Basfondamenti della Rigenerazione e Riparazione - Lezione 1

**BASI DELLA RIGENERAZIONE E RIPARAZIONE -SALA** Lezione 1 (2 marzo) [Programma:] Meccanismi comuni ai vari processi, partono dal momento del danno, quali molecole vengono coinvolte, che tempistiche seguono, perchè avvengono con una successione temporali, quali sono gli attori che intervengono ne...

**BASI DELLA RIGENERAZIONE E RIPARAZIONE -SALA** Lezione 1 (2 marzo) [Programma:] Meccanismi comuni ai vari processi, partono dal momento del danno, quali molecole vengono coinvolte, che tempistiche seguono, perchè avvengono con una successione temporali, quali sono gli attori che intervengono nella riparazione nei vari tessuti (cutaneo, osseo). La guarigione in alcuni tessuti si avvale di due meccanismi: riparazione e rigenerazione La rigenerazione nei mammiferi e uomo è riservata ad alcuni tipi di tessuti, quindi si cerca di capire perché e quali sono le cellule che portano avanti questo processo e se ci sono modelli che riescono a farci capire cosa avviene, che animali son ostati studiati (planaria, anfibi). Le staminali dove si trovano, come si possono ottenere, come si differenziano dalle altre cellule, come si può avere un numero adeguato di cellule per stimolare il processo rigenerativo, che limiti ci sono. Uso degli embrioni per aiutare a guarire: utilità, limiti, sono cellule pericolose o no? Riprogrammazione nucleare, come le cellule staminali possono essere caratterizzate e differenziate e cellule negli annessi fetali. Cosa troviamo nell'adulto, da poco cellule ottenerne in numero adeguato per terapia, rigenerazione dei parenchimi con queste cellule (cute, tessuto nervoso, ecc) Il cuore e muscolo possono essere rigenerati? I vasi? **GUARIGIONE DELLE FERITE** **--** **DALL'EMOSTASI ALL'ANGIOGENESI** Guarigione è il processo che porta a **ricostruzione di un tessuto danneggiato**, il motivo del danneggiamento può essere diverso (processo infiammatorio, per morte di tessuti a seguito di ischemia, trauma, qualunque evento che porti a una soluzione di continuo), la soluzione di continuo viene sostituita poi con un **tessuto cicatriziale**, in realtà la cicatrice è costituita prevalentemente da una proteina ovvero il **collagene di tipo 1**. Il collagene 1 è **fibrillare**, essendo fibrillare conferisce una **forte resistenza al tessuto**. Alcuni tessuti riescono ad essere **riparati attraverso sostituzione** delle cellule perse con **nuove cellule** che sono in grado di far **ripristinare la funzione** che è stata persa (es quello che avviene in alcuni rettili come le lucertole quando perdono la coda che ricresce con tutte le componenti ossee, nervose, mesenchimali ed epiteliali). L'evoluzione porta alla stabilizzazione di caratteri **utili** alla specie e **perdita di quelli inutili o dannosi** e questo porta alla morte dell'individuo che presenta certi caratteri che non gli consentono di sopravvivere in un certo ambiente, questa è la **selezione naturale**. La **riparazione connettivale**, cioè la **formazione di una cicatrice,** ha lo scopo di riportare un tessuto che non ha in se le capacità rigenerative a quelle condizioni anatomiche il più possibile simili a quelle che erano prima del danno, la deposizione di questa cicatrice è però un **evento finale**, è preceduto da un'altra **serie di eventi** che si innescano appena avviene la **distruzione del tessuto**. Quando il tessuto viene danneggiato l'organismo risponde con il **processo immediato di infiammazione** che ha lo scopo di **circoscrivere il danno,** di rimuovere il danno e dare la possibilità all'organismo di ripararlo. L'infiammazione usa **processi emostatici** e quando c'è un danno ad un tessuto spesso avviene un **sanguinamento per rottura dei capillari**, il sangue viene a contatto con il **fattore tissutale** e determina la **coagulazione del sangue**. Abbiamo [due strade diverse]: da una parte, se abbiamo una lesione di un **tessuto capace di rigenerare,** abbiamo una serie di eventi che portano alla **formazione di cellule** che **sostituiscono** ciò che è stato danneggiato e perso e si **recupera la funzione**; ma se questo non può avvenire, come alternativa abbiamo la **formazione di una cicatrice** più o meno estesa. I problemi ci sono e sono rilevanti quando il processo di deposizione della cicatrice non viene ad essere regolato, perché ci può essere una **eccessiva deposizione di tessuto connettivo** che porta ad una **sostituzione del tessuto normale** con questo tessuto **incapace di svolgere una funzione** se non quella di connettere tra loro gli elementi e comporta una perdita di funzione, tanto che l'organo che è modificato da questa eccessiva deposizione di tessuto connettivale presenta la caratteristica di essere **[fibrotico]** e un tessuto fibrotico perde la sua capacità funzionale. Es la *fibrosi miocardica* e *fibrosi* *epatica* che **riducono la funzione miocardica ed epatica** e l'organismo ne risente. Un **danno** che avviene su un tessuto può essere **guarito** attraverso: o il **processo rigenerativo** con ricostruzione della parte mancante (es ciò che avviene a seguito di una lesione epatica chirurgica, il fegato rigenera e riacquista la massa che aveva prima riformando i suoi lobi e la sua funzione, da origine al [mito di Prometeo] in cui l'uccello rapace mangia il fegato a chi ha sottratto il fuoco degli dei e l'ha donato all'umanità, il rapace durante il giorno mangia il fegato ed esso nella notte ricresce, questo è dato dalla capacità del **fegato di rigenerare**, probabilmente i medici del tempo avevano osservato questa rigenerazione), oppure, se questo non avviene, il tessuto perso è **sostituito da una cicatrice** che tiene vicine le parti di tessuto funzionante. Se il processo di infiammazione non si risolve e **perdura nel tempo** (infiammazione cronica), questo processo continua a danneggiare il tessuto e va incontro a **continui processi di riparazione cicatriziale**, se il fenomeno perdura in un tempo esteso, la continua formazione di cicatrici crea un **danno irreversibile** al tessuto e diventa **fibrotico**, compare la fibrosi. **CASCATA DI EVENTI**: Questo processo di riparazione avviene attraverso **varie fasi**: - All'inizio c'è la [fase emostatica] con **rimozione del tessuto danneggiato**, - Segue la [contrazione della ferita] che **riduce le dimensioni** della ferita stessa, - [Proliferazione] di cellule mesenchimali che fanno parte del tessuto connettivo tra cui **fibroblasti ed altre cellule**, - [Formazione di nuovi vasi], - [Sintesi di proteine], - Spegnimento di questi processi plastici che porta a [rimodellamento] di ciò che è stato formato, - Finisce con il [consolidamento], ciò che è stato formato viene prima **rimodellato** e poi acquista **forza e resistenza** e viene **consolidato**. Questa sequenza di eventi avviene in un **arco temporale** e questo arco è come lo sviluppo di una opera teatrale perchè c'è un prologo, la comparsa di alcuni attori che hanno importanza diversa nelle varie fasi, alcuni lasciano posto ad altri sviluppando una comunicazione con gli altri, quando vogliamo intervenire quindi dobbiamo stare attenti a quando entriamo e a cosa facciamo perché se tiriamo via dalla scena un attore importante gli spettatori non capiscono più, se invece in un momento di coralità il soprano fa un intervento fuori tempo percepiamo che c'è qualcosa che non funziona nella regia, il soprano è importante e deve rispettare i suoi tempi e quelli degli altri. Possiamo agire andando a **mettere cellule o citochine**, ma se sono sbagliate creiamo confusione e possiamo **alterare il processo di guarigione**. [Popolazioni cellulari che intervengono e per quanto tempo sono osservate]: All'inizio si ha **sanguinamento e coagulazione** in **tempi rapidi** per contrastare la perdita ematica con ruolo molto importante da elementi detti **piastrine** (non vere cellule perché non hanno il nucleo), l'infiammazione inizia appena si crea il danno nel tessuto. Le prime cellule che arrivano sono i **neutrofili**, ma non sono critiche per il processo riparativo, vivono poco, svolgono una funzione importante di [fagocitosi dei batteri o funghi]: **provengono dal sangue**, non sono normalmente presenti nel tessuto e qui hanno vita breve, per arrivare al tessuto hanno bisogno che ci sia del sangue che ci arriva e quindi **fuoriescono dai capillari** con un processo detto **[diapedesi]**, si muovono ancorandosi a proteine presenti sulla matrice, il loro ruolo principale è **fagocitare dei batteri** perché quando subiamo un trauma si apre una voragine nel tessuto attraverso cui precipitano batteri e funghi, per cui i granulociti neutrofili sono importanti, ma sono utili solo se ci sono batteri o funghi da fagocitare, se no non servono. Persone con patologie di funzionamento dei granulociti hanno difficoltà a combattere infezioni ma non a riparare un danno. Altre cellule che vengono dopo, circa 2-3 giorni, sono i **macrofagi**, questi sono dei **super-fagociti**, non hanno il compito di eliminare batteri o funghi o protozoi di cui se ne occupano i granulociti, ma vengono dopo perchè sono molto preziose e **non devono finire a contatto con i batteri che li danneggerebbero**, svolgono la loro funzione quando i batteri non ci sono più. Quindi prima intervengono i granulociti che eliminano i batteri e contengono l'infezione, questo contenimento consente lo svilupparsi dell'infiammazione verso un **orientamento di ricostruzione del danno**; la ricostruzione non può avvenire finchè non sono rimosse le cause del danno. Il danno ha causato distruzione del tessuto e ha rotto i vasi causando sanguinamento. La conseguenza della **rottura dei vasi** è che **non arrivano più nutrienti e ossigeno** alle cellule e tessuti che quindi muoiono, ci saranno cellule che resistono più di altre ma in queste condizioni il danno per loro aumenta e la cellula viene danneggiata iniziando un cammino di morte guidato da una serie di eventi ordinati (apoptosi), oppure no come avviene per la necrosi. Quando avviene un grosso **scoinvolgimento di equilibri** intracellulari si traduce con **liberazione di calcio**, **attivazione di enzimi e proteine** e la **cellula si rigonfia**, il **DNA viene distrutto** in modo indipendente da enzimi, per cui viene ad essere frammentato in modo irregolare. Quando però le cellule non sono ancora morte e sono in **ipossia,** possono dare risposta ad essa, ovvero si ha la **traslocazione di HIF** (fattore indotto da ipossia) che trasloca nel nucleo e come tipo di attività che esercita abbiamo la **trascrizione di una proteina** capace di **stimolare le cellule endoteliali** che si chiama **VEGF** (fattore cellulare di crescita degli endoteli). I meccanismi sono estremamente **coordinati** e importanti, ad esempio, nella sostituzione dei tessuti che si susseguono durante la riparazione dell'osso. Quando abbiamo l'arrivo dei macrofagi abbiamo presenza di **cellule che sintetizzano tante molecole** che **richiamano altre cellule** in parte già richiamate dalle piastrine. In un territorio in cui abbiamo vasi rotti, coagulati, tessuti strappati, cellule morte a seguito di trauma e altre che stanno morendo perché non arriva l'ossigeno, le cellule che arrivano **non possono sopravvivere** e quindi **bisogna creare le condizioni** per permettere di **sopravvivere alle cellule**, a questo punto possiamo richiamare tante cellule diverse. Le cellule arrivano **migrando all'interno dei tessuti nella matrice** fatta da proteine. Le cellule devono **degradare la matrice per muoversi** o le cellule circolanti, devo arrivare solo se i vasi sono vicini alla nostra sede, altrimenti c'è uno scenario non favorevole alle cellule. Queste cellule sono capaci di dare il contributo con **sintesi di matrice** e quindi deve succedere qualcosa. Le piastrine che vengono dal circolo sono **intrappolate dalla rete di fibrina** e **formano il coagulo** che arresta la fuoriuscita degli eritrociti, ma prima che il coagulo diventi abbastanza spesso da impedire anche la fuoriuscita del liquido dai vasi consente anche la fuoriuscita di siero (il **siero** è il plasma privato dalle proteine usate per la coagulazione), quindi questo siero **fuoriesce e riempie la zona** dando **umidità al tessuto**, poi intervengono vari processi man mano che il tempo passa. La **coagulazione** che porta alla formazione di questa rete che imbriglia i globuli rossi è caratterizzata da una proteina che è la **fibrina**, questa proteina estremamente **collosa** origina da una proteina che non è collosa che circola nel sangue che è il **fibrinogeno**, dove è attivato il processo coagulativo sono attivati enzimi che **tagliano il fibrinogeno** che libera un **frammento capace di unirsi ad altri frammenti**, questa è la prima **matrice extracellulare** che riempie la zona di danno ed è molto importante. Se continuiamo a togliere il sangue che fuoriesce ritardiamo il processo di guarigione e formazione della crosta, negli anfibi la crosta è rivestita da epitelio mentre nei mammiferi no, quando la crosta cade vediamo la pelle integra, negli anfibi questo non avviene ma l'epidermide cresce al di sopra della crosta. Se l'evoluzione ha voluto questo è perchè gli anfibi passano maggior parte del tempo in acqua e se la fibrina fosse a contatto con acqua verrebbe idrolizzata, si scioglierebbe e la crosta si romperebbe dando origine a nuovo sanguinamento. Se si bagna la crosta diventa più fragile e sanguina, non guarisce velocemente. Quindi la **fibrina può essere idrolizzata da acqua**, non va rimossa se no si ritarda il processo di guarigione. L'altro aspetto utile della fibrina che usano i chirurghi è un ritrovato biotecnologico con costi alti perchè funziona da vera e propria **colla** tanto da **sostituire il filo da sutura** e **non lascia cicatrici**, mentre il filo di sutura a volte dove passa crea del danno. Inoltre, la fibrina consente: quando ci tagliamo vediamo anche se la lama è sottile uno **slabbro grosso**, i **margini del taglio si aprono** e si forma uno **spazio più o meno largo rispetto alla grandezza della lama**, questo perché si ha semplice **azione elastica della matrice** che non è più tenuta insieme, noi nei tessuti abbiamo tante proteine e quando le recidiamo le proteine non più ancorate da una parte e dall'altra si **retraggono verso il loro ancoraggio** e ci si ritrova uno spazio più aperto. Le cellule devono andare a rimettere a posto le cose, una cellula è circa 10-15 micron, un taglio invece è di qualche mm, quindi il micron è la millesima parte di un mm, per cui una cellula deve arrivare all'altro margine della ferita. Il punto di sutura del chirurgo serve per vincere la **forza di retrazione** del tessuto e tenere vicini i lembi e far passare le cellule da una parte all'altra e depositare proteine che tengono unite i margini. Se la cellula vede il punto fisico che deve raggiungere distante e il taglio è profondo, vede un baratro sotto, se dobbiamo attraversare un canale facciamo un salto e chi è più alto riesce ad attraversare facilmente, se invece dobbiamo attraversare uno spazio molto grosso abbiamo bisogno di **un ponte**. Le cellule usano la **rete di fibrina** che si forma e attiva dove c'è il sangue che riempie tutta la lesione, per cui il fattore tissutale che trova ai bordi della ferita attiva la coagulazione, per cui l'enzima che viene ad essere formato è in grado di tagliare a sua volta il fibrinogeno per produrre la fibrina che localmente forma la rete (sotto foto al microscopio elettronico a scansione). Questa proteina è **collosa** ed è capace di **tenere attaccate altre proteine** nel sangue come la **fibronectina**. La fibronectina è una proteina solubile presente nel siero. Le cellule esprimono sulla superficie le **integrine** (assenti quando la cellula è a riposo) che legano la fibronectina, le cellule che non sanno riconoscere la proteina non si agganciano, se invece hanno la capacità di riconoscere la proteina e formano legami con essa allora si possono ancorare e grazie a questo si muovono. Le cellule quando si muovono producono **estroflessioni** della membrana e citoplasma che diventano sottili e vanno ad esplorare, trovano il punto di adesione e il resto della cellula viene richiamato, hanno bisogno di **punti di ancoraggio** per spostarsi, non hanno ciglia con cui muoversi. La fibrina, quindi, **lega la fibronectina** e le cellule grazie a questi punti di ancoraggio, che riconoscono grazie alle integrine esposte sulla superficie che hanno anche un'ancora citoplasmatica, **riescono a muoversi**. Le cellule riescono a spostarsi e a colonizzare questo spazio risultato dalla distruzione del tessuto che è stato riempito da sangue, se non avessimo il sangue a riempirlo le cellule non potrebbero fare questi movimenti, dovremmo mettere noi qualcosa di esterno per ricreare questa situazione. Le *ulcere* sono **perdite di tessuto con infiammazione cronica** che impedisce la formazione di vasi, sono molto difficili da curare, così come le *piaghe*. Le possibilità sono tagliare il tessuto necrotico ai margini di piaga o ulcere per ricostruire la zona, oppure dobbiamo farci aiutare anche da **biomateriali o biomimetici** che possono sostituire questi tessuti naturali. Questo è soltanto la fase della coagulazione, non abbiamo ancora parlato di piastrine. (Se rimuoviamo troppo presto una garza inglobata nella crosta rallentiamo la guarigione perché rimuovendola rompiamo il coagulo e stacchiamo la rete che si era formata e sanguina nuovamente). Le **piastrine poi rilasciano** altri fattori, hanno **citochine** particolari (PDGF, TGF beta, IGF-1, PAF, PDEGF, fibronectina che arricchisce quella già presente nel sangue, serotonina) questo porta allo sviluppo di un **tessuto iniziale** che mantiene una continuità. Il coagulo (crosta) si dispone a riempire lo spazio lasciato vuoto dalla distruzione e retrazione del tessuto. Il PDGF rilasciato è un fattore di motilità e di proliferazione per le cellule mesenchimali. I **fibroblasti nel tessuto normalmente sono quiescenti**, non replicano, ma replicano quando **sono stimolati** e il **PDGF** è uno dei fattori che li stimolano. Quando legano questa molecola che deve arrivare ai fibroblasti iniziano a **sintetizzare delle proteasi** che gli consentono di **liberarsi della matrice** che li tiene fermi, **proliferano e si muovono** perchè il PDGF ha effetto **chemiotattico** e si muovono verso gradiente di concentrazione. La maggior concentrazione è dove le piastrine hanno rilasciato il fattore che si diffonde dalla presenza di acqua data dal siero che fuoriesce, per cui il fatto di avere una ferita umida aiuta anche a **veicolare i fattori di crescita a distanza** (decine centinaia di micron) della sede della lesione. Lo **stimolo alla crescita** per cui è uno **stimolo locale**, non agisce su cellule molto distanti. Quando vogliamo stimolare cellule dobbiamo fare in modo che i fattori arrivino sulle cellule e se non vogliamo creare problemi all'organismo dobbiamo veicolare il più velocemente e precisamente possibile questi fattori, es con scaffold. Questi fattori rilasciati dalle piastrine in parte si vanno a **legare alla fibrina**, in parte **raggiungono le cellule** per cui quando si muovono riescono a ritrovarsi un fattore di concentrazione via via crescente alla zona della lesione, se intervenissimo con una soluzione fisiologica per lavare via facciamo sparire i gradienti e disorientiamo la crescita e migrazione delle cellule. La fibrina costituisce anche il **primo collante** e impedisce alla ferita di muoversi, questo **da stabilità alla crescita,** alla **deposizione di matrice** e alla **migrazione di cellule**, quindi il coagulo svolge diverse funzioni, è una barriera fisica, è ricco di fibrina che quando viene clivata svolge ruolo importante per **stimolare fibrinopeptidi che stimolano migrazione cellulare**, ricco di fibronectina, contiene piastrine che rilasciano molecole attive sulle cellule e costituisce quindi la **prima matrice provvisoria**. Rivista che ha pubblicato il primo articolo [Analisi western:] tecnica che si usa per preparare le proteine. Elettroforesi di ciò che è presente in un medium con piastrine. Nell'emostasi (primo stadio) si verificano due eventi molto importanti: - Formazione di fibrina - Aggregazione piastrinica. Le piastrine sono fondamentali. Inizialmente si sapeva soltanto ciò che era noto dalla coagulazione: la loro rilevanza deriva dal fatto che sono in grado di formare il tappo piastrinico bloccando la fuoriuscita del sangue. Soltanto nel 2000 si è osservato un evento: la presenza di tante proteine, prima assenti, nel sovranatante di una capsula piena di piastrine: si è visto che quando le piastrine venivano attivate, **comparivano nuove proteine** (visibili nelle bande nell'immagine a sinistra che prima non erano presenti).\ Queste proteine, nel tempo, sono state studiate e individuate: la maggior parte sono **fattori di crescita,** alcuni promuovono la crescita di vasi, di cellule epiteliali ecc. Dei farmaci sono composti da una molecola sola, ma in natura non avviene così, attualmente siamo primitivi negli approcci terapeutici, in contemporanee agiscono moliti fattori, la sinergia di azione di queste molecole è importante, se vogliamo sostituirle dobbiamo fare attenzione. Quindi, le piastrine quando si contraggono liberano PDGF, FGF, TGF-β, IGF, VEGF, EGF, KGF, SDF\... oltre a diverse interleuchine. A cosa servono queste proteine? La stessa cellula non è in grado di seguire due programmi contemporaneamente: se sta replicando non riesce a esprimere quei geni che la caratterizzano nelle sue funzioni (quindi geni che la caratterizzano nel differenziamento).\ Allora, avere un forte rilascio di fattori di crescita subito, per le cellule che sono presenti e che non sono state uccise dagli eventi legati all'infiammazione o dall'ischemia che si verifica in seguito alla rottura dei vasi, è un forte **stimolo a proliferare e a richiamare cellule vicine**; le cellule, tuttavia, vista la velocità con cui si muovono, impiegano tempo ad arrivare. È necessario prestare attenzione al fatto che, nello scenario dell'infiammazione, devono essere presenti tutte le cellule in una volta, e non bisogna ostacolare in alcun modo la progressione e l'attivazione di queste ultime; in caso contrario, non solo si ritarderebbe enormemente la guarigione, ma questa potrebbe addirittura essere impedita. Ad esempio, l'uso di certe pomate può ostacolare la migrazione cellulare e quindi si ritarda la guarigione.\ È stato detto che, i fenomeni con cui l'infiammazione si sviluppa sono orchestrati: alcuni possono avvenire solo se prima il terreno è stato preparato. Si vedono come fenomeni immediati: \- **sanguinamento\ - coagulazione** Non servono per la coagulazione, ma sono fattori di crescita attivi su vari tipi cellulari, ad esempio:\ - cellule mesenchimali come osteoblasti, condroblasti, fibroblasti\... \- cellule epiteliali Questi fattori di crescita hanno diverse **funzioni**:\ 1) agiscono come **chemiotattico\ **2) stimolano la **replicazione** 3\) stimolano il **differenziamento** Tabella: gli stessi fattori di crescita sono sintetizzati da più cellule e il target di questi fattori di crescita non sono una singola cellula, un singolo tipo cellulare, ma tutte quelle che hanno i recettori per questi fattori. È importante sapere che **un fattore agisce su più bersagli diversi** e più cellule danno una risposta perché non c'è un singolo elemento cellulare che porta alla riparazione del danno, ma è la cooperazione di più cellule che portano a guarigione, inoltre il fatto che sono **più cellule che sintetizzano stesso fattore** ci fa capire che abbiamo comunque la **presenza di quel fattore di crescita**, il fattore esercita azione per tempo lungo perché la cellula non è unica, **l'azione perdura nel tempo** e da una **garanzia di induzione e modulazione continua** della risposta riparativa nel tempo, spesso è necessario che presenti oscillazioni, perché la presenza continua porta ad incapacità della cellula di rispondere. Molti recettori vanno incontro a **down regulation** e la cellula ne esprimerà meno, fanno modulazione del segnale per rispondere nel migliore dei modi.