Sebenta Buzz Lightyear - 2023

Sebenta teóricas BCM (Bora Chorar Maltinha) Maria Gama 2023 ESTRUTURA E FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS................................................................................................ 2 1. ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS............................................................................

Sebenta teóricas BCM (Bora Chorar Maltinha) Maria Gama 2023 ESTRUTURA E FUNÇÃO DAS PROTEÍNAS................................................................................................ 2 1. ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS................................................................................................................... 2 2. RELAÇÃO ENTRE ESTRUTURA E FUNÇÃO DE PROTEÍNAS................................................................................. 5 3. HEMOGLOBINA E MIOGLOBINA............................................................................................................... 7 4. ENZIMAS.......................................................................................................................................... 12 PROCESSOS NUCLEARES – MECANISMOS GENÉTICOS.......................................................................... 16 1. ESTRUTURA NUCLEAR, DNA E CROMOSSOMAS........................................................................................ 16 2. PROCESSOS NUCLEARES....................................................................................................................... 18 3. VISÃO GERAL DA TRADUÇÃO PROTEICA E MODIFICAÇÕES PÓS-TRANSLACIONAIS.............................................. 25 4. TERAPIAS GENÉTICAS (SEMINÁRIO)........................................................................................................ 31 CONTROLO DA EXPRESSÃO GENÉTICA................................................................................................. 32 1. FATORES DE TRANSCRIÇÃO................................................................................................................... 32 2. CONTROLO PÓS-TRANSCRICIONAL E RNAS NÃO CODIFICANTES.................................................................... 36 ORGANIZAÇÃO INTERNA DA CÉLULA................................................................................................... 39 1. MEMBRANAS.................................................................................................................................... 39 2. CITOESQUELETO................................................................................................................................. 42 3. MOTORES MOLECULARES..................................................................................................................... 47 4. TRANSPORTE INTRACELULAR................................................................................................................. 51 5. VIAS DE TRANSPORTE VESICULAR........................................................................................................... 55 6. LISOSSOMAS E DOENÇAS (SEMINÁRIO)................................................................................................... 59 MECANISMOS DE SINALIZAÇÃO........................................................................................................... 59 1. ESTRATÉGIAS E VIAS DE SINALIZAÇÃO. RECETORES.................................................................................... 59 2. RECETORES E PROTEÍNAS G.................................................................................................................. 62 3. RECETORES E TK................................................................................................................................ 64 4. SINALIZAÇÃO POR EVS (SEMINÁRIO)...................................................................................................... 67 CICLO CELULAR.................................................................................................................................... 67 1. CICLO CELULAR E CHECK POINTS............................................................................................................ 67 2. CHECK POINTS G1 E REPLICAÇÃO........................................................................................................... 70 3. CHECK POINTS G2 E MITOSE................................................................................................................. 71 CONTEXTO E COMPORTAMENTO CELULAR.......................................................................................... 74 1. ADESÃO CELULAR E CADERINAS............................................................................................................. 74 2. MATRIZ EXTRACELULAR E INTEGRINAS..................................................................................................... 77 3. APOPTOSE E SENESCÊNCIA CELULAR....................................................................................................... 80 4. MOBILIDADE CELULAR E QUIMIOTAXIA................................................................................................... 84 5. DIFERENCIAÇÃO E RENOVAÇÃO CELULAR................................................................................................. 85 6. CÉLULAS ESTAMINAIS PLURIPOTENTES E REPROGRAMAÇÃO CELULAR............................................................. 89 7. TERAPIAS CELULARES (SEMINÁRIO)........................................................................................................ 89 MECANISMOS DE IMUNIDADE............................................................................................................. 90 1. IMUNIDADE INATA E ADAPTATIVA.......................................................................................................... 90 2. SISTEMA DE COMPLEMENTO................................................................................................................. 96 3. MATURAÇÃO LINFOCITÁRIA T............................................................................................................. 100 4. MATURAÇÃO LINFOCITÁRIA B............................................................................................................. 104 5. COMPLEXO MAJOR DE HISTOCOMPATIBILIDADE..................................................................................... 108 6. MECANISMOS DE APRESENTAÇÃO ANTIGÉNICA...................................................................................... 111 7. RESPOSTA IMUNE MEDIADA POR CÉLULAS T.......................................................................................... 115 8. RESPOSTA IMUNE MEDIADA POR CÉLULAS B.......................................................................................... 118 9. ANTICORPOS E ANTIGÉNIOS................................................................................................................ 123 10. MECANISMOS DE TOLERÂNCIA E REGULAÇÃO IMUNE.......................................................................... 126 11. REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE.................................................................................................... 130 12. AUTOIMUNIDADE......................................................................................................................... 134 13. ATIVAÇÃO DA RESPOSTA ADAPTATIVA NA AUTOIMUNIDADE E OPORTUNIDADES TERAPÊUTICAS (SEMINÁRIO).. 138 1 Estrutura e função das proteínas 1. Estrutura das proteínas As proteínas são as macromoléculas mais abundantes, sendo componentes-chave das propriedades estruturais e funcionais dos seres vivos. São constituídas pela associação linear de aminoácidos em cadeias polipeptídicas. São sintetizadas nos ribossomas – tradução – com base na informação de cadeias de tRNA que são produzidas no núcleo a partir do DNA – transcrição. Funções das proteínas: Catalisadores (enzimas) Transmissão de impulsos nervosos Transportadores (hemoglobina) (neurotransmissores) Armazenamento (caseína) Crescimento e diferenciação celular Proteção imune (anticorpos) (fatores de crescimento) Reguladores (insulina, glucagon) Coagulação sanguínea (fibrina) Movimento (actina, miosina) Manutenção da distribuição de água Estruturais (colagénio) entre o compartimento intersticial e vascular (albumina) Os aminoácidos são as moléculas constituintes das proteínas, ligando-se através de ligações peptídicas (ligações covalentes entre o terminal amina (+) de um aa e o terminal carboxilo (-) do seguinte) nas cadeias polipeptídicas. As ligações peptídicas formam- se por reações de desidratação que requerem o consumo de energia. A cadeia lateral – grupo R – define o aa e influencia a estrutura das proteínas dependendo da sua estrutura e complexdade. Img. 1 – Estrutura geral de um aminoácido (exceto prolina - iminoácido) Os 4 átomos que formam a ligação CO-NH estão no mesmo plano. Sendo que a ligação C-N é uma ligação dupla parcial, não podendo girar sobre si própria. As ligações C=O e N-H são trans uma em relação à outra, ou seja, têm direções opostas. As ligações C-C e C-N (dentro de próprio aa) são de livre rotação. Assim, o esqueleto polipeptídico das proteínas é uma estrutura semi- rígida. Dos 700 aa descobertos, apenas 20 constituem as nossas proteínas, sendo que 9 destes não são sintetizados pelo ser humano, pelo que têm de ser ingeridos – aminoácidos essenciais. Cadeia lateral Propriedades Aminoácidos Apolar Aa hidrofóbicos Alanina (Ala; A), valina (Val; V), prolina (Pro; P), fenilalanina(Phe; F); glicina (gly; G), cisteína (Cys; C), leucina (Leu; L), isoleucina (Ile; I), metionina (Met; M), triptofano (Trp; W) Polar sem carga Aa hidrofílicos Aspargina (Asn, N); glutamina (Gln, Q); serina (ser, S); trionina (Thr, T); tirosina (Tyr, Y) Polar carregada Carga positiva em Lisina (Lys, K); Arginina (Arg, R); Histidina (His, H) positivamente pH fisiológico Polar carregada Carga negativa em Ácido aspártico (Asp, D); Ácido glutâmico (Glu, E) negativamente pH fisiológico Tab. 1 – Aminoácidos e diferentes cadeias laterais (grupo R) Em meio aquoso, os aa com cadeias laterais apolares agrupam-se em determinadas regiões no “interior das proteínas” de modo a evitar o contacto com a água. Assim, influenciam a estrutura das proteínas. A císteina e a metionina são os únicos aminoácidos com enxofre. 2 Os aminoácidos são estereoisómeros, ou seja, os átomos estão ligados na mesma ordem, havendo diferença apenas na organização espacial da molécula. Os estereoisómeros estão um para o outro como uma imagem está para o objeto no espelho. Todos os aa, com exceção da prolina, podem apresentar-se na forma L ou na forma D, quando na sua forma livre. As proteínas contém apenas aa na sua forma L. Níveis de organização estrutural das proteínas: Estrutura Organização Ligações Notas Primária Cadeia linear Lig. Peptídicas “esqueleto covalente” Secundária Enovelamento de partes Pontes de H entre o O alfa-hélices e folhas beta da cadeia polipeptidica do grupo carboxilo e o “elemento de suporte H do grupo amina interno” Terciária Enovelamento de uma Lig. Entre os átomos Geralmente coincide cadeia polipeptídica das cadeias laterais com a estrutura nativa como um todo dos aa 3D Quaternária Associação de mais de Lig. Não covalentes Nem sempre; o nome uma cadeia quase sempre depende do nº de polipeptídica reversíveis cadeias associadas Tab. 2 – Níveis de organização estrutural da proteína Estrutura/conformação nativa – estrutura que confere à proteína uma função biológica específica. Corresponde à conformação mais estável, com menor energia livre. Resíduos de aminoácidos – aminoácidos inseridos na cadeia polipeptídica Características da estrutura primária: Nível estrutural mais simples do qual deriva todo o arranjo espacial da molécula Específica para cada molécula e determinada geneticamente Descreve o nº, tipo e sequência de aa sem preocupação da orietação espacial Pode ser destruída por hidrólise química ou enzimática (=> pequenos péptidos ou aa livres) Modificações pós-traducionais a residuos de aa: Hidroxilação da prolina e lisina (introdução de um grupo hidroxila) Metilação da lisina (adição de grupo metil) Glicosilação (adição de hidratos de carbono) Fosforilação (Adição de grupos fosfato) Acetilação (adição de grupos acetil) Ubiquitinação (adição de uma ubiquitina – proteína) Estrutura secundária: Hélice α Esqueleto covalente: C-C-N-C-C-N Forma de espiral enrolada para a direita, com espaçamento de 3.6 resíduos de aa por volta. Sem participação da prolina As cadeias laterais voltam-se para fora da hélice Estrutura secundária: Folha β pregueada As cadeias dispõem-se lateralmente com ligações entre os átomos da ligação peptídica As cadeias laterais voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha 3 Motivos conservados da estrtura secundária – estrutura super-secundária – são arranjos consecutivos de 2-3 elementos de estrutura secundária (podendo ter uma estrutura primária diferente) que funcionam como assinaturas de uma função específica. A presença destes motivos em diferentes proteínas com funções semelhantes permite a classificação de muitas proteínas em famílias. Interações entre cadeias laterais de aminoácidos (estrutura terciária): Ligações não covalentes (também envolvidas na formação de proteínas quaternárias) o Interações hidrofóbicas – entre cadeias não polares o Pontes de hidrogénio – entre cadeiras laterais polares o Ligações iónicas (eeletrostáticas) – entre cadeias laterais carregadas com sinais contrários Ligações covalentes: ponte de enxofre (ponte dissulfeto) entre cisteínas – são mais fortes do que as outras ligações e por isso são importantes em proteínas que são secretadas. Como a estrutura terciária depende diretamente da estrutura primária, uma mutação pontual no DNA pode ter como consequência uma alteração completa na conformação da proteína. Domínios de uma proteína – módulos (regiões particulares) da protéina com estrutura e função diferentes. Ex: domínios cinase e domínios de função regulatória. Há domínios que são conservados ao longo da evolução em proteínas relacionadas. Folding Folding – processo através do qual uma proteína adquire a sua conformação nativa começando como uma simples cadeia de estrutura primária. Teoricamente, qualquer cadeia contendo n resíduos pode enrolar-se em 8n conformações. No entanto cada proteína adquire a sua conformação nativa. In vivo, as proteínas assumem a sua conformação com o auxílio de proteínas da classe das chaperones. São reconhecidos dois tipos de chaperones. As chaperones moleculares ligam-se a proteínas com uma conformação não-nativa, proteínas não-funcionais, etc, levando-as a serem degradadas nos proteossomas. As chaperoninas, conhecidas como proteínas do stress ou proteínas do choque térmico, são as proteínas que “catalizam” o folding de proteína. Quando o controlo do folding das proteínas falha – “misfolding” – (ex: stress celular muito elevado e prolongado), acumulam-se proteínas aberrantes que não são degradadas e que acabam por se agregar, levando, frequentemente, à formação de pré-fibrilhas que podem evoluir para fibrilhas amiloides. Estas estruturas são altamente insolúveis, muito resistentes e tóxicas para as células, estando muitas vezes associadas a doenças neurodegenerativas quando ocorrem no SNC. Arranjo/estrutura supramolecular – grandes conjuntos de proteínas (centenas de cadeias polipeptídicas) com funções diferentes mas com um objetivo comum. Classificação de proteínas: Quanto ao número de cadeias Monoméricas – uma única cadeia polipeptídica Oligoméricas – duas ou mais cadeias polipeptídicas o Dímero (homo-; hetero) o Trímero o Tetrâmero o … 4 Quanto à sua conformação: Globulares: em forma de esfera; relativamento solúveis em água Fibrosas: em forma de fibra (cilíndrica); pouco solúveis; papel essencialmente estrutural Quanto à sua composição: Simples – constituidas apenas por aa sem componentes não proteícos Compostas – contêm outras biomoléculas ou átomos o Grupos prostéticos (grupo heme da hemoglobina) o Glicoproteínas (carbohidratos associados) o Lipoproteínas (lípidos associados) o Metais associados (Fe, Zn, Ca, Cu, Mo, etc) 2. Relação entre estrutura e função de proteínas Proteínas fibrosas As proteínas fibrosas têm uma forma alongada e cilíndrica, em forma de fibra. Têm muitas vezes uma função estrutural e são insolúveis em água. Não têm uma verdadeira estrutura terciária. Encontram-se em agregados que se formam devido aos grupos R hidrofóbicos que se juntam, evitando interações com o meio aquoso. As sequências de resíduos de aa tendem a repetir-se, sendo a variedade de resíduos geralmente reduzida. Estruturas “coiled-coils” de hélices alfa (α -queratinas) Folhas beta antiparalelas (proteína da seda) Tripla hélice de cadeias polipeptídicas (colagénio) As queratinas são uma classe de proteínas estruturais abundantes encontradas nos pelos, nas penas, em escamas, etc. Formam estruturas muito resistentes mecanicamente, sendo por isso resistentes a vários tipos de stress. As α -queratinas são as mais comuns. Os dímeros que as constituem são formados por duas hélices alfa que interagem para formar uma única hélice, em que os resíduos hidrofóbicos estão voltados para o centro da mesma. A organização regular dos filamentos confere à queratina a sua resistência. Img. 2 – Organização estrutural de filamentos de queratina Existem vários genes que codificam as queratinas, podendo estes ser separados em dois tipos: tipo I (acídicos) e tipo II (neutros ou básicos). Estes genes podem ser encontrados em vários agrupamentos em diferentes loci no genoma humano. O tipo de célula determina, muitas vezes, o tipo de queratina que é traduzido. Exemplo: queratinócitos da pele – K14 (tipo I) e K5 (tipo II); a queratina na pele confere resistência às abrasões mecânicas a que é sujeita. 5 Epidermólise bulhosa – causada por mutações nos queratinócitos K5 e/ou K14. Formam-se bolhas em resposta a fricção ou traumas menores, devido à falta de estrutura e resistência. A proteína da seda (componente principal da seda) têm uma estrutura formada por folhas beta antiparalelas que se sobrepõem graças às cadeias laterais Ala e Gly. Img. 3 - Estrutura da proteína da seda. Cadeias laterais Ala e Gly destacadas a laranja. O colagénio é o importante componente da pele, dos tendões e ligamentos, dos dentes e dos ossos. É a proteína mais abundante no corpo humano (25%). É o principal componente do tecido conjuntivo. A sua estrutura é uma tripla hélice de cadeias polipeptídicas (left-handed super helix). Tropocolagénio – unidade estrutural do colagénio. É uma tripla hélice de cadeias com comprimento médio de 1000 resíduos de aa. Estas cadeias têm uma sequência repetitiva de resíduos de aa em que cada 3º resíduo é uma glicina (Gly-X-Y-Gly-X- Y-Gly; X e Y correspondem muitas vezes a resíduos de prolina e lisina). A glicina tem uma cadeia lateral bastante reduzida, permitindo o empacotamento das 3 cadeias polipeptídicas. As duas extremidades do tropo colagénio são clivadas de modo a permitir a associação entre várias destas estruturas em fibrilhas de colagénio, e posterior associação em fibras. Img. 4 – Estrutura das fibras de colagénio O tropocolagénio é sintetizado no interior das células e secretado nesta forma. Só no exterior é que se dá a clivagem das extremidades e a associação em fibrilhas e fibras. As ligações entre as várias unidades do tropocolagénio estão desencontradas, dando às fibras uma maior resistência a forças de torção, por exemplo. Isto resulta num aspeto estriado (visto longitudinalmente) em microscopia eletrónica. Tipo Função e localização Tipo I Principal componente de tendões, ligamentos e ossos Tipo II Mais de 50% da proteína em cartilagens. Constituinte da notocorda em embriões Tipo III Fortalece as paredes de estruturas ocas, como os vasos, os intestinos e o útero, (lâminas elásticas) Tipo IV Componente da lâmina basal dos epitélios, nomeadamente nos capilares e nos glomérulos renais. Tab. 3 – Visão geral dos prncipais tipos de colagénio, e das suas funções e localizações. Ostogénese imperfeita – doença que afeta os ossos, geralmente causada por uma mutação nos genes COL1A1 ou COL1A2, que codificam três subunidades do colagénio tipo I. O resultado é tecido conjuntivo deficiente ou a incapacidade de produção do mesmo. 6 Proteínas globulares As proteínas globulares têm uma forma compacta e vagamente esférica. As enzimas são um exemplo de proteínas globulares. Geralmente formam colóides em água. A sua forma esférica é um resultado da estrutura terciária. Os resíduos apolares (hidrofóbicos) voltam-se para dentro, e os polares (hidrofílicos) voltam-se para fora, permitindo o estabelecimento de interações dipolo-dipolo, justificando assim a solubilidade da molécula. A tripsina é um exemplo de uma proteína globular. É uma enzima que participa na digestão ao nível do intestino delgado. Proteínas membranares As proteínas membranares estão associadas às membranas biológicas. De um modo geral, os resíduos hidrofóbicos são os que se encontram em contacto com a bicamada fosfolipídica. Os resíduos hidrofílicos na superfície externa e interna da célula estão em contacto com o meio aquoso. Tomando o exemplo de um canal, a superfície interior do canal contém resíduos de aa polares, para permitir a passagem de moléculas carregadas e de iões. Img. 5 – Associação de proteínas à membrana celular. Img. 6 – Diferentes estruturas de proteínas transmembranares e funções das mesmas. 3. Hemoglobina e Mioglobina A hemoglobina e a mioglobina são proteínas da família das globinas. São proteínas solúveis com um grupo prostético heme unido por ligações não covalentes à cadeia polipeptídica. O estudo das semelhanças e diferenças entre a hemoglobina e a mioglobina permite-nos perceber como as difereças estruturais se refletem em diferenças funcionais. Hemoglobina Mioglobina Estrutura 4 cadeias polipeptídicas 1 cadeia polipeptídica Função e Localização Transporte de oxigénio no sangue Armazenamento de oxigénio no tecido muscular Afinidade Afinidade variável por O2 Alta afinidade por O2 Tab. 4 – Visão geral: hemoglobina vs mioglobina. Estas duas proteínas partilham um ancestral comum. 7 Img. 7 – Comparação das estruturas 3D das globinas α e β da hemoglobina e mioglobina As globinas α e b β que constituem a hemoglobina e a mioglobina têm uma semelhança estrutural, sendo formadas por 7 ou 8 segmentos de α-hélices que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme. No entanto, as 3 sequências de aa são bastante diferentes. Isto acontece porque a estrutura secundária dos segmentos não depende das cadeias laterais dos aminoácidos, permitindo a acumulação de mutações pontuais sem alterações na estrutura geral. O grupo heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigénio. Este grupo é sintetizado nas células aeróbicas, sendo o produto da cadeia das porfirinas. Na última etapa desta cadeia, um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX formando o heme. O Fe2+ fica no centro do heme, formando 6 ligações: 4 com os átomos N do anel porfirínico, 1 ligação à cadeia polipeptídica através de um resíduo de histidina (posição 87 nas cadeias α e posição 92 nas cadeias β) na bolsa hidrofobica da hemoglobina – histidina proximal – e a 1 molécula de O2. Img. 8 – Ligação do O2 ao Fe2+. Quando a ligação é estabelecida, há uma redistribuição dos eletrões no ião, reduzindo o seu raio atómico, o que lhe permite ficar no mesmo plano que o anel porfirínico. Hemoglobina (Hb) Estrutura: Primária: com algumas diferenças entre as vérias globinas Secundária: hélices alfa Terciária: globular – aa hidrofílicos no exterior (solubilidade) e aa hidrofóbicos no interior (pockets para inserção do grupo heme) Quaternária: tetrâmero solúvel Na HbA (tipo mais comum em adultos) cada cadeia alfa está em contacto com duas cadeias beta e cada cadeia beta com duas cadeias alfa. Assim definem-se dois dímeros (α1β1 e α2β2). Cada subunidade está associada a um grupo heme, sendo assim a hemoglobina capaz de transporta 4 moléculas de O2 simultaneamente. 8 A oxigenação faz com que o Fe2+ se mova para o plano da porfirina, isto vai provocar uma distorção da cadeia da Hb, causando uma alteração conformacional. Quando esta alteração conformacional ocorre numa das subunidades, ocorrem alterações nas restantes, alterando-se a afinidade destas para o O2. Esta ligação vai então provocar uma rotação de 15º de um dímero alfa-beta em relação ao outro. Este rearranjo estrutural permite aumentar a afinidade para o O2. Conformações da hemoglobina: T (tenso) – estado desoxigenado – desoxi-Hb o Subunidades mais afastadas (5A) o Estrutura molécular mais “rígida”, dificultando o acesso ao O2 R (relaxado) – estado oxigenado – oxi-Hb o Maior proximidade das cadeias o Ligação de O2 à desoxi-Hb favorece a conformação R por rotura de pontes salinas – aumenta a “flexibilidade” da molécula e facilita a ligação a mais moléculas de O2. Img. 9 – Conformações da hemoglobina Alosterismo na hemoglobina A ligação da primeira molécula O2 ao heme facilita o preenchimento dos outros grupos heme, de tal maneira que a ligação da quarta molécula de O2 é 300 vezes mais fácil que a ligação da primeira. Diz-se então que o O2 é um modelador alostérico* positivo. *Alosterismo – qualquer alteração na estrutura terciária/quaternária de uma proteína induzida pela ação de uma molécula ligante, que pode ser um ativador, um inibidor, um substrato ou os 3. Img. 10 – Alosterismo na hemoglobina: cooperatividade Curva de saturação da hemoglobina A curva de saturação da hemoglobina em funçao da pressão de oxigénio é uma sigmoide, refletindo o efeito de cooperatividade entre os subgrupos da Hb. Nos pulmões, a pressão de O2 é bastante mais elevada que nos tecidos. Assim, a Hb tem uma maior afinidade nos pulmões. Estas diferenças na afinidade da Hb para o O2 fazem da Hb um excelente transportador de O2. Img. 11 – Curva de saturação da hemoglobina pelo O2 A afinidade da hemoglobina pelo O2 depende do pH do meio. Um meio mais ácido promove a forma T, ou seja, para uma mesma pressão de oxigénio a saturação de Hb é menor em meios 9 mais ácidos. Num pH fisiológico de 7.4, a saturação da Hb é de 42%, em acidose, num pH de 7.2, este valor desce para 35%, e em alcalose sobe para 65%. O aumento da concentração de CO2 (por ligação direta ou por se transformar em H2CO3) estimula a libertação de oxigénio. A afinidade diminui no meio mais ácido (o H2CO3 dissocia- se em H+ e HCO3-. Assim, podemos dizer que o ião H+ e o CO2 são modeladores alostéricos negativos. O processo de alteração da afinidade da Hb pelo O2 ou CO2 na presença de H+, CO2 e O2 é o efeito Bohr- Haldane (Bohr – efeito do pH; Haldane – Hb perde afinidade pelo CO2 quando pO2 é elevada). Img. 12 – Efeito do pH na afinidade da Hb pelo O2 Isto tudo tem uma importância fisiológica: em tecidos mais ativos metabolicamente, onde há maior produção de CO2 e maior demand de O2, a Hb tem uma afinidade menor ao O2 “libertando-o” para os tecidos mais ativos. O 2,3-Bifosfoglicerato (2,3-BPG) é outro ligando modelador alostérico da hemoglobina. Esta molécula liga-se à conformação T, estabilizando-a e diminuindo a afinidade da Hb ao O2. O 2,3- BPG é produzido nos tecidos extrapulmonares. O seu papel fisiológico é aumentar substancialmente a libertação de O2 nos tecidos. Este modelador alostérico negativo liga-se na cavidade central do tetrâmero da Hb, estabilizado por interações eletrostáticas. A exposição prolongada à altitude aumenta o 2,3-BPG – adaptação que leva a uma maior libertação do O2 nos tecidos. (A pressão atmosférica do O2 é consideravelmente menor em maiores altitudes). P50 – pressão parcial do oxigénio (mmHg) na qual a Hb se encontra 50% saturada. A P50 normal, a um pH de 7.4 é de aproximadamente 27mmHg. Condições que diminuem a afinidade da Hb pelo O2 aumentam a P50 (desvio para a direita). Condições que aumentem a afinidade da Hb pelo O2 diminuem a P50 (desvio para a esquerda). Img. 13 – Alterações à curva de saturação da Hb Histidina distal A histidina distal protege o Fe2+ da oxidação (impedindo a formação da meta-hemoglobina com Fe3+) e impede a ligação do CO ao Fe2+ (o CO tem uma maior afinidade ao Fe que o O2). O CO liga-se linearmente ao Fe2+, havendo então um impedimento estéreo (relativo à conformação 3D da molécula) por parte da histidina, o que não acontece na ligação com o O2 a 120º. 10 Ontogenia das hemoglobinas Hemoglobina Fórmula Nome Embrião ζ2ε2 Gower I α2ε2 Gower II ζ2γ2 Portland I Feto α2γ2 F (predomina) α2β2 A Adulto α2β2 A (predomina) α2δ2 A2 α2β2glucose AIc Tab. 5 – Ontogenia das hemoglobinas A existência de diferentes tipos de Hb ao longo do desenvolvimento biológico explica-se pelas distintas condições respiratórias no meio intra-uterino e extra-uterino. A pequena diferença de afinidade entre a HbF e a HbA medeia a transferência de oxigénio do organismo materno para o feto. Na HbA, as subunidades β ligam-se ao 2,3 – BPG, o seu regulador natural. Na HbF, as cadeias γ não se ligam a esta molécula, e por consequência têm uma maior afinidade para o O2, pemitindo que a Hb F capte o O2 num ambiente pobre em O2 como a placenta. Hemoglobinopatias – classificação Estruturais (erros na sequência de aa) o Polimerização – HbS – Anemia falciforme (importante: alterações na estrutura primária induzem alterações na estrutura terciária e, consequentemente, na função da proteína; Hb em forma de foice, dificultando a sua circulação) – Resíduo Val em vez de Glu na posição 6 o Afinidade alterada para O2 ▪ Aumentada (Hb Yakima – eritrocitose) ▪ Diminuíada (cianose) o Hemoglobinas instáveis (Hb Koln, Hb Philly, Hb Genova – corpos de inclusão e hemólise) Talassémias (erros na síntese de globina) Variantes talassémicas (estruturais com fenótipos talassémicos associados) o HbE, Hb Constant Spring, Hb Lepore Persistência hereditária de HbF Adquiridas o Methemoglobina o Sulfhemoglobina o Carboxihemoglobina o Aumento dos níveis de HbF Mioglobina A mioglobina tem uma estrutura monomérica, ou seja, é constituída por uma cadeia única (com 154 aa). A cadeia forma 8 hélices (A – H), estando o grupo geme na bolsa hidrofóbica entre dois resíduos de histidina (His64 e His93) com um átomo de Fe2+ central, tal como a Hemoglobina. O ferro tem 6 ligandos: 4 átomos de N (anel de porfirina), 1 His93 e 1 O2. As estruturas secundárias e terciárias da mioglobina e das subunidades beta da Hb são quase idênticas (mioglobina com 8 subunidades e subunidades beta da Hb com 7). 11  Comparação das curvas de saturação pelo O2 da hemoglobina e da mioglobina A curva de saturação da mioglobina é hiperbólica e não sigmoide. Comparando as duas curvas no gráfico, nota-se facilmente que a mioglobina tem uma P50 muito mais baixa, ou seja, encontra-se 50% saturada a pressões parciais de oxigénio muito baixas. Img. 14 – Comparação das curvas de saturação da mioglobina e da Hb. A mioglobina não é uma proteína alostérica, não havendo presença do efeito cooperativo nem alterações na sua afinidade por O2 provocadas por alterações no pH e por ligação a 2,3-BPG. 4. Enzimas As enzimas são catalisadores biológicos que permitem que as reações químicas se efetuem a uma velocidade elevada e com muita especificidade. A maioria dos processos metabólicos são catalisados por enzimas para que se possa dar o correto funcionamento de células, tecidos e órgãos. Assim, o funcionamento incorreto das enzimas está frequentemente associado a patologias. Nas reações catalisadas por enzimas o reagente que se liga à enzima denomina-se de substrato. As enzimas aceleram as reações químicas em escalas de tempo muito varíáveis e muito amplas. Tanto podem acelerar uma reação que demoraria 106 anos para pouco mais de um ms, como podem acelerar reações que demorariam menos de um minuto para que estas ocorram num µs. Vias catabólicas (catástrofe) – degradação de moléculas complexas em componentes mais simples, havendo libertação de energia Vias anabólicas – síntese de moléculas mais complexas através das suas partes constituíntes, com recurso à utilização de energia. Armazenamento da energia: o ATP (adenosina trifosfato) é a molécula mais utilizada pelas células para armazenar energia. O ATP tem ligações entre os grupos de fosfato, que, quando quebradas por hidrólise, libertam a energia química “armazenada”. A energia libertada nas vias catabólicas pode ser armazenada transformando o ADP em ATP. Características das enzimas: Não são consumidas nas reações. Aceleram as reações químicas diminuindo a energia necessária para que estas aconteçam. Tipos de reações catalisadas por enzimas: Degradação (reações catabólicas) Síntese (reações anabólicas) Modificação Existem muitas classes de enzimas, cada uma delas associadas a um tipo de reação. Tipicamente os nomes das enzimas terminam em -ase, mas alguns podem terminar em -ina (ex: tripsina). 12 Estrutura molecular das enzimas: Holoenzima – totalidade dos componentes da enzima Apoenzima – componente proteica da enzima Centro catalítico – local onde se liga o substrato e onde ocorre a reação Cofator – substância inorgânica cuja presença é essencial para que ocorra catálise Coenzima – substância orgânica cuja presença é essencial para que ocorra a catálise Img. 15 – Componentes de uma enzima Nota: nem todas as enzimas têm esta estrutura específica Ribozimas – enzimas compostas por RNA Ligação do substrato: Teoria “Chave – Fechadura” – A enzima tem uma estrutura rígida, específica para a ligação do substrato. Esta ligação promove então as condições termodinâmicas necessárias à catálise. Teoria do “Encaixe Induzido” – Ao entrar em contacto com a enzima, o substrato modifica a estrutura da enzima induzindo a ligação entre os dois. Qualquer uma destas teorias pode estar correta, depende da enzima e da reação em estudo. Img. 16 – Ligação substrato-enzima: teoria chave – fechadura (esq) e teoria encaixe induzido (dir) Interações enzima-substrato: Orientação dos substratos Reorganização das cargas Indução de alterações conformacionais Img. 17 – Ligação substrato-enzima: interações 13 As enzimas são recicladas após cada reação, continuando a atuar até serem inativadas, degradadas/desnatradas ou simplesmente deixarem de funcionar após um uso prolongado. Invertase ou Sacarase: Quando o substrato (sucrose) se liga a esta enzima, a enzima altera a sua conformação, expondo a ligação entre a glucose e a frutose, promovendo então a hidrólise da sucrose. Efeito alostérico – alteração dos parâmetros cinéticos (conformação da enzima) por ligação de uma molécula num local diferente do centro ativo onde se ligam os substratos – centro alostérico. Regulação da atividade enzimática Ativadores – ligam-se à enzima no centro alostérico, provocando uma alteração conformação do centro ativo desta, que vai favorecer a ligação ao substrato – ativação alostérica Inibidores o Irreversíveis – destroem a enzima através de uma ligação covalente irreversível ao centro catalítico ou simplesmente através da degradação de uma das partes da enzima essenciais à sua função. o Reversíveis ▪ Competitivos – estruturalmente semehantes ao substrato, competindo com este pelo sítio ativo da enzima. A relação entre a quantidade de inibidor e de substrato determina ▪ Não competitivos –ligam-se à enzima no centro alostérico induzindo uma alteração estrutural no centro ativo da enzima, inativando-a – inibição alostérica. Img. 18 – Inibidores reversíveis de uma enzima. Geralmente as reações catalisadas por enzimas encaixam-se em sequências mais ou menos ramificadas de reações – vias metabólicas. Existem ainda efeitos de de feedback negativo ou de retro-inibição, em que o produto de uma dada sequência de reações é um inibidor de uma das reações anteriores nesta sequência. Cinética enzimática Velocidade de uma reação enzimática – quantidade de produto formado por unidade de tempo Unidade enzimática (U): 1U é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 µmol de subtrato num minuto. 14 Para uma concentração inicial de substrato, a velocidade de reação aumenta com a concentração da enzima. E, inversamente, para uma concentração inicial de enzima, a velocidade de reação aumenta com a concentração do substrato. Img. 19 – Reação enzimática (esq); Gráfico velocidade de reação – concentração de substrato Parâmetros cinéticos: Vmax – velocidade máxima a que a reação pode ocorrer, teoricamente atingida quando a enzima estiver saturada por uma concentração “infinita” de substrato Km – concentração de substrato que corresponde a metade da velocidade maxima de reação – constante de Michaelis [𝑆] Equação de Michaelis-Menten: 𝑉0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]+𝐾 𝑀 Esta equação permite-nos fazer previsões da velocidade da reação. Os inibidores das enzimas têm um efeito na cinética enzimática: Inibidores competitivos: aumento de Km (c/ aumento da concentração do inibidor) Inibidores não competitivos: Diminuição de Vmax (c/ aumento da concentração do inibidor) Img. 20 – Efeitos dos inibidores na cinética enzimática e correspondentes equações de reação. Quanto maior a complexidade das reações, mais complicada a cinética enzimática associada 15 Processos Nucleares – Mecanismos Genéticos 1. Estrutura Nuclear, DNA e Cromossomas Processos nucleares: Replicação, transcrição e processamento do mRNA Arquitetura nuclear Envelope nuclear – dupla membrana que delimita o núcleo o Junto ao envelope nuclear podemos encontrar regiões do DNA que não estão a ser transcritas e que se encontram mais condensadas – heterocromatina o Entre a membrana interna e a membrana externa encontra-se o espaço perinuclear. o Constitui a barreira entre o citoplasma e o nucleoplasma Img. 21 – arquitetura nuclear o A membrana externa está em contínuo com o RER, estando associada aos ribossomas e a membrana interna está associada à lâmina nuclear (citoesqueleto) o É destruído em cada divisão celular, havendo reciclagem dos seus componentes o Os poros nucleares (Nuclear Pore Complex, NPC) estabelecem a comunicação entre o núcleo e o resto da célula. O nº de poros nucleares aumenta com a atividade nuclear. O NPC é composto por: ▪ 8 complexos proteicos de sustentação ligados por anéis proteícos ▪ Transportador central (transporte ativo) ▪ Filamentos citoplasmáticos que reconhecem as moléculas a transportar ▪ Cesto nuclear formados por filamentos e por um anel) Img. 22 – Complexo do poro nuclear Citoesqueleto nuclear – lâmina nuclear – rede fibrosa densa que fornece suporte estrutural ao núcleo o Constituído maioritariamente por lamininas o 20 nm de espessura o Ancoragem dos NPCs o Pensa-se que é também um local de adesão da cromatina (organizada em grandes loops) – S/MARs (Scaffold/matrix attachment regions) o 2 tipos de lâminas nucleares nos vertebrados ▪ Tipo A (lâminas A e C formadas por splicing alternativ de um mesmo gene; grande homologia) ▪ Tipo B (lâminas B1 e B2, que são constitutivas) o O estado de fosforilação afeta a formação do envelope nuclear: ▪ Lâmina fosforilada (pela Ciclina B/Cdk1) – desagregação do envelope ▪ Lâmina desfosforilada – formação do envelope nuclear 16  Nucleoplasma – citoplasma do núcleo delimitado pelo envelope nuclear. Contem: o Nucléolo – zona do núcleo não delimitada por membrana, geralmente no meio da cromatina em que se dá a síntese de componentes ribossomais – “fábrica produtora de ribossomas” [ver mais sobre a produção dos ribossomas na secção formação de ribossomas] ▪ Tamanho e número variáveis consoante atividade metabólica e ciclo celular G2/ prófase: desagregação durante condensação dos cromossomas M/G1: reconstituição ▪ Componentes: Centro fibrilar – transcrição rRNA – cromatina que codifica genes rRNA, RNA Pol I (RNA polimerase I) e SRP (signal recognition peptide – utilizado para o exporte dos ribossomas para o citoplasma) Componente fibrilar denso – processamento rRNA – rRNA nascente e proteínas organizadoras. Componente granular – montagem do ribossoma Img. 23 – Componentes do nucléolo o Corpos nucleares – corpos pouco estudados (exemplos: corpos Cajal e corpos PML) o Cromatina – DNA + proteínas (nomeadamente histonas [ver mais sobre histonas na secção histonas]) ▪ Eucromatina – cromatina transcricionalmente ativa ▪ Heterocromatina – cromatina altamente condensada e transcricionalmente inativa Constitutiva – nunca transcrita Facultativa – não transcrita naquela célula em particular ▪ Na mitose a cromatina está organizada em cromossomas ▪ Para além das histonas, existem outras proteínas que se ligam ao DNA e que podem ter funções estruturais ou podem ainda ter um papel na regulação da transcrição o Compartimento intercromatina o É também o local de processamento de: ▪ snRNPs – small nuclear nibonucleoproteins – combinadas com o pré-mRNA e outras proteínas formam os sliceossomas ▪ snoRNPs – small nucleolar RNAs – envolvidas nas modificações dos rRNAs (metilação) Formação dos ribossomas Há um único transcrito produzido (centro fibrilar do nucléolo) que, através do seu processamento (componente fibrilar denso), origina as subunidades 18S, 5.8S e 28S dos ribossomas. O rRNA 5S (RNA plimerase III) é transcrito fora do nucléolo e as proteínas ribossomais são importadas do citoplasma para o núcleo através dos poros nucleares. A montagem das duas subunidades dos ribossomas vai então acontecer na componente granular do nucléolo. Subunidade menor (40S): 18S + proteínas ribossomais Subunidade maior (60S): 5S, 5.8S e 28S + proteínas ribossomais 17 Img. 24 – Formação dos ribossomas Histonas As histonas são pequenas proteínas com elevada proporçao de aa básicos (Arg e Lys). O DNA (147 bp) está envolto num octâmero de histonas, com duas moléculas de cada uma das seguintes: H2A, H2B, H3 e H4 – constituíndo um nucleossoma. A H1 é a histona linker, que tem como função manter a estrutura do nucleossoma. Os octâmeros estão ligados por DNA linker que pode ter até 80 nucleótidos, associados à histona H1. Img. 25 – Nucleossoma Níveis de organização do DNA DNA em dupla hélice (2 nm) Nucleossoma (o DNA pode ainda ser transcrito) (11 nm) Solenóide – conjunto de 6 nucleossomas (o DNA já não pode ser transcrito) (30 nm) Fibra de cromatina (700 nm) Cromatídeo (1400 nm) Img. 26 – Organização do DNA 2. Processos nucleares Replicação do DNA Características da replicação: Semi-conserativa: cada uma das cadeias parentais é usada como molde para a formação da cadeia nova Bi-direcional: ocorre em dois sentidos na bolha de transcrição Direção de 5’ para 3’ (formação da cadeia nova): os novos nucleótidos é SEMPRE efetuada na extremidade 3’OH A adição de novos nucleótidos na extremidade 3’ ocorre pela ligação da extremidade 5’trifosfato do nucleótido à extremidade 3’OH do último nucleótido na cadeia, havendo a libertação de pirofosfato (2P). 18  Origem de replicação do DNA: Várias proteínas iniciadoras ligam-se à região de origem de replicação do DNA, formando um loop que destabiliza a região adjacente rica em A e T. Nesta região vão se ligar as DNA helicases que, num processo que gasta energia, rodam, promovendo a separação das duas cadeias. Forma-se então uma região em que as cadeias estão separadas, a bolha de replicação, onde se vai alojar a maquinaria de replicação. Forquilha de replicação – zona de separação das cadeias e de replicação do DNA que se move prograssivamente ao longo do DNA parental, em direções opostas da origem de replicação. Img. 27 – Origem de replicação do DNA. DNA helicases – hidrolisam ATP para separar cadeias de DNA. Movem-se ao longo da cadeia dupla, abrindo cerca de 1000 nucleótidos por segundo. Esta abertura ocorre à frente das forquilhas de replicação. Proteínas SSB (single-strand DNA binding proteins) – Após a atuação das DNA helicases, estas proteínas ligam-se à região do DNA parental em cadeia simples, de modo a estabilizarem a cadeia simples (destabilizam a cadeia dupla). DNA polimerase – proteína que faz a síntese das novas cadeias de DNA, adicionando nucleótidos na extremidade 3’OH. Ancoragem da DNA polimerase: Duas proteínas, a sliding clamp e a clamp holder, ligam-se ao DNA na região onde vai ocorrer a replicação. A sliding clamp vai servir de âncora para a DNA polimerase. Img. 28 – Ancoragem da DNA polimerase ao DNA 19 Replicação Bi-direcional: forquilha de replicação assimétrica A cadeia leading é sintetizada continuamente. A cadeia lagging é sintetizada descontinuamente. A síntese é feita em fragmentos – fragmentos de Okazaki – posteriormente unidos entre si para formar uma cadeia contínua. A sintese diferente justifica-se pelo facto de a DNA polimerase conseguir adicionar fragmentos apenas num dos terminais. Img. 29 – Fragmentos de Okasaki: cadeia lagging DNA primase – enzima que coloca primers de RNA na cadeia de DNA. Estes primers com terminal 3’OH livre são reconhecidos pela DNA polimerase, que adiciona novos nucleótidos nesta extremidade. Img. 30 – DNA primase e primer de RNA Ação da DNA polimerase: No local catalítico da DNA polimerase encontra-se a extremidade 3’ da cadeia que está a ser formada. Na presença de um nucleótido a proteína muda de conformação, promovendo a ligação deste nucleótido à cadeia e a libertação de dois grupos fosfato. Na cadeia lagging, são depositados vários pequenos primers, a partir dos quais se formam os fragmentos de Okazaki, por ação da DNA polimerase. De seguida, uma RNase (nuclease – enzima que degrada nucleótidos RNA) remove o primer de RNA. A DNA polimerase faz então a substituição do primer de RNA por nucleótidos de DNA. Por fim, os fragmentos de DNA são unidos por ação da DNA ligase, que estabelece ligações fosfodiéster entre os dois fragmentos. Esta ligação é feita em dois passos: Primeiro, o ATP é utilizado para ativar o terminal 5’ de um dos fragmentos, e de seguida ocorre a ligação dos dois fragmenteos propriamente dita, havendo libertação de AMP (adenosina monofosfato). Img. 31 – Ação da DNA ligase Complexo multi-enzimático de replicação do DNA: DNA helicases Proteínas SSB DNA primase DNA ligases DNA polimerases Sliding clamp e clamp loader 20 Reparação e recombinação do DNA Apesar de o DNA ser uma molécula extremamente estável, podem ocorrer erros na replicação ou mutações por diversas razões. Tipos de erros na replicação do DNA Dada a quantidade de intervenientes no processo de replicação, a probablidade de ocorrência de erros é mais elevada. Este processo tem uma taxa de erro de 1 para 10 nucleótidos copiados. Possíveis fontes de erros: Pequenas alterações na geometria da hélice em que podem formar-se pontes de hidrogénio entre G e T Incorporação de formas tautoméricas* das 4 bases do DNA formando-se pares do tipo C-A e T-G sem alteração da geometria da duplahélice *formas tautoméricas – isómeros que resultam do deslocamento transitório das ligações químicas. A (imina) emparelha com C e T (enol) emparelha com G Img. 32 – formas tautoméricas das bases dos nucleótidos Revisão (proofreading) do DNA A DNA polimerase utiliza um segundo local catalítico – sítio catalítico exonucleótido – para a revisão da cadeia de DNA nascente. Neste modo de edição, a cadeia nascente desemparelha-se momentaneamente da cadeia molde onde os nucleótidos não emparelhados corretamente são removidos. Mecanismos de proofreading: 1. Atividade exonucleolítica 3’-5’ – a forma tautomérica é instável acabando por reverter à sua forma normal, levando a que haja um reconhecimento do erro. 2. Paragem da polimeração quando à recohecimento de um erro. A DNA polimerase passa para o seu modo de editing, corrige o erro e retoma a polimerização da cadeia. Danos no DNA Espontâneos – decorrem de erros na atividade celular normal Induzidos – exposição a agentes mutagénicos ⇒ mecanismos de reparação 21 Mecanismos de reparação do DNA 1. Base excision repair (remoção de bases) – O erro é detetado por uma enzima que remove a base do nucleótido. Duas enzimas – AP endonuclease e a fosfodiesterase – removem a glicose fosfato deixando um local vazio na cadeia. Este local é então preenchido pela ação da DNA polimerase e da DNA ligase. 2. Nucleotide excision repair (remoção de nucleótidos) – No local do erro, a DNA helicase cria uma bolha, separando cerca de 30 nucleótidos. A Nuclease de excisão remove uma porção contendo o erro. A DNA polimerase e a DNA ligase fazem a reparação. 3. Double-strand breaks (danos nas duas cadeias de DNA) – nesta situação não há uma cadeia molde intacta. Este tipo de dano pode levar à desagregação cromossómica e à perda de genes. a. Non-homologous end joining (NHEJ) – quando há uma quebra, as duas pontas são simplesmente ligadas pelos heterodímeros Ku, podendo haver perda de DNA (podendo então resultar numa mutação). Mesmo havendo o risco de perda de DNA, este método é aceitável uma vez que a maior parte do genoma humano não é utilizado. b. Homologous recombination (HR) – o cromatídeo afetado é reparado usando o cromatídeo homologo como template para a porção afetada. Este método é preferencial em momentos logo após a replicação. Uma nuclease degrada as extremidades partidas. Como as cadeias de DNA filhas ainda estão emparelhadas, a célula consegue usar a cadeia intacta para servir como molde. A reparação é feita por uma polimerase de reparação. Por fim as novas porções são ligadas pela DNA ligase. Defeitos nos mecanismos de reparação do DNA podem resultar em vários tipos de patologias bastante graves. Img. 33 – Recombinação homóloga. Transcrição Gene – Unidade de DNA que contém a informação para a síntese de uma cadeia polipeptídica ou de um RNA funcional. A expressão génica é diferente nos eucariotas e nos procariotas devido à presença de núcleo nos primeiros e ausência do mesmo nos segundos. Nos procariotas a transcrição e a tradução ocorrem, geralmente, em simultâneo. Nos eucariotas, após a transcrição, o RNA é processado, exportado para o citosol, e, finalmente traduzido. Existem vários tipos de RNA, e não só apenas o mRNA, o tRNA e o rRNA, que estão envolvidos na tradução. O RNA pode assumir também funções reguladoras e catalíticas (ribozimas). 22 RNA polimerases (eucariotas) – enzimas responsáveis pela polimerização orientada (5’ → 3’) e sequencial do RNA através da transcrição. Estas enzimas ligam-se ao DNA e catalisam as ligações fosfodiester entre ribonuclótidos, produzindo o RNA. Exitem 3 tipos de RNA polimerases nos eucariotas, responsáveis pela síntese de diferentes tipos de RNAs. RNA polimerase I II III Localização Nucléolo Nucleoplasma Nucleoplasma RNAs - rRNAs 28s, 18s, 5.8s - mRNA - tRNAs transcritos - snRNAs - rRNA 5s - snoRNAs - snRNA U6 - miRNAs - 10% RNAs Função RNA - Componentes - Spcing - Splicing ribossomais - Controlo génico pós- - Síntese de proteínas - Síntese de proteínas transcricional - Componentes - Síntese de proteínas ribossomais Tab. 6 – RNA polimerases dos eucariotas Etapas da transcrição: 1. Iniciação a. A RNA polimerase ligação ao promotor no DNA b. Há a separação das cadeias do DNA perto do local de início da transcrição c. Ligação dos dois primeiros ribonucleótidos. 2. Elongação – A RNA polimerase avança na cadeia molde de DNA, adicionando ribonucleótidos na extremidade 3’ da cadeia de RNA emergente, com utilização de ATP. 3. Terminação – Libertação da cadeia de RNA e do complexo polimerase do molde de DNA A RNA polimerase “lê” a cadeia molde no sentido 3’ → 5’ Organização geral dos promotores dos eucariotas: A transcrição começa no local +1 (ponto de referência para várias regiões no DNA). A região promotora é essencialmente composta por dois elementos: Elementos promotores proximais (-200bp do local de início de transcrição) TATA box (zona central do promotor) – importante para determinar o local preciso para o ínicio da transcrição localizando-se, aproximadamente, a – 25-30 nucleótidos do início da transcrição. O promotor produz um nível baixo de transcrição – transcrição basal. Este nível é alterado pelos “reguladores da transcrição”. Img. 34 – Organização estrutural do promotor num gene de um mamífero e no gene de uma levedura Regulação da transcrição: Enhancers (ativadores) – estimulam a transcrição Silencers (silenciadores) – reprimem a transcrição 23 Ligação do complexo polimerase e início da transcrição Exitem uma série de fatores de transcrição necessários para a ligação da RNA polimerase II ao DNA. 1. TFIID – a subunidade TBP (TATA-binding protein) deste fator de transcrição liga-se à TATA box marcando o local do promotor do DNA. 2. TFIIB – reconhece uma sequência BRE no DNA imediatamente a montante da TATA box e vai permitir a ligação da RNA polimerase no local correto para o início da transcrição 3. RNA pol II liga-se ao TFIIB e ao DNA 4. TFIIF – recuta o TFIIE e estabiliza a interação da RNA pol II com o TFIID e com o TFIIB 5. TFIIE – recruta o TFIIH 6. TFIIH a. A TFIIH atua como uma helicase, usando a energia libertada pela hidrólise do ATP para criar a bolha transcricional b. A TFIIH também atua como cinase, fosforilando a “cauda” da RNA polimerase – CTD (Carboxyl Terminal Domain) – e alterando a sua conformação, permitindo assim que esta se separe do complexo de iniciação de transcrição para a elongação da cadeia de RNA. 7. Após a incorporação dos 1ºs ribonucleótidos, os fatores de transcrição são libertados, exceto o TFIID. CTD (Carboxyl Terminal Domain) – domínio da subunidade maior da RNA pol II que tem um conjunto de 7aa repetidos, essenciais para a atividade da polimerase: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser Img. 35 – Início da transcrição: complexo de iniciação Processamento do mRNA Modificações terminal 5’ – 5’CAP Modificações o Fosfatase – remove o grupo fosfato a 5’ o Guanilil-transferase – adiciona GTP a 5’ o Metil-transferase – adiciona grupo metil (CH3) à guanosina Funções da 5’CAP o Protege o mRNA de enzimas hidrolíticas o Sinaliza o local de ligação de ribossomas Img. 36 – 5’CAP 24 Modificação terminal 3’- Cauda poli-A Modificações o Endonuclease liberta 3’OH o Poli-A polimerase adiciona adeninas Funções da cauda o Inibição da hidrólise o Facilta a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma o Facilita a ligação ao ribossoma Splicing Splicing do mRNA – remoção de intrões e união dos exões originando uma molécula de mRNA com uma sequência codificante contínua, havendo manutenção da 5’CAP e da cauda Poli-A. Img. 37 – Splicing O splicing dos intrões é mediado por complexos formados por ribonucleoproteínas – spliceossomes – que reconhecem sequências específicas no pré-mRNA que indicam os locais onde vai ocorrer a excisão dos intrões. O complexo junta as duas extremidades do intrão formando uma “bolha” que vai ser removida. Por fim, um complexo de junção de exões (EJC) é responsável pela junção dos dois segmentos de mRNA resultantes. 3. Visão Geral da tradução proteica e modificações pós-translacionais Tradução O Código genético Codão – grupo de 3 nucleótidos no mRNA que corresponde a um aa específico. Anti-codão – grupo de 3 nucleótidos do tRNA que corresponde ao codão Codão start: AUG – Metionina Codão STOP: UAA, UAG ou UGA. Nenhum destes corresponde a um aa, pelo que quando são lidos a síntese da proteína para. Redundância do código genético – vários códões podem codificar o mesmo aminoácido Img. 38 – Código genético (representação circular) Nota: nem todos os aminoácidos na cadeia de mRNA que foi transcrita são traduzidos. 25 Elementos principais mRNA – quando no citoplasma, interafe com os primeiros fatores de iniciação da síntese proteica (eIF4G e eIF4E), formando uma estrutura circular Img. 39 – mRNA: do núcleo para o citoplasma tRNA o Estrutura: constituídos por cerca de 80 nucleótidos. Partes da cadeia interagem entre si, fornecendo à molécula a sua estrutura característica com 3 loops e uma cauda que interage com o aa. Possui o anticodão para “descodificar” o código genético. Tem bases raras que surgem de modificações das bases comuns. o Modificações: a retirada de intrões é feita após a formação da estrutura secundária. A extremidade 3’ é clivada e são adicionados os nucleótidos que vão ser reconhecidos pelo aa. A extremidade 5’ também é clivada. o tRNA-aminoacil = aa + tRNA. A cada tRNA corresponde uma aminoacil tRNA sintetase, que é uma enzima que catalisa a ligação do tRNA ao aa correto. A aminoacil-tRNA sintetase começa por ativar o aa para o adicional à extremidade 3’ do tRNA. A aminoacil-tRNA sintetase tem 2 locais ativos ▪ Local de síntese – neste local podem entrar aa semelhantes ao aa específico do tRNA. Após a ligação neste centro ativo, o aa é ligado ao tRNA ▪ Local de edição – se o aa conseguir entrar neste local, é um aa incorreto e é por isso removido ▪ Assim, o aa correto é aquele que capaz de entrar no sítio de síntese e incapaz de entrar no sítio de edição. Img. 40 – Aminoacyl sintetase Ribossoma – as duas subunidades são montadas no núcleo e exportadas para o citoplasma. Funciona como uma ribozima (2/3 rRNA + 1/3 proteínas). o Subunidade pequena – acomoda o mRNA; local onde o anti-codão do tRNA se liga ao codão do mRNA. 26  o Subunidade grande – local onde se vai dar a formação da cadeia polipeptídica o Função do rRNA do ribossoma: ▪ Estrutura ▪ Posicionamento dos tRNA e mRNA ▪ Catálize da ligação peptídica o Função das proteínas do ribossoma: estabilizam a estrutura do ribossoma e ajudam nas mudanças confrmacionais o Um ribossoma acomoda 3 tRNAs em 3 sítios, 2 de cada vez: ▪ Sítio E – local de saída (Exit) ▪ Sítio P – local de ligação (Pairing; Polipeptido) ▪ Sítio A – local de chegada (Arrival; Acetilamino transferase?) ATP e GTP aa Proteínas envolvidas na tradução – existem muitas proteínas que estão envolvidas no processo de tradução o eIFs – Fatores de Iniciação Eucarióticos. Geralmente ligam-se ao complexo acoplados a GTP, cuja hidrólise vai servir como fonte de energia para as várias reações o Efs – Fatores de Alongamento (Elongation) o Fatores de libertação Etapas da tradução: 1. Iniciação a. O i-tRNA (Met) liga-se à subunidade menor do ribossoma (sítio P) sem este estar montado. É o único tRNA capaz de fazer isto. O i-tRNA é trazido pelo eIF2 b. O mRNA, na sua estrutura circular, liga-se à subunidade menor do ribossoma. Os eIF4G e eIF4E e a 5’cap auxiliam a subunidade ribossomal a reconhecer o mRNA. Juntam-se outros fatores de iniciação. c. A subunidade menor percorre o mRNA até ao codão AUG utilizando energia. d. Quando se dá a ligação do anti-codão ao codão AUG, os fatores de iniciação dissociam-se permitindo a montagem do ribossoma completo Img. 41 – Iniciação da tradução 2. Alongamento: O mRNA é lido de 5’ para 3’ e a cadeia começa no N-terminal e os novos aa são adicionados no C-terminal a. Um tRNA acoplado ao EF1-GTP chega ao síto A b. O rRNA testa a ligação entre o tRNA e o mRNA c. Se a o tRNA for o correto, a EF1-GDP dissocia-se, induzindo alterações conformacionais que vão permitir a ligação do novo aa ao anterior 27  d. Existe um pequeno atraso entre a saída do EF1-GDP e a formação da ligação peptídica. Neste intervalo, o rRNA testa novamente a estabilidade da ligação entre o codão e o anti-codão e. Forma-se a ligação entre os aa e a ligação entre o aa e o tRNA no sítio P é clivada. Esta reação é catalisada pela Peptidyl sintetase na subunidade maior f. O EF2-GTP liga-se no sítio A e provoca mudanças conformacionais, que deslocam o mRNA e os tRNA – translocação g. Dá-se a hidrólise do GTP, sendo o EF2-GDP libertado. h. A subunidade menor liga-se novamente à subunidade maior, expondo, novamente, o codão no sítio A. O tRNA no sítio E dissoci a-se da estrutura, sendo reciclado. Img. 42 – Alongamento da cadeia polipeptídica 3. Terminação a. Fatores de dissociação, ligados a GGTP, ligam-se ao sítio A quando um codão stop aparece b. A hidrólise do GTP provoca alterações conformacionais no ribossoma c. A peptidil transferase hidrolisa a ligação entre a cadeia polipeptídica e o último tRNA d. O mRNA é libertado e. As duas subunidades são separadas e a maquinaria de tradução dissocia-se, estando os vários componentes prontos para mais um ciclo de tradução. Img. 43 – Fim da tradução (Fase inicial) Geralmente, as proteínas são feitas em polirribossomas. Um único mRNA é lido por vários ribossomas que estão separados por cerca de 80 nucleótidos. A tradução é um processo extremamente rigoroso, com erros em 1/10 000 aa incorporados. Em eucariotas são adicionados cerca de 2aa/s a 37º. Este valor é geralmente maior nos procariotas 28 Regulação da tradução Do ponto de vista energético, faz mais sentido que esta regulação ocorra nas fazes iniciais da tradução de modo evitar gastos energéticos. Deficiência de aa: Neste caso, a célula vai ter tRNAs não acoplados a aa. Estes tRNAs são reconhecidos por proteínas que fosforilam a eIF2. Estando este fator ligado ao i-tRNA, não é possível iniciar a tradução. Inibição do processo por antibióticos – grande parte dos antibióticos funcionam por interações com porções dos ribossomas, bloqueando o processo da tradução. Processos Co-traducionais Folding – à medda que a proteína sai do ribossoma começa o processo de folding, normalmente assistido por proteínas chaperones. Muitas vezes as chaperonas estão ligadas ao ribossoma para assistir no processo. As partes hidrofóbicas são reconhecidas pelas chaperonas e “escondidas” até a formação da porção seguinte da cadeia polipeptídica. Este mecanismo permite que as proteínas adquiram a sua estrutura 3D correta. Direcionamento das proteínas Existem sequências de resíudos de aa nas proteínas que são reconhecidas por proteínas citosólicas que levam as levam para o seu destino na célula. Estas sequências são específicas para cada compartimento celular. Importação para o RE: As proteínas que devem ser importadas pelo RE têm uma sequência de resíduos aa hidrofóbicos que são reconhecidos pela proteína SRP (signal recognition particle). Esta proteína, ao chegar à membrana do RE, liga-se ao recetor na membrana. Uma proteína translocadora acoplada ao recetor recebe a porção hidroóbica e encaminha a cadeia para o lúmen do RE à medida que esta está a ser formada. Img. 44 – Translocação co-traducional de proteínas para o RE Modificaçõs pós-traducionais Papel das modificações: Necessárias para a proteína adquirir a sua forma funcional Reconhecimento da proteína Estabilidade Regulação da atividade da proteína 29 Características gerais das modificações: Maioria são ligações covalentes Maioria são reversíveis Ocorrem em determinados aa Podem ser co-traducionais ou pós traducionais Principais modificações pós-traducionais: Clivagem proteolítica Sumoilação Glicosilação Lipidação Acetilação Carboxilação Metilação Hidroxilação Fosforilação Etc… Ubiquitinação Clivagem proteolítica – processo irreversível co-traducional ou pós-traducional caracterizado pela remoção de, por exemplo, metioninas iniciais e de sequências de reconhecimento para a translocação intracelular. As peptidases catalisam este processo. Glicosilação – adição covalente co-traducional ou pós-traducional de um oligossacarídeo ao grupo amina (N-glicosilação) ou ao grupo OH (O-glicosilação), que ocorre no RE, no Golgi ou em vesículas secretórias - glicoproteínas. A adição do oligossacarídeo é catalisada por glicosil transferases, enquanto que as glicosidases quebram esta ligação. Esta modificação confere estabilidade às proteínas (tornam-se mais hidrofílicas), e é muito comum e proteínas de membrana. A maioria das proteínas que passam pelo RE são glicosiladas ainda durante a tradução. Lipidação – adição covalente co-traducional ou pós-traducionalde grupos lipídicos (hidrofóbicos) às proteínas. Esta modificação permite a integração das proteínas na membrana. O grupo lipídico pode ainda mediar a interação entre proteínas e conferir mais estabilidade à proteína. Fosforilação/Desfosforilação (Cinases/fosfatases) – Adição/Remoção de um grupo fosfato que se liga covalentemente ao grupo R de tirosinas, serinas ou treoninas. Estas modificações causam mudanças conformacionais e são reversíveis. Podem também fazer parte da estrutura reonhecda por sítios ativos ou impedir o reconhecimento da proteína. Mais de 1/3 das proteínas são reguladas por fosforilação/desfosforilação. Ubiquitinação (Ubiquitina ligase x ubiquitinase) – adição covalente de uma pequena proteína (76aa) chamada ubiquitina a um resíduo de Lys. A quantidade de ubiquitina e a posiçao da Lys envolvida são determinantes para o papel da modificação. As ubiquitinas podem ser adicionadas em série (poliubiquitinação) para marcar a proteína para a sua destruição nos proteossomas. Acetilação/ Desacetilação – adição do grupo acetil a Lys (Acetil transferase/acetilases) – e Metilação/Desmetilação – adição do grupo metil em Arg e Lys (Metil transferase/metilases) – estas modificações alteram a carga e a conformação da proteína. As histonas têm as extremidades N projetadas para o exterior do nucleossoma, permitindo que a sua afinidade ao DNA seja alterada através de modificações pós-traducionais nestes terminais. Isto permite controlar o enrolamento de determinadas secções do DNA, e, consequentemente controlar a expressão génica. Uma mesma sequência de aa, ou seja, uma mesma proteína, pode ter funções diferentes, dependendo das modificações que sofre. Estas modificações adicionam ainda mais complexidade ao processo de expressão génica. 30 Img. 45 – Complexidade da expressão genética 4. Terapias Genéticas (Seminário) Terapia génica – inserção de genes/ material genético nas células de um indivíduo para substituir, manipular ou suplementar genes disfuncionais causadores de patologia Tipos de terapia génica Substituição de gene – loss-of-function defect; mutações que levam à perda de uma determinada função, normalmente mutações recessivas Supressão de gene – gain-of function defect; mutações que levam ao ganho de uma função nociva para o organismo, normalmente mutações dominantes Edição genómica – correção de um gene na sua localização genómica específica (tecnologia CRISPR, funciona apenas para mutações de tamanho bastante limitado) Vetores para inserção do material: Vetores virais – cada um tem um mecanismo de entrada na célula diferente. A porção do DNA viral associada à replicação do mesmo é removida o Adenovirus o Retrovirus o Lentivirus (como HIV) – o DNA é integrado no cromossoma num local aleatório que pode levar a mutações por inserção de DNA. Na maior parte dos casos é inócuo, uma vez que a maior parte do nosso material genético não está associado a nenhuma proteína ou RNA funcionais. o Adeno-associated virus (AAV) – o material genético junta-se aos cromossomas mas não se integra nestes Vetores não-virais: lipossomas, DNA, nanoparticulas Vetor Viral Não Viral Vantagens − Alta eficácia de entrada na célula − Fácil de produzir − Tropismo seletivo − Baixo custo − Expressão do gene pode ser − Podem conter genes mais longos controlada − Baixa probabilidade de gerar reações − Pode atuar em células específicas imunes Desvantages − Díficil produção − Baixa eficácia de transdução − Geram reações imunes − Não pode atuar em células específicas − Tamanho limitado de material − Necessárias grandes quantidades genético que pode ser translocado − Toxicidade − Mutações Tab. 7 – Vantagens e desvantagens de vetores virais e não virais 31 Vias de administração: In vivo: vacinas/ injeções locais Ex vivo: Células removidas da pessoa são trabalhadas em laboratório e administradas posteriormente Controlo da Expressão Genética 1. Fatores de Transcrição O controlo da expressão genética é um mecanismo de diferenciação celular. Os diferentes tipos de células sintetizam diferentes conjuntos de RNAs e proteínas. Muitos processos são comuns a todas as células, e portanto células diferentes de um mesmo organismo têm produtos genéticos em comum. Alguns RNAs e proteínas são abundantes nas células especializadas em que funcionam, não sendo detetados em qualquer outro tipo de célula. Podemos também identificar, com precisão, o tipo de célula conforme o espetro de mRNAs encontrados. Por exemplo, os neurónios podem ser classificados em subtipos, utilizando este tipo de análise. A expressão genética pode ser controlada nas vérias etapas entre o DNA e a proteína ativa. Img. 46 – Etapas em que a expressão genética nos eucariotas pode ser controlada Fatores de transcrição – Controlo da transcrição Reguladores de transcrição – grupo de proteínas que reconhecem sequências específicas de DNA (através dos seus motivos estruturais). Permitem determinar os genes transcritos com uma especificidade espacial e temporal. Img. 47 – Locais de ligação de um regulador de transcrição a uma sequência de DNA específica 32 Estas proteínas ligam-se a sequências especificas do DNA sequências cis-regulatórias. Os reguladores de transcrição são, normalmente, dímeros e não monómeros. Isto permite duplicar o tamanho da sequência reconhecida (um monómero reconhece 6-8 nucleótidos) e aumentar a especificidade e a afinidade da ligação do regulador ao DNA. Os reguladores da transcrição podem ligar-se cooperativamente ou não cooperativamente ao DNA. Ligação não cooperativa – os reguladores encontram-se na forma de dímeros no nucleoplasma e ligam-se nesta forma ao DNA. A curva de ligação é logarítmica, em que temos um aumento de ligações da proteína ao DNA com o aumento da concentração da proteína. Ligação cooperativa – os reguladores encontram-se na forma de monomeros no nucleoplasma. A curva de ligação é sigmoideia, havendo por isso uma situação “tudo ou nada” em que a partir de uma certa concentração passamos de quase não haver ligações entre o regulador e o DNA para uma situação de “saturação de ligações”. Img. 48 – Ligação dos reguladores ao DNA A estrutura do nucleossoma dificulta a ligação dos reguladores ao DNA. Muitas vezes a ligação das proteínas reguladoras altera ligeiramente a conformação do DNA, esta alteração é oposta pela ligação do DNA às histonas. Assim, a ligação cooperativa acaba por ser favorecida nesta situação. A ligação de um dos componentes favorece a ligação do segundo, uma vez que altera ligeiramente a conformação do DNA. Img. 49 – Como os nucleossomas afetam a ligação dos reguladores da transcrição Os reguladores de transcrição podem ativar ou desativar a transcrição – ativadores e repressores. Operador – sequência de DNA entre o promotor e o gene onde se ligam os reguladores de transcrição. Operão – conjunto promotor + operador + genes todos contíguos, relacionados com uma mesma função e regulados em conjunto. Exemplo 1: Operão do triptofano Na E. coli, um repressor regula a transcrição de um conjunto de 5 genes relacioados com a síntese do aminoácido triptofano. O operão triptofano é inativado aquando a ligação de um repressor. Este repressor é ativado na presença de concentrações elevadas de triptofano. Exemplo 2: Operão Lac A expressão deste operão (encontrado também na E. coli) é regulada por um repressor e por um ativador. 33 O operão contém 3 genes (lacZ, lacY e lacA). O primeiro gene do operão, lacZ, coficia a enzima β-galactosidase que decompõe a lactose em galactose e glicose. O repressor lac liga-se ao operador lac na ausência de lactose. (Não é preciso a enzima se não houver lactose) O ativador CAP (proteína ativadora de catabólito) liga-se ao operão na ausência de glicose. (Só precisamos de decompor a lactase para ter glicose se não houver glicose já disponível. Glicose Lactose Ativador Repressor Operão + + Inativado Inativado Desligado + - Inativado Ativado Desligado - - Ativado Ativado Desligado - + Ativado Inativado Ligado Tab. 8 – Regulação do operão Lac Nos eucariotas, a região de controlo de genes consiste num promotor e em várias sequências cis-regulatórias. Estas sequências regulatórias podem estar em locais bastante afastados do promotor mas através das dobras do DNA os reguladores de transcrição (que podem estar acoplados a coativadores ou co-repressores) conseguem interagir com o complexo proteíco da transcrição. Img. 50 – Nos eucariotas, os reguladores de transcrição formam complexos, ligados ao DNA. Algumas proteínas são partilhadas por repressores e ativadores, sendo por isso o conjunto de proteínas (e RNAs não codificantes) que regula a expressão genética. Diferentes formas de atuação de proteínas repressoras eucarióticas: 1. Ligação competitiva ao DNA – o ativador e o repressor competem para se ligaram a sequências reguladoras que se sobrepõem. 2. Ligação ao ativador, impedindo-o de funcionar 3. Interação direta com os fatores gerais de transcrição impedido a sua montagem 4. Atração de outras enzimas que estimulam a reorganização do DNA para a formação de heterocromatina ou para o enrolamento do DNA num nucleossoma, situação em que a transcrição é impossível/ menos “provável”. Img. 51 – Modos de atuação dos repressores eucarióticos 34 Interruptores genéticos: exemplo da regulação do desenvolvimento da Drosophila No desenvolvimento da Drosophila, o gene Eve é regulado por uma região composta por 7 segmentos distintos. Este gene é expresso em 7 tiras. Usando a tecnologia do DNA recombinante foi possivel associar um dos segmentos regulatórios a um gene lacZ, cujo produto, β-galactosidase, é facilmente identificável. Verificou-se que esta enzima só foi produzida na segunda tira. Concluiu-se assim, que a expressão do gene Eve na segunda tira é regulada pelo segundo segmento. Repetiu-se a experiência com os restantes segmentos, chegando-se à conclusão que cada um dos segmentos regulatórios está associado a uma das tiras. Img. 52 – Experiência que demonstra a construção modular da região regulatória do gene Eve Regulação da atividade dos reguladores de transcrição: A. A proteína é apenas sintetizada quando é necessário B. Ativação por ligação de um ligando C. Ativação por modificação covalente D. Ativação por adição de uma segunda subunidade E. Ativação por remoção de um inibidor F. Importação nuclear estimulada pela remoção de um inibidor G. Libertação da membrana nuclear por proteólise regulada Img. 53 – Regulação da atividade dos reguladores de transcrição em células eucarióticas, exemplos Controlo genético combinatório: Com várias combinações de diferentes reguladores podemos obter vários tipos de células diferentes. Na verdade, podemos converter tipos de células noutros tipos em laboratório, introduzindo nestas uma combinação de reguladores diferentes. Este fenómeno tem uma importância vital na diferenciação celular e no deselvolvimento embrionário. Pensa-se que, ao sentirem a sua posição relativa no embrião, as células sintetisam diferentes proteínas reguladoras da transcrição. Img. 54 – Controlo genético combinatório (5 reguladores -> 8 células diferentes) 35 Circuitos de transcrição: Os circuitos de transcrição permitem que a célula realize operações lógicas. Img. 55 – Tipos mais comuns de circuitos de transcrição. A e B representam reguladores de transcrição. Setas verdes representam controlo positivo e linhas vermelhas com barras representam controlo negativo da transcrição. 2. Controlo pós-transcricional e RNAs não codificantes Expressão diferencial de genes: patologia Assim como a expressão diferencial de genes está associada à diferenciação celular, também pode estar associada a certas patologias. Nos cancros é comum haver uma desrregulação da expressão de alguns genes em células cancerígenas, quando comparadas com células normais. Por exemplo, o cancro da mama está associado, frequentemente, a amplificações dos genes erbB2/HER2/neu. Esta amplificação pode ocorrer a nível do DNA, ou da expressão deste (regulação da expressão genética). RNAs não codificantes Os RNAs não codificantes são RNAs que não participam ativamente no processo de tradução, mas que têm um papel regulador. Muitas das funções destes tipos de RNAs são ainda desconhecidas. 1 – 2% do genoma humano é transcrito (transcritoma) e traduzido em proteínas (proteoma) 70 – 90% do genoma é transcrito (transcritoma) mas não traduzido (pervasive transcription) o Neste genoma não traduzido incluem-se os RNAs não codificante, incluindo ▪ lncRNAs (long non-coding RNAs) com mais de 200 nt (aproximadamente) ▪ microRNAs com cerca de 20 nt Tipos de RNAs: Img. 56 – Tipos de RNAs 36 80 – 90% da massa de RNAs não codificantes corresponde a rRNA. No entanto, existe um número muito maior de tRNAs na célula. A quantidade dos RNAs não codificantes regulatórios é mínima nas células, mas têm um papel fundamental na regulação da expressão genética. MicroRNAs – síntese e funções 1. RNA pol II – transcrição de uma molécula relativamente longa de pri-miRNA com ansas de auto- emparelhamento 2. Drosha e DGCR8 – Inicia o processamento dos pri- miRNAs no núcleo, clivando as extremidades livres, originando pre-miRNAs com 70 – 100 nt 3. Exportina 5 e Ran-GTP – Transporte do pre-miRNA do núcleo para o citoplasma Img. 57 – Síntese e regulação de miRNAs 4. Dicer e TRBP – Esta endoribonuclease processa o RNA em cadeia dupla e o pre-microRNA em pequenos fragmentos. (Corta as extremidades, nomeadamente o loop, originando pontas soltas, mas emparelhadas) 5. RISC (RNA-induced silencing complex) – induz a separação das cadeias, sendo uma destas descartada enquanto que a cadeia de miRNA maturado associada à RISC forma um complexo ribonucleoproteico com função reguladora. Função do Complexo miRNA-RISC: Se houver emparelhamento perfeito entre o miRNA e o mRNA, este é degradado pela Argonauta; Havendo emparelhamento os ribossomas estão impedidos de prosseguir no processo da tradução; Se houver erros de emparelhamento, o mRNA pode ser localizado em focos citoplasmáticos de processamento (P bodies) onde é degradado. Uma única molécula de mRNA pode ligar-se parcialmente a dezenas de mRNAs diferentes, regulando assim a expressão de uma quantidade considerável de genes. Paralelaments, um único mRNA pode ser regulado por vários mi-RNAs. Nos mamíferos os mi-RNAs não impedem a tradução do mRNA, mas acabam por reduzir a tradução. Existem vários tipos de mi-RNAs que podem ser transcritos em conjunto, em clusters, ou independentemente. Os mi-RNAs podem também estar presentes nos intrões. SiRNAs (small interfering RNA) vs miRNAs: Os mi-RNAs são moléculas endógenas de regulação enquanto que os siRNAs são moléculas exógenas. Devido à sua estrutura em cadeia dupla, são ambas processadas pela Dicer e encaminhadas por esta para o RISC que é o efetor do silenciamento/ interferência. O funcionamento acaba por ser o mesmo. Os siRNAs podem ser utilizados para silenciar a expressão de determinados genes. No entanto é necessário introduzir o siRNA apenas nas células em que desejamos silenciar esses genes. Isto 37 é relativamente fácil de atingir em linhas celulares in vitro, mas difícil em humanos e com potenciais efeitos tóxicos. MiRNAs e cancro: Uma série de mutações em mi-RNAs estão associadas a tumores cancerígenos. O estudo das alterações induzidas por estas mutações permite um conhecimento mais profundo das funções dos mi-RNAs. Alterações induzidas: Prolongamento dos sinas de Resistência à morte celular proliferação Imortalidade replicativa Evasão a supressores de crescimento Indução da angiogénese celular Ativação da invasão e metástase Um exemplo mais concreto é o caso dos oncogenes. Os oncogenes facilitam a divisão e proliferação celular. Os miRNAs atuam como supressores de tumores uma vez que reduzem a tradução destes oncogenes – silenciadores dos oncogenes. Sabe-se ainda que há alterações na transcrição de vários miRNAs em doenças infecciosas. LncRNAs Img. 58 – diferentes funções dos lncRNAs. Estes RNAs não foram ainda estudados extensivamente Estes RNAs não codificantes parecem ter uma função específica em diferentes tipos celulares. Mutações nestas moléculas têm, por isso, diversas consequências nos diferentes tipos de células. 38 Inativação do cromossoma X Nas mulheres, nos primeiros estadios embrionários, um