TP 1: Exploration des voies de signalisation (2024-2025) - M2 Biochimie PDF

M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS TP 1 : Exploration des voies de signalisation et méthodologie d’étude des récepteurs. Dans un organisme pluricellulaire,...

M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS TP 1 : Exploration des voies de signalisation et méthodologie d’étude des récepteurs. Dans un organisme pluricellulaire, la communication cellulaire assure le bon fonctionnement des différents tissus. Chaque cellule perçoit/reçoit des milliers de messages provenant des autres cellules et de l’environnement. La liaison du signal extracellulaire (ou ligand) qui peut être à son récepteur spécifique déclenche une cascade d’activation de protéines intracellulaires aboutissant à une modification du comportement de la cellule. Figure 1: cascade de signalisation cellulaire: Signal = molécule informationnelle = corps chimique (une cytokine inflammatoire ou non, un composant microbien, une structure microparticulaire, un acide aminé, un nucléotide, un gaz, etc…) produit par une cellule vivante pour transmettre un signal à une autre cellule qui reçoit ce signal par un récepteur spécifique (hormone, facteur de croissance …). Récepteur = protéine cellulaire ayant pour ligand une molécule informationnelle provenant du milieu extracellulaire.Le récepteur est souvent situé à la surface de la cellule mais peut aussi être intracellulaire. Cellule cible = cellule pourvue d ’un récepteur capable de traduire le signal d ’une molécule informationnelle. L’activation d’une protéine de signalisation s’effectue habituellement par addition d’un groupement phosphate, le plus souvent au moyen d’une phosphorylation par une protéine-kinase qui, selon le résidu phosphorylé, est une tyrosine-kinase, une sérine-kinase ou une thréonine-kinase. Son inhibition s’effectue par soustraction du groupement phosphate par une protéine-phosphatase. La transduction du signal permet à une cellule de répondre et de s’adapter aux stimuli provenant des autres cellules et de l’environnement. Le signal se traduit par une modulation de la croissance, la prolifération ou la mort cellulaire, la différenciation, la migration et l’activation cellulaires, la réponse immune ou d’autres fonctions cellulaires via la régulation de gènes codant pour des facteurs de croissance, des cytokines, des chimiokines, des protéases, etc… Comment explorer les voies de signalisation ? En recherche, toutes les étapes de la signalisation intracellulaire peuvent être étudiées, depuis la liaison du ligand à son récepteur jusqu’à la réponse cellulaire. L’exploration des voies de transduction utilisent, in vitro, des techniques de biologie cellulaire, de biologie moléculaire et de techniques d’imagerie et, in vivo, des souris invalidées. Elle est de complexité diverse. Elle est simple lorsqu’elle est basée sur la mise en 1 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS évidence des phosphorylations d’une protéine spécifique, complexe lorsqu’elle évalue les interactions protéiques des différentes voies de signalisation. L’implication d’une voie de signalisation intracellulaire dans un processus biologique peut aussi se baser sur l’évaluation fonctionnelle de la réponse cellulaire (par exemple croissance cellulaire, apoptose, différenciation, migration, production d’une molécule spécifique, de cytokines etc…) en fonction de la modulation ciblée d’une protéine de signalisation. Cette modulation peut se faire par des inhibiteurs pharmacologiques, des méthodes de biologies moléculaires par ARN interférence ou encore l’utilisation de cellules isolées de souris invalidées. 1. Comment mettre en évidence une phosphorylation? La phosphorylation d’une protéine peut être détectée par des techniques immuno- empreintes (ou Western Blot), immuno-enzymatiques de type ELISA ou encore de microscopie à fluorescence. Figure 2: Etude d’une phosphorylation par Western Blot. Les protéines contenues dans l’échantillon à étudier sont séparées par électrophorèse sur gel d’acrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium, un puissant détergent qui empêche les interactions protéiques et donne aux protéines une charge négative. Le pourcentage d’acrylamide contenu dans le gel crée des mailles plus ou moins serrées. Les protéines les plus grosses sont arrêtées en haut du gel tandis que les plus petites migrent dans le fond du gel. Les protéines séparées dans le gel d’acrylamide sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose grâce à un courant électrique. Après des étapes de lavage, on détecte la protéine d’intérêt grâce à des anticorps. La membrane est incubée avec un premier anticorps (ou Ac primaire) qui va se lier uniquement à la forme phosphorylée de la protéine d’intérêt. Cet Ac primaire va être reconnu par un Ac secondaire qui est couplé à une enzyme (en général une péroxydase). On détecte ensuite tous ce complexe protéique en ajoutant le substrat de l’enzyme. Lors de la réaction enzymatique, il se produit un signal chemiluminescent que l’on peut recueillir sur un film autoradiographique. L’intensité de la bande obtenue est proportionnelle à la quantité de protéine phosphorylée. On apprécie cette quantité en calculant le rapport entre la forme phosphorylée et la quantité totale de la protéine. En exemple : phosphorylation de la MAPK p38 (p38P) en présence ou non d’un stimulus. p38T= quantité totale de MAPK p38. Quelque soit la technique utilisée, le principe est identique et se déroule en trois étapes : 1/ Incubation de l’échantillon protéique avec un anticorps (appelé anticorps primaire) dirigé uniquement contre la forme phosphorylée de la protéine de signalisation d’intérêt (en général une kinase) ; 2 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS 2/ Incubation d’un anti-anticorps secondaire couplé soit à un fluorochrome soit à une enzyme et dirigé contre l’Ac primaire ; 3/ Révélation de l’Ac secondaire soit par observation de la fluorescence en microscopie soit par évaluation de l’activité enzymatique en ajoutant son substrat. La méthode d’immuno-empreinte est la plus employée figure 2. C’est une méthode semi- quantitative tout comme la microscopie. En revanche, l’ELISA est quantitative mais est beaucoup plus onéeuse (coûteuse). 2. Comment mettre en évidence d’une interaction protéine-protéine? La signalisation intracellulaire implique de nombreuses interactions moléculaires formant des complexes protéiques pouvant associer plus d’une dizaine de protéines. Il est donc primordial de mettre en évidence ces interactions pour mieux comprendre les mécanismes d’action des différentes protéines. La méthode de référence pour étudier une interaction protéine-protéine est l’immunoprécipitation des protéines. L’immunoprécipitation: L’immunoprécipitation (IP) permet d’isoler une protéine spécifique d’un échantillon contenant beaucoup d’autres et ensuite d’identifier toutes les protéines qui lui sont liées. Elle se déroule sur trois étapes principales : (Figure3). 1- Précipitation : l’échantillon est incubé avec un anticorps spécifique qui est couplé à des billes (supramagnétiques ou en agar-agar). Après une étape de centrifugation, la protéine d’intérêt est ainsi « capturée ou précipitée» par l’anticorps fixé aux billes. Figure 3 : Etude d’une interaction protéine-protéine. L’immunoprécipitation est la technique de choix pour identifier les partenaires d’une protéine de signalisation (dénommée protéine d’intérêt). Elle se déroule en 3 étapes principales : 1/ isolement du groupement (ou complexe) protéique par incubation de l’échantillon d’étude avec un anticorps (Ac) dirigé contre la protéine d’intérêt. Les Ac sont couplés à 3 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS des billes qui peuvent être supramagnétiques ou fabriquées en agar-agar. L’échantillon est centrifugé à faible vitesse pour sédimenter (ou précipiter) les billes couplés aux Ac qui ont donc lié le complexe protéique. Celui-ci est ensuite détaché (ou élué) des billes. 2/ Séparation du complexe protéique. La séparation des protéines s’effectue par électrophorèse sur gel d’acrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium. La présence des protéines est révélée par une coloration au bleu de Coomassie du gel d’électrophorèse. 3/ Identification des protéines partenaires. Elle peut s’effectuer soit par spectrométrie de masse en découpant les bandes bleues visualisée sur le gel soit par Western Blot avec des Ac spécifiques. 2- Elution : les protéines précipitées sont ensuite lavées puis détachées ou éluées des billes par des tampons spécifiques. 3- Identification des protéines isolées : les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence dodécylsulfate de sodium (détergent puissant qui permet de dissocier les interactions protéiques). L’identification des différentes protéines liées à la protéine cible peut se faire soit par Western Blot en utilisant des anticorps spécifiques (ce qui suppose une connaissance préalable des partenaires de la protéine étudiée) soit par séquençage par spectrométrie de masse des protéines visualisées sur le gel d’électrophorèse. Cette technique nécessite souvent plusieurs étapes de précipitation (avec des anticorps différents) pour mettre en évidence tous les partenaires d’une protéine cible. La grande difficulté de cette méthode réside dans la disponibilité des anticorps spécifiques. 3- Etude fonctionnelle: L’étude fonctionnelle est une méthode globale d’évaluation des voies de signalisation. Elle consiste à évaluer la réponse cellulaire (prolifération, différenciation, apoptose, production de cytokines, de protéines matricielles etc…) à un stimulus précis en présence ou non d’une modulation d’une voie de signalisation spécifique. Cette modulation peut se faire avec des inhibiteurs pharmacologiques, par ARN interférence ou en utilisant des cellules invalidées pour la protéine de signalisation étudiée. Les tests fonctionnels peuvent être évalués de façon qualitative et/ou quantitative et par de nombreuses méthodes. Figure 4: Signaux extracellulaires et réponses cellulaires 4 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS Figure 5:Résumé des méthodologies d’étude des récepteurs. Les récepteurs cytoplasmiques sont purifiés à partir du cytosol (ou leur forme nucléaire activée à partir de noyaux), et les récepteurs membranaires le sont à partir des membranes ce qui peut s’avérer plus difficile. Protocole expérimentale:Thème : Exploration des voies de signalisation cellulaire Objectifs pédagogiques :  Comprendre les mécanismes des voies de signalisation intracellulaire.  Apprendre à utiliser des outils expérimentaux pour analyser l’activation de ces voies.  Explorer les effets de certains stimuli ou inhibiteurs sur des voies de signalisation spécifiques. Matériel :  Cellules en culture (ex. cellules HEK293, fibroblastes, ou cellules tumorales)  Inhibiteurs spécifiques des voies de signalisation (ex. Wortmannin pour la voie PI3K/Akt, U0126 pour la voie MAPK/ERK)  Anticorps spécifiques pour la détection de protéines phosphorylées (par Western blot)  Milieu de culture et réactifs pour la stimulation (ex. EGF, TGF-β, LPS)  Luminomètre ou cytomètre en flux (pour l'analyse de la réponse cellulaire)  Logiciel d'analyse (ex. ImageJ pour la quantification des résultats) 5 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS Protocole : 1- Préparation des cellules : Ensemencez les cellules dans des plaques de culture (24 ou 6 puits) et laissez-les adhérer pendant 24 heures dans un milieu approprié. 2- Stimulation des voies de signalisation :  Traitez les cellules avec un agent stimulant (ex. EGF pour la voie MAPK/ERK ou Akt) ou inhibiteur (Wortmannin, U0126).  Incubez pendant des temps variables (ex. 15, 30, 60 min) pour observer les variations temporelles de l'activation des voies. 3- Extraction des protéines : Après stimulation, récoltez les cellules en utilisant un tampon d’extraction de protéines contenant des inhibiteurs de phosphatases. Mesurez la concentration des protéines pour normaliser les quantités entre les différents échantillons. 4- Western blot : Effectuez un Western blot pour détecter les protéines phosphorylées spécifiques des voies de signalisation (ex. p-ERK, p-Akt). Utilisez des anticorps contre les formes phosphorylées des protéines d'intérêt. Analyse des résultats : Quantifiez l’intensité des bandes correspondant aux protéines phosphorylées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image (ex. ImageJ). Comparez l’activation des voies de signalisation en fonction du traitement et du temps. Discussion des résultats : Interprétez les résultats obtenus, en analysant l'activation ou l'inhibition des voies de signalisation dans différentes conditions. Discutez des implications biologiques et des mécanismes de régulation. Résultats attendus :  Activation ou inhibition des voies de signalisation en fonction des stimuli ou des inhibiteurs utilisés.  Visualisation des protéines phosphorylées via Western blot. 6 M2 BIOCHIMIE (2024-2025) Enseignante : METCHAT Module: RETS Questions de discussion : Quelles sont les conséquences de l'activation prolongée d'une voie de signalisation ? Comment les cellules régulent-elles la signalisation pour éviter une réponse excessive ? Pourquoi certaines voies de signalisation partagent des protéines en commun ? 7