samenvatting-eindversie-mg2.pdf

lOMoARcPSD|33185463 Samenvatting eindversie - MG2 Moleculaire genetica 2 (BFW) (Universiteit Leiden) Scannen om te openen op Studeersnel Studeersnel wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit...

lOMoARcPSD|33185463 Samenvatting eindversie - MG2 Moleculaire genetica 2 (BFW) (Universiteit Leiden) Scannen om te openen op Studeersnel Studeersnel wordt niet gesponsord of ondersteund door een hogeschool of universiteit Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Moleculaire genetica 2 Globale structuur van chromosomen (H4 blz. 194-216) Al onze verschillende cellen worden gestuurd door hetzelfde chromosomale DNA. Door differentiatie ontstaan er cellen die een verschillende vorm en functie hebben. Differentiatie wordt bepaald door het DNA, hier komen bepaalde genen tot expressie om bepaalde eiwitten te maken. Verschillen in gen-activiteit zorgen voor verschillen in cellen. Cellen kunnen zich anders gedragen, of zelfs zieke cellen worden wanneer hun gen-activiteit verandert. Chromosomaal DNA en het verpakken van de chromatine fiber (blz. 187) Gist wordt gebruikt voor humaan onderzoek en vele andere toepassingen omdat het eukaryoot en eencellig is. Als er aan een DNA-streng eiwitten van een gistcel worden toegevoegd wordt het compacter. DNA bestaat uit een dubbele helix van twee strengen. In één draai van de helix bevinden zich 10 basenparen die samen 3.5 nanometer lang zijn. Het menselijk genoom bestaat uit 6.4 miljard basenparen waardoor het DNA van één cel uitgestrekt twee meter lang is. Omdat al dit DNA in de cel moet passen moet het DNA heel compact worden gemaakt en dus worden opgevouwen. Dit heet ‘condensatie’ van het DNA. De condensatie van het DNA moet dynamisch zijn opgebouwd zodat er nog wel activiteit in het DNA kan plaats vinden. Speciale gebieden van interfase chromosomen de-condenseren zodat bepaalde DNA sequenties beschikbaar zijn voor bijv. gen expressie, DNA repair en DNA replicatie (interfase = fase waarin de cel zich voorbereid op het delen, bestaat uit: G1, S en G2 fase). Deze gebieden condenseren weer zodra deze processen zijn voltooid. De eiwitten die binden aan het DNA om chromosomen te vormen zijn verdeeld in 2 klassen: histonen (histones) en non-histon chromosomale eiwitten (non-histone chromosomal proteins). Het complex van eiwitten uit beide klassen met het nucleaire DNA heet chromatine. Het eerste niveau van chromosoom verpakking bestaat uit nucleosomen, deze worden gevormd door histonen. Elke Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 nucleosoom bestaat uit een complex van 8 histon-eiwitten: H2A, H2B, H3 en H4 (2 van elk), hierbij worden er H3-H4 en H2A-H2B dimeren gevormd. Dit complex van 8 histon-eiwitten heet een octameer. De histon-eiwitten vormen een eiwitkern en hieromheen windt dubbelstrengs DNA van 147 baseparen lang. DNA slaat 1,7x linkshandig om het octameer heen en wordt daarmee 3 keer korter. Het stukje DNA tussen 2 nucleosomen wordt linker DNA genoemd, de lengte hiervan kan variëren. Uit het octameer steken de zogenaamde N staarten (N terminal tails), dit zijn de aminouiteinden van het eiwit. Elk van de kernhistonen heeft zo’n staart en deze dienen als bindingsplaatsen voor andere eiwitten van andere nucleosomen. De eiwitten in het octameer hebben veelal een positieve lading. Dit komt door de positieve aminozuren lysine en Arginine. De positieve lading neutraliseert de negatief geladen DNA backbone. Het DNA om het octameer bevat veel A-T bindingen dichtbij het octameer (minor groove inside) en meer G-C bindingen verder weg van het octameer (minor groove outside). G-C bindingen zijn namelijk lastiger van het octameer af te krijgen en zouden voor een te sterke binding aan het octameer zorgen. Wanneer RNA-polymerase een nucleosoom tegen komt, kan de transcriptie stoppen of vertraagd worden. Echter zijn er andere eiwitten die er voor kunnen zorgen dat het nucleosoom loslaat of opschuift om zo transcriptie te laten plaatsvinden. Sommige transcriptie-eiwitten zijn zelf al sterk genoeg om nucleosomen op te schuiven of te verwijderen. Nucleosomen vormen het 1e niveau van compactie. Het naar elkaar toe trekken van de nucleosomen wordt het 2e niveau van compactie genoemd. Er ontstaat zo de 30 nm fiber. Hierdoor wordt het DNA wel 10 x korter. Dit proces is energetisch eigenlijk ongunstig doordat je negatieve ketens naar elkaar drukt. Deze fiber ontstaat door het histoneiwit H1. Dit is geen core eiwit (eiwit in het nucleosoom). H1 bindt aan linker DNA en zorgt dat de hoek tussen DNA en nucleosomen kleiner wordt. Vervolgens zullen de postieve N uiteinden van de eiwitten in het nucleosoom binden aan het negatieve DNA van een nucleosoom verderop. Zo worden nucleosomen naar elkaar getrokken. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 DNA is bijna altijd opgevouwen tot het 2 niveau van compactie. Verdere compactie van DNA is afhankelijk van het celtype en het tot uiting komen van bepaalde genen. De globale structuur van chromosomen (blz. 207) We gaan nu kijken naar de organisatie van het chromosoom op een meer globale schaal en de manier waarop de verschillende domeinen zijn gerangschikt. De chromosoomstructuur bestaat uit de primaire structuur van de nucleotide volgorde, de secundaire structuur van de dubbele helix en de tertiaire structuur van de opvouwing met behulp van eiwitten (de beads-on-a-string, 30 nm fiber en de chromatine loops). De 30 nm fiber is nog niet klein genoeg, er moet nog een hoger niveau zijn voor het vouwen en compacter maken van DNA. Het nog compacter maken van DNA gebeurd door DNA loops en spoelen. Deze chromatine verpakking is dynamisch en verandert vaak afhankelijk van de behoeftes van een cel. In deze sectie wordt besproken:  Ongewone interfase chromosomen, die goed zichtbaar kunnen worden gemaakt. Hiermee kan men functies laten zien die representatief zijn voor alle interfase chromosomen.  Interfase chromosomen in zoogdieren  De extra vorm van compactie die chromosomen krijgen wanneer ze van interfase naar mitose gaan Chromosomen zijn gevouwen in grote lussen van chromatine Inzicht in de structuur van chromosomen in interfase cellen komt voort uit het bestuderen van Lampbrush chromosomen. 0 Je ziet dat er grote chromatine lusjes voortkomen uit een lineaire chromosomale as. Je ziet hierop niet alles in kleine schaal (geen kleine loops en nucleosomen). De vorming van loops zorgt er voor dat het DNA meer compact wordt maar dat er ondertussen wel Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 stukken beschikbaar zijn voor transcriptie. De loops leiden dus vooral tot organisatie. Door de loops ontstaan verschillende domeinen met verschillende functies in het DNA. De meeste genen in de DNA loops komen actief tot expressie. De meerderheid van het DNA zit niet in de loops en blijft sterk gecondenseerd op de chromosoom as waar genen over het algemeen niet tot expressie komen. De interfase chromosomen van eukaryoten hebben ook DNA loops. Deze kunnen alleen niet zichtbaar worden gemaakt met een lichtmicroscoop omdat ze te klein en fragiel zijn. Er wordt beweerd dat de interfase chromosomen van eukaryoten allemaal dezelfde rangschikking van loops hebben. De positie van de loops kan worden bepaald met behulp van de techniek genaamd ‘chromosome conformation capture’. Hierbij wordt geprobeerd de 3D-structuur van chromosomen in kaart te brengen. Uit experimenten is gebleken dat het DNA in menselijke chromosomen bestaat uit lussen van verschillende lengten. ‘Chromosome conformation capture’: Als eerst worden stukken DNA binnen een chromsoom aan elkaar gekoppeld door middel van DNA-binding proteins. Daarna wordt er hier een cross-link gevormd. Hierna wordt het stukje chromosoom geknipt wordt door restrictie-enzymen (deze herkennen specifieke plekken om te knippen). Hierdoor worden losse fragmenten gevormd. Het opengeknipte DNA wordt weer gemaakt door middel van DNA-ligase en het cross-linking eiwit wordt verwijderd. Zo kunnen fragmenten bepaald worden die normaal in de ruimte dicht bij elkaar liggen vanwege de loops, maar die in de lengte van het chromosoom wel 1000 basenparen van elkaar afliggen. De fragmenten kunnen in volgorde bepaald worden door middel van een polymerase chain reaction (PCR). Vorming van loops (staat alleen in sv, niet in boek) Tijdens de metafase van een cel bestaan de chromosomen uit twee chromatiden en een centromeer die de chromatiden met elkaar verbindt. In deze fase is het eiwit condensin (een SMC-eiwit) het belangrijkste eiwit voor de opvouwing van de chromatine. Het eiwit bestaat uit twee SMC-units (coiled coils) die samen een stukje DNA kunnen omhelzen. Condensin is zeer flexibel maar kan eventueel gestabiliseerd worden door middel van ATP-hydrolyse. Het eiwit herkent een plek waar twee stukken DNA samenkomen en houdt deze bij elkaar. Het eiwit cohesin (ook een SMC-eiwit) is betrokken bij de vorming van loops in het DNA. Cohesin wordt geholpen door het eiwit CTCF, deze bindt aan specifieke sequenties en bepaalt zo de binding van cohesin en de plek van de vorming van loops in het DNA. Topoisomerases zijn enzymen die supercoiling veroorzaken of weghalen. Topoisomerase II kan een DNA streng open knippen en er een andere streng doorheen halen waardoor er Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 supercoils ontstaan of verdwijnen. Deze eiwitten kunnen dus ook zorgen voor de vorming van loops in het DNA. Opvallend is dat topoisomerases zich in gecondenseerd DNA bevinden, op plekken waar condensin of cohesin ook zouden kunnen zitten. Polytene chromosomen gebruiken om chromatine structuren te weergeven Fruitvliegen bevatten vaak polytene chromosomen. Dit zijn reuze chromosomen die zijn ontstaan doordat ze groeien en meerdere celcycli (meerdere DNA replicaties) ondergaan zonder te delen. Deze cellen, met een hoger aantal standaard chromosomen, worden polyploide genoemd. Door deze chromosomen kunnen bepaalde eigenschappen weergeven worden die normaal gesproken moeilijk te zien zijn. In fruitvliegen zijn het 4 verschillende chromosomen die bij elkaar komen. Deze worden 1024 keer gekopieerd en liggen allemaal naast elkaar (zeer georganiseerde structuur). Bij polytene chromosomen van fruitvliegen onder de lichtmicroscoop zijn er duidelijk donkere banden en lichte interbanden te zien. Ongeveer 95% van het DNA bevindt zich in de banden en 5% in de interbanden. Het DNA in de banden is meer gecondenseerd (verpakt) dan het DNA in de interbanden. Banden kunnen daarnaast een hogere concentratie eiwitten bevatten dan interbanden. Het banden patroon is ook aanwezig in de Lampbursh chromosomen van amfibieën. Er zijn veel verschillende vormen van chromatine. Elke vorm bevat nucleosomen met een verschillende combinatie van gemodificeerde histonen. De sterk gecondenseerde delen van chromosomen bevatten bepaalde histonmodificaties. In de polytene chromosomen zijn bijvoorbeeld gemethyleerde histonen in het heterochromatine te vinden. Terwijl in het euchromatine geacetyleerde histonen juist te vinden zijn. Specifieke samenstellingen van (non-histon) eiwitten kunnen de vorm van chromatine veranderen. Zo kunnen ze er voor zorgen dat een bepaald gebied dezelfde chromatine structuur krijgt. Deze gebieden worden afgesloten door barrière eiwitten. De variaties van non-histon eiwitten op een bepaalde plek maken het mogelijk dat in de ene cel bepaalde genen wel tot expressie komen en in andere niet. Chromatine loops decondenseren wanneer genen tot expressie moeten komen Puffs in polytene chromosomen zijn delen waar het chromosoom veel minder compact is, maar hebben een andere structuur dan het euchromatine. In de puffs vindt veel meer transcriptie plaats. Puffs zijn actief in RNA-synthese en dus essentieel voor de productie van specifieke eiwitten die belangrijk zijn bij de Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 ontwikkeling van een fruitvlieg. Puffs ontstaan door de decondensatie van een chromosoom band. De chromatine fibers die een Puff vormen kunnen worden weergeven met een elektronenmicroscoop. Je ziet dan weer verschillende loops. Wanneer genen in een loop niet tot expressie komen hebben ze een dikkere structuur (gevouwen 30 nm fiber). Wanneer genen in een loop wel tot expressie komen wordt de loop meer verlengd en dunner. In menselijke cellen worden de loops groter en nemen een groter volume in beslag wanneer een gen tot expressie komt. X Chromosomen bezetten specifieke ‘gebieden’ in de celkern. In menselijke cellen heeft elk van de 46 chromosomen zijn eigen ‘plek’ in de nucleus (celkern). De chromosomen zitten dus niet compleet door elkaar maar zijn op een bepaalde manier gerangschikt. De chromosomen worden gevouwen in een conformatie genaamd ‘fractale bol’. Met deze knoopvrije conformatie is het mogelijk om het DNA maximaal te condenseren maar tegelijkertijd behoudt het ook zijn vermogen om zich op te vouwen en te ontvouwen. De specifieke plaatsen van chromosomen in menselijke cellen zijn te zien door middel van FISH-analyse waarbij ieder chromosoom een eigen kleur krijgt. In het midden van de celkern bevinden zich meer genen. Genen die eerst uitstaan en aan de buitenkant van de celkern zitten, verhuizen naar specifieke delen in het midden van de kern wanneer deze genen worden aangezet. Met fluorescentie kan weergeven worden welke gebieden van de nucleus de meeste genen bevatten. Groen = gebied met veel genen Rood = gebied met weinig genen Geel = gebied met gemiddeld aantal genen Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Chromatine kan zich verplaatsen naar specifieke plaatsen in de kern om genexpressie te veranderen De positie van een gen in de celkern verandert wanneer het tot expressie komt. Het kan zijn dat een bepaald stuk van het chromosoom dat tot expressie moet komen uit zijn ‘chromosoomgebied’ gaat en een lange lus vormt (zie afbeelding met chromosomen met verschillende kleurtjes). Er zijn bepaalde gebieden in de celkern voor ‘gene silencing’, hier komen genen niet tot expressie. En er zijn gebieden voor ‘gene expression’ waar ze wel tot expressie komen. Het versnellen van interacties en processen in verschillende compartimenten van de celkern wordt geregeld door de zogenaamde transcription factory. Hier vormt zich een clustering van genen waardoor de concentratie van transcriptie factoren en de transcriptie zelf wordt verhoogd. Netwerken van macromoleculen vormen specifieke delen in de kern Een voorbeeld van een netwerk van macromoleculen in de celkern is de nucleolus. Deze bestaat uit een netwerk van RNAs en eiwitten geconcentreerd om rRNA genen die actief worden getranscribeerd (transcriptie). Een ander voorbeeld is de inter-chromatine granule, deze is opgebouwd uit een netwerk van RNA en eiwitten. Deze structuren ontstaan door het samenstellen van bepaalde groepen macromoleculen en worden nucleaire sub-compartimenten (nuclear subcompartments) of sub-nucleaire organellen (subnuclear organelles) genoemd. Nucleaire sub-compartimenten hebben in tegenstelling tot membraangebonden compartimenten in het cytoplasma geen lipide bilayer membraan. Hierdoor kunnen ze geen kleine moleculen opnemen die nodig zijn voor bepaalde reacties of moleculen uitsluiten. Uit nucleaire sub-compartimenten steken lange flexibele polypeptideketens en/of lange stukken niet-coderend RNA (grijs). Hierop zitten bindingsplaatsen voor specifieke RNA moleculen en eiwitten die nodig zijn om een bepaald proces te katalyseren (gekleurde Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 vormpjes). Als verschillende eiwitten aan elkaar binden ontstaan er ‘staging areas’ (rood omcirkeld), deze versnellen de reacties in de kern. De sub-compartimenten (inclusief de nucleolus) vormen zich alleen als het nodig is, hiervoor zijn er verschillende enzymen en RNAs nodig. Op de afbeelding hieronder zie je hoe nucleaire sub-compartimenten aan moleculen komen die nodig zijn voor processen zonder een bilayer membraan. Bij A: links  bolvormig sub- nucleair organel (spherical subnuclear organelle), rechts  subnucleair organel tegen de nuclear envelope aan. Mitotische chromosomen zijn heel sterk gecondenseerd Tijdens de mitose zijn de chromosomen van bijna alle eukaryoten goed te zien met lichtmicroscopie. In de afbeelding hiernaast zie je een chromosoom in de metafase van de mitose. Tijdens de interfase ontstaan er door replicatie 2 zuster chromatiden die in het midden nog vast zitten bij het centromeer. Deze chromosomen zijn normaal gesproken bedekt met verschillende moleculen, inclusief RNA-eiwit complexen. Elke chromatide bestaat uit loops van chromatine die voortkomen uit een centrale band. Mitotische chromosoom condensatie is het laatste niveau van chromosoom verpakking. 2 belangrijke redenen voor het condenseren van chromosomen tijdens mitose:  De zuster chromatiden kunnen makkelijker uit elkaar getrokken worden in de anafase van de mitose.  Het beschermt het breekbare DNA tegen breuken als ze in verschillende dochtercellen worden geduwd. Samenvatting: DNA-structuur is medebepalend voor de activiteit van DNA. Interactie tussen DNA en eiwitten is nodig voor een dynamische opvouwing van het DNA. ‘Lampbrush’ & ‘polytene’ Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 chromosomen zijn voor belang van ‘exotische’ gegevens. Lokalisatie van chromatine in menselijke cellen is dynamisch. Chromatine structuur en functie (blz. 194) De opvouwing van DNA is een dynamisch proces tijdens de interfase van ‘polytene’ chromosomen. Bij het humane DNA is dit ook een erg dynamisch proces vanwege de activatie en inactivatie van genen. Tijdens de interfase zijn de chromosomen niet sterk gecondenseerd, echter tijdens de metafase juist wel. De vorming van puffs en loops gebeurt dus tijdens de interfase in zowel eukaryoten als prokaryoten. Er zijn verschillende eiwitten (in de kern zelf of in het membraan) die de loops in de chromosomen stabiliseren. Enzymen kunnen de histonen in de loops verplaatsen en zo de activiteit van het DNA veranderen. Heterochromatine is georganiseerd en beperkt genexpressie Er zijn twee soorten chromatine: Euchromatine (GC rijk) = relatief niet zo compact, deze genen komen dus makkelijker tot uiting. Heterochromatine (AT rijk) = sterk compact, genen die hier in zitten komen niet tot expressie. Heterochromatine zit vooral bij de centromeren en telomeren maar het is ook aanwezig op andere plekken afhankelijk van de fysiologische toestand van de cel. Het DNA in heterochromatine bevat weinig genen. De mechanismen die de vorming van heterochromatine en euchromatine bepalen zijn belangrijk voor epigenetica (niet alleen de exacte code in het DNA bepaalt de expressie maar ook codes in histonen enz.). Chromatinestructuren zijn erfelijk, dit is een vorm van epigenetische erfelijkheid. De heterochromatische staat is zelf-voortplantend De vorming van euchromatine en heterochromatine is een dynamisch proces. Chromosomen zijn mozaïekstructuren van eu- en heterochromatine. Als een gen zich bevindt in het euchromatine kan het gen geactiveerd worden of is het al actief. Als een gen zich bevindt in het heterochromatine kan het niet geactiveerd worden. De grens tussen hetero- en euchromatine is niet heel duidelijk waardoor de genen beïnvloed kunnen worden. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Position effect = een fenomeen waarbij een stukje chromosoom dat normaal euchromatine is wordt vertaald naar heterochromatine dat in de buurt ligt. Dit veroorzaakt vaak inactivatie (silencing) van de normaal actieve genen. Dit verschijnsel is waargenomen in veel eukaryoten, waaronder gisten, planten en mensen. Bij vliegen ontdekt: als euchromatine in een vroeg stadium wordt omgezet in heterochromatine betekent het dat de nakomelingen van die cellen dit overerven. Dit fenomeen heet het position effect variegation. Normaal gesproken zorgen bepaalde barrière DNA sequenties dat euchromatine niet verandert in heterochromatine. Bij vliegen die chromosomale herschikking erven is deze barrière echter niet meer aanwezig. Tijdens de vroege ontwikkeling kan heterochromatine zich verspreiden (spreading) in het naburige chromsomale DNA, euchromatine. Deze verspreiding stopt snel maar het nieuw gevestigde patroon van heterochromatine wordt vervolgens geërfd. Hierdoor zullen bij de nakomelingen dezelfde stukken euchromatine verandert zijn in heterochromatine. Deze stukken gaan dan van de actieve naar inactieve vorm. Dit fenomeen waarbij er meer heterochromatine wordt gevormd kan verklaard worden met moleculaire mechanismen. Er zijn bij muizen meer dan 100 genen ontdekt die de verspreiding van heterochromatine versterken (enhancers) of tegengaan (suppressors). Het blijkt dat veel van deze genen coderen voor non-histon chromosomale eiwitten die interactie hebben met histonen en betrokken zijn bij het aanpassen of behouden van de chromatine structuur. Kern histonen kunnen gemodificeerd zijn op verschillende plekken Histonmodificaties bepalen de vorming van eu- en heterochromatine. Er zijn enzymen die zich binden aan een deel van een histon en modificaties aanbrengen die de activiteit van het histon veranderen. Een soort enzym brengt de modificatie aan en aan en een andere soort kan het weer weghalen. De histon-subunits (4 core histonen) bevatten lange staarten die uit het nucleosoom steken (N-terminale staarten) en deze zijn targets voor de enzymen. Post- translationele modificaties kunnen ook op andere plaatsen (aan de oppervlakte) op het histon voorkomen maar het gebeurt vooral in de N-terminale staarten van histon H3. Belangrijk is dat alle histonmodificaties omkeerbaar zijn. De modificaties van de histonen zijn het aanbrengen van een methylgroep (methylatie), het aanbrengen van een fosforgroep (fosforylatie), het aanbrengen van een acetylgroep (acetylatie) en het aanbrengen van een ubiquitinegroep (ubiquilylatie). Deze modificaties worden op specifieke aminozuren in de histonstaart aangebracht. Histon H1, het linker-histon dat alle histonen in een nucleosoom stabiliseert, kan ook gemodificeerd worden. Lysine acetylatie en methylatie zijn competitieve reacties en kunnen Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 dus niet beide plaatsvinden. Serine wordt vaak gemodificeerd door middel van fosforylatie. De lading en de vorm van het aminozuur verandert vanwege de modificatie waardoor je een andere interacties krijgt met eiwitten. Interacties in individuele chromosomen die tot een 30 nm fiber leiden, vinden alleen plaats tussen nucleosomen die in de ruimte dicht bij elkaar liggen. Hieronder zie je de verschillende modificaties die mogelijk zijn per aminozuur van de staarten van de kern histon eiwitten (core histon proteins). Voorbeeld van een modificatie is de acetylering van lysines en fosforlylering van serines op de N terminale staarten. Bij de acetylering van lysine verliest de staart zijn positieve lading. Hierdoor wordt de affiniteit van de staart voor aangrenzende nucleosomen minder en verandert de chromatine structuur, het wordt minder compact. De grootste effecten ontstaan echter door het aantrekken van andere eiwitten door bepaalde modificaties. Zo trekt de trimethylatie van een lysine op een H3 staart het heterochromatine-specifieke eiwit HP1 aan. Dit eiwit draagt bij aan het ontstaan van heterochromatine (maakt het dus compacter). Over het algemeen ‘lezen’ de aangetrokken eiwitten de modificaties om te bepalen hoe en wanneer een bepaald gen tot expressie komt. Op deze manier wordt de gen expressie en daardoor de structuur en functie van de cel geregeld door de chromatinestructuur. Het aanbrengen van histonmodifciaties hangt in de meeste gevallen af van transcriptie regulator eiwitten (transcriptiefactoren). Op deze manier bepaalt het DNA hoe histonen worden gemodificeerd. Soms blijven histonmodificaties zitten terwijl de transcriptiefactoren al verdwenen zijn. Er blijft dan een soort ‘herinnering’ achter op het DNA die overgebracht kan worden naar de volgende cel generatie (is dus erfelijk). Dit zie je ook bij het eerdergenoemde position effect variegation. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Chromatine heeft extra variëteit door histon varianten Naast de 4 standaard core histonen bevatten eukaryoten ook histon varianten. Deze histonen komen veel minder voor dan de normale histonen. Van alle core histonen behalve van histon H4 zijn er varianten. In de afbeelding hieronder zie je voorbeelden van core histonen en de bijbehorende histonvarianten. Covalente modificatie en histon varianten zorgen voor controle van de chromosoom functie Histonmodificaties komen voor in bepaalde combinaties. Sommige combinaties hebben invloed op hoe en wanneer het DNA verpakt en minder verpakt is. De histoncode hypothese staat voor de invloed van histonmodificaties en histonvarianten op de vouwing en vorm van chromatine. Histonmodificaties brengen vaak een lading aan het histon die de interacties met het DNA kan beïnvloeden, zoals de sterkte van de binding van het histon aan het DNA of de stabiliteit van het nucleosoom. De Histoncode = epigenetische code: bepalen of genen wel of niet tot expressie komen. Verschillende regulator eiwitten hebben kleine domeinen die binden aan specifieke markeringen (modificaties) op het DNA. Een van de domeinen herkent bijvoorbeeld een trigemthyleerde lysine 4. Dit domein behoort tot de familie van PHD domeinen die gemethyleerde lysines op histonen herkent. Vaak worden de domeinen aan elkaar verbonden tot één groot eiwit complex die bepaalde combinaties van histon modificaties herkent. Dit wordt een reader-complex genoemd. Het reader complex is een eiwit complex dat wordt aangetrokken door histonmodificaties, deze ‘leest’ en Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 andere eiwit complexen aantrekt die nodig zijn voor het katalyseren van een biologische functie. De markeringen op nucleosomen als gevolg van toevoegingen op histonen (modificaties) zijn dynamisch. Modificaties kunnen constant worden toegevoegd en verwijderd. De histon staarten die uit het nucleosoom steken zijn ook toegankelijk als het chromatine gecondenseerd is. Doordat ze zo toegankelijk zijn kunnen markeringen hierop gelijk worden ‘gelezen’ als er iets moet veranderen in de cel. Hieronder zie je bepaalde modificaties en de betekenissen hiervan. Een complex van reader en writer eiwitten kunnen specifieke modificaties toevoegen aan chromatine Het fenomeen van position effect of variegation laat zien dat er van euchromatine heterochromatine gemaakt kan worden. De enzymen die modificaties toevoegen of weghalen zijn deel van multisubunit complexen. Deze kunnen naar bepaalde gebieden op het chromatine gebracht worden door sequence-specifieke DNA-bindings eiwitten (transcriptie regulators). Histoncode = epigenetische code: bepalen of genen wel of niet tot expressie komen. Reader complexen kunnen histoncodes lezen en eventueel binden wanneer de modificaties overeen komen met het complex. Vervolgens kunnen hier weer andere eiwitten aan binden (en DNA inpakken/ uitpakken). Histonmodificaties kunnen over het chromosoom verspreid worden via zogenaamde reader/writer complexen.  Writer = enzym (eiwit) dat een modificatie aanbrengt op een chromosoom  Reader = enzym (eiwit) dat deze modificatie leest en vervolgens hier aan bindt Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 De histoncode wordt dus gemaakt en vermenigvuldigt door middel van een schakel van eiwitten. Allereerst trekt een regulatie-eiwit (regulator protein) die zich bevindt op het linker DNA een code writer-eiwit aan. Dit code writer-eiwit brengt een modificatie aan en hierna ontstaat er een kettingreactie. Hierbij trekt het code writer-eiwit op zichzelf weer een code reader-eiwit aan die de modificatie herkent. Dit code reader-eiwit is verbonden met een code writer-eiwit (zitten in zelfde eiwit complex) die bindt aan een naastgelegen nucleosoom en brengt daar een modificatie aan. Dit proces herhaalt zich steeds. Zo zorgt het ‘code-reader-writer’-complex voor het verspreiden van chromatineveranderingen over een chromosoom. In het echt is dit proces ingewikkelder. De readers en writers zijn deel van een eiwit complex dat meerdere readers en writers bevat en dus meerdere modificates aan kan brengen op nucleosomen. Vaak hebben deze reader-writer-complexen een ATP afhankelijk chromatin remodeling eiwit. De reader, writer en remodelling –eiwitten kunnen samen leiden tot (de)condensatie van grote gebieden van het DNA. In gist bevindt zich het RSC-complex wat een voorbeeld is van een ‘chromatine-reader- writer-remodeling’-complex. Het bestaat uit vijftien subunits, één ATP-afhankelijk ‘remodeler’-domein en vier ‘code-reader’-domeinen. Een soort gelijk proces vindt plaats wanneer histon modificaties weggehaald moeten worden. In dit geval is er een ‘eraser enzym’ (zoals demethylase of deacetylase) aanwezig in het complex. Barrière DNA sequenties blokkeren de spreiding van reader-writer-complexen en hierdoor worden naast elkaar gelegen chromatine domeinen van elkaar gescheiden De ketting reactie van reader-writer-complexen herhaalt zich tot ze een barrière eiwit tegenkomen. Barrière-eiwitten voorkomen het verspreiden van heterochromatine. Dit kan door middel van drie mechanismen. Allereerst is er een barrière- eiwit dat bindt is aan een nucleaire porie en op die manier een barrière vormt voor het verspreiden van heterochromatine. Daarnaast is er een barrière-eiwit dat sterk gebonden is aan een groep niet gemodificeerde nucleosomen. Op die manier kan dit eiwit dit stukje chromatine resistent maken voor heterochromatine verspreiding. Als laatste is er een barrière-eiwit die bepaalde modificaties kan wissen zodat er niet nog een reader-writer-complex kan binden. Chromatine in centromeren laten zien hoe histonvarianten speciale structuren kunnen creëren In het heterochromatine is het chromosomaal DNA sterk gecondenseerd (opgevouwen) wat leidt tot de inactivatie van genen. Het centromeer van DNA is sterk gecondenseerd en bevat dus alleen heterochromatine. Het centromeer is het gebied van een chromosoom waar trekdraden tijdens de mitose binden voor een goede deling van de 2 dochterchromosomen. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 In veel complexe organismen, inclusief de mens, is elk centromeer ingebed in een stuk centromerisch chromatine (centromeric chromatine). Dit chromatine bevat een centromeer- speciefieke variant van H3, CENP-A (centromeer protein A). Daarnaast bevat het andere eiwitten die nucleosomen inpakkken en de kinetochore vormen, het bewegingslichaam dat de microtubuli (van spoeldraden tijdens de mitose) aan het DNA verbindt. In gist bestaat het centromeer uit een specifieke DNA sequentie van ongeveer 125 nucleotide paren. De CENP-A histon variant vormt samen met de drie andere core histonen een centromeer-specifiek nucleosoom. Aan dit nucleosoom binden bepaalde eiwitten die het nucleosoom verbinden met een microtubule van een spoeldraad tijdens de mitose. Centromeren van complexere organismen zijn veel groter dan die van gisten. Zo bestaan centromeren van vliegen en mensen uit honderdduizenden nucleotideparen. Deze bevatten ook CENP-A maar blijken geen specifieke DNA sequentie te hebben. De centromeren bestaan uit korte zich herhalende sequenties, bekend als alpha satellite DNA bij mensen(AT rijk). Maar deze sequenties komen ook voor op andere plekken in het DNA en zijn dus niet centromeer specifiek. Bij complexe organismen is het centromeer bepaald door een bepaalde samenstelling van eiwitten en niet door een specifieke DNA sequentie. Andere histon-varianten (staat alleen in sv, niet in boek) H3.3 en CENP-A histonen lijken op het H3 histon alleen hebben ze speciale functies. H3.3 zorgt voor transcriptionele activatie en CENP-A zorgt voor de vorming van een centromeer. H2AX, H2AZ en macroH2A zijn varianten van het H2A histon. H2AX zorgt voor stimulatie van DNA-repair en recombinatie en H2AZ zorgt voor het open gaan van het nucleosoom waardoor transcriptiefactoren beter kunnen binden en initieert dus transcriptie. Ook helpt H2AZ voor de chromosoom segregatie tijdens mitose (de splitsing van de twee homologe chromosomen). MacroH2A zorgt voor transcriptionele repressie en de inactivatie van het X- chromosoom. 0 Sommige chromatine structuren kunnen rechtstreeks worden geërfd Het doorgeven van de histoncode aan dochtercellen wordt epigenetische overerving genoemd. Bij de chromosoom duplicatie voor een celdeling worden de histonmodificaties ook gedupliceerd. De histonchromatine eiwitten die aan de histonmodificaties binden en zo zorgen dat er heterochromatine ontstaat worden bij de celdeling verdeeld over de 2 dochterchromosomen. In de dochtercellen zorgen deze eiwitten ervoor dat er aan de naastgelegen gemodificeerde nucleosomen ook heterochromatine eiwitten gaan binden waardoor de structuur compleet wordt. Dit proces gaat Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 waarschijnlijk op een soort gelijke wijze als het proces met reader-writer-remodeling- complexen. Experimenten met kikker embryo’s stellen dat zowel het activeren als inactiveren van chromatine structuren epigenetisch kunnen worden geërfd Epigenetische overerving speelt een grote rol in het ontstaan van multicellulaire organismen. Alle cellen in een organisme bevatten het zelfde genoom maar toch zijn het verschillende cellen en ontstaan bij celdeling dezelfde cellen. Zo ontstaat uit een levercel, 2 dochter levercellen. Dit kan omdat alle verschillende cellen een ander patroon van gen expressie hebben en deze wordt doorgegeven van de ene cel generatie naar de andere. De chromatine structuur speelt hier een grote rol bij want deze bepaalt of een gen tot expressie komt of niet. De cell memory houdt een specifieke chromatine structuur in stand. Samenvatting: Modificaties van histonen en histonvarianten. Specifieke eiwitten betrokken bij opvouwing van DNA, ‘histon code’ en vouwing chromatine. Chromatinestructuur betrokken bij regulatie genen, centromeren en telomeren, eu- en heterochromatine, vorming van verschillende cellen met hetzelfde DNA. Extra info uit samenvatting: Tijdens de replicatie, wanneer een replicatie vork ontstaat, laten sommige histonen los. Bij de vorming van nieuwe nucleosomen worden de originele histonen vermenigvuldigt en toegevoegd. Telomeren zijn delen van het chromosomaal DNA die ook bestaan uit telomeren. Gist bevat het telomeerspecifiek eiwit SIR2 (silent information regulator). Dit eiwit is histon-deacetylase en NAD+ afhankelijk. De heterochromatine vorming in de telomeren wordt gereguleerd door een samenspel van meerdere processen: - Specifieke eiwitten herkennen telomeer DNA-sequenties - SIR2-eiwitten binden aan deze specifieke eiwitten - SIR2-spreidt zich uit over telomeren - Deacetylering gevolgd door methylering van de histonen - Ontstaan van heterochromatine - NAD+ is hoog bij voedselgebrek waardoor SIR2 actief wordt (hierdoor worden een aantal genen geïnactiveerd) Chromatinestructuren voegen unieke eigenschappen toe aan het functioneren van chromosomale gebieden. Zo zorgt de structuur voor het bepalen van de ‘genetic read-out’ en de vorming van centromeren en telomeren. De chromatinestructuren zijn overerfbaar net zoals de invloed op genregulatie. Ook andere eiwitten zijn betrokken bij de vorming van heterochromatine. Het HP1- en PcG-eiwit zorgen voor verschillende vormen van heterochromatine. HC3 H.5 Samenvatting (287-295) – DNA: transpositie en site-specifieke recombinatie Neem NHEJ en homologe recombinatie van MG-1 door! Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Chromosomen bestaan uit euchromatine en heterochromatine, telomeren en centromeren. Er zijn actieve en inactieve genen en er ontstaan 200 verschillende celtypen door ‘cel specifiek’ gebruik van het chromosomale DNA. Ons genoom komt evolutionair uit een eencellig organisme. Door de evolutie wordt het DNA in een organisme complexer en specifieker (door middel van mutaties en recombinatie). Virussen kunnen de oorzaak zijn van de verlenging van het DNA. De toename van DNA is gebaseerd op het opnemen van DNA van de buitenwereld (via virussen, losse stukken DNA in andere cellen). Virus-DNA kan integreren in het genoom van de gastheercel, virus verlaat met zijn DNA de gastheercel en kan dit vervolgens weer in het DNA van andere cellen integreren. Zo kan het genetisch materiaal van de ene cel naar de andere cel verplaatst worden. Het virus kan ook een stuk van het gastheercel genoom DNA meenemen naar de volgende gastheercel. In de sequenties van ons DNA kunnen bekende sequenties van virussen of bacteriën waargenomen worden. Mobiele genetische elementen/jumping genes (delen van DNA uit virussen of andere DNA bronnen) bestaan uit enkele honderden tot tienduizenden basenparen. Ze kunnen in elk chromosoom integreren en kunnen springen binnen chromosomen of tussen chromosomen. Deze elementen zorgen voor toevoeging van informatie (evolutie of ziekte). Elk mobiele element draagt genen met zich mee die coderen voor een enzym die de beweging van dat element katalyseert. Dit doet het enzym door het DNA op verschillende manieren te breken en weer aan elkaar te plakken. Door mutaties zijn veel mobiele genetische elementen niet meer actief. Hoe zijn we dan tot de ontdekking van deze mobiele genetische elementen gekomen? Doordat ons DNA vol zit met moleculaire fossielen. Dit zijn retro-virussen, die ons vroeger infecteerden. Mobiele genetische elementen worden ook wel dus moleculaire parasieten genoemd. De variëteit van onze bevolking hangt af van de beweging van mobiele genetische elementen. Deze zorgen voor mutaties, die vaak nadelig zijn, maar ook voordelig kunnen uitpakken. De voordelige mutaties worden doorgegeven aan het nageslacht. In deze sectie bespreken we hoe mobiele genetische elementen kunnen bewegen rond het genoom. Sommige elementen worden getransporteerd via transpositie mechanismen, waar anderen worden vervoerd door conservatieve site-specifieke recombinatie. De mobiele genetische elementen bestaan uit twee soorten, de transpositionele site- specifieke recombinatie (transpositie) van niet-homologe DNA sequenties. Hierbij is DNA- synthese, ligase en ATP nodig. De andere mobiele genetische elementen zijn de conservatieve site-specifieke recombinatie van homologe DNA sequenties. Hierbij zijn alle factoren zoals DNA-synthese enzovoort niet nodig Transposities vinden plaats door middel van transposons of ‘transposable elements’ en bevatten genen nodig voor transpositie, ze bewegen via DNA-intermediairs of RNA- intermediairs. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Mobiele elementen die zich verplaatsen door middel van transpositie worden transposonen genoemd. Heel erg ‘bescheiden’/niet erg precies in het kiezen van hun targets sites. Daarvoor kunnen transposonen op veel locaties in het genoom zitten. De meeste transposonen bewegen nauwelijks. Te veel beweging kan het genoom vernietigen. Transpositionele site-specifieke recombinatie bestaat uit drie varianten: 1. DNA-only transposons: deze bevatten short inverted repeats aan de uiteinden. Ze verplaatsen zich via transposases door middel van ‘cut & paste’ of ‘copy & paste’ mechanismen. DNA-only transposonen komen veelvuldig voor in bacteriën. Deze transposonen hebben grotendeels voor de antibiotica resistentie spreiding gezorgd. Doordat er genen op de transposonen liggen die coderen voor enzymen die resistent zijn tegen de al bestaande antibiotica. Sommige cellen bevatten deze transposonen nog niet met zulke sequenties, kunnen ze wel verkrijgen door horizontal tranfser. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Bij de ‘cut & paste’ versie binden transposase monomeren aan de specifieke transposon sequenties. Deze gaan met elkaar in interactie waardoor er een loop ontstaat. De loop wordt uit het chromosoom geknipt waarna het gebroken DNA wordt gerepareerd door middel van homologe recombinatie of non-homologous end-joining. De transposases knippen hierna een nieuwe site open in het target-chromosoom en het transposon wordt ingebouwd. Mutaties in het chromosoom na excisie van een transposon kunnen worden voorkomen door homologe recombinatie en non-homologous end-joining. Bij de ‘copy & paste’ versie bindt transposase aan een specifieke sequentie waarna er een hoop gecompliceerde reacties plaats vinden waarbij het transposon wordt gerepliceerd en ingebouwd waardoor het genoom groter wordt. 2. Retroviral-like retrotransposons: deze bevatten long terminal repeats aan de uiteinden. Ze verplaatsen zich via reverse-transcriptase en integrase door middel van RNA-intermediairs geproduceerd door een promotor in de LTRs. Bij het retroviraal-achtige retrotransposon wordt RNA door middel van reverse-transcriptase omgezet tot DNA. Dit DNA wordt ingebouwd in het gastheerchromosoom (door middel van integrase). Dit gebeurt bij het HIV-virus. Reverse transcriptase (in retrovirussen) heeft de functie van DNA-polymerase en RNA-afbraak. Integrase (ook een eiwit in virussen) kan in het virale DNA knippen en deze laten aanvallen op het target DNA door middel van een aangebouwde hydroxylgroep. Het target DNA wordt open geknipt en daarna wordt het virale DNA ingebouwd (zoals bij retrovirus HIV of retroviral-like retrotransposon Ty1 element in gist). Integrase doet dit op een soortgelijke manier als de ‘cut en paste’ methode. Retrovirus = de eigenschap van het virus om de flow van het DNA om te keren DNA > RNA naar RNA > DNA. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Retroviral-like retrotransposonen zijn een grote famielie van de transposonen. Ze bewegen zich in en uit chromosomen op dezelfde manier als retro-virussen. Deze elementen (retro- viral) kunnen in het organisme gevonden worden als gist, vliegen en zoogdieren. In tegenstelling tot virussen, hebben deze elementen geen intrinsieke eigenschap om hun ‘eigen’ cel te verlaten, maar bewegen ze langs de cellen via de normale route; DNA- replicatie. Het verschil tussen retro-virussen en retroviral-like retrotransposonen is dat retroviral-like transposonen geen eiwitlaag hebben. 3. Non-retroviral retrotransposons: deze bevatten een poly-A staart aan het 3’ einde van het RNA transcript en het 5’ einde is vaak ingekort. Ze verplaatsen zich via transcriptase en endonuclease door middel van RNAintermediairs geproduceerd door een buur-promotor. Gewervelde chromosomen bestaan vaak uit herhalende sequenteis. Echter menselijke chromosomen, zijn vaak gemuteerd en afgeknotte versies van nonretroviral retrotransposonen. De meeste van deze elementen zijn immobiel, maar enkele kunnen wel bewegen. Het humane genoom bevat gemuteerde repeatgebieden de LINE’s (long interspersed nuclear elements)/L1 elementen. LINE’s/L1 elementen nemen ongeveer 20% van ons genoom in. Meeste L1 elementen zijn inmiddels niet meer mobiel echter zijn enkele dat nog wel: hemofilie (L1 insertie in gen voor bloedstollingseiwit factor VIII). L1 karakteristieken zijn Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 5000 basenparen, twee open-reading-frames (waarvan één onbekend is) en reverse transcriptase/endonuclease activiteit. Een ander non-retroviraal retrotransposon is het Alu element. Het Alu element is een SINE (short interspersed nuclear element). De lINE’s en SINE’s nemen ongeveer 30% van ons genoom in. In bacteriën komen voornamelijk DNA-only transposons voor terwijl gist voornamelijk retroviral-like retrotransposons bevat. In de fruitvlieg en de mens komen alle drie de typen transposons voor. In de mensen zijn alleen de nonretro-viral elementen nog een beetje aan het bewegen. De retroviral like elementen liggen alllemaal stil op een familie na. Dus bij mensen zorgen de nonretro-viral elementen voor de mutaties. Bij muizen bewegen beide elementen nog, wat zorgt voor 10% van de mutaties. De andere vorm van het verplaatsen van mobiele genetische elementen is de conservatieve site-specifieke recombinatie. Bij conservatieve site-specifieke recombinatie heeft het mobiele element twee speciale plaatsen (een voor het breken en de ander voor het vormen van het DNA), één op elk DNA molecuul. Afhankelijk van de positie en de relatieve oriëntatie van de twee recombinatieplaatsen kan er DNA integratie, DNA excisie of DNA inversie optreden. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Conservatieve site-specifieke recombinatie wordt vaak gebruikt door virussen om hun genomen te verplaatsen uit hun hostcel/ ‘eigen’ cel. Wanneer een hostcel is beschadigd, kan het virus de beschadigen wegknippen en zich weer vormen tot een viruscel totdat het een nieuwe hostcel heeft gevonden. De term conservatief in deze recombinatie-methode komt van het volgende: alle gebroken fosfaatbindingen die zijn verbroken op het begin door het knippen op specifieke plaatsen worden weer hersteld. Hierna volgt het conservatieve recombinatieproces. Dit in tegenstelling bij transpositie, waar gaps nodig zijn om het proces uit te voeren. Door de promotor er tegen gedraaid in te zetten, spelen er zich nu twee processen af = phase variation. De fases worden omgedraaid. De omdraaingsreactie is herstelbaar, zodat bacteriën de twee typen flagelline kunnen reguleren. Deze reactie beschermt de bacterie tegen het immuunstelsel van de cel. Als de cel antibodies aanmaakt tegen een vorm van flagelline, gaat het de andere vorm aanmaken. Voor de insertie van bacteriofaag Lambda DNA in een bacterieel genoom is DNA-integrase nodig. Hierbij heb je specifieke aanhechtingsplaatsen zowel in het bacterieel genoom als in het bacteriofaag DNA. Integrase bindt aan het bacteriële chromosoom en aan het bacteriofaag DNA. Hierna vindt katalyse plaats van double-strand breking en worden de einden samengevoegd. Hierna dissocieert integrase en zijn er heteroduplex stukken gevormd. Deze integratie gaat op basis van homologe sequenties (de DNA strengen kunnen met elkaar basenparen). De opvouwing van het Lambda genoom gaat door middel van een nette alignment van DNA en de vorming van een geordende ringstructuur. Het kost veel energie om DNA zo compact op te vouwen, er is dus energie nodig maar, dit levert vrije energie op als een cel wordt geïnfecteerd. Integratie van het bacteriofaag genoom in bacteriële genoom levert voordeel op voor de verspreiding van de bacteriofaag. Integratie kan ook voordeel opleveren voor het bacteriële genoom. Door middel van transposons die worden ingebouwd, kunnen genen uit of aan worden gezet (promotors kunnen voor een andere plek terecht komen en dus een Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 andere sequentie tot expressie brengen). Deze functie kan worden overgedragen bij celdeling. In de lever zit een specifieke promotor die het cre-recombinase gen kan aanzetten en hierdoor wordt crerecombinase alleen in de levercellen wordt gemaakt. Na transcriptie van cre-recombinase kan een ander gen worden verwijderd uit het chromosoom (cre- recombinase knipt het aan de lox-sites van dit gen) en gaat dus verloren wanneer de levercel deelt. In andere weefsels komt cre-recombinase niet tot expressie omdat het een weefselspecifieke promotor heeft. Hier wordt het gen met de lox-sites wel geactiveerd. Samenvatting: Mobiele genetische elementen bewegen op twee manieren. De eerste is transpositionele sitespecifieke recombinatie (transpositie). Hierbij wordt DNA-synthese, ligase en ATP gebruikt. Je hebt DNA-only transposons, retrovirale-like retrotransposons en non-retroviral retrotransposons. De tweede is conservatieve sitespecifieke recombinatie, hier is geen DNA-synthese, ligase of ATP bij nodig. Site specifieke recombinatie is betrokken bij het ontstaan van ons genoom, bijdrage aan de evolutie op lange termijn, ontstaan van mutaties en ziekten, verspreiding van virus, vorming gastheergenoom en technologische toepassingen. H.6 Samenvatting (317-333) – RNA processing: splicing, transport en nuclear bodies Een bacterieel gen wordt getranscribeerd tot boodschapper RNA wat op zichzelf wordt getransleerd tot een eiwit. Bacteriële genen bevatten alleen coderende sequenties. Daarentegen bevatten menselijke genen zowel coderende als niet-coderende sequenties. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Eukaryoten hebben genen die bestaan uit exonen (sequenties die tot expressie komen) en intronen (sequenties die niet tot expressie komen). Voordat de coderende exonen kunnen leiden tot een eiwit moeten de intronen (= zijn veel langer over het algemeen) uit het preRNA geknipt worden. In het geval van het humane ß-globine gen worden drie exonen gescheiden van twee korte intronen. In het humane bloedstollingsfactor VIII gen zitten tussen de intronen lange exonen waardoor er veel informatie wordt weggegooid na processing. Splicing is een vorm van processing na de transcriptie (dus eerst worden van de exonen en intronen een nieuwe streng RNA gemaakt, voordat het gespliced wordt). Hierbij worden de intronen verwijderd en de exonen weer aan elkaar verbonden. Alleen nadat het RNA op fouten is na gelopen in de 5 naar 3 richting, en nadat splicing is opgetreden, kan RNA > MRNA worden genoemd. Intronen kunnen variëren van 10 tot 100.000 nucleotiden en nemen ongeveer 25% van het genoom in. In een preRNA molecuul bevinden zich een aantal specifieke intron en exon sequenties. Elk splicing event kan een intron verwijderen door twee fosforyl-transfer reacties = transesterficaties (knipreacties): in het intron bevindt zich een adenine met een hydroxylgroep, deze hydroxylgroep valt aan de andere kant van het intron aan en vormt zo een lariaat. Hierna vinden reacties tussen de overgebleven exonen plaats en raak je het intron kwijt. Een groot complex katalyseert het splicing proces, bestaande uit 5 additionele RNA-moleculen Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 en honderden eiwitten. Dit complex hydrolyseert ATP dat benodigd is voor het splicingproces. Alternatieve splicing is splicing die afhankelijk is van de condities. Het tropomyosine gen heeft zowel exonen als intronen. Afhankelijk van de plek in het lichaam en het celtype waar het RNA molecuul wordt geproduceerd levert splicing verschillende producten op. Op basis van één gen kunnen dus verschillende eiwitten geproduceerd worden en is er dus extra informatie in het DNA worden opgeslagen. Dit komt voor bij ongeveer 75% van onze genen. Intronen en exonen bevatten drie geconserveerde herkenningssequenties voor de uitvoering van correcte splicing. Exon 1 wordt de donor site (5’ site) genoemd en exon 2 is de acceptor site (3’ site). Dit zijn de uiteinden die na het verwijderen van het intron weer worden samengevoegd. Elke site heeft een consensus sequentie, waardoor de cel weet waar hij moet knippen/splicen. Het herkennen van deze consensus sequenties gebeurt door gespecialiseerde RNA-moleculen. Echter, deze consensus sequenties zijn heel klein, waardoor het lastig voor de cel is om constant op dezelfde plek te knippen. Dan het alternatieve splicingproces erbij meegenomen, maakt het voor onderzoekers lastig om het genoomstelsel van een mens helemaal uit te pluizen. Dit door de vele variatie. De herkenningssequenties (donor site en acceptor site binden aan small nuclear RNA’s (snRNA’s). Dit zijn die gespecialiseerde RNA-moleculen, redelijk klein, die de consensussequenties herkennen. Er zijn 5 snRNA’s. Elk snRNA’s heeft gezelschap van 7 sub- units om een snRNP te vormen (small nuclear ribonucleoprotein). Een paar snRP’s vormen een spliceosome. De branchsite is de plek waar de adenine met de hydroxyl groep zit. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Het Spliceosome is het eiwit/RNA complex dat de splicing van RNA uitvoert. Het is een soort machine dat bestaat uit vijf snRNA’s en ongeveer 140 eiwitten. De snRNA’s (U1, U2, U4, U5, U6) hebben een functie in de herkenning van het RNA (= doen ze door te basenparen met de consensus sequentie). Het mechanisme van RNA splicing begint bij een intron ingesloten door twee exonen. U1 bindt aan de herkenningssequentie aan de 5’ uiteinde. BBP (het branchpoint binding protein) en U2AF (een hulp eiwit) binden aan de branchsite. De twee eiwitten op de branchsite worden uitgewisseld voor een U2 eiwit. Hierna binden de overige snRNP’s (small nuclear ribonucleoproteins, de snRNA’s met ieder zeven of meer eiwitten eraan) aan het RNA. U1 en U4 verlaten het complex en er wordt een lariaat gevormd waarna direct aan de 5’ kant wordt geknipt. Dan wordt de 3’ kant geknipt en de exon uiteindes samengevoegd. Een van de meest verassende dingen aan een spliceosome is dat de katalysator site wordt gevormd door zowel RNA moleculen als eiwitten. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Voor de herkenningsstappen is ATP nodig net zoals voor het uitsmelten en weer samenvoegen van het RNA. Tijdens het splicingsproces vinden er twee transesterficaties plaats waarbij juist geen ATP wordt gebruikt, omdat de fosforbindingen genoeg energie vasthouden voor het splicen. RNA-RNA rearrangements zijn nodig om de herkenningssequenties te checken en herchecken, wat de precisie van splicing vergroot. Deze RNA-RNA rearrangements verbruiken ATP. Deze RNA rearrangements laten de splicing signalen op het pre-RNA meerdere keren onderzoeken door snRNP’s: bijvoorbeeld eerst wordt de verbinding op de 5’site gecheckt door U1, vervolgens na het loslaten van U1, komt U6 er voor in de plaats. Hierdoor wordt er constant gecheckt of het splicing proces goed gaat. Daarnaast zorgen de rearrangements ervoor dat het splicingproces in de juiste volgorde verloopt: eerste actieve site gevormd > tweede actieve site gevormd. Als het checken op een ramp uitloopt, gaat het splicen niet door. Rearrangement U1 > U6 Nadat het splicingproces is afgelopen blijven de snRNP’s gebonden aan het lariaat. Door de snRNP’s te laten ontbinden van het lariaat is weer een bepaal erearrangement nodig dat ATP- hydrolyse gebruikt. Door de ATP-hydrolyse nemen snRNP’s weer hun beginvorm aan en kunnen ze weer een nieuwe reactie op gang helpen. Bij de completering van het splicingproces, de spliceosome geeft een signaal af waarbij eiwitten aan het nieuwe gevormde mRNA binden dichtbij de positie waar eerst het intron zat. Dit wordt het exon junction complex (EJW) genoemd. Deze eiwitten markeren de site als een succesvolle splicing. Bij elke succesvolle splicing worden 200 eiwitten gebruikt, als we het vormen van snRNP’s meenemen. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Als we het splicingproces alleen aan de snRNP’s overlaten zullen er veel fouten ontstaan; exon-skipping en het gebruik van ‘cryptic’ splice sites (zie afbeelding). 1. Als transcriptie vordert, draagt de gefosforyleerde staart van RNA-polymerase verschillende componenten van het spliceosome. De coördinatie van transcriptie ten opzichte van splicing moet wel goed zijn om exon-skipping te voorkomen. 2. Exon definiton. Exongroottes zijn veel meer uniform (gelijk) dan intron groottes. Door exon definition zoekt de splicing machine naar een homoloog van dezelfde groote exon sequenties, die dus steeds terug te zien zijn. Als RNA synthese bezig is, voegen SR (serine, arganine) eiwitten zich op de 3’ en 5’ sites om deze plekken te markeren. Het invoegen van deze eiwitten gebeurt aan het 5’ uiteinde (de cap). Deze SR-eiwtten rekruteren weer U1 en U2 eiwitten om op de exongrenzen te plakken. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Waarom SR-eiwitten binden is nog niet bekend. Van een paar is bekend dat ze binden aan specifieke RNA sequenties; splicing enhancers. hnRNP associeert met het intron, waardoor de spliceosoom wordt geholpen om intronen en exonen uit elkaar te houden. Het markeren van de exon grenzen kan dan wel gebeurd zijn (tijdens het werk van RNA- polymerase), dat betekent niet dat het splicen gelijk gebeurt. Hier kan een vertraging inzitten, waardoor intron sequenties niet per se in de volgorde worden verwijderd als ze voorkwamen in de RNA-keten. Er zijn drie verschillende splicings-mechanismen: major-, U12-type- en transsplicing. Deze splicingsmechanismen zijn erg vergelijkbaar maar er zijn verschillende RNA’s voor nodig. De major-splicing volgt het mechanisme van de standaard splicing. Het U12-type splicing maakt gebruik van andere herkenningssequenties en andere snRNP’s (U11 in plaats van U1 en U12 in plaats van U2). Deze twee typen splicing komen voor in hogere eukaryoten waarbij het U12-type gebruikt wordt bij 0.1% van onze genen. Transsplicing komt alleen maar voor in lagere eukaryoten. Hierbij is een SL snRNP betrokken omdat een stukje SL snRNA het eerste exon wordt van het mRNA. Bijzonder is dat het SL snRNA vrijwel in alle mRNA’s één exon vormt. Dit zou voor een betere translatie kunnen zorgen. Uitleg Samenvatting (dubbelop): Een oplossing voor splicings-fouten is het co-transcriptionele snRNP assemblage en de exon- definitionhypothese. Bij co-transcriptionele snRNP assemblage is de vorming van splicingscomplexen gekoppeld aan de transcriptie dus wanneer de transcriptie goed verloopt zal de splicing ook goed verlopen. Bij de exon-definition hypothese geldt de theorie dat de exongrootte bij eukaryoten ongeveer dezelfde lengte hebben maar dat de intronen variabel zijn. U1, SR en hnRNP’s helpen bij de bepaling van exongrootte. In alle organismen is de gemiddelde lengte van een exon 150 nucleotiden. Onder de exon-definition-hypothese valt de markering van splicesites en het maskeren van de cryptische sites. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 RNA is zeer belangrijk en misschien wel belangrijker dan DNA. RNA kan reacties beïnvloeden en katalyseren. Zo kom je bij de theorie van een RNA-world. Heel onze wereld bestond uit RNA vroeger = RNA-world. RNA wordt beïnvloed door de chromatine structuur. Zó kan ook splicing worden geregeld. Er zijn twee manieren waarop dit kan gebeuren. De eerste: splicing en transcriptie zijn gekoppeld, de snelheid waarmee RNA-polymerase over het DNA gaat kan RNA splicing beïnvloeden. Dus een gepakte chromatine zorgt voor het slomer gaan van RNA-polymerase over het DNA. Hierdoor kan de splicing machine minder van de nieuwe RNA streng splicen, omdat dit tegelijkertijd verloopt met de DNA-transcriptie. De tweede: specifieke histon modificatis trekken componenten van de spliceosoom aan. Doordat dan chromatine in de buurt van het RNA wordt getranscribeerd (in een andere vorm overbrengen), komen de histon modificaties ook in het eindproduct van het RNA terecht. We weten niet hoe precies splicing verloopt. Er zijn enkele controle systemen, alleen die houden niet alle mutaties tegen. Splicing is zo flexibiel, dat het uit de klauwen van deze controle systemen soms blijft. Voorbeeld: een mutatie in een nucleotide sequentie die nodig is voor het verwijderen van een intron. Je zou denken dat deze intron dan niet gespliced wordt door de controle systemen. Echter, de mutatie kan voor een nieuw splicing patroon zorgen (A in de afbeelding). Of voor exon skipping (B in de afbeelding). In andere zaken wordt een cryptische sequentie benut (C in de afbeelding). En ergens anders weer een extra exon (D in de afbeelding). De splicing machine zoekt dus steeds het beste patroon om te splicen telkens nadat een mutatie is opgetreden. Dit heeft mede geleid tot de vele variaties in genen en organismen. Zó is splicing ook goed te reguleren door het lichaam, doordat op verschillende momenten verschillende eiwitten kunnen worden gemaakt. Self-splicing intronen kunnen zichzelf splicen door RNA-activiteit. Bij de eerste groep is een guanine met een hydroxylgroep de initiator terwijl de tweede groep adenine als initiator heeft. Ons splicings-mechanisme is dan ook gebaseerd op de tweede self-splicing intron groep. Eiwitten versnellen slechts deze RNA-gestuurde processen. Waarom is splicing dan zo Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 moeilijk proces, omdat uit de RNA-world RNA geëvolueerd is van een self-splicing intron tot een pre- mRNA splicing proces. Een andere vorm van RNA processing is het knippen en polyadenyleren van het 3’ uiteinde van het preRNA. Allereerst maakt RNA polymerase het preRNA. Op dit preRNA binden de eiwitten CPSF en CstF (eiwitten die met het RNA-polymerase meereizen) door middel van herkenningssequenties. Poly-A polymerase (PAP) (PAP heeft geen template nodig) wordt uitgewisseld met CstF en zet ongeveer 200 adenine nucleotides aan het 3’ einde. Uiteindelijk binden er poly-A-binding proteins aan de poly-A staart en de polyadenylering stopt. Net zoals splicing en 5’ capping komt 3’ polyadenylering alleen voor bij eukaryoten. Na het stoppen heeft het 5’uiteinde een ontbrekende cap, waardoor exonucleases de streng gaan opeten. Ze eten net zo lang, totdat het RNA-polymerase geen houvast meer heeft en van de nieuwe RNA streng loslaat. Hoe kan de cel ervoor zorgen dat de nieuwe streng mRNA uit de cel wordt getransporteerd en dat de resten van het maken van de nieuwe streng mRNA worden afgevoerd. Wat is het onderscheid dat deze stoffen scheidt? Na de drie proces stappen moet het gevormde mRNA de kern uit worden getransporteerd. Hiervoor moet het mRNA aan bepaalde voorwaardes voldoen. Zo moeten er CBC, PABP en SR eiwitten gebonden zijn maar geen snRNP’s. Bij het nuclear pore complex (eiwitten bij de poriën van het kernmembraan) wordt alles gecontroleerd en het mRNA dat volledig klaar is uit de kern getransporteerd met de 5’ kant eerst. Door middel van de nuclear pore complexen kan er actief transport van mRNA naar het cytoplasma (cytosol) plaats vinden waarna er op de ribosomen kan worden getransleerd. De resten waarmee mRNA wordt gemaakt worden gedegradeerd in het exosoom; groot eiwitcomplex dat volzit met 3’ naar 5’ RNA exonucleases. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Het nuclear pore complex bestaat uit een ring waarin het mRNA molecuul wordt opgevangen. Daarnaast bestaat het uit nucleaire transport receptoren die de identiteit van macromoleculen ontdekt. Voor het overbrengen van mRNA een specifieke nucleaire transport receptor moet eerst worden geladen met een juist mRNA, voordat het mRNA getransporteerd kan worden. Na het transportproces laat de transport receptor los van het mRNA en kan het weer een nieuw transportopdracht uitvoeren. Welke eiwitten nog gebonden zijn aan het mRNA voordat het de cel uitgaat, beïnvloeden het lot van het mRNA in het cytosol. Er zijn verschillende factoren die kunnen lokaliseren en herkennen. Er kan zowel transport naar de kern als van de kern plaats vinden. Er zijn verschillende eiwitten die aan het mRNA kunnen worden gehangen om het transport preciezer te maken zoals NLS (import), Transportin (beide) en NES (export). Na transport uit de nucleus laat het cap binding protein los en binden initatiefactoren voor translatie aan de 5’ kant waarna het RNA circulariseert. Deze circularisatie is nodig voor de translatie. Naast coderende RNA’s moeten er ook niet-coderende RNA’s gesynthetiseerd worden, bijvoorbeeld voor de RNA delen in de ribosomen. 3-5% van al het gemaakte RNA is mRNA, 15% bestaat uit introns en de rest is ribosomaal RNA (voor translatie mRNA). Bij bacteriën zorgt een RNA-polymerase voor elke RNA-vorm. Maar bij mensen is dit anders. RNA polymerase 1 synthetiseert rRNA. RNA polymerase heeft geen C-terminale staart, waardoor op het nieuwe rRNA geen caps of poly-A-staarten voorkomen. Een volgroeid organisme moet 10 miljoen RNA-kopiën maken om 10 miljoen ribosomen te construeren. 10 miljoenen RNA nodig per dus. De cel kan voor zoveel rRNA zorgen, omdat het verscheidene rRNA genen heeft. Er zijn 4 typen rRNA’s, elk present in een kopie van een ribosoom. Drie van de vier (18S, 5.8S en 28S) worden gemaakt door het chemisch modificeren en het cleaven (kloof) van een enkele grote voorloper van rRNA (precursor). De vierde (5S) wordt gesynthetiseerd door een gescheiden cluster van genen door een ander polymerase: polymerase 3. Heeft geen chemische modificatie nodig. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Het precursor rRNA wordt ook geprocessed. Eerst vinden er chemische modificaties plaats waarna het wordt geknipt in drie moleculen. Deze moleculen worden geïntegreerd in het grote of het kleine subunit. De chemische modificaties worden aangestuurd door ‘guide RNA’s’. Deze guide RNA’s zijn gecodeerd in intronen en andere genen (liggen dus gebonden door basenparing). Alle guide RNA’s zijn familie van een grote klasse van snoRNA’s (small nucleolar RNA’s). Deze worden zo genoemd omdat deze stoffen hun functie uitvoeren in een sub-compartiment van de nucleolus. De nucleolus is verantwoordelijk voor de productie van ribosomen. De nucleolus bevat geen membraan maar bestaat uit een clustering van macromoleculen waardoor reacties sneller kunnen verlopen. In deze clustering zitten rRNA genen, precusor en rijp rRNA, rRNA- processing enzymen, snoRNP’s, ribosomale eiwitsubunits en tRNA’s. In de nucleolus vindt rRNA-transcriptie, RNA-processing en samenvoeging van rRNA’s in ribosomale subunits plaats. Afhankelijk van de fase van de celcyclus is de nucleolus meer of juist minder geclusterd. Nucleolus in celcylcus: Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 De grootte van de nucleolus reflecteert het aantal ribosomen in de cel. Ribosomen fabriek, de nucleolus: In de kern bevinden zich nog meer subnucleaire structuren:  Cajal bodies (de plek waar de snRNP’s en snoRNP’s hun laatste fasen uitzitten, en waar de snRNP’s worden gerecycled terwijl hun RNA’s ontdaan worden van de rearrangements opgedaan tijdens splicing)  GEMS (Gemini bodies): modificatie snRNA en snoRNA, recycling snRNP en reset snRNA  Interchromatine granule clusters (speckles): opslag van rijpe snRNPs Al deze structuren zijn niet omgeven door membranen maar wel zeer dynamisch. De Cajal bodies en GEMS worden vaak samen aangetroffen en zijn misschien wel identiek. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Samenvatting: splicing is mogelijk door RNA-RNA interacties en wordt versneld door eiwitcomplexen. Vanwege alternatieve splicing kan uit één gen meerdere producten ontstaan. Nucleaire export van RNA wordt geregeld door nuclear pore complexen waar controle plaats vindt van het mRNA. 3’ en 5’ processing van eukaryoot mRNA zorgt voor bescherming van het mRNA. De nucleolus is verantwoordelijk voor ribosoom productie. Andere nucleaire structuren zijn de Cajal bodies, GEMS bodies en interchromatine granule clusters. RNA-world: eerst RNA, dan RNA > eiwitten, tenslotteDNA> RNA > eiwitten Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 MG H.6 Samenvatting – Regulation of translation & RNA World (347 – 366) Translatie is het proces waar ribosomen een stuk RNA omzetten in een functioneel eiwit. Na het transleren van het RNA kunnen er drie dingen plaats vinden, het vouwen van het eiwit wat fout gaat waardoor er degradatie of opnieuw vouwing plaats vindt, het vouwen van het eiwit wat direct goed gaat of het ongevouwen eiwit dat verplaatst wordt naar het endoplasmatisch reticulum. Als er iets fout gaat met de synthese van eiwitten kan dit grote gevolgen hebben en daarom is een goede regulatie essentieel. De plaats waarbij de translatie begint is cruciaal, omdat als er een fout inzit heel het eiwit verkeerd wordt afgelezen (niet-functioneel) of niet wordt afgelezen. Regulatie van transcriptie is al strikt, maar die van regulatie nog strikter!! Ontregeling van de translatie veroorzaakt ziekten zoals kanker, alzheimer of cystic fibrosis. Verhoogde synthese van ribosomaal eiwit L6 leidt tot prostaatkanker. Verschillende eiwitten zijn dan gedereguleerd waardoor er geen apoptose meer mogelijk is. Regulatie van translatie is nog strikter dan die van transcriptie. Een primair DNA transcript wordt eerst gespliced en er wordt een 5’ cap en 3’ poly-A-staart aangezet. Hierna wordt het uit de nucleus getransporteerd en getransleerd tot een eiwit. Translatie wordt uitgevoerd door ribosomen. Ribosomen bestaan uit twee subunits en vier RNA moleculen. Het ribosoom heeft drie tRNA bindingsplaatsen. Op de A-site komen nieuwe tRNA’s binnen, in de P-site wordt de aminozuur keten verlengd en in de E-site verlaten de tRNA’s het ribosoom. Bij prokaryoten wordt de translatie geïnitieerd door de Shine-Dalgarno sequentie (5’ – AGGAGGU – 3’). Deze sequentie bevindt zich een aantal nucleotides voor het startcodon. Het ribosoom bindt aan deze sequentie door middel van RNA-RNA interacties. Het 16S deel bindt Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 eerst aan het mRNA (om de initiatie AUG codon te positioneren) en daarna volgt de 30S unit. Bacterieel mRNA bestaat uit polycistronisch RNA (= meerdere eiwitten kunnen gemaakt worden van hetzelfde mRNA), deze heeft meerdere Shine-Dalgarno sequenties en meerdere startcodons. De ShineDalgarno sequentie is niet altijd noodzakelijk, soms is de AU rijkheid in een sequentie al genoeg. De translatie van het mRNA begint met het startcodon AUG. Een speciaal tRNA is nodig voor de start van de translatie: initiator tRNA. De initiator tRNA neemt methionine met zich mee, dat er voor zorgt dat elk eerste aminozuur aan de N- terminus methionine bevat. Iniatiator tRNA heeft een andere sequentie dan normaal tRNA, zodat het zo herkent wordt. In eukaryoten, wordt het initiator tRNA complex eerst geladen in een kleine ribosomale sub-unit samen met andere eiwitten: genaamd eukaryotische initiatie factoren (eIF’s). Het tRNA is in staat om direct te binden aan de P-site. Bij eukaryoten wordt de 5’ cap van het mRNA herkent en bindt de kleine subunit van het ribosoom hieraan. Ook binden er verschillende initiator factoren aan het mRNA. Het ribosoom samen met het initiator tRNA elongeert langs het mRNA op zoek naar de eerste AUG. De initiator factoren laten los en de grote subunit bindt. De kozak consensus sequentie (ACCAUGG) wordt herkent door het ribosoom waarna het begint met de translatie. Het mRNA wordt door het ribosoom gevonden door de aanwezige cap met de eiwitten: eiF4E en eIF4G. Daar bindt het ribosoom aan, waarna het verder gaat langs dit mRNA met zijn zoektocht naar een AUG. Additionele initiatie factoren reageren als ATP-helicases om de beweging uit te voeren. Na het vinden van de AUG-site, scheiden de initiatie factoren zich af van het mRNA. Hierdoor kan het grote ribosomale deel aan het kleine ribosomale deel binden, waardoor de ribosoom weer compleet is. De initiator tRNA blijft nog even zitten op de P-site en verlaat voorspoedig de A-site. Afwijkingen van de consensus sequentie kunnen een aanleiding zijn tot leaky scanning. Door kleine veranderingen in de sequentie zou het ribosoom verder op het mRNA pas kunnen beginnen met het mRNA aflezen. Ook zou er reïnitiatie van het gen plaats kunnen vinden. Het hoeft dus niet zo te zijn dat bij de eerste AUG de start moet plaatsvinden, soms wordt namelijk de eerste of eerste en tweede AUG overgeslagen. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Dit kan komen door een kleine verandering in de consensus sequentie bijvoorbeeld, waardoor de startplaats niet wordt herkent. Dit fenomeen ‘leaky scannig’ kan worden gebruikt voor het net iets ander vormen van dezelfde eiwit. Zó kan er op een N-terminale staart een signaal getransleerd worden en op de andere staart niet, waardoor beide eiwitten naar een ander compartiment in de cel worden vervoerd. Translatie wordt beëindigt door middel van een stopcodon. Er zijn drie stopcodons (UAA, UAG en UGA). Het ribosoom komt uiteindelijk uit bij een stopcodon, deze bevindt zich dan in de A side, er bindt dan geen tRNA maar een release factor (een eiwit dat lijkt op een tRNA molecuul). Er vindt een reactie plaats met een water molecuul (ipv een aminozuur koppeling), waardoor het eiwit een carboxylzuur groep aan het uiteinde krijgt. Het ribosoom valt uit elkaar (grote en kleine ribosomale delen scheiden) en de delen zijn weer beschikbaar voor nieuwe translatie. Synthese eiwitten duurt tussen 20 seconden en enkele minuten. In het eukaryote en prokaryote systeem vindt vaak translatie plaats via een polysoom waarbij meerde ribosomen simultaan één RNA molecuul transleren. Een efficiënte startsequentie leidt dus tot hoge eiwit productie. Op deze plaatsen is dus ook een verhoogde concentratie van eiwitten aanwezig. In eukaryoten heb je eerst alle processing stappen van RNA, en daarna bindt pas het ribosoom (nadat de initiatiefactoren zijn gescheiden van het mRNA). In prokaryoten vindt geen processing plaats dus translatie kan meteen beginnen (transcriptie en translatie zijn aan elkaar gekoppeld). In prokaryoten kan DNA worden gekoppeld aan het membraan doordat transcriptie en translatie gekoppeld zijn. Bepaalde eiwitten worden naar het membraan gebracht die vast zitten aan de translatie en transcriptie factoren, en dus ook aan het RNA en DNA. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Ribosomen verslinden energie (10 ATP per peptide binding). Proofreading tijdens het translatie proces (in bacteriën) wordt gereguleerd door de elongatie factoren EF-Tu en EF-G. Er zou een RNA molecuul kunnen ontstaan zonder stopcodon (vanwege een mutatie etc.). In eukaryoten vindt dan geen initiatie van translatie plaats omdat er geen circularisatie heeft plaats gevonden. In prokaryoten vindt juist wel initiatie plaats vanwege een tmRNA molecuul. Een tmRNA molecuul is een transfer en messenger RNA molecuul in één. Bij een ribosoom dat vast zit op een gebroken mRNA molecuul komt een tmRNA binnen op de A- site. Deze verschuift naar de P-site en heeft een eigen template waardoor er elf alanines aan de keten gezet worden. Hierna stopt de translatie en wordt het eiwit afgebroken door enzymen die de alanine staart herkennen. Vaak is de genetische code voor elk celdeel hetzelfde, toch zijn er uitzonderingen. Zó maakt mitochondria wel een ander aminozuur dan je eigenlijk zou verwachten bij die drieletter code. Daarnaast gebeurt er ook wel eens een variatie dat bekend staat als: translatie encoding. Een andere nucleotide volgorde, dan de sequentie waarmee het oorspronkelijke Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 aminozuur zou worden gemaakt, gepresenteerd in een mRNA kan de betekenis van de genetische code veranderen op een bepaalde plek in datzelfde mRNA. Hierdoor ontstaat een nieuw aminozuur. Toch betekent stop niet altijd stop. UGA is een van de drie stopcodons en codeert voor serine. Echter zijn er enzymen die serines omzetten in selenocysteine waardoor er een selenocysteine aan de keten wordt toegevoegd in plaats van een release factor. Selenocysteine is dus een nieuw aminozuur. Frame-shifting kan ook een oorzaak zijn waardoor translatie niet stopt. Door insertie of deletie van één nucleotide verandert het reading-frame van het ribosoom. Programmed -1 ribosomale frame-shifting komt veel voor in retrovirussen. Hierdoor krijg je uit één mRNA meerdere eiwitten en vaak in een vaste verhouding. Voor de programmed -1 ribosomale frameshifting is een slippery sequence nodig, hierop vindt de frameshift plaats. Ook is er een spacer element van 5-8 nucleotiden nodig en is een structuur element in de vorm van een pseudoknot nodig om de ribosoom te laten pauseren. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Nonsense-mediated afbraak (meest krachtige controle systeem) voorkomt de translatie van verkeerde eiwitten. Hierbij binden exon junction complexen (EJC’s) aan de splicings sites en na transport uit de nucleus laten deze los. Als de splicing goed is verlopen, zou het ribosoom op het einde van het mRNA, bij de laatste exon, geen EJC’s meer tegen moeten komen en zijn alle EJC’s gepasseerd. Zó is een nieuw eiwit gevormd. Bij abnormale splicing mist er een exon junction complex en worden de anderen ook niet losgelaten. Hierdoor eindigt het ribosoom te vroeg en binden Upf eiwitten aan de EJC’s. Upf triggert mRNA degradatie. Nonsense-mediated afbraak is belangrijk geweest in de evolutie van eukaryote cellen. Daarnaast is het ook belangrijk geweest in de ontwikkeling van het immuun systeem. Als laatste verzacht nonsense-mediated afbraak geërfde mensenziekten. Als er twee mRNA strengen zijn, een met mutaties en een goeie, dan zorgt nonsense-mediated afbraak ervoor dat de streng met mutatie wordt afgebroken. Antibiotica zijn goede voorbeelden van remmers van het translatieproces. Antibiotica zijn veelal afgeleid van schimmels, ze doden bacteriën door specifiek aan te grijpen op ribosomale machinerie. Antibiotica zijn vaak specifieke prokaryote of eukaryote remmers. Tetracycline blokkeert de binding van tRNA op de A-site van het ribosoom, chloramphenicol zorgt voor de remming van peptidyl transferase zodat er geen koppeling van aminozuren plaats vindt en erythromicin zorgt er voor dat een tRNA vast komt te zitten in de E-site waardoor er geen translocatie van de volgende tRNA plaats vindt. Dit zijn allemaal voorbeelden van prokaryote translatie remmers. Chloramphenicol remt ook de translatie in eukaryote mitochondria (omdat in theorie de mitochondria zijn ontstaan uit bacteriën). Anisomycine remt peptidyl transferase in eukaryote cellen en cycloheximide remt net zoals chloramphenicol de translocatie, echter is dit in eukaryoten in plaats van bacteriën. Er zijn antibiotica die moleculen hebben vergelijkend met tRNA’s maar deze breken juist Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 eiwitsynthese af. Zo is puromycine een pro- en eukaryote translatieremmer omdat de 3’ uiteinde van puromycine overeenkomt met die van tRNA’s. Ookal wordt de translatie van een eiwit juist uitgevoerd betekent dit nog niet dat het een functioneel eiwit is. Voor een functioneel eiwit is een goede vouwing en structuur van het eiwit nodig. Deel 2 H.6 Samenvatting (347-366) Wanneer een eiwit vouwt, stopt het bijna al zijn hydrofobe gebieden in zijn binnenste kern. Daarnaast vormen er zich allemaal non-covalente bindingen in verschillende delen in het Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 molecuul. Al deze energie gunstige rangschikkingen zorgen voor de juiste vouwing van het eiwit. De aminozuurvolgorde is niet alleen gemaakt voor het maken van een bepaald eiwit, maar ook voor het snel opvouwen van dat eiwit. Voor sommige eiwitten, begint deze vouwing onmiddellijk bij de N-terminale staart. Dus nadat een eiwit loslaat van het ribosoom, vouwt het onmiddellijk (a-helices en b-sheets). Andere eiwitten vormen in de fase gelijk na het loslaten van het eiwit een molten globule. Molten globule is de eiwitstructuur voor dat deze gevouwen wordt (als het net het ribosoom heeft verlaten). Simpele eiwitten kunnen vaak zichzelf tot een functionele vorm vouwen terwijl complexe eiwitten hier vaak vouweiwitten als hulp bij nodig hebben. De molten globule bestaat vaak uit simpele structuren zoals alfa-helices en beta-sheets. Chaperonnes zijn hulpeiwitten die zorgen voor de vouwing van een nieuw gevormd eiwit. Chaperonne eiwitten hebben een algemene naam Hsp (heat shock protein). Na een heat Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 shock denatureert een eiwit en door middel van chaperonnes kan het eiwit weer gevouwen worden. Chaperonnes eiwitten kunnen ook eiwitten ‘redden’ die verkeerd zijn opgevouwen = off- pathway. Ze binden dan aan het hydrofobe deel en zorgen weer voor een heat schock. Small Hsp25 zijn holders, deze houden alleen de slechte gevouwen eiwitten vast en voorkomen dat deze eiwitten voor problemen zorgen in de cel.  Hsp60 en Hsp70 zijn eiwitten die zorgen voor de vouwing, ontvouwing en stabilisatie van eiwitten.  Hsp90 is een chaperonne voor binding en stabilisatie.  Hsp100 is een unfolder lost problemen door eiwitaggregaten op Hsp60 en Hsp70 vormen de grootste eukaryote chaperonne-families. Mitochondriën brengen hun eigen Hsp60- en Hsp70-varianten tot expressie. Hsp70 is in een vroeg stadium al bij de vouwing van een eiwit betrokken (hij bindt wanneer een eiwit deels nog gevormd wordt). Deze chaperonne verbruikt ATP en zorgt voor of een direct correct gevouwen eiwit of een tussen stadium van vouwing. Hsp60 = chaperonin zorgt er voor dat een nog niet correct gevouwen eiwit gevouwen wordt tot een correct gevouwen eiwit. Het eiwit wordt naar binnen gehaald in de chaperonne (soort isolatie kamer), hier bevinden zich veel hydrofobe gebieden waardoor eiwitten zich thuis voelen en zich ontvouwen. Dan wordt een cap op het chaperonne gedaan, het eiwit correct gevouwen en wordt de cap er weer afgehaald om zo het correct gevouwen eiwit weer los te laten. Hsp60 verbruikt ook ATP. Hsp90 is betrokken bij de vouwing van onco-eiwitten dus een hsp90-remmer kan een mogelijk anti-tumor agens zijn. Chaperonne eiwitten HSp 60 en 70 gebruiken veel ATP, meerdere ronden van ATP hydrose om een eiwit goed te kunnen vouwen. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Als een eiwit hydrofobe delen aan de buitenzijde heeft is het of mislukst, of het heeft een ongeluk gehad dat het later alsnog ontvouwt, of het heeft gefaald om zijn normale partner sub-unit te vinden in een groot eiwit complex. Zowel prokaryoten als eukaryoten hebben chaperonnes nodig om hun eiwitten functioneel op te vouwen. Chaperonnes schermen hydrofobe eiwitdomeinen af en voorkomen hierdoor vorming van eiwitaggregaten. Eiwitten kunnen verschillende routes doorlopen: 1. Ze worden meteen netjes gevouwen, 2. Ze worden netjes gevouwen door middel van chaperonnes, 3. Ze worden niet goed gevouwen en afgebroken, 4. Ze vormen een eiwit aggregaat. Ongevouwen eiwitten kunnen aggregatie vormen, zijn protease gevoelig, binden chaperonnes en zijn niet functioneel. Gevouwen eiwitten hebben precies de tegenovergestelde functies. Het proteasoom zorgt voor de afbraak van ongewenst eiwitten. Eiwitafbraak in het proteosoom begint bij de ubiquilatie van een ongewenst eiwit. Aan het niet functionele eiwit zit een target plaats voor ubiquitine-ligase. Ubiquitine-ligase zet samen met ander eiwitten (E1 en E3) een keten van ubiquitine aan het ongewenste eiwit waardoor het proteasoom het ongewenste eiwit herkent. Het eiwit komt het proteasoom binnen waar allereerst deubiquitinatie plaats vindt. Hierna wordt het eiwit ontvouwen door protein unfoldases (in meerdere rondes) waarbij ATP wordt gebruikt. In de core van het proteasoom wordt proteolyse van het eiwit uitgevoerd. Via de andere kant van het proteasoom verlaten de afgebroken stukjes eiwit het proteasoom. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Dieper op het proteasoom in: Proteasoom bestaat uit een holle cylinder (20s) gevormd uit meerdere sub-unit eiwitten die zich stapelen als 4 ringen. De actieve sites zijn naar binnen gericht. Aan het eind van de cylinder zit een cap (19s), bestaande uit een zes sub-unit eiwit (ook ringvormig). De eiwitten die de ringstructuur mogelijk maken heten ook wel unfoldases of AAA eiwitten. Deze eiwitten hebben de functie als hexameer, net als wat bij DNA te zien is. De cap geldt als herkennigsplek voor verkeerd gevouwen eiwitten. Alleen eiwitten die verkeerd gevouwen zijn kunnen de cap passeren, die hebben een markering gekregen. De markering is ubiquitine. Proteasoom kan ook nog eiwitten vernietigen die het ER hebben bereikt. Een ER controle systeem detecteert de verkeerde gevouwen eiwitten, en stuurt ze terug ‘retrotranslocates’ ze naar het cytosol waar ze worden gedegradeerd door het proteosoom. Een belangrijke eigenschap van het proteasoom is dat het proteasoom, in tegenstelling tot andere complexe processen, heel de structuur vasthoudt totdat het is omgezet. Andere processen laten meestal delen eerder los. Ubiquitine is een klein eiwit bestaande uit 76 aminozuren. Het is niet alleen gekoppeld aan eiwitafbraak maar ook aan histon-regulatie, endocytose en DNA-repair. Eiwitten kunnen afgebroken worden omdat ze verkeerd gevouwen zijn (sinds hun synthese of na gebruik), omdat de concentratie van deze eiwitten veranderd moet worden of omdat eiwitten na een bepaalde fase of tijd in de celcyclus niet meer nodig zijn of zelfs storen. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 De controle van eiwitafbraak is dus strikt gereguleerd. Het mechanisme van ubiquitine-ligase activatie is een van de factoren die eiwitafbraak reguleert. Ook is de activatie van het target signaal voor polyubiquitine een regulatiefactor. Sommige eiwitten moeten een kort leven hebben. Hier komt regulatie van het proteasoom bij kijken. Er zijn verschillende mechanismen: Activatie ubiquitin ligase door ATP- hydrolyse of een allosterische stof. Daarnaast kan het degradatie signaal worden bereikt ook door ATP-hydrolyse, maar daarnaast door het unmarken van het eiwit of door het creëren van een destabiliserende N-terminale staart. Zie afbeeldingen hierboven. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Elke eiwit draagt dus zijn eigen destructie signaal met zich mee op de N-terminale staart. Door de acylatie van de staart komt het E3 enzym hierop af. Echter, dit plekje is goed verstopt als het eiwit goed is opgevouwen, waardoor d eiwit niet wordt afgebroken. Bij Prionziektes (Creutzfeldt-Jacobm, Kuru, Gekke koeien en Scrapie ziektes) zorgen eiwitten voor infecties in het lichaam, hier is dus geen RNA of DNA bij betrokken. Hetzelfde eiwit kan verschillende typen aggregaten vormen en bij Prion strains is elk type aggregraat infectieus omdat proteasomen hier niet bij kunnen. Proteasomen in tumorcellen ruimen soms te fanatiek regulatie-eiwitten op waardoor belangrijke processen belemmerd worden. Longtumoren lijken vaak te verdwijnen na een behandeling met proteasoomremmers. Al met al wordt de productie van een functioneel eiwit in een eukaryote cel op verschillende niveaus gereguleerd, wat cruciaal is voor een gezonde cel. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 De RNA-wereld (zie blz.19) staat voor de theorie dat RNA aan het begin van het leven staat. Er zijn verschillende argumenten voor een RNA-wereld:  RNA is informatiedrager en enzym in één  -RNA vormt complexe 3D structuren (in tegenstelling tot DNA) en allosterisch gedrag zoals eiwitten  Natuurlijke selectie in compartimenten  Pre-biotische experimenten resulteerden in RNA bouwstenen - Biosynthese dNTP verloopt via rNTP  RNA is katalytisch middelpunt in ribosoom, splicosoom, self-splicing introns, hammerhead ribozyme, hairpin ribosyme en HDV ribozyme. De allereerste moleculen moeten in staat zijn geweest hun eigen synthese te katalyseren. Er zijn voorbeelden van RNA-achtige informatiedragers. Deze kunnen basenparing en een dubbele helix vormen waardoor ze een template voor eigen synthese kunnen vormen. RNA kan een secundaire structuur vormen in het eigen molecuul en een tertiaire structuur vormen door complexere interne interacties of interacties tussen twee RNA moleculen. Hammerhead ribozyme, hairpin ribozyme en heptitis delta virus ribozyme zijn voorbeelden van katalytische RNA moleculen. De vorming van katalytisch RNA is bewezen door in vitro experimenten. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 H7: Controle van genexpressie (392- 413) Moleculaire genetische mechanismes die gespecialiseerde cellen creëren en behouden Cellen moeten genen aan en uit kunnen zetten om zich aan te passen aan de omgeving. Zeker als een cel in een multicellulair organisme zich moet differentiëren in een specifiek cel type. Cell memory is een vereiste voor de vorming van georganiseerde weefsels en voor het onderhoud van stabiele gedifferentieerde cel types. Cell memory zorgt ervoor dat cellen hun differentiatie door kunnen geven aan hun dochtercellen. Aan de andere kant, andere veranderingen in genexpressie in eukaryoten, net als de meeste veranderingen in bacteriën, zijn voor korte tijd. Bijvoorbeeld: bij aanwezigheid van tryptofaan in de cel zullen de genen die voor tryptofaan coderen worden geblokkeerd. Zodra tryptofaan de cel uit is, verdwijnt de blokkering en zijn de genen weer aan gezet. De dochtercellen van deze cel zullen geen herinnering hebben dat hun voorouders blootgesteld werden aan tryptofaan. Transcriptie regulatoren In embryo’s van de meeste organismen en volwassenen zitten de kernen in de cellen. Extracellulaire informatie en signalen moeten het plasmamembraan passeren om vervolgens signalen in het cytosol te activeren waardoor allerlei transcriptie regulatoren actief worden. Er zijn verschillende manieren waardoor de transcriptie regulatoren in eukaryoten worden gereguleerd: A. Eiwit binding. Het eiwit wordt alleen gemaakt als het nodig is en kan snel verwijderd worden door middel van proteolyse. B. Activatie door ligand binding C. Activatie door covalente modificatie. Bijvoorbeeld fosforylatie. D. Formatie van een complex tussen DNA-bindend eiwit en een apart eiwit met een transcriptie- activatie domein. E. Een inhibitor verwijderen van het actieve domein door fosforylatie. F. Toegang tot de kern stimuleren door het verwijderen van een inhibitor. G. Door gereguleerde proteolyse ervoor zorgen dat een transcriptiefactor loslaat van het membraan. Gedownload door Aliyah Sandino ([email protected])  lOMoARcPSD|33185463 Transcriptiefactoren kunnen samen werken en zo de expressie van een individueel gen reguleren. Ook is het zo dat 1 transcriptiefactor bij meerdere genen voor regulatie van genexpressie zorgt. Dus de combinatie van een paar transcriptiefactoren (TF) kunnen voor heel veel verschillende soorten cellen zorgen. In het plaatje is te zien dat de even TF nummers naar links gaan en de oneven nummers naar rechts. Uiteindelijk leiden 5 TF tot 8 verschillende cellen. Cellen krijgen dus de TF van hun voorouders mee. Ook kunnen andere TF worden toegevoegd aan de cel. Op deze manier krijgt een cel een hele boel soorten TF. De combinatie van alle TF is enorm belangrijk voor een organisme, want slechts de toevoeging van 1 TF kan ervoor zorgen dat de cel zich in een totaal andere cel gaat differentiëren. Controle van genexpressie Gespecialiseerde cellen moeten constant reageren op hun omgeving. De belangrijkste signalen zijn van andere cellen om het gedrag van het hele organisme te reguleren. Deze signalen zorgen vaak voor veranderingen in de transcriptie. Nu gaat het echter over hoe gespecialiseerde cellen snel hun genen aan en uit kunnen zetten als reactie op hun omgeving. Ondanks dat regulatie van genexpressie uit een combinatie van TF bestaat, kan slechts 1 TF ervoor zorgen dat een gen aan of uit staat. Heel simpel doordat de complete combinatie niet meer klopt. Te vergelijken met een cijfercode: als alle nummers op 1 na goed staan kan het slot niet open. Mocht alleen dat ene foute nummer worden veranderd en het vervolgens wel goed is, gaat het slot wel open. De hele cijfercode en het slot zijn dus afhankelijk van dat ene cijfer. Bovendien kan dit nummer bij meerdere sloten gebruikt worden. Dus 1 TF reguleert bij meerdere genen. Snelle controle van genexpressie gebeurt vaak via hormonen. Een bepaald hormoon wordt uitgescheiden in bepaalde kritische omstandigheden. Het hormoon kan dan een complex vormen met een receptor en dit complex kan dan voor maximale transcriptie van bepaalde genen zorgen. Zodra de omstandigheden weer normaal zijn is het hormoon niet langer aanwezig en daalt de expressie van de genen weer. Een voorbeeld hiervan staat hiernaast. De actie van de glucocorticoid receptor is schematisch weergegeven. Links staat een serie genen die elk een verschillende TF gebonden hebben aan hun regulatie gebied. Dit gebonden TF is echter niet genoeg om voor volledige transcriptie van de genen te zorgen. Rechts is het effect van het toevoegen van een extra TF weergegeven. De glucocorticoid receptor zit in een complex met het glucocorticoid hormoon. De toevoeging van dit complex aan de al gebonden TF zorgt voor maximale transcriptie van het gen. De genen zijn dan dus ‘aan’ gezet. Als het hormoon niet langer aanwezig is, laat de receptor los en gaat de transcriptie weer terug naar het oude niveau. Dit is dus een voorbeeld van snel genen aan uit kunnen zetten. Elke cel is wel anders en heeft an