Dictaat Moleculaire Genetica 1 PDF

Dictaat Moleculaire Genetica 1 College 1 In de cel zit alle genetische informatie van een organisme. DNA moet worden gerepliceerd want het DNA moet worden doorgegeven aan het nagelacht. Er kunnen mutaties ontstaan bij het repliceren van de cel. Er zijn echter methoden, stoffen en andere zaken, om h...

Dictaat Moleculaire Genetica 1 College 1 In de cel zit alle genetische informatie van een organisme. DNA moet worden gerepliceerd want het DNA moet worden doorgegeven aan het nagelacht. Er kunnen mutaties ontstaan bij het repliceren van de cel. Er zijn echter methoden, stoffen en andere zaken, om het DNA te repareren van deze mutaties. Genetische recombinatie is het combineren van verschillende DNA-segmenten tijdens de replicatie. Dit zorgt voor genetische variatie wat uiteindelijk een grote oorzaak is van evolutie. DNA wordt afgelezen en omgezet naar RNA. Dit proces heet transcriptie. Om uiteindelijk het RNA te vertalen naar een eiwit wordt er gebruik gemaakt van translatie. Al deze systemen worden gereguleerd en eventuele fouten worden opgevangen. Alle organismen maken gebruik van nucleïnezuren om te vertalen naar aminozuren. Al deze processen worden gekatalyseerd door enzymen. Als al deze processen kunnen worden gecategoriseerd en in een stamboom worden geplaatst. Er kunnen drie groepen worden onderscheiden: eukaryoten, prokaryoten en archaea. Prokaryoten zijn organismen zonder celkern en de meeste bacteriën vallen hieronder. Eukaryoten zijn organismen met celkern. Gisten zijn eukaryoten en menselijke cellen vallen hier ook onder. Om verder nog scheiding te maken kan er gekeken worden naar de methode die door het organisme wordt gebruikt voor de transcriptie en translatie. Het ribosomaal RNA is een goede manier om overeenkomsten te bekijken. Homologe genen zijn genen met een gemeenschappelijke voorouder die ongeveer dezelfde functie hebben. De archaeabacteriën zijn afgesplitst van een gemeenschappelijke voorouder met de eukaryoten. De algemene lijn in evolutie is dat er meer genen bij zijn gekomen door de tijd heen. Het ontstaan van nieuwe genen kan allereerst door een mutatie. Een voorbeeld is photolyase-activiteit, bij allerlei organismen kan een eiwit (Phr eiwit) energie halen uit opgevangen licht halen en dit gebruiken om DNA te repareren. Bij zoogdieren is dit gen ook nog aanwezig maar heeft er een mutatie plaats gevonden waardoor het codeert voor een cryptochroom activiteit waarbij het opgevangen licht wordt gebruikt voor de biologische klok. Een andere methode voor het ontstaan van nieuwe genen is gen duplicatie. Van een gen eindigen er na de duplicatie twee identieke genen in de cel. Vervolgens muteert één of beide genen en zo ontstaan er twee vergelijkbare genen met net een andere functie. Voorbeeld: bacillus subtillus heeft een gen dat maar liefst 77 duplicaties heeft van hetzelfde gen, met name voor transporteiwitten Voorbeeld: in mensen zijn er genen voor alpha en bèta hemoglobine, in primitieve vissen was er één soort van dit gen, maar door duplicaties ontstonden er in kikkers twee varianten van het gen voor de twee soorten hemoglobine. In mensen zijn er maar liefst 11 kopieën van dit gen te vinden, 5 voor het alphaglobine en 6 voor de bètaglobine. Tijdens de foetale periode wordt er vooral alphaglobine geproduceerd, volwassene vooral bètaglobine. Bij homologe genen wordt er onderscheid gemaakt tussen orthologe genen en paraloge genen. Orthologe genen zijn genen in twee verschillende organismen die een gezamenlijke voorouder hebben en vervolgens zijn bij één of bij beide organismen deze genen gemuteerd waardoor ze net een andere functie krijgen. Paraloge genen zijn genen die binnen één soort zijn gedupliceerd en vervolgens door mutatie een andere functie ten opzichte van elkaar hebben gekregen. Nog een manier van het ontstaan van nieuwe genen is door het mengen van genen, stukjes van gen A worden gemengd met stukjes van gen B en zo ontstaan er twee genen met een andere volgorde. Voorbeeld hiervan is het Tre2 gen, dit gen komt alleen voor in mensapen en mens en dit gen is een combinatie van twee genen die te vinden zijn in alle zoogdieren. Een andere manier is om via horizontal transfer genetische innovatie te krijgen. Bij horizontal transfer vindt er genoverdracht plaats vanuit het ene naar het andere organisme. Bacteriën kunnen ‘kaal’ DNA opnemen. Daarnaast is het ook mogelijk dat er overdracht van DNA-fragmenten plaats vindt via virussen of via plasmiden. Het doorgeven van genen aan een volgende generatie wordt ook wel vertical transfer genoemd. Bij onderzoek wordt er vaak gebruik gemaakt van de E.coli bacterie. Deze bacterie heeft een verdubbelingstijd van 20 minuten en het genoom bestaat uit 1 circulair chromosoom. Bij experimenten worden random mutaties aangebracht en vervolgens werd er gekeken wat het resultaat was. Dit heet ook wel forward genetics genoemd. Tegenwoordig wordt er vooral gebruik gemaakt van reverse genetics waarbij er eerst naar het genoom wordt gekeken en dan een gerichte mutatie toegepast. Gistcellen zijn eukaryoten die een verdubbelingstijd hebben van 1,5 uur. Gist kent een haploïde en een diploïde fase. Bij de haploïde fase is er van elke chromosoom maar één en in de diploïde fase zijn er van elk gen twee. Caenorhabditis elegans is een simpele worm die van bevruchte eicel naar volwassen dier 4 dagen zit. Ook deze worm wordt vaak in het laboratorium gebruikt. Deze worm heeft maar 40 cellen waarvan 2 zenuwcellen. Drosophila is een vliegsoort die ook vaak in het laboratorium gebruikt wordt. Deze vlieg heeft van bevruchte eicel 9 dagen nodig tot een volwassen vlieg. Zebravissen worden ook veel gebruikt, in deze vissen zijn makkelijk mutanten aan te maken omdat het embryo doorzichtig is en de individuele cellen goed te volgen zijn. Het duurt drie maanden om van een bevruchte eicel naar volwassen vis te gaan. Muizen hebben een groot genoom en hebben 80% homologe genen met de mens. De generatietijd van muizen is maar 10 weken. Vooral voor ziektemodellen worden deze dieren gebruikt. College 2 DNA staat voor desoxyribonucleïnezuur en RNA staat voor ribonucleïnezuur. Nucleotiden zijn opgebouwd uit suikers, organische basen en 1, 2 of 3 fosfaten. In de onderstaande figuur is dat te zien, bij RNA zit er aan de 2’ in plaats van een waterstofatoom een OH-groep. Aan de 5’ kant zitten de fosfaten en aan de 1’ kant zit de base. Er zijn 5 basen in totaal, namelijk adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil. Thymine komt alleen in DNA voor en uracil alleen in RNA. Uracil, thymine en cytosine hebben een pyrimidine vorm en adenine en guanine hebben een purine vorm. De base zit met een glycosideband aan de 1’ kant van de suiker. De fosfaatgroep zit met een esterband aan de 5’ kant van de suiker. Een suiker met een base is een nucleoside en een suiker met een base en een fosfaatgroep is een nucleotide. In de onderstaande tabel staan alle namen voor nucleosiden en nucleotiden. Desoxyuridine bestaat wel maar is een intermediair in de synthese van desoxythymidine. Base Nucleoside Nucleotide Afkorting nucleotide adenine adenosine (deoxy)adenosinemonofosfaat (d)AMP (deoxy)adenosinedifosfaat (d)ADP (deoxy)adenosinetrifosfaat (d)ATP guanine guanosine (deoxy)guanosinemonofosfaat (d)GMP (deoxy)guanosinedifosfaat (d)GDP (deoxy)guanosinetrifosfaat (d)GTP cytosine cytidine (deoxy)cytodinemonofosfaat (d)CMP (deoxy)cytodinedifosfaat (d)CDP (deoxy)cytodinetrifosfaat (d)CTP thymine thymidine deoxythymidinemonofosfaat dTMP deoxythymidinedifosfaat dTDP deoxythymidinetrifosfaat dTTP uracil uridine uridinemonofosfaat UMP uridinedifosfaat UDP uridinetrifosfaat UTP Wanneer een DNA keten wordt gemaakt wordt er een koppeling gemaakt tussen de 5’ kant en 3’ kant van twee nucleotiden. De ppi groep is een goede vertrekkende groep. De binding tussen de nucleotiden wordt de fosfodiesterband genoemd. De band waarmee de fosforgroepen aan elkaar zitten wordt de fosfoanhydrideband genoemd. Wanneer een DNA sequentie wordt uitgeschreven wordt dit gedaan van de 5’ kant naar de 3’ kant. DNA bestaat uit twee strengen en RNA uit één streng. De twee strengen in DNA zijn met elkaar verbonden door middel van waterstofbruggen. Hiervoor zijn NH- en OH-groepen uitermate voorgeschikt omdat ze een grote elektronegativiteit hebben. In DNA vormen purines waterstofbruggen met pyrimidines. Guanine vormt drie waterstofbruggen met cytosine en adenine vormt twee waterstofbruggen met thymine. Wanneer er een helix is met veel AT baseparing dan is de helix dus minder stabiel dan wanneer er veel GC baseparing is. De ene streng loopt anti-parallel ten opzichte van de andere. Dit betekend dus dat de ene streng van 5’ naar 3’ loopt de andere van 3’ naar 5’. Als je van één streng de sequentie weet, weet je door de vaste baseparing ook de sequentie van de andere streng, de strengen zijn dus complementair. De keten suikers en fosfaten waar de basen aanzitten wordt ook wel de backbone genoemd. De DNA strengen vormen samen een dubbele helix. De afstand tussen de basen is 0.34 nm en een DNA-helix heeft ongeveer 10 baseparen per turn. Deze strengen draaien rechtshandig om elkaar heen. Er zijn twee groeven in het DNA de minor groove en de major groove. De minor groove is een stuk smaller dan de major groove. Basen stapelen op de manier dat ze doen door hun orbitalen. Als ze loodrecht op elkaar zouden stapelen, dan zouden de elektronen elkaar teveel afstoten en dit is energetisch ongunstig. Aromatische systemen zijn wel energetisch gunstig als ze enigszins verschoven zijn en dit veroorzaakt de draaiing. De basen in een helix zitten dicht op elkaar gestapeld. De waterstofbruggen in de helix kunnen worden verbroken door enzymen. Daarnaast kunnen de waterstofbruggen ook verbroken worden door het verhogen van de temperatuur. Ook kan de pH verhoogt worden. Bij een hoge pH zijn namelijk veel OH —ionen aanwezig die competeren met de OH-groepen in het DNA. Het verbreken van de waterstofbruggen heet uitsmelten of denatureren. Deze strengen zitten dan los in de cel, maar kunnen ook weer aan elkaar binden en dit wordt ook wel hybridiseren of renatureren genoemd. Het complex tussen twee gehybridiseerde strengen wordt ook wel duplex genoemd. Om een gen te bekijken wordt er een oligonucleotide of primer gebruikt. Dit is een stukje DNA van 2 tot 50 nucleotide en hier kan een fluorescent molecuul aan gehangen worden. Deze methode wordt Fluorescent In Situ Hybridisation genoemd of FISH. College 3 Een helix heeft een bepaalde draaiing, baseparing moet regelmatig verbroken worden voor zaken als replicatie en transcriptie. Die windingen vormen een probleem voor het verbreken van de baseparing. Wanneer een enzym de helix gaat ontwinden vormen er aan de ene kant teveel windingen en aan de andere kant te weinig, op een gegeven moment komt het enzym niet meer door de streng heen. Het DNA vormt dan lussen in de helix en deze lussen worden supercoils genoemd. Supercoiling ontstaat doordat het DNA terug wil naar de ideale situatie waarbij er 10 baseparen per turn zitten. Er is twee soorten supercoiling: positieve supercoiling en negatieve supercoiling. Een positieve supercoil ontstaat bij teveel windingen en zorgt ervoor dat er een winding minder in het DNA komt en een negatieve supercoil ontstaat bij te weinig windingen. In het onderstaande plaatje is het verschil te zien tussen positieve (links) en negatieve (rechts) supercoiling. Supercoiling gebeurt alleen als de uiteinden gefixeerd zijn. Supercoiling gebeurd dus in plasmiden en in een circulair DNA, maar ook in lange DNA-strengen. Bij een paar miljoen baseparen is het DNA niet heel vrij, ook door interactie met allerlei eiwitten, dus er ontstaat ook supercoiling. Supercoiling zorgt voor erg veel druk op het DNA, dus er kunnen er niet te veel van inzitten. Bij de replicatie ontstaat er bijvoorbeeld veel supercoiling, zowel positief als negatief. Dit wordt eruit gehaald met behulp van topoisomerases. DNA topoisomeren zijn DNA helices die chemisch identiek zijn, maar topologisch verschillend, dus verschillen in het aantal windingen. Er zijn twee typen topoisomerase: topoisomerase I en topoisomerase II. Topoisomerase I maakt een breuk in één van de strengen van de DNA helix, vervolgens bindt de tyrosine in het enzym aan de fosforgroep aan de 5’ kant. Het enzym verandert vervolgens van conformatie waardoor de ongebroken streng door het gat van de gebroken streng kan. De fosfaatgroep bindt weer aan de OH-groep aan de 3’ kant en de streng is weer compleet en er is een winding meer of minder in de helix. De reactie die topomerase I katalyseert heet een transesterificatiereactie. Dit proces is hieronder afgebeeld. Topoisomerase I kan geen supercoiling inbrengen, alleen maar supercoiling weghalen. Omdat het DNA van nature naar de 10 windingen per turn wil, heeft topoisomerase I geen energiebron nodig. Topoisomerase I zorgt er alleen maar voor dat het weghalen van supercoiling gereguleerd gaat. Topoisomerase II kan naast supercoiling weghalen ook supercoiling inbrengen. Dit kost echter ATP. Als het DNA een supercoil vormt dan kruist het DNA over zichzelf heen. Topoisomerase II zoekt een kruising op bij een supercoil. Hij maakt vervolgens twee breuken in één van de twee dubbele helices bij die kruising en haalt vervolgens de ongebroken dubbele helix erdoorheen. Hierdoor worden twee supercoils weggehaald of juist toegevoegd. Topoisomerase II is een dimeer. Dit is een eiwit dat uit twee subunits bestaat die identiek zijn aan elkaar. Ook topoisomerase II maakt gebruik van tyrosines voor het katalyseren van deze reactie (zie onderstaande afbeelding). Topoisomerase II gebruikt 2 ATP moleculen voor de katalyse. Een andere functie van topoisomerase II is om twee in elkaar gehaakte circulair DNA moleculen uit elkaar te halen. Supercoiling kan erg nuttig zijn in de cel. Chromosomaal DNA is heel lang en het wordt compact gemaakt door supercoiling. Als al het DNA relaxed zou zijn zou het namelijk niet in de cel passen. Er wordt eigenlijk alleen maar negatieve supercoiling in de cel gebruikt. Dit komt omdat bij positieve supercoiling het DNA te strak wordt opgewonden en dan kunnen enzymen minder goed hun werk doen. Bij negatieve supercoiling is het DNA al een beetje open en dan kunnen enzymen er juist makkelijker bij. Het karyotype is de globale verdeling van GC-baseparen en AT-baseparen op de chromosomen. Donkere strepen op de chromosomen zijn AT rijke gebieden en lichte strepen op de chromosomen zijn GC rijke gebieden. Met chromatine painting kunnen individuele chromosomen gekleurd worden. Dan kan bijvoorbeeld ook heel makkelijk gezien worden wat kankercellen zijn aangezien deze dan uit verschillende kleuren bestaan door het verkeerd aan elkaar plakken van chromosomen. De algemene trend is dat hoe meer DNA een organisme heeft, hoe complexer hij is. Dit is enigszins waar, echter complexe eukaryoten hebben heel veel DNA wat nergens voor codeert. Ongeveer 25% van het menselijk DNA bestaat uit genen. Van heel het DNA is echter maar 1.5% coderend voor een eiwit. Dit komt omdat onze genen voor een groot gedeelte uit intronen bestaan. Bij bacteriën codeert elk gen voor een eiwit, maar bij eukaryoten is dat niet zo. Het RNA dat wordt getranscribeerd van de genen kan wel uit 100.000 nucleotiden bestaan. Hiertussen zitten stukjes van ongeveer 150 nucleotiden die exons worden genoemd en deze exons zijn coderend. De overige gebieden zijn intronen en coderen nergens voor. Door middel van RNA splicing worden de intronen uit het RNA geknipt. De functie van de exons is nog niet helemaal bekend. Het menselijk DNA bestaat uit ongeveer 3.2 miljard bp en kan opgedeeld worden in twee grote delen, namelijk unieke sequenties, waar de genen onder vallen, en repeated sequenties die vooral uit LiNEs en SiNEs bestaan. Dit zijn zogenaamde repeats, herhalingen van een bepaalde sequenties. De LiNEs zijn ongeveer 5000 bp lang en de SiNEs ongeveer 400 bp. De LiNEs en SiNEs vallen onder de transposons en deze kunnen zich naar overal in het DNA verplaatsten met behulp van een enzym dat transposase heet. Ze zijn echter op het moment sporadisch actief. We hebben ook in ons DNA retrovirale elementen. Dit zijn bekende restanten van retrovirussen. Een retrovirus is een virus wat RNA als genoom heeft en dit kan kopiëren naar DNA door middel van reverse transcription. College 4 Bij prokaryoten is supercoiling vaak genoeg om al het DNA compact genoeg te krijgen. Bij eukaryoten is dit echter niet het geval en zijn er ook nog allerlei eiwitten nodig om het DNA compact genoeg te krijgen. Het met eiwit bezette DNA heet chromatine. De eiwitten die het DNA bezetten  heten histonen. Dit zijn kleine eiwitten (100 tot 136 aminozuren) die veel lysine en arginine bevatten waardoor het eiwit positief geladen is. Er zijn vier histoneiwitten en dat zijn H2A, H2B, H3 en H4, deze komen alle vier, twee keer voor in een histon. DNA heeft een negatieve lading en slaat zich heen om het histon. Het histon met het DNA eromheen heet een nucleosoom. Een eiwit heeft een C-terminus en een N- terminus. Aan het uiteinde van de ‘staarten’ zitten de N- termina van de histoneiwitten. De positieve lading bindt aan de negatieve lading van de fosfaatgroepen. Het DNA zit linksom om de histonen heen gedraaid en past er twee keer omheen. Wanneer de histonen worden weggehaald blijft er negatieve supercoiling achter. Om nucleosomen te vormen ontstaat er positieve supercoiling, die eruit moet gehaald worden door topoisomerase. Er passen 147 baseparen om het nucleosoom heen en dan zitten er ongeveer 50 baseparen tot eht volgende nucleosoom. Dit stuk DNA wordt het linker-DNA genoemd. De plekken waar veel G-C baseparing is zit vaak in de minor groove die naar buiten staat en AA, TT, en TA dinucleotiden zitten vaak in de minor groove die tegen het nucleosoom aan zit. Dit komt door de draaiing waardoor aan de binnenkant de minor groove een beetje wordt samengeperst en aan de buitenkant wordt uitgerekt. Over het algemeen is het wel random wat er aan de binnenkant zit en wat aan de buitenkant, maar er is wel voorkeur. Met nucleosomen is het DNA 3 keer korter dan zonder. DNA moet echter nog compacter worden dan dat. In werkelijkheid zitten nucleosomen ook dicht op elkaar gepakt. Het histoneiwit H1, ook wel het linkerhiston genoemd, bindt aan het linker-DNA zodat de hoek kleiner wordt met de nucleosoom en de nucleosomen dus dichter bij elkaar komen te liggen. Een andere manier is dat de positief geladen N-staarten van de histonen binden aan zowel DNA als aan histoneiwitten op andere plaatsen in het DNA. Dit vormt het 30 nm fiber en het DNA wordt daarmee 10 keer verkleint. Er zijn nog meer ordes van compactie. Het is echter niet goed genoeg onderzocht om daar een definitieve theorie aan vast te hangen. Voor nu wordt echter aangenomen dat de 30 nm fiber een helix achtige vorm krijgt en dat daar weer grote supercoiling in komt en vervolgens dat weer opdraait tot een superhelix waarbij uiteindelijk de chromatide wordt gevormd. Tijdens de celdeling is het DNA ongeveer 10000x gecompacteerd en na de celdeling ongeveer 1000x gecompacteerd. Er zijn twee soorten compactie bij chromatine, namelijk euchromatine en heterochromatine. Bij euchromatine zit het chromatine niet compact op elkaar en kunnen dus makkelijker getranscribeerd worden. Deze genen komen dus veel tot expressie. Bij heterochromatine zit het chromatine heel erg dicht op elkaar en er kan dus geen transcriptie plaatsvinden en de genen komen dus niet tot expressie. Mannen hebben een X-chromosoom en een Y-chromosoom en vrouwen hebben twee X-chromosomen. Om te voorkomen dat een vrouw twee keer zoveel eiwitten produceert heeft het lichaam ervoor gezorgd dat één van die X-chromosomen volledig is ingepakt in heterochromatine. Dit is zo dicht dat het ook tijdens de interfase zichtbaar is onder de microscoop. College 5 Soms moeten genen die om een histon zitten tot expressie kunnen komen. In de cel zijn zogenaamde chromatine structure remodeling (RSC) complexen aanwezig en deze complexen binden aan een chromatine en vervolgens draaien ze, met behulp van ATP, het chromatine met het DNA, waardoor bepaalde delen van het DNA vrij te komen liggen. Een andere manier om genen op het chromatine tot expressie te laten komen is door een subunit met, behulp van een histonchaperone en ATP, uit het histon te halen en vervolgens een nieuwe te plaatsen waardoor uiteindelijk het DNA een stukje verschoven is. Je kan ook een heel histon vervangen en dan komt er een ander nucleosoom op een andere plek en het DNA is verschoven (zie afbeelding hiernaast). Histonen kunnen vervangen worden door histonvarianten. Histonvarianten zijn histoneiwitten met net een andere structuur en als deze geplaatst worden dan kunnen genen hierdoor meer of juist minder tot expressie komen. Een andere manier om histonen te veranderen is om ze te modificeren. Modificatie is gericht op 1 aminozuur en deze wordt gemodificeerd. Aan de lysines in de histonstaarten kan een acetyl-groep worden gezet aan de aminogroep. Dit heet acetylering en hierdoor ontstaat een acetyl lysine en deze is ongeladen. De histonstaartjes zijn betrokken bij het compact houden van het DNA dus zodra de aminogroep zijn lading verliest wordt de structuur losser. Aan lysine kan ook een, twee of drie methyl groepen worden gezet, wat methylering heet. Aan serine kan een fosfaatgroep gezet worden, wat fosforylering heet. Er zijn nog meer soorten modificaties die kunnen plaatsvinden aan de histonstaarten. De modificaties vormen een bepaalde volgorde en deze volgorde heet ook wel de histoncode of epigenetische code. Van veel van deze codes is nog niet bekend wat ze precies doen, wel is er bekend dat de code belangrijk is, aangezien het bepaald welke genen tot expressie kunnen komen en welke niet. Een bepaalde combinatie van histon modificaties kan herkend worden door een reader complex. Als dit eiwit kan binden aan de juiste modificaties, kan hij een ander eiwit binden die een bepaalde functie gaat uitvoeren, bijvoorbeeld om meer genexpressie te krijgen. Er is ook een eiwit dat modificaties kan aanbrengen, namelijk het writer complex. Zodra dit writer complex een modificatie heeft aangebracht dan bindt er een reader complex aan de modificatie waar vervolgens weer een writer complex aan bindt en wordt er een modificatie aangebracht op een naburig nucleosoom. Op die manier wordt de code verspreid over een heel stuk DNA met behulp van de reader-writer complexen. Om te voorkomen dat de modificatie over het hele chromosoom wordt verspreid, zijn er zogenaamde barrier proteins die een begrenzing vormen om het reader-writer complex tegen te gaan. De epigenetische code moet ook worden doorgegeven aan dochtercellen. DNA replicatie is het maken van een exacte kopie van het DNA. Er zijn echter een aantal problemen bij replicatie. Het is gevaarlijk om alleen enkelstrengs DNA (ssDNA) te hebben want dat loopt makkelijk breuken op, doordat de fosfodiesterband tussen nucleotiden met water kan reageren. Daarnaast kost het aanzetten van nucleotiden energie. De energie voor het aanzetten van nucleotiden wordt geleverd door dNTP (zie college 2) en het enzym DNA polymerase reguleert de replicatie. DNA polymerase zorgt ervoor dat de 3’ OH-groep wordt gekoppeld aan de fosfaatgroep. Pyrofosfaat PPi is een goede vertrekkende groep, dit betekend dat het een energiegunstige reactie is, en dit levert de energie voor de koppeling (zie onderstaande figuur). DNA polymerase heeft een 5’ →3’ polymerase activiteit. Op de template streng, dit is de streng die gekopieerd wordt, wordt een klein beginstukje gezet voor DNA om te beginnen, dit heet een primer, een vervolgens gaat DNA polymerase van af de 3’ kant van de primer verder met het aanzetten van nucleotiden en als je dan naar de beweegrichting kijkt dan gaat dit dus van de 5’ kant naar de 3’ kant van het DNA. Om te voorkomen dat er enkelstrengs DNA ontstaat, wordt er direct na het openbreken van het DNA, direct een nieuwe streng tegenaan te synthetiseren. Het polymerase kan alleen van 5’ naar 3’ synthetiseren. De ene streng kan van 5’ naar 3’ gesynthetiseerd worden dus dat is geen probleem, maar de andere streng zou van 3’ naar 5’ gesynthetiseerd moeten worden en er bestaat geen polymerase die op die manier werkt. Er ontstaat hierbij een zogenaamde replicatievork (zie onderstaande afbeelding). De streng die van 5’ naar 3’ gesynthetiseerd wordt kan gewoon continu gerepliceerd worden en deze streng heet de leading strand. De andere streng moet in stukjes van 5’ naar 3’ gesynthetiseerd worden en deze streng heet de lagging strand. De brokstukjes DNA worden ook wel okazaki fragmenten genoemd. Leading strand synthese gaat altijd sneller dan lagging strand synthese. Elke seconde wordt er een okazaki fragment gemaakt. DNA polymerase repliceert bij prokaryoten met een snelheid van 1000 nucleotiden per seconde. Bij eukaryoten gaat dit slechts met een snelheid van 100 nucleotiden per seconde. De okazaki fragmenten bij prokaryoten zijn 1000 nucleotiden lang bij prokaryoten en 100 bij eukaryoten. De reden dat de snelheid bij eukaryoten zoveel lager ligt dan bij prokaryoten, is omdat de nucleosomen moeten worden uitgepakt voordat ze kunnen worden gerepliceerd. DNA polymerase probeert random verschillende nucleotide totdat er een passende is gevonden. De polymerase heeft een active site en als twee nucleotiden hier tegenover elkaar inpassen dan is het de correcte. Door de hoge snelheid gaat dit ongeveer 1 op de 105 nucleotiden fout en deze worden verkeerd geplaatst. Om fouten te corrigeren is er bij de replicatie zogenaamde proofreading. Wanneer er een verkeerd basepaar wordt gemaakt, ook wel een mismatch genoemd, dan is er geen stabiele baseparing en goede structuur. Hierdoor hapert DNA polymerase en dan wordt de exonuclease activiteit van DNA polymeras geactiveerd. Door de verkeerde structuur kan de nieuw gevormde streng naar de editing site van het DNA polymerase en deze knipt het verkeerde nucleotide uit het DNA (zie onderstaande afbeelding). In de cel zijn er allerlei enzymen die in staat zijn om DNA en RNA af te breken, die nucleases worden genoemd. De hoofdgroepen zijn DNase, die verantwoordelijk is voor de afbraak van DNA, en RNase, die verantwoordelijk is voor de afbraak van RNA. Er zijn nucleases die een stuk DNA of RNA in het midden van de streng kunnen knippen, deze enzymen heten endonucleases. Er zijn ook nucleases die aan de uiteindes van een stuk DNA of RNA knippen. Deze enzymen heten exonucleases. Als een exonuclease van de 3’ naar de 5’ knipt dan is het een 3’ → 5’ exonuclease en als het van de 5’ naar de 3’ knipt dan is het een 5’→ 3’ exonuclease. DNA polymerase heeft een 3’ → 5’ exonuclease activiteit. College 6 DNA polymerases kunnen niet zomaar ergens beginnen met synthetiseren. Een enzym dat dit wel kan is RNA polymerase. RNA polymerase plaatst ongeveer één helixwinding (~10 nucleotiden) op de template streng en dan is dat stukje stabiel genoeg om aan het DNA te blijven plakken. Deze kleine stukjes RNA op de template streng worden ook wel primers genoemd. Dit type RNA polymerase wordt ook wel primase genoemd. Op de leading strand wordt maar één primer gezet, omdat DNA polymerase vanaf dat punt continu kan synthetiseren, op de lagging strand moet er echter elk okazaki fragment een nieuwe primer opgezet worden. DNA polymerase synthetiseert vervolgens tot de vorige primer en stopt dan. Het stukje primer moet worden afgebroken en dit wordt door een RNase gedaan. Er ontstaat dan een gat en deze gaten worden opgevuld door DNA polymerase. Dit is niet hetzelfde polymerase als degene die de replicatie uitvoert. Nu zijn alle nucleotiden in plaatst, maar de laatste fosfodiesterband is nog niet gemaakt. Er is een enzym nodig die dat aan elkaar plakt en dit enzym heet DNA ligase. Voor het vormen van de fosfodiesterband gebruikt ligase ATP en zet dit om in AMP en PPi. De AMP wordt gekoppeld aan de fosforgroep aan de 5’ kant van de breuk en hierdoor is nucleofiele aanval van OH- groep aan de fosfaatgroep mogelijk en is de breuk gemaakt (zie figuur hiernaast). DNA polymerase is in staat om baseparen te verbreken, echter dit gaat veel te langzaam. Er is een extra enzym nodig om de baseparing te verbreken en dit enzym heet DNA helicase. Helicase zit als een ring om één van de twee strengen. Deze helicase beweegt van 5’ naar 3’, er zijn echter ook helicases die de andere kant op bewegen. Helicase zit dus aan de lagging strand. Helicase gebruikt voor de beweging ATP hydrolyse. Er zijn bij een eiwit drie conformaties, ongebonden, ATP-gebonden en ADP-gebonden. Door deze conformationele veranderingen kan een eiwit bewegen. Helicase heeft zes gelijke subunits waarbij twee ATP gebonden hebben, twee ADP gebonden hebben en twee leeg zijn. Dit draait cyclisch door waardoor de helicase over het DNA heen spint met dezelfde  snelheid als polymerase (zie figuur hiernaast). Dit kost erg veel ATP. Er ontstaat door de helicase veel supercoiling die eruit moet worden gehaald met behulp van topoisomerase. Tijdens het repliceren ontstaat er op de lagging strand een stukje ssDNA. Enkelstrengs DNA is niet alleen gevaarlijk omdat het makkelijk breuken oploopt, daarnaast wil het ook graag baseparen vormen. Dus er ontstaat baseparing met naburige nucleotiden in dezelfde streng, en er ontstaan dus een soort lussen in het ssDNA. Deze worden ook wel hairpins genoemd. Er is een eiwit bij betrokken om het ssDNA enkelstrengs te houden. Dit eiwit heet het single strand binding protein (SSB). Dit eiwit zit vrij los op het DNA, dus zodra DNA polymerase er tegenaan tikt, laat het SSB meteen los (zie onderstaande figuur). DNA polymerase moet snel over het DNA kunnen bewegen en zit daarom heel zwak aan het DNA. Het risico hierbij is wel dat het polymerase er snel vanaf kan vallen. De oplossing hiervoor is een zogenaamde sliding clamp. Dit is een ringvormig eiwit dat om het DNA gebonden zit en aan dit eiwit bindt het DNA polymerase. De sliding clamp zit niet aan het DNA vast, maar door de ringvormige structuur blijft het om de streng heen hangen. Hierdoor kan de clamp makkelijk meebewegen met het DNA polymerase. Om een sliding clamp op het DNA te zetten wordt er gebruik gemaakt van een clamp loader. Dit enzym bindt door middel van ATP hydrolyse aan de clamp en maakt deze open. Vervolgens wordt de clamp om het DNA gezet en de clamp loader laat los. DNA polymerase kan dan binden en de clamp loader kan weer hergebruikt worden (zie onderstaande figuur). De clamp zit om dubbelstrengs DNA heen en wordt dus achter DNA polymerase op het DNA gezet. Bij eukaryoten bestaat de sliding clamp uit drie subunits, bij prokaryoten uit twee. Deze subunits zijn echter niet homoloog en hebben in de evolutie een verschillende voorouder. Uit het verhaal lijkt het alsof de DNA polymerase op de lagging strand weg synthetiseert van de leading strand, echter in realiteit zitten alle enzymen en eiwitten in één groot complex (zie onderstaande figuur) College 7 Bij de replicatie worden fouten gemaakt en om deze op te lossen wordt er gebruik gemaakt van proofreading die de fouten beperkt tot 1 op de 10 miljoen. In het genoom zouden er dan echter nog best vaak mutaties optreden, daarom is er nog een systeem om fouten op te vangen, namelijk mismatch repair (MMR). Het is belangrijk dat de template streng en de nieuwgevormde streng goed van elkaar worden onderscheiden. Bacteriën hebben een systeem om verkeerde baseparen te repareren, waarbij ze gebruik maken van DAM methylase. DAM methylase herkent een specifieke sequentie, namelijk 5’ GATC 3’, en zet aan de adenosine een methylgroep. De methylgroep heeft geen effect op de baseparing. De sequentie 5’ GATC 3’ is een palindroom, wat inhoudt dat de complementaire sequentie precies dezelfde volgorde heeft, in dit geval 3’ CTAG 5’. Het enzym doet dit bij alle deze sequenties. Bij een zojuist gesynthetiseerde streng zijn deze methylgroepen nog niet aangebracht. Op deze manier kan de bacterie dus onderscheid maken tussen de oude en nieuwe streng. Om foute baseparing te repareren, maakt de bacterie gebruik van zogenaamde mutators. Dit zijn enzymen die mutaties in het DNA aan kunnen brengen. Er zijn drie enzymen die van belang zijn bij mismatch repair, namelijk MutS, MutH en MutL. MutS is het eiwit dat de schade herkent en hieraan bindt, MutH is een endonuclease dat bindt aan de methylgroep en een breuk aanbrengt in de ongemethyleerde streng en MutL is het eiwit die de twee eiwitten met elkaar verbind en zo duidelijk is welke streng de ongemethyleerde streng is. MutH knipt pas als MutL gebonden heeft. Vervolgens verwijdert een exonuclease de nucleotiden van de gemethyleerde groep tot aan het foute basepaar. Dit kan zowel een 3’ naar 5’ exonuclease zijn als een 5’ naar 3’ exonuclease. Hierdoor ontstaat er een gat dat opgevuld wordt door DNA-polymerase en uiteindelijk worden de uiteindes weer aan elkaar geplakt door een ligase (zie figuur linksonder vorige pagina). Bij mensen is er ook mismatch repair. Mensen hebben alleen MutS en MutL tot hun beschikking. Dit komt omdat mensen geen DAM methylase aanmaken en MutH dus geen nut heeft. MutS bindt zich net als bij bacteriën aan de fout en MutL aan MutS. In plaats van aan MutH, bindt Mutl aan een zogenaamde NICK. Een NICK is een enkelstrengs breuk in dsDNA en dit is de benaming voor de breuken tussen de okazaki fragmenten op de lagging strand. Door te binden aan een NICK is precies bekend welke streng de gesynthetiseerde streng is (zie figuur hiernaast). De leading strand is continu en er is nog niet precies bekend hoe de gesynthetiseerde streng wordt herkend. DNA replicatie wordt gestart op vaste plekken op het chromosoom en deze plekken worden origin of replication (ori) genoemd. De ori is een bepaalde sequentie op het DNA waar eiwitten moeten binden. Het eerste dat hier moet gebeuren is dat de helix moet worden open gemaakt. Vervolgens wordt er op beide strengen een helicase gezet. Dit wordt gedaan met een zogenaamde helicase loader. Dit enzym is een vergelijkbaar enzym als de clamp loader en gebruikt ook ATP om helicase op de streng te zetten. De derde stap is het zetten van een primase op het DNA, die vervolgens de primer synthetiseert op de streng. Wanneer de primer is gemaakt kan er een sliding clamp op het DNA worden geladen met behulp van een clamp loader en hier kan uiteindelijk het DNA polymerase aan binden. Al deze stappen worden bij beide strengen uitgevoerd en er ontstaan twee replicatievorken die vanuit de ori vertrekken. De leading strand synthese van beide vorken gaan als eerste repliceren. Vervolgens switchen de primases naar de andere vork en zetten vanaf dat punt de primers op het DNA van de lagging strand synthese (zie afbeelding hiernaast). De initiatie van de replicatie bij bacteriën gebeurt door een initiatie eiwit dat een AT-rijke sequentie herkent en hieraan bindt. Het DNA wordt rechtsom om het eiwit heen gedraaid waardoor er positieve supercoiling ontstaat en bij het AT-rijk gebied ernaast komt er een winding minder en die wordt dus wat meer opengedraaid. Vervolgens is er ruimte genoeg voor helicase en primase om te binden aan het DNA (zie onderstaande afbeelding). In theorie zouden bacteriën opnieuw kunnen beginnen met de replicatie zodra de replicatie eiwitten zijn vertrokken uit de origin. Er is daarom regulatie nodig om te voorkomen dit niet continu gebeurt. Deze regulatie gebeurt door methylering. Net gesynthetiseerde strengen zijn namelijk nog niet gemethyleerd. De origin is op dat moment dus hemigemethyleerd. Pas als beide strengen gemethyleerd zijn is het mogelijk voor de bacterie om de replicatie opnieuw te starten. Bij E.coli is het mogelijk om ongeveer nadat de helft van het DNA gerepliceerd is om opnieuw te starten met de replicatie. Er wordt niet gewacht totdat het DNA volledig gerepliceerd is en verdeelt over twee cellen, omdat bacteriën graag heel snel willen repliceren. In 38 minuten is het DNA volledig gerepliceerd, E.coli doet er door het vroeg starten van de tweede replicatieronde slechts 20 minuten over om te delen. De replicatie bij bacteriën stopt wanneer de replicatievorken elkaar tegenkomen. De helicases worden van het DNA afgehaald en de polymerases moeten op eigen kracht door het DNA heen en volgen de helix. Hierdoor ontstaat er een kluwen van DNA strengen en deze worden uit elkaar gehaald door topoisomerase II (zie afbeelding hiernaast). Het eindpunt is wanneer het DNA polymerase van de leadingstrand synthese een okazaki-fragment tegenkomt. DNA polymerase stopt met synthetiseren en het stukje primer voor het okazaki-fragment wordt Topo II weggehaald en opgevuld door een DNA polymerase en vervolgens worden de strengen weer aan elkaar geplakt door ligase. Het DNA is dan volledig gerepliceerd. Eukaryoten zijn niet continu aan het repliceren. Er is een gereguleerde celcyclus in de eukaryote cel. Deze is opgedeeld in een aantal fases. De mitose-fase (M-fase) is de fase waarbij de daadwerkelijke celdeling plaatsvindt, de gap1-fase (G1-fase) is een gat waarin geen replicatie-activiteit plaatsvindt,  de synthese-fase (S-fase) is waar het DNA wordt gesynthetiseerd en de gap2-fase (G2-fase) is een gat waarin wordt gecontroleerd of de replicatie goed verlopen is voordat de daadwerkelijke celdeling plaats vindt (zie afbeelding hiernaast). De duur van de fases verschilt heel erg per type cel. Bij de mens delen de meeste cellen nauwelijks meer en zitten dus constant in de G1-fase. Eukaryoten hebben veel meer DNA dan prokaryoten, en daarom hebben eukaryoten meerdere origins of replication. Met maar 1 origin zou het langste chromosoom bij de mens er namelijk 11,5 dag erover doen om te repliceren. De origins worden niet allemaal tegelijk geactiveerd, maar worden op verschillende tijden in de S-fases geactiveerd. Dit komt doordat sommige origins in euchromatine zitten en dus minder uitgepakt hoeven te worden dan origins in heterochromatine. Het initiatieproces is vergelijkbaar als bij de bacteriële initiatie, echter er zijn een paar verschillen. Bij eukaryoten zitten er al eiwitten gebonden aan de origin tijdens de G1-fase. Het complex wat hier aan gebonden zit heet het origin recognition complex (ORC) en hier wordt ook al een helicase aan gezet. Aan het begin van de S-fase worden zowel het ORC als de helicase gefosforyleerd en dit is het signaal voor de helicase om actief te worden en voor het ORC juist om inactief te worden. Doordat het ORC inactief wordt kan er niet opnieuw replicatie gestart worden voordat de celdeling compleet is (zie onderstaande afbeelding). Een ander verschil met bacteriën is dat het DNA zit ingepakt in histonen, echter deze worden automatisch van het DNA afgedraaid. Voor de replicatievork ontstaat er namelijk positieve supercoiling en het DNA zit om de histonen negatief gesupercoiled. Sommige van de histonen blijven plakken aan het DNA. In de dochterstrengen worden de histonen weer op het DNA gezet, er zijn dus twee keer zoveel histonen nodig. De histonen die gebonden blijven worden random verdeelt over de twee strengen. Ze worden dan gebruikt als bouwstenen samen met nieuw gesynthetiseerde histoneiwitten om de nieuw gesynthetiseerde strengen in te pakken in nucleosomen. De histoncode wordt verdeelt over de twee dochternucleosomen en na de replicatie komt er een reader-writer complex en die brengt de code aan op alle nucleosomen die deze nog niet hebben. Zo wordt de histoncode doorgegeven aan dochtercellen. College 8 Organismen met een lineair chromosoom hebben een probleem. Deze organismen hebben wel meerdere origins, maar er is er altijd wel één die er bij een uiteinde zit. De leading strand synthese is geen probleem bij een lineair chromosoom, echter bij de lagging strand synthese moeten er primers neergezet, echter als de leading strand synthese aangekomen is bij het einde valt het helicase met alle eiwitten van het DNA af, maar er moet nog een stuk van de lagging strand gesynthetiseerd worden. Er is dus altijd een stukje DNA op de lagging strand dat niet kan worden gekopieerd. Het DNA wordt dus elke keer als het gerepliceerd wordt een paar honderd nucleotiden korter. Op een gegeven moment zouden stukken DNA die essentieel zijn voor het overleven van de cel kunnen wegvallen en dit leidt tot celdood. Wat er wordt gedaan om het probleem op te lossen is om het DNA aan de 3’ kant een stukje langer te maken. Hierdoor kan er een extra primer tegenaan gezet worden en toch al het DNA worden gerepliceerd. Deze stukjes DNA worden telomeren genoemd. De telomeren bestaan uit heel veel herhalingen (>1000) van dezelfde korte sequentie, genaamd repeats (bij mensen GGGTTA), en codeert nergens voor. De telomeren worden door een enzym genaamd telomerase op het DNA geplakt. Telomerase is een 5’ → 3’ polymerase dat een RNA-molecuul ingebouwd heeft in zijn structuur en dit gebruikt hij als template. Dit enzym valt onder de reverse transciptases, wat enzymen zijn die RNA als template gebruiken en DNA synthetiseren (zie afbeelding hieronder). Telomerase gebruikt dNTP’s voor het synthetiseren van de streng. Er is een verband tussen celdeling en de activiteit van telomerase. Telomerase is veel actiever in cellen die constant aan het delen zijn dan in cellen die niet of nauwelijks meer delen. Telomerase bepaald ook op deze manier hoeveel een cel kan blijven delen. Dit doen ze door inactief te worden naar een aantal delingen en op die manier kunnen er geen nieuwe delingen meer gemaakt worden. Deze regulatie is nodig, want oneindig delende cellen leveren tumoren op. Bij veel tumoren is telomerase ook erg actief. Het uiteinde van de DNA is een stukje ssDNA, hier kunnen gemakkelijk exonucleases aan vreten en dit uiteinde weghalen. Om te voorkomen dat dit gebeurt, wordt het uiteinde teruggevouwen in zijn eigen structuur. Doordat dezelfde sequentie de hele tijd herhaalt wordt kan het stuk ssDNA gemakkelijk baseparen met een stuk DNA in de helix. Er ontstaat een klein stuk ssDNA, maar het heeft geen vrij uiteinde, dus is beter beschermt dan het losse uiteinde. De lus die dan ontstaat wordt een t-loop genoemd (zie afbeelding hiernaast). De t- loop is ook een manier van regulatie, want naast de exonucleases kan ook telomerase niet meer bij het uiteinde. Uit onderzoek blijkt dat een cel in staat is om zijn telomeren te ‘meten’, hoe hij dit precies doet is nog niet bekend. In het DNA kan er allerlei schade (lesions) ontstaan. Dit betekent niet meteen dat er een mutatie ontstaat, dit is pas wanneer de schade zorgt voor een andere base in een nieuw gevormde streng. Er zijn allerlei zaken die schade kunnen veroorzaken. Allereerst kan water een veroorzaker zijn van schade. Water kan reageren met een fosfodiesterband en deze verbreken. Wat ook met water kan reageren is de glycosideband. Hierdoor valt de base van de suiker af en dan zit er in het DNA een plaats waar geen base zit. Dit wordt ook wel een apurinic site of apyrimidimic site (AP-site). Bij purines gebeurt dit makkelijker dan bij pyrimidines. Per dag vallen er 18000 purines per cel per dag af en 600 pyrimidines per cel per dag. Wat ook nog met water kan reageren is de aminogroep van cytosine. Dit wordt deaminatie genoemd. Op de plek van de aminogroep komt er een zuurstof. De base is dan een uracil geworden en dit hoort niet in het DNA thuis. Uracil kan baseparen met een A, en bij de replicatie komt er bij de helft van de strengen een AU basepaar, terwijl er een GC basepaar hoort te zitten. Dit wordt een transitie mutatie genoemd. Deaminatie kan ook voorkomen bij adenine en guanine. Adenine wordt hypoxanthine en guanine wordt xanthine. Hypoxanthine heeft als eigenschap dat het met zowel een T als een C als een A baseparen kan vormen. Er zijn nog meer reacties die plaats kunnen vinden naast de hydrolysereacties. Ook methylgroepen kunnen reageren met basen door methylering en dit gebeurt 6000 keer per cel per dag. Een ander heel reactieve stof die in de cel kan voorkomen zijn zuurstofradicalen. Dit zijn zuurstofatomen die nog een ongepaard valentie-elektron hebben en dus heel makkelijk bindingen kunnen aangaan met andere stoffen en dit gebeurt 1500 keer per cel per dag. Op de afbeelding hieronder staat waar allemaal in het DNA deze reacties kunnen optreden. Deaminatie en alkylering kan ook nog door allerlei andere chemische verbindingen in de cel gebeuren. Cis-platina is een anti-tumor medicijn dat crosslinks in het DNA kan vormen tussen twee guanine basen. Door deze extra verbinding kan de helix op die plaats niet meer open. Een tumorcel repliceert heel veel en zodra DNA polymerase tegen zo’n crosslink aanbotst kan hij niet meer verder repliceren en gaat de cel dus dood. Helaas tast dit medicijn wel heel veel goede replicerende cellen zoals haarcellen.  UV-licht kan ook schade in het DNA veroorzaken. Door de energie kunnen twee thymines aan elkaar gebonden worden in een covalente binden. Hierdoor verandert de structuur van het DNA dusdanig dat de base onleesbaar wordt voor DNA polymerase. Het heeft ook een effect op supercoiling doordat er meer basen per winding zitten (zie afbeelding hiernaast). College 9 Wanneer een AP-site niet wordt gerepareerd dan kan dit leiden tot deletie van een basepaar, dus dat er één basepaar verdwijnt. Wanneer er één bij komt dan wordt er gesproken van een insertie. In de meeste gevallen slaat een DNA polymerase een nucleotide zonder base gewoon over. Bij deaminatie is er sprake van een transitie. Eerst was er een GC basepaar en na de deaminatie heeft een gedeelte een AU basepaar. Bij de deaminatie van adenine ontstaat er hypoxanthine en deze kan binden met zowel een C, een T als een A. Als hypoxanthine met een C een basepaar vormt, dan ontstaat er na de replicatie een GC basepaar. Als hypoxanthine met een A een basepaar vormt ontstaat er een TA basepaar, dit heet een transversie. Wat dit inhoudt is dat de baseparing wel hetzelfde is, maar de basen hebben van plaats gewisseld. De meeste mutaties zijn transities, want hypoxanthine baseparing met A verloopt slecht (zie onderstaande afbeeldingen). Om te voorkomen dat mutaties ontstaan in het DNA zijn er allerlei mechanismen om schade in het DNA te repareren. Op AP-sites te repareren zijn er enzymen die AP-sites kunnen herkennen. Zodra zo’n enzym heeft gebonden aan een AP-site, dan verbreekt het enzym één van de twee fosfodiesterbanden. Het enzym heet daarom een AP-endonuclease. De tweede stap is een enzym dat fosfodiesterase heet en die knipt de andere fosfodiesterband. De suiker zonder base valt uit het DNA en er ontstaat een gat. Vervolgens komt een DNA polymerase om een nieuwe nucleotide in te bouwen. Hiervoor gebruikt het enzym dNTP. Als laatst komt er een DNA ligase die ATP gebruikt om de fosfodiesterband weer te dichten. Wanneer er door deaminatie een uracil in het DNA belandt, dan ontstaat er een mismatch, want er staat een U tegenover een G en deze vormen geen goede baseparing. Een enzym genaamd uracilglycosylase spoort het uracil op en verbreekt de glycosideband en de base valt eruit. Er ontstaat een AP-site en deze wordt behandelt zoals elke andere AP-site. Uracil DNA glycosylase heeft een pocket waar uracil heel goed inpast en waterstofbruggen vormt met asparagine. Cytosine past niet omdat de aminogroep botst met die van asparagine en thymine is te groot voor de pocket (zie afbeelding hiernaast). Het loskoppelen van een uracil met uracilglycosylase is een onderdeel van Base Excision Repair (BER). Voor veel soorten schade is er een enzym te vinden in de cel. Cytosines in gewervelden, waaronder de mens, zijn vaak gemethyleerd. Wanneer er deaminering plaatsvindt kan dit veranderen in een thymine en deze base hoort in het DNA, dus kan niet op dezelfde manier worden gerepareerd als uracil. Voor deze schade is er een enzym dat twee pockets heeft, waarbij in de ene pocket een G past en in de andere pocket een T. Op deze manier worden alleen de T’s eruit geknipt die tegenover een G staan. Het verschil tussen mismatch repair en BER is dat mismatch repair alleen kan plaatsvinden vlak na de replicatie en BER als er geen replicatie plaatsvindt. De thymine dimeer die ontstaat bij schade van UV-licht moet worden verwijdert. In het voorbeeld bij het eerste college over photolyase kwam al naar voren dat dit enzym een rol speelt bij het repareren van het DNA. Dit enzym gebruikt zichtbaar licht als energie om de covalente banden tussen de thymine dimeer weer te verbreken. Bij mensen wordt dit enzym niet meer gebruikt voor het repareren van het DNA, maar voor de biologische klok. Bij mensen wordt er gebruik gemaakt van Nucleotide Excision Repair (NER). NER kijkt naar schade die de vorm van de dubbele helix verstoord. Een pyrimidine dimeer zorgt ervoor dat er een knik in de helix komt en ook dat de helix ontwindt. Cisplatina en psoraleen zijn voorbeelden van stoffen die ervoor zorgt dat er crosslinks ontstaan tussen basen en dit verstoord natuurlijk ook de algehele structuur van de helix. Bij bacteriën zijn er 6 eiwitten en bij mensen zelfs meer dan 20 eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het repareren van allerlei soorten schade door middel van NER. Wanneer één van de eiwitten een schade detecteert komt een excision nuclease (een soort endonuclease), die op twee plaatsen ongeveer op winding afstand van elkaar zitten breuken aan in één streng van de helix. Omdat het een wat langer stuk is van 10 tot 12 nucleotiden is er vervolgens een helicase-activiteit nodig om het stuk losgeknipte DNA van de helix af te ritsen. Vervolgens kan een DNA polymerase de complementaire streng synthetiseren en als laatste is er een ligase nodig om de boel aan elkaar te plakken (zie afbeelding onderaan vorige pagina). NER is later in de evolutie ontstaan, want de eiwitten bij bacteriën zijn niet homoloog met die van eukaryoten. Er zijn situaties waar polymerase niet meer verder kan en de replicatie komt stil te liggen. Er zijn zogenaamde bypass DNA polymerase die het normale DNA polymerase vervangen en die doen aan translesion synthesis. De polymerase doet niet aan proofreading en plaatsen random een nucleotide tegenover de schade. Er zijn ongeveer 10 van dit soort bypass polymerases voor de verschillende soorten schade (zie onderstaande afbeelding). Er is bijvoorbeeld een specifieke bypass polymerase voor thymine dimeren en bouwt hierbij eigenlijk altijd adenine in. Het maakt in principe niet uit welke base er tegenover wordt gezet aangezien het meestal toch niet goed past. De bypasses veroorzaken vaak een mutatie, maar de replicatie kan in ieder geval worden hervat. Mutaties in de eiwitten die betrokken zijn bij de reparatiesystemen kunnen leiden tot allerlei vervelende ziektes. Zo kan bij een mutatie bij enzymen betrokken bij mismatch repair voor darmkanker zorgen. Mutaties bij enzymen betrokken bij NER veroorzaken allerlei ziektes zoals huidkanker, UV overgevoeligheid en neurologische aandoeningen. Er kunnen ook schades optreden aan de backbone. Een enkelstrengs breuk ontstaat door een verbreken van de fosfodiesterband. Dit kan op twee manieren, namelijk dat er aan de 3’ een OH groep zit en aan de 5’ een fosfaatgroep, of dat er aan de 3’ een fosfaatgroep zit en aan de 5’ een OH groep. De eerste is gemakkelijk te repareren aangezien ligase die breuk meteen kan dichten. De andere breuk kan niet door ligase worden gerepareerd. De schade wordt hierdoor erger, want exonucleases kunnen deze uiteinden aanvallen en nucleotiden weghalen. Deze gaten kunnen gelukkig gemakkelijk opgevuld worden door DNA polymerase en ligase kan dan uiteindelijk de nieuw gesynthetiseerde streng vastplakken aan de oude streng (zie afbeelding hiernaast). Een dubbelstrengs breuk is een groter probleem om te herstellen. Bij een dubbelstrengs breuk kan het namelijk een tijd duren voordat de strengen elkaar weer gevonden hebben en in deze tijd halen exonucleases veel nucleotiden weg. Dubbelstrengs breuken kunnen om verschillende redenen ontstaan, maar vooral wanneer er veel radicalen in de buurt aanwezig zijn en bij ioniserende straling gebeurd dit vaak. Er zijn twee methoden om deze schade te repareren. De eerste methode is nonhomologous end-joining (NHEJ). Hierbij binden zogenaamde Ku-eiwitten aan de uiteinden van de gebroken strengen. Deze eiwitten verwijderen nucleotiden totdat de uiteinden weer kunnen baseparen. Zodra dit het geval is plakt ligase de uiteindes weer aan elkaar vast en de streng is weer compleet (zie afbeelding hiernaast). Een groot nadeel van NHEJ is dat er veel nucleotiden, en dus mogelijk genetische informatie, verloren gaat in het proces. Nog een nadeel is dat het mogelijk is dat twee chromosomen breken en vervolgens verkeerd aan elkaar worden teruggeplakt. De andere methode om dubbelstrengs breuken te repareren heet homologous recombination (HR). Bij dit systeem gaan er geen nucleotiden in het proces. Bij de meeste schades kan de complementaire streng gebruikt worden als template om de schade te repareren. Om dubbelstrengs breuken te repareren zou het handig zijn als er een kopie van het DNA ergens is. Deze kopie kan aanwezig zijn net na de replicatie. Deze kopie kan gebruikt worden om de verloren nucleotiden weer terug te brengen in de DNA streng. Dit systeem is hetzelfde bij zowel bacteriën als bij eukaryoten. Bacteriën maken altijd gebruik van HR want ze zijn altijd aan het delen, dus er is altijd een kopie aanwezig. Bij eukaryoten is dit niet altijd het geval, want eukaryote cellen zitten vaak in de G1-fase en in deze fase is er geen kopie aanwezig van het DNA. Om deze reden maken eukaryote cellen gebruik van NHEJ als ze in de G1-fase zitten. Bij homologe recombinatie duurt het ook een tijd voordat dit van start gaat, dus ook hier vreten exonucleases aan de uiteindes. Vervolgens wordt er een streng uitgewisseld met de complete kopie van het DNA. Er zijn enzymen nodig voor het laten verlopen van de uitwisseling. Na de uitwisseling ontstaat er heteroduplex DNA. Het stuk dat verdwenen was gebruikt het onbeschadigde DNA als template streng met behulp van een DNA polymerase. Wanneer het stuk gerepareerd komt het DNA weer los van de kopie en deze neemt zijn normale vorm weer aan. De streng wordt met behulp van ligase weer aan de rest vastgemaakt en de beschadigde complementaire streng maakt gebruik van de  gerepareerde streng om met behulp van DNA polymerase het verdwenen stuk aan te vullen en ligase plakt de strengen weer aan elkaar (zie afbeelding onderaan vorige pagina). Het RecA-eiwit bindt aan het ssDNA en windt om het DNA heen en bindt de template streng van de kopie. Vervolgens schuift hij de template streng met behulp van ATP langs de kapotte streng tot er een match is. Vervolgens laat het eiwit los en is er heteroduplex DNA gevormd (zie afbeelding hiernaast). Homologe recombinatie komt niet alleen voor bij het repareren van het DNA, maar ook bij de meiose. Tijdens de voortplanting komt het genetisch materiaal van de vader bij dat van de moeder en deze genen worden gecombineerd met elkaar. Het vervolgens combineren en het vervolgens uit elkaar halen van de chromosomen is de meiose. Dit proces verloopt hetzelfde als bij homologe recombinatie. Het begint met twee chromosomen waarvan er één van de moeder en één van de vader is. Vervolgens wordt er bewust een dubbelstrengsbreuk in één van de chromosomen aangebracht door middel van enzymen. Vervolgens wordt een stuk van het DNA weggehaald en wordt doormiddel van een RecA achtig eiwit met het andere chromosoom heteroduplex DNA gevormd. Er zijn vervolgens twee mogelijkheden. De eerste mogelijkheid is dat het DNA wordt aangevuld op dezelfde manier als bij een onbedoelde breuk en zodra het stuk lang genoeg is wordt het weer vastgemaakt met de originele streng. De sequenties kunnen anders zijn daar ervoor, waardoor bepaalde mutaties kunnen worden overgeërfd. De tweede mogelijkheid is dat er met behulp van ligase de streng al vast wordt gemaakt aan de gesynthetiseerde streng, maar nog wel in de heteroduplex vorm, waardoor er een soort van kruisweg ontstaat. Deze kruisweg wordt ook wel de Holiday-junction genoemd (zie afbeelding rechtsonder op de vorige pagina). De junctions kunnen opschuiven waardoor grote stukken heteroduplex DNA kan ontstaan. Dit opschuiven wordt ook wel branch migration genoemd. De chromosomen worden door de junctions bij elkaar gehouden en voor de meiose moeten ze uit elkaar worden gehaald. Dit wordt gedaan door de junctions door te knippen met behulp van een enzym en vervolgens plakken ligases de strengen aan elkaar. Het doorknippen kan op twee manieren: non-crossover en crossover. Bij non-crossover knipt het enzym op dusdanige wijze de junction door dat slechts een klein gedeelte van het andere chromosoom overblijft. Bij crossover knipt het enzym op dusdanige wijze de junction waardoor er grote delen van het DNA van de ene chromosoom in de andere belanden (zie afbeeldingen hieronder). Non-crossover gebeurt in 90% van de gevallen en crossover gebeurt in 10% van de gevallen. Non-crossover Crossover Hieronder staan een aantal afbeeldingen waar de Holiday junction meer eruit ziet zoals in het echt om duidelijker te maken hoe het knippen leidt tot (non-) crossovers. non-crossover College 10 Voor branch migration zijn enzymen nodig die dit katalyseren. Deze enzymen heten RuvA en RuvB. RuvA bindt aan de Holiday junction en splitst de strengen, en vervolgens begeleiden twee RuvB complexen het DNA naar de buitenkant (zie afbeelding hiernaast). De activiteit van RuvB lijkt op die van Helicase, alleen beweegt nu het DNA door het enzym heen, in plaats van het enzym over het DNA. Ook al zijn de genen homoloog kunnen er verschillen in zitten en dit kan leiden tot mismatches als dit bij elkaar gevoegd wordt. In een experiment is bepaald dat het geheel rechtsom draait. Voor het knippen van de junction wordt RuvC gebruikt en ligase plakken de strengen weer aan elkaar. De mismatches die ontstaan worden gerepareerd door Mismatch Repair. Er bestaat een kans dat de streng van de vader wordt gebruikt als template, maar ook die van de moeder, en dit gaat random. Bij het zoeken naar homologie kan er een zogenaamde unequal crossover plaatsvinden. Een sequentie wordt net verkeerd geplaatst ten opzichte van elkaar doordat er meerdere sequenties homoloog zijn en dan wordt er bij de ene sequentie een gen verwijdert en bij de andere komt er één dubbel te zitten (zie afbeelding hiernaast). Er zijn verschillende soorten RNA in de cel: ribosomaal RNA (rRNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA) en small nuclear RNA (snRNA). RNA is in principe altijd enkelstrengs, maar wil wel graag baseparen vormen. In een RNA-keten ontstaan hairpins en stemloops, dit zijn stukken RNA die baseparen hebben gevormd en daardoor een structuur aannemen. De basen binnen zo’n loop kunnen weer binden aan een stuk RNA en zo ontstaat er een soort van RNA kluwen. De strengen zitten rechtshandig om elkaar heen gedraaid. Voor rRNA en tRNA is de structuur belangrijk voor de functie. In RNA kunnen GU met elkaar baseparen. Dit zou normaal gesproken een mismatch zijn en gerepareerd, maar door de korte levensduur is dit niet nuttig. Daarnaast zijn de enzymen daarvoor ontworpen voor nucleotiden met een deoxyribose in plaats van een ribose. RNA wordt gesynthetiseerd door RNA polymerase en deze gebruikt daar NTP voor. De synthese van RNA uit DNA heet transcriptie. In plaats van een replicatievork ontstaat er bij de synthese van RNA een transcriptiebubbel. Het DNA wijkt net zoals aan het begin van de replicatie wat uiteen en vervolgens synthetiseert RNA polymerase van 5’ naar 3’ het RNA-molecuul. De DNA streng waarop het RNA wordt gemaakt heet de template strand en de tegenover gelegen DNA streng heet de coding strand. Op de coding strand ligt de informatie voor de eiwitsynthese, want het RNA molecuul is complementair aan de template strand net zoals de coding strand en dus hebben ze dezelfde nucleotidevolgorde. RNA polymerase gaat met een snelheid van 50 nucleotiden per seconde. Dit is een stuk langzamer dan DNA polymerase en dat komt doordat RNA polymerase zelf de baseparing moet verbreken (zie afbeelding linksonder vorige pagina). Het stuk RNA dat op het DNA zit tijdens de replicatie is ongeveer 10 nucleotiden groot. Alle polymerases gebruiken magnesium om de reactie stabieler te laten verlopen. Net zoals bij DNA replicatie ontstaat er bij RNA synthese voor het RNA polymerase uit positieve supercoiling en achter negatieve supercoiling. Topoisomerases zijn dus nodig om dit weer weg te halen. Er kunnen meerdere RNA polymerases tegelijk aan de slag met de synthese van RNA. De startsequentie van de transcriptie op het DNA bij bacteriën heet de promotor. De eindsequentie van de transcriptie heet de terminator. De promotorsequentie verschilt per gen en dit heeft er mee te maken dat sommige genen goed en andere genen slecht tot expressie kunnen komen. Aan de promotor bindt een zogenaamde transcriptiefactor (TF). Bij bacteriën heet de belangrijkste transcriptiefactor het σ-eiwit. Hoe beter dit eiwit bindt aan de promotor hoe makkelijker RNA polymerases kunnen binden aan de sequentie. Eukaryoten hebben meerdere transcriptiefactoren, want in elke cel zitten dezelfde genen, maar niet in elke cel moeten bepaalde genen goed tot expressie komen. Dit wordt gedaan door chromatine remodeling. Het eerste nucleotide dat wordt gesynthetiseerd heet de +1 positie. Alles wat daarvoor ligt wordt met een – aangegeven. Je hebt vervolgens het -10 gebied en het -35 gebied. Alles voor de +1 positie wordt stroomopwaarts genoemd en alles na de +1 positie stroomafwaarts. Het -10 gebied is een erg AT rijk gebied, waardoor het relatief makkelijk kan uitgesmolten worden tot de +1 positie. Het transcriptiefactor heeft een zogenaamde consensussequentie nodig om te binden en deze zit in het -35 gebied en heeft bij bacteriën de volgorde TTGACA. De optimale afstand tussen het -10 gebied en het -35 gebied is 17 nucleotiden. De sigmafactor bindt aan de -35 sequentie en vormt een complex met het DNA en gaat vervolgens het DNA openritsen. Dit wordt gedaan tot aan de +1 positie en dan is er een soort van transcriptiebubbel gecreëerd. Dan kan het RNA polymerase de eerste twee nucleotiden op het DNA zetten. Dit gaat heel inefficiënt en de nucleotiden kunnen er makkelijk weer afvallen. Dit proces wordt abortieve initiatie genoemd. Het opzetten van nucleotiden wordt geprobeerd net zolang totdat er ongeveer 10 nucleotiden op het DNA zitten, dus tot de +10 positie. Zodra 10 nucleotiden zijn gekoppeld laat de sigmafactor los en kan het RNA polymerase op eigen kracht verder met synthetiseren. Dit wordt promotor clearance genoemd. Sigma wordt hergebruikt en kan weer opnieuw binden met een RNA polymerase. De gebieden liggen op de coding strand van het DNA. De sequentie kan ook op de andere streng liggen, maar dan wordt dat de coding strand. Vanaf het moment dat sigma loslaat gaat RNA polymerase over het DNA lopen en dit wordt de elongatie genoemd. De terminatie van de transcriptie gebeurt door een terminatiesequentie. Deze  sequentie heeft een bepaalde volgorde waardoor er achtereenvolgens stukken DNA worden gesynthetiseerd die zo goed complementair zijn, dat deze waterstofbruggen met elkaar gaan vormen. Er blijven dan alleen nog maar een paar AU baseparen over en deze zijn dusdanig zwak dat ze worden losgetrokken door de rest (zie afbeelding hiernaast). Het RNA polymerase kan vervolgens weer gebruikt worden voor de replicatie van nieuwe RNA moleculen. Op de onderstaande afbeelding staat de complete cyclus nog eens weergegeven. College 11 Bij bacteriën is er maar één RNA polymerase en maar één belangrijke transcriptiefactor. Eukaryoten hebben drie verschillende RNA polymerases: RNA polymerase I, II en III (RNA pol I, II & III). RNA polymerase I is verantwoordelijk van de transcriptie van het rRNA in de ribosomen. RNA polymerase II is verantwoordelijk van de transcriptie van mRNA. RNA polymerase III zijn is verantwoordelijk voor de synthese van tRNA en snRNA. rRNA heeft een lengte van 1500 tot 2500 nucleotiden, mRNA hebben een lengte van 500 tot 2*106 nucleotiden en tRNA heeft een lengte van 75 nucleotiden. Alle polymerases hebben hun eigen transcriptiefactoren, namelijk transcriptiefactor I, II en III (TF I, II & III). Elke cel moet het mRNA tot translatie (het vertalen van RNA naar eiwit) brengen dus rRNA en tRNA moeten in grote hoeveelheden aanwezig zijn in de cel, dus de productie van deze RNA moleculen wordt niet heel erg gereguleerd. Of mRNA tot expressie komt hangt per cel af, dus deze variant moet wel goed gereguleerd worden. Dit wordt gedaan met behulp van transcriptiefactoren. Er zijn ongeveer 30 eiwitten betrokken bij het reguleren van de activiteit van RNA polymerase II en deze eiwitten hebben ongeveer dezelfde functie als het sigma-eiwit bij bacteriën. Deze eiwitten binden ook bij de promotersequentie, waardoor het DNA open wordt gesmolten, vervolgens gaat RNA pol II proberen 10 nucleotiden op het DNA te zetten, de abortieve initiatie. Net als bij bacteriën is er weer een consensus sequentie te vinden. Deze ligt in het -30 gebied en wordt ook wel de TATA box genoemd. Deze sequentie heeft de volgorde TATA(A/T)A(A/T). Deze TATA box wordt gebonden door een transcriptiefactor genaamd het TATA-binding protein (TBP) en hij buigt het DNA. Dit gaat vrij gemakkelijk aangezien AT rijke gebieden gemakkelijk buigen. Er liggen nog meer consensus sequenties op het gebied, namelijk de initiatie regio (INR) en die zit bij de start (+1) van de transcriptie. Ook in het gen zelf kunnen gebieden zitten die invloed hebben op de promotoractiviteit. Bij +30 ligt het DPE gebied die een bepaalde consensus heeft. Het TBP bindt als eerst en vervolgens binden er nog 9 andere eiwitten en dit grote eiwitcomplex heet TFIID. Dit complex bedekt drie consensussequenties namelijk de TATA box, het INR en DPE. Het eiwitcomplex bedekt 60 nucleotiden van -30 tot +30. Wanneer TFIID gebonden is, bindt het eiwitcomplex TFIIB aan de BRE consensus sequentie en aan TFIID. Vervolgens binden ook de transcriptiefactoren TFIIE, TFIIH en TFIIH aan het complex en pas als alle transcriptiefactoren zijn gebonden kan RNA polymerase II binden aan het DNA. Vervolgens bindt TFIIH aan het DNA en dit enzym heeft een helicase activiteit en ritst het DNA open en RNA polymerase kan de abortieve initiatie starten. Voor dat er over kan gegaan worden tot de elongatie moeten eerst alle eiwitten actief van het hele complex afgehaald worden. TFIIH heeft ook een kinase-activiteit en dit houdt in dat het enzym fosforylering kan katalyseren. Aan RNA polymerase zit nog een soort van staart dat het C-terminal domain (CTD) wordt genoemd en RNA polymerase zit met deze staart vast aan het complex. De staart bevat 52 repeats van 7 aminozuren en in iedere repeat zitten twee serines en aan deze serines kan TFIIH fosfaatgroepen plakken. Door de fosfaatgroepen krijgt de staart een sterke negatieve lading en dit stoot alle transcriptiefactoren af en het RNA polymerase kan de elongatiefase in (zie afbeelding hiernaast). Het binden van alleen transcriptiefactoren is nog niet genoeg voor de initiatie. Er zijn nog allerlei eiwitten die er voor regulatie zijn. Een ander verschil tussen bacteriën en eukaryoten is dat transcriptie en translatie tegelijkertijd plaats kan vinden bij bacteriën. Dus terwijl een RNA streng wordt gesynthetiseerd kunnen ribosomen binden en eiwitten vormen. Dit heet co-transcriptionele translatie. In eukaryoten kan dit niet. Het mRNA wordt getransripteerd in de celkern en wordt dan naar buiten getransporteerd naar het cytoplasma waar de ribosomen zich bevinden en hier vindt dus geen transcriptie plaats. Voordat het mRNA naar buiten kan moet het mRNA eerst nog bewerkt worden. In eukaryoten zit veel niet-coderend DNA en dit moet er eerst worden uitgehaald. De intronen moeten uit het mRNA worden gehaald en de exonen aan elkaar geplakt worden. Dit wordt RNA splicing genoemd worden. Om te voorkomen dat het RNA wordt ontbonden door RNases moet het worden beschermd met een zogenaamde 5’ cap en een 3’ polyAstaart. Het heeft daarnaast ook nog een functie bij de translatie. Alle eiwitten die nodig zijn om deze processen uit te voeren reizen mee met het CTD van het RNA polymerase. Op deze manier krijgen alleen mRNA moleculen deze modificaties (zie afbeelding hiernaast).  Pre-mRNA splicing gebeurt door een reactie binnen het RNA zelf. Tussen twee exonen zit een intron en aan de 3’ exon zit een geconserveerde adenine. De 2’ OH van deze adenine valt de fosfodiesterband aan op de grens tussen het 5’ exon en het intron en er ontstaat een soort lassostructuur. De 3’OH aan het uiteinde van de 5’ exon kan de fosfodiesterband aanvallen tussen het intron en het 3’ exon en op die manier zitten alleen de exonen nog maar aan elkaar vast en is het intron losgemaakt (zie afbeelding hiernaast). Het complex wat dit katalyseert is het spliceosome. Het soort reactie dat plaatsvindt is een transesterificatie. Dit is hetzelfde principe als bij topoisomerase. De 5’cap wordt gedaan voordat intronen uit het pre-mRNA worden gehaald. Aan de 5’ kant zitten drie fosfaatgroepen. De cap wordt eraan gezet door allereerst met behulp van een defosfatase een fosfaatgroep van de 5’ af te halen. Vervolgens wordt er met behulp van een GTP een guanine aan de 5’ fosfaatgroep gezet van het pre-mRNA. De guanine zit dan als het ware omgekeerd aan de streng. Het is een 5’ naar 5’ koppeling en exonucleases kunnen hier niets mee en daardoor is dit uiteinde goed beschermd (zie afbeelding hiernaast). Er wordt ook nog een methylgroep aan de cap gezet. Naast bescherming dient de cap ook als signaal voor het exportsysteem dat het gaat om een mRNA molecuul. Een derde functie is dat het nodig is voor efficiënte translatie. Het is niet de bedoeling dat mRNA’s een lange levensduur hebben, want dan zouden bepaalde eiwitten constant tot expressie komen. Afhankelijk van hun functie hebben mRNA een verschillende levenstijd in de cel. In het pre-mRNA zitten er over het algemeen veel meer intronen dan exonen. Splicing gebeurt gedurende de transcriptie. De transcriptie van intronen kost veel energie en dit lijkt verloren te gaan. Een extreem geval is het DMD gen te noemen die bestaat uit 11 duizend nucleotiden exonen en maar liefst 2 miljoen nucleotiden aan intronen. Dit mRNA doet er zo lang over om te synthetiseren dat wanneer er ’s ochtends wordt gestart met transcriptie, het ’s avonds laat pas klaar is. Het nut van zoveel intronen is dat mutaties zich makkelijk kunnen voordoen zonder dat dit problemen oplevert voor de cel. Soms gebeurt het dat er door een mutatie op de grens tussen intronen en exonen een intron niet wordt weggehaald en dat er een nieuw eiwit wordt gegenereerd. Evolutionair gezien levert het hebben van intronen dus voordelen op, want cruciale processen worden door mutatie niet aangetast, maar er kan wel een nieuw en nuttig eiwit worden gevormd. Wat ook mogelijk is, is dat er een breuk ontstaat in een intron en dat deze wordt vastgeplakt aan een ander gebroken intron en dat er daardoor twee exonen die eerst niet bij elkaar zaten, vanaf dat punt wel bij elkaar zitten. Een ander nut van intronen komt naar voren bij alternative splicing. Hierbij worden in sommige cellen exonen gebruikt die in andere cellen worden overgeslagen. Hierdoor ontstaan er dus eiwitten die wel op elkaar lijken, maar net een andere structuur kunnen hebben dat nuttiger is voor de desbetreffende cel. Bepaalde eiwitten zorgen ervoor dat bepaalde exonen worden overgeslagen. Een voorbeeld van alternative splicing is het alpha-tropomyosine gen die bij bijvoorbeeld gestreept spierweefsel anders tot expressie komt dan bij glad spierweefsel of in de hersenen. Zo wordt met dit gen 5 eiwitten gemaakt. Een extremer voorbeeld is het gen dat verantwoordelijk is voor het aanleggen van neurale circuits, waarbij maar liefst 38,016 mogelijke combinaties van splicing. Dit gen bestaat namelijk uit een gedeelte van exonen die altijd worden gebruikt, en vervolgens 4 gebieden waar er telkens maar één van wordt gekozen. Waarschijnlijk worden niet alle varianten gemaakt, maar er zijn er al wel meer dan honderd aangetoond. Als laatst wordt er aan de 3’ kant van het mRNA een zogenaamde polyAstaart aangezet. Een polyAstaart kan er pas aangezet worden als de 3’ kant beschikbaar is. Wanneer het RNA polymerase is gearriveerd bij de terminatiesequentie dan wordt ongeveer 30 nucleotiden verder het mRNA afgeknipt. De transcriptie stopt dan niet, maar aan het mRNA wordt geen cap meer gezet, dus exonculease knipt het RNA weg en halen het RNA polymerase in. Het RNA polymerase valt vervolgens van het DNA af. Het enzym poly-A-polymerase wordt aan de 3’ kant van het mRNA gezet en vervolgens worden er ongeveer tweehonderd adenosines aan vast geplakt. Vervolgens bindt het poly-A-binding protein aan de poly-A staart en reguleert de lengte van de staart (zie onderstaande afbeelding). Het mRNA is dan compleet en kan de cel uit getransporteerd worden. College 12 Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende aminozuren. Er zijn maar 4 verschillende soorten nucleotiden, dus één nucleotide zou maar voor 4 aminozuren kunnen coderen, twee nucleotiden kunnen voor 16 aminozuren coderen en drie nucleotiden kunnen 64 verschillende combinaties vormen. Drie achtereenvolgende nucleotiden worden dus een codon genoemd. Er zijn 64 codons en  20 aminozuren, dus voor bepaalde aminozuren kunnen meerdere codons gebruikt worden. De codons staan vaak genoteerd in een tabel. Deze tabel geeft dus de sequentie weer van het mRNA en moet als volgt gelezen worden. De eerste positie van het codon zit aan de 5’ kant en dan kan er gekozen worden voor U, C, A of G, vervolgens voor positie twee kan er weer gekozen worden voor U, C, A of G en voor de derde positie aan de 3’ kant weer een keuze. Voorbeeld: 5’ UCG 3’ codeert voor een serine (Ser). Er zijn twee aminozuren waar maar één codon voor is, dit zijn methionine en tryptofaan. Er zijn ook drie stopcodons. Deze geven de stop aan van de translatie. Het startcodon is AUG en deze codeert ook voor methionine. RNA heeft drie zogenaamde reading frames. Het is afhankelijk van waar er gestart wordt welk eiwit er wordt gevormd, dus dit moet goed gereguleerd worden dat er altijd in dezelfde reading frame wordt gestart (zie afbeelding hiernaast). Het is ook belangrijk dat er voorkomen wordt dat er niet van reading frame wordt gewisseld tijdens de translatie. De aminozuren worden door middel van transfer RNA (tRNA) naar het juiste codon worden gebracht. tRNA wordt gesynthetiseerd door RNA polymerase III en het RNA is 75 nucleotiden groot. Het molecuul heeft een zogenaamde klaverblad structuur. Aan de 3’ kant van het tRNA zit het bijbehorende aminozuur geplakt, als je vervolgens richting de 5’ de structuur afloopt dan kom je als eerste de zogenaamde T-loop tegen, vervolgens kom je bij de anticodon-loop uit en voor het 5’ eind kom je nog de D-loop tegen. In de anticodon-loop zit het anticodon. Dit anticodon is complementair aan het codon en kan hier baseparing mee vormen. De baseparing met het mRNA is antiparallel, dus als het codon van 5’ naar 3’ loopt, dan loopt het anticodon van 3’ naar 5’ (zie afbeelding hiernaast). Op de afbeelding zijn in de D- loop allerlei D’tjes, die staan voor dihydro-uracil. De Y’s staan voor pyrimidines en kunnen dus zowel een U als een C zijn. Een R staat voor een purine. In de anticodon loop en de T-loop zit ook een ψ, dit staat voor een pseudo uridine. Dit is een uracil die verkeerd aan de suiker zit vastgeplakt. In de T-loop zit ook nog een thymine. Er zijn een aantal modificaties van nucleotiden die in tRNA kan voorkomen. De eerste is een inosine, wat eigenlijk hetzelfde is als hypoxanthine. Een adenine wordt bewust gedeamineerd en er komt een keton-groep voor in de plaats. Een tweede modificatie is een thiouracil, waarbij de ketongroep aan een uracil vervangen is door een zwavelatoom. De derde  modificatie is een dimethyl guanine, waarbij er aan de aminogroep twee methylgroepen worden geplakt (zie afbeelding onderaan de vorige pagina). Er zijn nog meer van dit soort modificaties bekent en gemiddeld heeft een tRNA dertien van dit soort modificaties. Een aantal van deze modificaties zijn verantwoordelijk voor de 3D structuur van het tRNA molecuul. De T-loop en de D-loop hebben interacties met elkaar door waterstofbruggen. Door de structuur steekt de anti-codon loop uit zodat het goed kan baseparen met het mRNA (zie afbeelding hiernaast). Er zijn maar zo’n dertig verschillende tRNA’s nodig om alle 61 codons te transleren. Dit heeft te maken met de baseparing tussen het codon en het anti-codon. Wanneer het mRNA van 5’ naar 3’ wordt afgelezen (net zoals in de tabel) dan komt het anti-codon er van 3’ naar 5’ tegenover te staan. De derde nucleotide op het anticodon (dus aan de 5’ kant van het tRNA) wordt ook wel de wobble-positie genoemd. Dit nucleotide heeft meer vrijheid dan de andere twee nucleotiden. Hierdoor is het mogelijk dat er waterstofbruggen worden gevormd tussen guanine en uracil. Normaal gesproken is dit niet mogelijk, omdat de positie van uracil anders is dan wanneer het normaal bindt met adenine en dit zou de structuur verstoren. Doordat er bewegingsruimte is op de wobble-positie kan dit wel. Op de andere twee posities kan alleen normale baseparing gevormd worden. Ook de base inosine kan op de wobble-positie zitten. Deze kan met zowel A, U als C baseparing vormen. Wanneer gekeken wordt naar de tabel, dan valt op dat de aminozuren in groepen staan. In de tabel hiernaast staat welke baseparing op de wobble positie mogelijk is bij bacteriën. Voorbeeld: als er een U zit op de wobble positie, kan er een baseparing worden gemaakt met een A en een G, en dan is ook te zien in de tabel dat bijvoorbeeld argenine zowel wordt gecodeerd door 5’AGA3’ als 5’AGG3’, er is dus maar één anticodon voor nodig, namelijk 3’UCU5’. Isoleucines worden gelezen door een tRNA met inosine. De meeste bacteriën hebben 31 tRNA’s en nog een speciaal start tRNA. Bij eukaryoten gaat het vormen van bepaalde baseparing lastiger door het ribosoom en kunnen er alleen baseparen gevormd worden zoals in de tabel hiernaast. De mens heeft 497 verschillende tRNA’s met 48 verschillende anticodons. De reden dat de mens zoveel verschillende tRNA’s heeft met dezelfde anticodons is omdat er veel tRNA nodig is in eukaryote cellen. Alle tRNA’s eindigen met 3’ACC5’. Een aminozuur wordt aan het tRNA gezet door een reactie tussen de 3’ OH-groep van het tRNA en de OH-groep van het aminozuur. De band die wordt gevormd is een esterband. Het vormen van deze band kost energie en heeft ongeveer dezelfde werking als ligase. Het enzym dat wordt gebruikt heet aminoacyl-tRNA synthetase en dit enzym koppelt een AMP aan het aminozuur met behulp van ATP en vervolgens wordt het aminozuur gekoppeld aan de 3’ OH (zie afbeelding hiernaast). Het aminoacyl-tRNA synthetase herkent het juiste tRNA door het anticodon te herkennen en het 3’ uiteinde. Voor een aantal tRNA synthetases is het herkennen van het juiste aminozuur geen probleem door de unieke structuur. Maar aminozuren zoals valine en isoleucine hebben een zeer vergelijkbare structuur. Valine past in een tRNA synthetase voor isoleucine. Deze enzymen hebben ook nog een editing site waar wordt gecontroleerd of het aminozuur goed is. Deze pocket is kleiner dan het aminozuur zelf en isoleucine zal in dit voorbeeld er dus niet in passen en valine wel. Als het aminozuur in de pocket past wordt de band gehydrolyseerd en kan de band opnieuw worden gemaakt. Er zijn maar 20 synthetases nodig en dit is omdat het enzym niet alleen naar het anticodon kijkt, maar ook naar het aminozuur. De tRNA’s die coderen voor hetzelfde aminozuur hebben ook een vergelijkbare structuur (zie afbeeldingen hieronder). In het geval van leucine herkent de synthetase niet het anticodon, maar de structuur van de tRNA’s. College 13 De volgende stap in de translatie is de peptidebandvorming tussen de aminozuren. De tRNA’s zitten vast op het mRNA en zodra de peptideband gevormd is laat het tRNA los van het DNA af (zie afbeelding hierboven). De peptides worden van de N-terminus naar de C-terminus gesynthetiseerd. Deze reactie vinden plaats in de ribosomen. De ribosomen zorgen ervoor dat het tRNA in de goede reading frame blijft. Daarnaast activeren de ribosomen ook de bovenstaande reactie. Ribosomen bestaan vooral uit ribosomaal RNA en ook nog voor een kleiner gedeelte uit eiwitten. De eiwitten hebben een secundaire functie en zorgen voor stabiliteit. De ribosomen brengen de aminozuren bij elkaar zodat de peptideband gevormd kan worden. De enzymfunctie die de ribosomen daarbij uitvoeren heet ribozym.  De translatie verloopt zowel bij eukaryoten als bij prokaryoten hetzelfde. De ribosomen bij eukaryoten zijn echter wel een stuk groter dan bij prokaryoten. De ribosomen zijn evolutionair gezien wel verwant aan elkaar. De ribosomen bestaan uit een grote subunit (50S) en een kleine subunit (30S). De ribosomen zijn op te delen in drie bindingsplaatsen, namelijk de aminoacetyl-site (A-site), peptidyl-site (P-site) en de exit-site (E-site). In de A-site bindt een nieuw tRNA en deze wordt vervolgens doorgeschoven naar de P-site waar de peptideband wordt gevormd, om vervolgens in de E-site te eindigen en daar het ribosoom weer te verlaten. Alle reacties vinden plaats in de grote subunit en het mRNA zit in de kleine subunit. Zodra er een tRNA in P-site en in de A-site zit wordt er een peptideband gevormd tussen de twee aminozuren, hierdoor laat het aminozuur dat vastzit aan het tRNA in de P-site los en schuift de grote subunit door, waardoor het tRNA zonder aminozuur in de E-site komt en het tRNA waar het nieuw gevormde eiwit aan vastzit in de P-site terecht komt. De kleine subunit schuift blijft eerst achter, maar schuift vervolgens op waardoor het tRNA in