autre mode d’action des ribo-régulateurs ® riboswitch La cellule contrôle la concentration du ligand. Si concentration ↗ du ligand, cela va former une tête d’épingle en emmenant la région RBS donc non reconnaissable, donc pas de traduction. Et inversement si faible concentration du ligand, alors celui-ci se détache et libère la région SBS qui devient reconnaissable. ® fonctionne comme un bouton on/off selon la concentration du ligand. 3. RÉGULATION GÉNIQUE DES EUCARYOTES - Régulation chromatidienne - Régulation transcriptionnelle - Régulation post-transcriptionnelle - Régulation traductionnelle - Régulation post-traductionnelle 5.1. La chromatine EUCHROMATINE (état décondensé, transcription active) vs HÉTÉROCHROMATINE (état condensé, transcription inactive) Modifications des histones par acétylation, méthylation, phosphorylation → Code histone Méthylation de l’ADN (5-10% des cytosines ): mécanisme de novo et conservatif ! Des groupements méthyls s’accrochent sur les bases de l’ADN, ce qui empêche la transcription (surtout dans la région promotrice)`ù, du coup les facteurs de transcriptions ne reconnaissent plus l’ADN. Lors de la réplication les cystosines ayant des groupements méthyles sont « répliqués » (sans les groupements), les cystosines sont reconnuse par la méthylase et vont subir une méthylation. 39 Ce mécanisme permet ; ® gestion de la transcription ® différenciation cellulaire (ex ; des groupements méthyls sur tout un gène pour éviter sa transcription) ® inactivation du 2e chromosome X chez les femmes (car sinon on aurait des gènes en plus et donc des protéines en pus, et cela n’est pas possible, il faut donc inactiver ce chromosome ) ® empreinte génétique parentale Intéressant pour l’épigénétique, gene silencing … La méthylation est en lien avec l’hygiène de vie car si on « stress » l’ADN, celui-ci est plus propice à faire des méthylations. 5.2. La transcription Séquences activatrices ou modératrices au niveau du promoteur Facteurs de transcription généraux, spécifiques ou inductibles Motifs (protéiques) d’interaction avec l’ADN Médiateur et activateur Schéma médiateur et activateur 40 5.3. La post-transcription Épissage alternatif ® pouvoir faire plusieurs protéines à partir de du même ARNm en fonction des exons et des introns. Modification éditoriale de l’ARNm ® il existe dans nos cellules des enzymes très complexes qui peuvent éditer, c'est-à-dire modifier l’ARNm en changeant leurs bases. Exemple de l’édition de l’apolipoprotéine B ® Cela veut dire qu’un même gène peut coder pour des protéines ¹ si l’ARNm a subi une modification par une enzyme (éditage). Stabilisation ou dégradation de l’ARNm (durée de vie limitée de l’ARNm, on peut dégrader un ARNm en ↗ les nuclléases) Petits ARN interférents (siARN) Le complexe RISC (=petits soldats) sont des protéines qui prennent les morceaux d’ARN coupés et les garde « en mémoire » donc reconnaissable (puisqu’elles sont complémentaires) en cas de réinfection DONC si récidive ® appel aux nucléases. (même système que les lymphocytes T). ARNm du gène endogène dans la cellule cible a la même séquence que l’ARN étranger (grâce à la mémoire des petits soldats) donc l’ARN va être reconnu par les petits soldats qui vont faire appel aux nucléases qui vont détruire le gène (il n’a plus d’utilité) Exemple des Petunia sp. Objectif: Petunia GM avec plus de copies du gène chalcone synthase (CHS), codant une enzyme clé de la biosynthèse de l'anthocyanine (couleur violette) 41 Résultats ; une partie des cellules a reconnu l’ARN étranger contenant le gène CHS et l’a donc neutralisé, et c’est donc pour cela que c’est devenu blanc, d’autres cellules l’ont « acceptées » et c’est pour cela que c’est plus foncé. … 5.4. La traduction Inhibition de la lecture de l’ARNm Inhibition des facteurs de traduction Régulation par les microARN (miARN)... 4. POUR CONCLURE... Darwin (selon sa théorie il existait des girafes avec des tailles de cou différentes ¹ et celle avec le cou le plus long a été sélectionnée par la sélection naturelle) et Lamarck (selon sa théorie, les girafes ont modifié leur code génétique pour allonger leur cou et avoir une meilleure survie) On a longtemps pensé que la théorie de Darwin était la bonne car il était impossible de changer son code génétique, mais de nos jours grâce à la découverte des mécanismes de modification de l’expression des codes génétiques, cela fait place au débat. Génétique: étude des gènes et de leur hérédité Épigénétique : étude de la régulation des gènes (et de leur hérédité??) Le débat sur la transmission de modifications épigénétiques acquises reste largement ouvert... 42  CHAPITRE 7 : GÉNIE GÉNÉTIQUE – BOITE À OUTILS 1. EXTRACTION ET PURIFICATION DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE Où se trouve le matériel génétique? - Procaryotes ® ADN circulaire, plasmides - Eucaryotes ® ADN mitochondriale, ADN nucléaire, ADN chloroplastes - Les virus Quelle est la nature du matériel génétique? - ADN→ADN nucléaire + ADN mitochondrial Identique pour toutes les cellules de l’organisme Information génétique complète Stable - ARN→ARNm, ARNt, ARNr, sARN,.... Spécificité tissulaire des ARNm Information sur l’expression des gènes Sensible au RNAses Quelle quantité? - 2 (copies) * 3*109 (taille du génome humain en pb) * 660 (masse molaire d’une pb) / 6,02*1023 (nbre Avogadro) = 7*10-12 g/cellule (7pg/cellule) - Quantification par spectrophotométrie: ® Permet de calculer la concentration en ADN L'ADN a un spectre d'absorption en UV maximum à 260 nm (longueur d’onde) Ce spectre d’absorption est proportionnel à la concentration de l’ADN : une unité de densité optique (DO) à 260nm correspond à 50µg d’ADN double brin ou à 40 µg d’ARN simple brin par mL. [ADN] = DO 260 x facteur de dilution x 50 (en µg/mL) Exemple : A260 = 0,2 DO, dilution de 5 mL dans 45 mL eau (donc Vtot = 50mL), [ADN] ? ® [ADN] = 0,2 x (50/5) x 50 = 100 µg/mL. A savoir-faire à l’exam !!!! 43 Les principales étapes d’extraction/purification des ac. nucléiques : 1. Prélèvement biologique 2. Lyse des cellules nucléées (détergents, traitements mécaniques,...) 3. Dégradation des protéines (protéinase K ® s’attaque aux nucléases en les inactivant) 4. Extraction des ac. Nucléiques (centrifugation, solvants,...) 5. Précipitation de l’ADN (alcools, centrifugation) ® ADN insoluble dans l’alcool donc précipite 6. Purification ® on mélange avec de l’alcool de ¹ concentrations pour n’avoir que l’ADN 7. Élution ® on rajoute de l’eau extrêmement pure donc l’ADN se solubilise Les outils enzymatiques ª Nucléases: coupent les liens phosphodiesters Ne pas confondre avec les ponts H qui eux se cassent par la t° ou le pH ® Exonucléases (ADN, ARN) - Sens5’–3’ - Sens3’–5’ ® Endonucléases non-spécifiques - DNAse I → ADN double ou simple brin - RNAse A→ARN et RNAse H (hybride ADN/ARN) ® efface toute trace d’ADN - Nuclease S1→ADN simple brin ® Enzymes de restriction = endonucléases spécifiques - Endonucléases particulières d’origine bactérienne - Séquences spécifiques de reconnaissance (4-10 pb, palindromes) - Coupures franches (|) ou cohésives (|---|) - Nomenclature précise ® neutralise les séquences palindromiques Exemple ; EcoRI (Escherichia coli RY317, enzyme I) ® ne coupe que si il voit GAATTC ® Site de coupure à 6 bp (paire de base) (1/46 = possibilité qu’il y 1 chance sur 4096 d’avoir cette région palindromique dans une séquence d’ADN ; 4 car 4 bases ¹ et 6 car région constituée de 6 bp), cette coupe forme des extrémités cohésives 5’ (en rose) (= ce qui dépasse, qui peuvent se remetre grace à une ligase pour recoller les sucres et les phosphates) HaeIII (Haemophilus aegyptius, enzyme III) →Site de coupure à 4 bp (1/44 ® crée donc plus de fragments car plus svt de coupures), extrémités franches 44  FseI (Frankia sp. Eu11b, enzyme I) → Site de coupure à 8 bp (1/48), extrémités cohésives 3’ (coupe dans l’autre sens) à Ces enzymes ne nécessitent pas d’énergie ! ! Les enzymes de restriction. La carte de restriction - Plusieurs centaines d’enzymes de restriction connues - Grande utilité pour le génie génétique : digestion enzymatique de l’ADN contrôlée! 2. LES OUTILS ENZYMATIQUES - Nucléases: coupent les liens phosphodiesters - Ligases: catalysent les liens phosphodiesters (5’P – OH 3’) ® fait une soudure entre un groupement OH et Pi - Polymérases: synthèse d’ADN et ARN (5’→3’!!) ADN polymérases: matrice = ADNsb + amorces, produit = ADN, peuvent être modifiées → thermostable ARN polymérases: matrice = ADNsb, produit = ARN ADN polymérases reverse-transcriptase: matrice = ARN + amorces, produit = ADNc 3. SÉPARATION DE FRAGMENTS D’ADN (OU ARN) ET VISUALISATION Combien de fragments différents a-t-on obtenus? Quelle est leur taille (pb)? Peut-on quantifier ces fragments? Electrophorèse sur gel (agarose ou acrylamide) 1. Chaque échantillon d’ADN (fragments obtenus suite à des enzymes de restrictions) est déposé dans un puits du gel. 2. Si un courant est appliqué dans la solution tampon, les fragments d’ADN migreront de la cathode (excès d’e-) vers l’anode (déficit d’e-). L’ADN est chargé négativement et va migrer vers là où il y a un déficit d’e-. 3. Plus un fragment est petit, plus sa vitesse de migration sera grande → Séparation ! Attention il faut arrêter au bon moment pour cela on utilise des indicateurs de couleurs. 45 Cependant l’ADN est incolore et pour pouvoir observer la migration, il faut le colorer. ® la vitesse de propagation est inversement proportionnel à la taille du fragment d’ADN ® Au plus le fragment est grand au plus la distance de migration est petite. ® Arrive en premier le plus petit fragment et en dernier le plus gros. Exemple: 1. Echelle de poids moléculaire (pb) ® pour voir comparer et estimer la taille du fragment de l’échantillon 2. Témoin positif (ex ; échantillon qui a le covid) 3. Echantillon A Échantillon à tester 4. Echantillon B 5. Témoin négatif (ex ; échantillon qui n’a pas le covid/eau pure) 6. Echelle de poids moléculaire Quantification possible ? Non Electrophorèse capillaire ® même principe sauf que ce système permet une quantification grâce à un détecteur/photomètre qui détecte chaque fragment pour chaque capillaire, de plus dans chaque puit on rajoute une échelle de poids moléculaire qui va être détectée d’une autre couleur par le photomètre. 46 4. HYBRIDATION Rappel hybridation : Association de 2 séquences d’acides nucléiques simples brins sur base de leur complémentarité Sondes moléculaires : séquences d’ADN complémentaire de la séquence cible (syn.: séquence d’intérêt) Exemple: recherche d’une mutation génétique entraînant une maladie A. Digestion enzymatique (fractionnement de l’ADN) B. Dénaturation du double (≈ 95°C) et ajout de la sonde moléculaire ® à 95°C tout est séparé et à 25°C les fragments se remettent ensemble et les plus petits se remettent plus vite. C. Hybridation de la sonde sur la séquence cible (≈55°C) et visualisation Facteurs influençant l’hybridation - La température - La concentration saline (MgCl ) - La nature (ADN, ARN, % C/G ® car entre C et G 3 ponts H liaisons plus fortes que A/T donc demande de chauffer pluspour dénaturer les liaosons) et la taille de la sonde ( car plus la sonde est plus petite plus vite elle va s’hybrider). 5. CLONAGE But du clonage moléculaire : Obtenir une population de bactéries, de cellules ou d’organismes qui contiendront le même matériel génétique (d’intérêt) 47  Dans quel cas? - Pour amplifier et conserver une séquence ADN - Pour exprimer une séquence d’intérêt ® pour mettre en évidence soit un gène important, soit un gène non exprimé ® on introduit le gène dans une bactérie et on la force à l’exprimer. - Pour introduire un gène dans des cellules ou des organismes = OGM - Pour produire une protéine d’intérêt - … Les principales étapes du clonage: 1. Intégration de l’insert (fragment ADN d’iintérêt) dans le vecteur (doit pouvoir rentrer facilement dans la cellule) 2. Transformation de l’hôte par le vecteur recombiné 3. Sélection des hôtes recombinants ® permet d’aller rechercher les bactéries qui ont exprimé le gène Vecteur de clonage ® Permet l’introduction du fragment ADN d’intérêt dans la cellule hôte Propriétés d’un bon vecteur : - Réplication active dans la cellule hôte - De petite taille - Possibilité d’y greffer des inserts de grande taille - Facilement sélectionnable (étape 3) et détectable - Présence dans la cellule hôte la moins perturbante possible → Plasmides = vecteur le plus utilisé (petits ADN db circulaires extra-chromosomiques (2 à 5 kpb), multicopiés dans les bactéries, réplication indépendante, gènes intéressants...) Les plasmides (origine naturelle – modifié par les biologiste pour répondre aux besoins du GG) Les types de vecteur de clonage Pour les - Les plasmides (insert de 10 à 15 kpb) procaryotes - Phages (virus de bactérie – insert de 15 à 20 kpb) - Cosmides (plasmide + séquence du phage – insert de 50 kpb) - YAC et BAC (yeast/bacterial artificial chromosome – insert de plus de 100 kpb) ® Pour les levures Pour les - Vecteurs viraux (spécialisés hôtes eucaryotes) eucaryotes - Vecteurs navettes (valable pour tout les hôtes) - … 48 Étape 1 : Intégration de l’insert dans le vecteur Étape 2 et 3 : Transformation et sélection des bactéries hôtes 3 résultats possibles ; - La bactérie contient le plasmide recombinant (transformation ok) Le plasmide choisit contient un opéron pour la b- galactosidase, si la bactérie a intégré l’insert, l’opéron lactose devient non fonctionnel et donc sur un milieu chromogène ne se colore pas. - La bactérie contient un plasmide natif recircularisé Si la bactérie n’a pas intégré l’insert, alors l’opéron lactose est fonctionnel et donc sur un milieu chromogène spécifique au lactose, elle va se colorer. - La bactérie ne contient pas le plasmide Les bactéries ayant intégré le plasmide sont sélectionnées grâce aux 2 gènes de sélection présents dans le vecteur - Gène de résistance à l’ampicilline (permet d'éliminer les bactéries qui n'ont pas le plasmide) - Gène lac Z permettant l’expression de la β-galactosidase 49 6. AMPLIFICATION Amplification PCR (polymerase chain reaction) Kary Mullis (1985). Prix Nobel de chimie en 1993 pour la découverte de la réaction en chaîne par polymérase La réplication de l’ADN in vitro!!! Les 3 étapes ; - Dénaturation de l’ADN double brin à 95° (30-60s) - Hybridation des amorces sur l’ADN simple brin à 50-60°C (10 à 40s) - Élongation (synthèse du fragment double brin) par l’ADN polymérase à 72°C (30-120s ® varie selon la taille du fragment) Matériel et méthode : 50  En théorie, n cycles de PCR permettent de produire 2n copies (amplicons) de la séquence ciblée Résultat après 30 cycles... Peut-on connaitre la quantité initiale de copies cibles ? Non L Amplification PCR quantitative (PCR en temps réel) ® Même principe que la PCR mais l’amplification est mesurée à chaque cycle grâce à un marqueur fluorescent qui s’incorpore dans le double brin formé (en fin d’élongation) ® Un point précis (Cp) du graphe d’amplification de l’échantillon est comparé à ceux de standards (quantités initiales connues)→ détermination de la quantité initiale de copies cibles de l’échantillon Concentration ADN initiale : 10x Exemple de la bactériose sur plante 7. SÉQUENÇAGE MÉTHODE DE SANGER Matrice ADN Amorces de séquençage ADN polymérase dNTPet et ddNTP (didéoxy-NTP) -OH en 3’, l’ADN polymérase -H en 3’, l’ADN polymérase peut fixer le nucléotide ne peut plus fixer le suivant nucléotide suivant = fait bloquer la synthèse 51 52