Virología - Virology PDF

Virología Juan Ignacio Pardou - 2022 0  Introducción a la virología Los virus son partículas muy pequeñas, de tan solo 20-300nm, (1 µm=1000nm) quienes se comportan como parásitos intracelulares obligados. Hay evidencias que sugieren que...

Virología Juan Ignacio Pardou - 2022 0  Introducción a la virología Los virus son partículas muy pequeñas, de tan solo 20-300nm, (1 µm=1000nm) quienes se comportan como parásitos intracelulares obligados. Hay evidencias que sugieren que los virus están presentes desde incluso antes que el 1580a.C. No existe una clara teoría que explique su surgimiento, sino que hay tres teorías posibles: − Teoría regresiva: Dice que los virus fueron originalmente un tipo de células pequeñas que parasitaban células más grandes. Con el paso del tiempo fueron perdiendo genes, quedándose con los imprescindibles para parasitar. − Teoría modular: Expresa que los virus podrían haberse originado a partir de fragmentos de material genético de células, que escaparon de ellas, de manera similar a los transposones. − Teoría de la coevolución: Sostiene que los virus podrían tener su origen en complejas biomoléculas, al mismo tiempo que aparecieron las más primitivas células, y desde entonces han sido dependientes de ellas. 1  La partícula viral La partícula viral madura se denomina virión, básicamente consiste en un bloque de material genético rodeado de proteínas que lo protegen del medio ambiente y le sirven de vehículo para su transmisión. Los virus pueden alternar entre dos estados, uno intra y otro extracelular. En el medio extracelular este virión es metabólicamente inactivo y solo sirve de transporte. La morfología de los virus hace referencia a este estado, en el que constan de ácidos nucleicos, una estructura que los recubre y sus enzimas. Los virus más simples y pequeños están constituidos por ácidos nucleicos y proteínas, el ácido nucleico es el genoma viral y se encuentra en el interior del virión, pudiendo ser ADN o ARN. Puesto que poseen escaso espacio para codificar la información, han evolucionado para lograr la máxima eficiencia replicativa con el menor número de genes. Generalmente el genoma está asociado con un pequeño número de moléculas proteicas que pueden tener actividad enzimática o cumplir alguna función estabilizadora para el plegamiento del ácido nucleico y armado del virion. El conjunto de genoma y proteínas asociadas se llama core, núcleo, nucleoproteína o nucleoide. Y este núcleo central está rodeado por una cubierta proteica, la cápside, que junto con el genoma constituye la nucleocápside. En algunos virus más complejos por fuera de la cápside se encuentra otra cubierta, la envoltura, que es una estructura membranosa lipídica provenientes de la célula hospedadora y glicoproteínas. A los virus que no posen envoltura, se los denomina desnudos. Cápside: Esta cubierta proteica que aloja el ácido nucleico en su interior tiene como misión protegerlo y reconocer los lugares de unión y penetración a las células, en el caso de los virus carentes de envoltura. Esta cubierta se encuentra formada por proteínas globulares denominadas capsómeros. La cápside protege al virus pero a su vez funciona de antígeno para el organismo invadido. A varias copias de una única proteína o pocos tipos de subunidades se les llama protómero. 2 La construcción en subunidades se da por: ▪ Necesidad: Los genomas virales pueden codificar pocas proteínas, pero pueden ser producidas rápidamente con alta eficiencia, siendo esta la solución más simple y práctica. ▪ Fidelidad: Al tratarse de genomas y proteínas pequeñas, disminuye el margen de error. ▪ Economía: Cada subunidad es formada con el gasto mínimo de energía, si existiese error, solo se descartaría una pequeña subunidad. Según la simetría, las cápsides pueden ser: ▪ Helicoidales: Capsómeros dispuestos helicoidalmente, sobre la hélice de ácido nucleico, adquiriendo forma de bastón, como por ejemplo el virus de la rabia. ▪ Icosahédricos: Adopta forma de poliedro de 20 caras triangulares obtenidas por la asociación de los capsómeros, pudiendo tener proteínas fibrilares que salen del icosaedro. Los adenovirus y el virus de la poliomielitis poseen esta disposición. ▪ Complejos: Los que no se adoptan a las simetrías anteriores, como la familia Poxviridae. o Autoensamblaje: Los virus son construidos de acuerdo con principios de diseño eficientes, por lo que son capaces de auto ensamblarse sin la participación de ningún factor organizador externo. A la vez, los virus pueden contrarrestar el problema de repulsión entre las cargas negativas presentes en los fosfatos de la proteínas mediante el empaquetado de moléculas con cargas positivas. Algunos virus icosahédricos, han sido sometidos a reconstrucción o reconstitución in vitro. Sin embargo, modificando las condiciones de estos experimentos, se han obtenido estructuras tubulares y otras variables morfológicas. Esto indica que las propiedades de empaquetamiento de las proteínas son las que determinan la estructura de la partícula viral. Este autoensamblaje es económico para los virus, ya que no requieren de información genética para lograrlo, así también proporciona un método sencillo y eficiente para eliminar subunidades defectuosas obtenidas durante la replicación viral. 3  Bacteriófagos: Estos son virus exclusivos de las bacterias, poseen genoma que puede ser ADN de simple o doble cadena. fagos pueden ser subdivididos en fagos de cola corta, fagos de cola larga no contráctil, y fagos con colas contráctiles y complejas que también pueden poseer otro tipo de estructuras como collares, placas basales y fibras A pesar de ser más complejos estructuralmente, los principios de ensamblaje de los bacteriófagos son similar a los de los virus que afectan a eucariotas. Las cabezas de los fagos tienen usualmente simetría icosahédrica mientras que su cola posee simetría helicoidal. Envoltura viral: Los virus envueltos obtienen la envoltura en el proceso de liberación por gemación. En dicha envoltura se insertan diferentes glicoproteínas de origen viral que se denominan espículas o glicoproteínas de superficie. Estas espículas son formadas por proteínas integrales de membrana que atraviesan la bicapa presentando tres dominios diferentes: ▪ Dominio hidrofílico hacia el exterior. ▪ Dominio hidrofóbico formado por aminoácidos que atraviesa la bicapa y se ancla a la membrana. ▪ Dominio hidrofílico hacia el interior. Este último dominio interactua con las proteínas de la nucleocápside directamente o a través de una proteína viral denominada proteína M. Estas glicoproteínas cumplen diferentes funciones, siendo esenciales para la infectividad, ya que actúan en la adsorción a la célula huésped, en el proceso de fusión que permite la entrada de la nucleocápside y a su vez son importantes en la gemación, permitiendo la salida del virus envuelto a partir de la célula infectada. Estas glicoproteínas son el blanco de reacción para el sistema inmune humoral y celular. 4  o Proteínas virales: La transcripción viral conduce a la síntesis de ARNm que codifica para proteínas, las cuales pueden ser: ▪ Proteínas tempranas: O también llamadas funcionales, son elementos no estructurales con actividad enzimática, quienes participan del ensamblaje de la partícula, la replicación del genoma, o en la modificación de la respuesta innata del huésped a la infección. ▪ Proteínas tardías: O estructurales, forman parte de la estructura viral. A su vez existen las viroporinas, que son proteínas de canales de transporte de iones. Ácidos nucleicos virales: Los virus poseen una única especie de ácido nucleico constitutiva, pudiendo ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario con estructura de doble hélice. o Tipos de ADN virales: La mayoría de los virus presenta ADN bicatenario, exceptuando los parvovirus y circovirus de ADN monocatenario. Estas moléculas tienen la facultad de ser circulares o lineales. El ADN circular de las familias Papovaviridae y Hepadnaviridae confiere protección frente al ataque de exonucleasas. En el caso de los papovavirus, el ADN puede presentar tres conformaciones: ▪ Forma I: Molécula circular covalentemente cerrada y superenrollada. Si se diera la ruptura en una unión de las cadenas, se desenrolla la doble hélice y resulta una molécula circular relajada (forma II). ▪ Forma III: Es el resultado de la ruptura en la otra cadena que origina una molécula bicatenaria lineal. El ADN doble circular incompleto de los hepadnavirus tiene una estructura muy peculiar y de características únicas dentro de los ADN virales: − Una de las cadenas (S, corta) es incompleta, de manera que el 15-50% de la molécula es monocatenaria. − La otra cadena (L, larga) posee una proteína covalentemente unida a su extremo 5´. − Los genomas de los hepadnavirus tienen tres (Avihepadnavirus) o cuatro (Orthohepadnavirus) marcos de lectura abiertos. o Tipos de ARN virales: En la mayoría son de cadena simple, siendo Reoviridae y Birnaviridae las únicas familias que presentan como genoma ARN bicatenario. En algunos grupos de virus el ARN puede estar segmentado en varias partes, siendo este número característico de cada familia. La polaridad o sentido de la cadena es una propiedad fundamental para definir los distintos tipos de ARN viral. Un virus es de cadena positiva cuando su ARN genómico tiene polaridad que le permite actuar como ARNm y ser traducido en proteínas inmediatamente al ingresar a la célula. Mientras que los de polaridad negativa son aquellos que tienen la secuencia complementaria al ARNm, por lo que al infectar, se debe sintetizar la cadena complementaria que será el ARNm. 5 Los virus de polaridad negativa llevan en su virión, una ARN polimerasa dependiente del ARN, llamada transcriptasa asociada al genoma que efectúa la transcripción del ARNm a partir del ARN genómico. Clasificación de los virus: o Nomenclatura: El nombre de los virus puede obedecer a diferentes cuestiones, como puede ser la enfermedad que producen (virus del polio), el nombre de los descubridores (virus del Epstein-Barr) o incluso las características estructurales de los mismos (Coronavirus). Incluso pueden tener un nombre derivado del lugar donde se los halló por primera vez (virus Coxsackie o Norwalk). El ICTV (International Committee on taxonomy of viruses) ha propuesto un sistema universal de clasificación viral utilizando diferentes taxones. o Clasificación de Baltimore: Agrupa a los virus de acuerdo a criterios como tamaño, simetría de la cápside, si son desnudos o envueltos, transmisión, huésped, ácido nucleico que contienen o enfermedad que causan. David Baltimore creo este sistema que consiste en clasificarlos en base a su ácido nucleico y mecanismo de replicación. Este esquema se basa en que los virus deben generar ARNm de simple cadena positivo a partir de su genoma para formar proteínas y replicarse, dividiéndolos en 7 grupos: o Mapas topográficos: Representan 1 de las 60 unidades estructurales del icosaedro. La topografía se ilustra coloreando las regiones según su distancia al centro del virus, conformando la distancia “Z”. Es posible ilustrar con distintos colores las zonas proteicas según la profundidad mediante el uso de programas informáticos y modelos virales 6  Ciclo replicativo de los virus Se llama ciclo replicativo al ciclo de vida que posee un virus dentro de su célula hospedadora. Los viriones o partículas virales existen en la fase extracelular, pero estos necesitan de una célula para poder replicarse y formar nuevas partículas virales. Este ciclo de replicación se puede dividir en varias etapas: ▪ Adsorción: Este proceso no requiere de energía y consiste en la unión específica de una proteína viral de unión, denominada antirreceptor a un receptor celular. Estos receptores pueden ser proteínas, de alta afinidad o residuos de carbohidratos. La presencia o ausencia de receptores en la superficie de la célula determina el tropismo de un virus; es decir, qué tipo de célula hospedadora es capaz de infectar. Cuando el virus ingresa y no es capaz de finalizar su ciclo replicativo, decimos que estamos ante una infección abortiva. Virus Receptor Función Virus de la inmunodeficiencia Antígeno de diferenciación de Receptor de señal felina (Retrovirus) leucocitos (CD9) Rotavirus porcino grupo A Ácido siálico Carbohidrato Virus de la influenza Ácido siálico Carbohidrato Coronavirus bovino Ácido siálico Carbohidrato Virus rábico (Rabdovirus) Receptor de acetilcolina Receptor de señal Rhinovirus ICAM-1 Receptor de señal Virus de la fiebre aftosa Integrinas 7 Algunos virus complejos como los poxvirus y los herpesvirus utilizan más de un receptor, por lo tanto poseen vías alternativas para ingresar a una célula. La unión a los receptores puede ser un proceso reversible; si no se produce la penetración del virus a la célula, el virus puede desprenderse de la superficie celular. El desprendimiento de la superficie celular después de haberse unido al receptor, generalmente conduce a cambios en el virus, como puede ser pérdida o alteraciones de las proteínas virales de unión, lo que produce una disminución o pérdida de las posibilidades uniones posteriores a otras células. En algunos casos se requiere de la interacción de co-receptores para lograr ingresar, este es el caso del HIV, quien utiliza los receptores CD4 de los linfocitos y a su vez requiere de quimiocinas. Otro es el caso de los adenovirus, quienes requieren de la unión de una proteína viral a la superficie celular y así mismo también necesitan de la unión de la proteína viral a una vironectina. Luego, dentro de los mecanismos indirectos para el ingreso, tenemos el caso de algunos virus que se unen a la región Fab de los anticuerpos y posteriormente se da la unión a moléculas receptoras para la Fc presentes en monocitos, macrófagos u otras células sanguíneas. Esto da como resultado el ingreso del virus y la posterior replicación dentro de la célula blanco. ▪ Ingreso: La penetración a la célula blanco ocurre casi inmediatamente luego de la unión del virus al receptor. Aunque, este proceso requiere de cambios conformacionales por lo que resulta dependiente de energía y a su vez de la temperatura. Este proceso difiere si el virus es desnudo y envuelto, aunque existe un mecanismo por endocitosis que es común para ambos tipos de virus. Otro tipo de ingreso es la inyección de genoma, como lo es el caso de los bacteriófagos. Dentro de los mecanismos de ingreso se encuentran: ▪ Translocación: La partícula viral atraviesa la membrana citoplasmática, pudiendo estar mediado por proteínas de la cápside y receptores específicos de membrana. Este mecanismo es usado por los virus desnudos Enterovirus y Picornavirus, dentro de los cuales se ubican los virus productores de la fiebre aftosa y la poliomielitis. ▪ Endocitosis: El virus ingresa mediante la formación de vesículas, con la posterior acción del pH para liberar el genoma viral dentro del citoplasma. Es el mecanismo más común de los virus tanto desnudos como envueltos. ▪ Fusión: Este solo se da en los virus envueltos, ocurre una fusión de la envoltura con la membrana celular, siendo directamente en la superficie celular o en una vesícula luego de la endocitosis. Este proceso requiere de un correceptor que permita la fusión especifica de la envoltura viral, uniendo la membrana celular y la viral, dando como resultado la liberación de la nucleocápside directamente en el citoplasma, no resultando dependiente de pH. ▪ Desnudamiento: En este paso, la cápside es removida parcial o totalmente dejando expuesto al genoma viral, en forma de core. La remoción de la envoltura viral en el caso de los virus envueltos ocurre durante la fusión de las membranas. En el caso de los virus que efectúan ingreso por endocitosis, la liberación del genoma se da por acción del pH. 8 Algunos virus pueden controlar este proceso, por ejemplo la proteína M2 del virus de la influenza actúa como un canal de membrana, que permite la entrada de iones hidrógeno en la nucleocápside, facilitando la pérdida de las envolturas. Esta proteína M2 es multifuncional y cumple también un rol en la maduración del virus. En las cápsides de herpesvirus y adenovirus se producen cambios estructurales luego de la penetración, esto les permite permanecer intactas durante cierto tiempo. Esta interacción permite el transporte de la cápside completa hasta el núcleo de la célula. La pérdida de envolturas se produce en los poros de la membrana nuclear, de esta manera al núcleo solo ingresa la nucleocápside. En los reovirus y poxvirus no ocurre una pérdida de envolturas completa, y muchas de las reacciones de replicación del genoma son catalizadas por enzimas codificadas por el virus, dentro de partículas citoplasmáticas. ▪ Replicación del genoma viral y síntesis de proteínas: La estrategia de replicación depende de la naturaleza del material genético del virus (clasificación de Baltimore). El objetivo final sea cual sea el genoma es el ARNm para poder sintetizar sus proteínas. ▪ Ensamblaje: Una vez finalizada la replicación y síntesis, todos esos componentes deben ser ensamblados para poder salir nuevos viriones iguales a los que han ingresado para poder infectar luego nuevas células. El sitio del ensamble depende del lugar de replicación del virus y del mecanismo por el cual el virus es liberado de la célula. Por ejemplo, los picornavirus, poxvirus y reovirus se ensamblan en el citoplasma, mientras que los adenovirus, herpesvirus y parvovirus lo hacen en el núcleo. Hay virus simples por lo general pequeños y desnudos que realizan un auto ensamble en donde hay señales de encapsidación para ensamblar la cápside y meter su genoma dentro de la cápside para salir de la célula. Los virus icosahédricos y envueltos hacen proteínas virales que pasan por el Golgi se empaquetan y se alinean en la membrana plasmática o de distintas organélas atrayendo componentes virales para gemar de la misma. Virus helicoidales como el de la rabia tienen capsómeros que se enrollan alrededor del ácido nucleico formando el virus helicoidal luego de recibir ciertas señales. Muchos virus producen altos niveles de concentración de componentes estructurales dentro de compartimentos subcelulares, estos se conocen como cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión son una característica común de los últimos estadios de la infección celular. El tamaño y ubicación de estas inclusiones en las células infectadas, -visibles con microscopio óptico- son generalmente características de algunos virus en particular: por ejemplo la infección con el virus de la rabia resulta en la formación de grandes inclusiones citoplasmáticas -perinucleares-, denominadas Corpúsculos de Negri. 9  ▪ Maduración: En simultaneo con la liberación, pudiendo darse antes o después. La maduración generalmente incluye cambios estructurales en la partícula viral, estos cambios pueden ser el resultado de cortes específicos de proteínas de la cápside para formar productos maduros, o de cambios conformacionales en las proteínas durante el ensamble. Estos eventos conducen frecuentemente a cambios estructurales sustanciales en la cápside. Es el proceso donde el virus se convierte en infecciosos gracias a enzimas proteolíticas codificadas por lo general en mismo virus. En conclusión este proceso es el cual el virus se prepara para infectar otra célula blanco. ▪ Liberación: Depende si es desnudo o envuelto. Los desnudos deben lisar/estallar la célula ya que no se llevan ninguna parte de la membrana. Una excepción son los herpesvirus desnudos que se liberan por gemación de la membrana nuclear ya que se replican en el núcleo y se llevan parte de la membrana nuclear, una vez en el citoplasma si ocurre el estallido celular para su liberación final. Este es el caso de los virus líticos. Los virus envueltos se liberan por lo general por gemación, adquiriendo su envoltura lipídica y las proteínas asociadas de la membrana. El tipo de membrana a través de la cual geman los virus depende del tipo de virus. Pudiendo ser a través de membranas de organélas celulares como en el caso de algunos bunyavirus y flavivirus, a través de la membrana citoplasmática como los ortomixovirus, coronavirus, Rabdovirus, hepadnavirus, o a través de la membrana nuclear como en los herpesvirus. La cápside con el genoma adentro se acerca a la membrana donde hay espículas alineadas (antirreceptoras para contactar a la otra célula hospedadora y poder entrar) saliendo de la célula y llevándose parte de la membrana hospedadora con proteínas de la célula dándose la gemación. 10  Replicación según la clasificación de Baltimore Virus de clase I: Virus de ADN de doble cadena. Estos se subdividen en dos grupos: o Replicación nuclear: Utilizan la ARN polimerasa nuclear, como el caso de las familias Herpesviridae, Adenoviridae, Poliomaviridae, Papilomaviridae. o Replicación citoplasmática: Virus evolucionados que han adquirido una ARN polimerasa ADN dependiente asociada al virión, por lo que son bastante independientes de la maquinaria celular. Es el caso de las familias Poxviridae y Asfarviridae. Llegan a la membrana nuclear en donde se asocian al complejo del poro nuclear. El ADN liberado se transporta al núcleo. La ARN polimerasa II transcribe genes y exporta los ARNm al citoplasma para sintetizar proteínas virales tempranas en los ribosomas de la célula hospedadora. Estas proteínas ingresan al núcleo en donde regulan la transcripción de los genes celulares y virales. Las proteínas tempranas incluyen las proteínas de replicación viral, que se importan al núcleo y cooperan con un número limitado de proteínas celulares en la síntesis de ADN viral. Algunas moléculas de ADN viral replicadas pueden servir como molde para nuevas rondas de replicación o para la transcripción de los genes tardíos (que codifican para las proteínas estructurales). Dentro del núcleo, las cápsides se ensamblan a partir de estas proteínas y los genomas virales de la progenie se encapsidan para formar viriones inmaduros no infecciosos. 11  Virus de clase II: Virus de ADN de cadena simple positivo, pudiendo ser lineal como en Parvoviridae o circular como el caso de Circoviridae y Anelloviridae. Al no poseer enzimas ADN ni ARN polimerasas, utilizan las celulares por lo que su replicación es nuclear. Las ADN polimerasas celulares replican el ADN viral para formar un intermedio de ADN de doble cadena, que se utiliza luego como molde para la transcripción de los ARNm virales. Estos sirven para la síntesis de proteínas tempranas y tardías. Virus de clase III: Virus de ARN de cadena doble, entre los que se encuentran las familias Reoviridae (rotavirus) y Birnaviridae. La replicación de estos virus tiene lugar en el citoplasma ya que poseen una ARN polimerasa ARN dependiente. Mediante la ARN polimerasa viral se sintetizan los ARNm y por otro lado se harán las copias de este genoma que luego se ensamblarán con las proteínas que fueron sintetizadas en los ribosomas. En el caso de los Rotavirus, desnudos pero con 3 cápsides, quienes tienen sus células blanco en el intestino por lo que deben atravesar varios segmentos del sistema digestivo luego de ingresar por la boca. A lo largo del pasaje por el tracto gastrointestinal tendrán un cambio conformacional en las capas externas del virus, activándolo y formando un túnel que permitirá inyectar el genoma en la célula intestinal. Luego de replicarse en el citoplasma pasan por el RE, donde se formarán las cápsides, posteriormente evacuan la célula por citólisis. 12  Virus de clase IV: Virus de ARN simple de sentido positivo, siendo similar al ARNm, por lo que pueden ser reconocidos por el ribosoma y traducirse directamente. Estos virus pueden dividirse en dos grupos: ▪ Los que producen ARNm monocistrónicos: Poseen varios codones de inicio, por lo que van a dar lugar a una proteína en cada lectura. Es el caso del orden Nidovirales, familias Coronaviridae y Arteriviridae ▪ Los que producen ARNm policistrónicos: Presentan un codón de inicio y uno de fin, por lo que su genoma (ARN +) actúa como ARNm. Este es traducido luego de la infección, resultando en la síntesis de una poliproteína, la que es posteriormente clivada para formar las proteínas maduras. Es el caso de las familias Picornaviridae (virus de la fiebre aftosa), Caliciviridae, Flaviviridae, Togaviridae y Astroviridae. Por ejemplo, los Picornavirus sintetizan una poliproteína de similar tamaño al genoma, capas de clivarse originando proteínas estructurales y no estructurales ya maduras. Estas estructuras se protegen por vesículas o membranas para no ser eliminadas en el citoplasma por acción de los mecanismos celulares. Luego se replica el genoma que se ensambla con las proteínas y sale de la célula. Por otro lado en cuanto a los Coronavirus, son más complejos ya que la hebra va al ribosoma y se lee en dos lecturas que dan origen primero a pequeñas proteínas no estructurales que forman un complejo de replicación para que se dé la segunda etapa de replicación, que consiste en el origen de proteínas estructurales. Su genoma replicado es menor al genoma original produciendo ARN subgenómicos (tamaño menor al original). Las proteínas estructurales pasan por el RE y Golgi para terminar de glicosilarse y salir por gemación de la célula hospedadora luego del ensamblaje. 13  Virus de clase V: Virus de ARN simple negativo, no siendo reconocidos por los ribosomas directamente. Por lo que necesitan de su ARN polimerasa ARN dependiente, siendo su replicación citoplasmática. Esta replicación generará una cadena opuesta a la original, que será (+), y si podrá ir al ribosoma para fabricar proteínas virales. Los genomas de estos virus pueden dividirse en dos grupos: Genomas segmentados Caso de la familia Ortomixoviridae, perteneciente al dominio Articulavirales. Y el otro dominio es el de los Bunyavirales, encontrándose las familias Arenaviridae, Hantaviridae y Peribunyaviridae. ▪ Genomas no segmentados Orden Mononegavirales. Familias Paramixoviridae, Rabdoviridae (rabia), Filoviridae, Pneumoviridae y Bornaviridae, siendo los dos últimos envueltos. Ejemplo de la familia Rabdoviridae. Ya que ninguna célula de mamíferos contiene una enzima capaz de transcribir y replicar ARN a partir de una cadena molde de ARN, el virus cuenta con su propia transcriptasa y replicasa. El virus penetra por endocitosis, cuando la nucleocápside alcanza el citoplasma, el genoma inmediatamente empieza a ser transcripto por la transcriptasa viral (polimerasa ARN dependiente), formando una hebra complementaria positiva que ira al ribosoma para producir proteínas estructurales y no estructurales. Una de esas proteínas será una polimerasa que dará origen a miles de copias del genoma del virus de la rabia (ssRNA-). Otras proteínas se glicosilarán en el RE y Golgi para luego ensamblarse y gemar de la membrana plasmática. En cuanto a los virus de la influenza, estos entran por medio de un endosoma. Una vez el genoma en el citoplasma la replicación ocurre por segmento ya que son segmentados y si o si deben pasar por el núcleo para robar los cap del ARNm celular, este es un capuchón que puede ser reconocido por los ribosomas para poder sintetizar las proteínas tempranas y tardías que se glicosilan en el RE y Golgi, se alinean en la membrana para ensamblarse y salir. En los virus segmentados se puede generar un reordenamiento genético intercambiando segmentos y originando así nuevas cepas. 14  Virus de clase VI: Virus de ARN simple positivo diploide, donde existen dos ARN positivos no complementarios y casi idénticos, con una forma ADN intermediaria. No puede actuar directamente como ARNm, sino que este sirve como molde para la síntesis de ADN por acción de la enzima viral transcriptasa reversa (RT). Este es el caso de la familia Retroviridae. El virus ingresa a la célula por endocitosis, la síntesis de ADN vírico, se produce en el citoplasma a través de la RT que cataliza la formación de ADN a partir de ARN genómico. El ADN creado pasa al núcleo celular y se integra en el genoma como provirus gracias a una integrasa del virión. Este provirus se comporta como un gen celular, tomando posesión de la célula de por vida, al quedar como provirus es capaz de traducirse en ARNm para realizar sus proteínas tempranas y tardías que se glicosilarán en el RE y Golgi para luego gemar de la célula. Virus de clase VII: Virus de ADN doble cadena, circular e incompleto con una forma ARN intermediaria. Poseen una cadena – completa y una cadena + incompleta, también utilizan la transcriptasa reversa (ADN polimerasa ARN dependiente), que al ser ADN polimerasa, al entrar a la célula puede reparar la cadena incompleta. Su replicación es primero en el núcleo y luego en citoplasma. Deben ir al núcleo para poder usar la ARN polimerasa para realizar sus propias proteínas. Corresponde a la familia Hepadnaviridae (virus de la hepatitis b humana). La infección de estos virus comienza luego de que la cápside ingresa a la célula y dentro de esta cápside preformada se comienza a hacer el ADN incompleto, el cual se libera en el núcleo y la transcriptasa reversa completa el ADN para formar una partícula superenrollada. Luego actúa la ARN polimerasa celular para transcribir los ARNm y producir proteínas en los ribosomas citoplasmáticos. Una vez que está en el citoplasma este ARN, actúa nuevamente la transcriptasa reversa para pasar el ARN viral a ADN viral, que puede volver al núcleo o ir a RE y el Golgi para terminar de formar la partícula viral y salir por exocitosis. 15  Patogenia de las infecciones virales Patogenia: Conjunto de mecanismos mediante los cuales un virus produce enfermedad en el hospedador. Patogenicidad: Capacidad del virus de producir enfermedad. Virulencia: Grado de patogenicidad de un virus. Tropismo: Es la especificidad de un virus por determinadas células de un órgano o tejido, esto se encuentra dado por la presencia de receptores específicos en la célula. Dentro de los requisitos para que se dé una infección viral se encuentran: ▪ Cantidad adecuada de virus o inoculo y su vía de transmisión. ▪ Presencia de células susceptibles. ▪ Defensas antivirales del hospedador ausentes o no efectivas. Susceptibilidad vs permisividad: La susceptibilidad es la presencia de receptores celulares, mientras que la permisividad es cuando la célula permite la entrada y replicación viral. Deben existir presencia de factores celulares requeridos por el virus para completar una infección productiva. La permisividad está influenciada por factores virales y también por aquellos inherentes al hospedador. ▪ Infección productiva: Aquella donde existe un ciclo de replicación completo con la producción de progenie viral, se lleva a cabo en las células permisivas a la infección. ▪ Infección abortiva: El virus infecta a una célula susceptible pero no completa el ciclo de replicación, no necesariamente es benigno para la célula. Interacción virus – célula hospedadora: Las alteraciones a nivel celular pueden ser: ▪ No citopáticas: No existen cambios morfológicos, generalmente son infecciones persistentes, pueden implicar alteraciones metabólicas, inhibición de síntesis, etc. ▪ Citopáticas: Presentan alteraciones, se las conoce como efecto citopático (ECP). Dentro de los ejemplos de ECP, encontramos: − Lisis celular, típico ECP de los virus desnudos. − Sincitios o sincicios, se forman células gigantes multinucleadas por fusión celular, se da en virus envueltos con inserción de proteínas de fusión en sus membranas celulares. Como el caso de Paramixovirus, Coronavirus y algunos Herpesvirus. − Cuerpos de inclusión, los cuales pueden ser citoplasmáticos o intranucleares. − Transformación celular. Patogénesis a nivel del hospedador: Se debe tener en cuenta las vías de transmisión de los virus, pudiendo ingresar por aerosoles, contaminación fecal-oral, vía venérea, por vectores como artrópodos, transmisión conjuntival, entre otras. 16 Luego del ingreso, los virus se diseminarán en el organismo, que puede ser de diversas formas: ▪ Diseminación en los epitelios: Los virus replican primero en las células epiteliales en el sitio de entrada y producen una infección localizada. La diseminación de la infección sobre las superficies epiteliales ocurre por la infección secuencial de las células vecinas, y dependiendo de cada virus en particular puede o no haber diseminación a los tejidos subepiteliales adyacentes. Un ejemplo son los Papillomavirus. ▪ Diseminación por vía linfática: Algunos virus pueden atravesar la barrera epitelial e invadir el tejido subepitelial mediante estrategias como la migración dentro de células fagocíticas. Al invadir estas células, migran hacia los linfonodos regionales por medio de los vasos aferentes. Los virus pueden diseminarse, mediante de los vasos eferentes, desde los linfonodos regionales hacia el torrente sanguíneo, y luego ser distribuidos rápidamente a través del organismo, ya sea dentro de las células o como viriones libres. Los órganos que actúan como filtros de la sangre (pulmón, hígado y bazo) son frecuentemente órganos blanco de los virus que producen infecciones generalizadas. Ejemplo virus del moquillo. ▪ Diseminación por vía hematógena (viremia): Es la vía más efectiva para la diseminación. El ingreso inicial del virus a la sangre luego de la infección se denomina viremia primaria, esta conduce a la localización del virus en los órganos. La replicación viral en los órganos blanco lleva a una producción de altas concentraciones de virus, produciendo una viremia secundaria y la posterior infección sistémica. En la sangre, los viriones pueden circular libres en el plasma o bien contenidos en células. Algunos virus tienen tropismo a diferentes poblaciones leucocitarias. La viremia asociada a monocitos es una característica del virus del moquillo canino (familia Paramixoviridae), la viremia asociada a linfocitos es una característica del virus de la enfermedad de Marek (familia Herpesviridae) y de la leucosis bovina (familia Retroviridae). Se dice viremia pasiva cuando el virus va en tránsito y activa cuando se encuentra infectando. 17  ▪ Diseminación por vía nerviosa: A su vez esta puede ocurrir luego de la diseminación hematógena. Los viriones de los herpesvirus viajan al sistema nervioso central a través del citoplasma de los axones infectando secuencialmente las células de Schwann de la vaina nerviosa, a su vez los herpesvirus pueden trasladarse desde los ganglios hacia piel y mucosas. Los virus de la rabia y de la enfermedad de Borna también migran hacia el sistema nervioso central por el citoplasma de los axones, pero generalmente no infectan la vaina nerviosa. Los nervios de los sistemas motor, sensorial y autónomo pueden estar involucrados en la diseminación neural de estos virus. Una vez producida la diseminación viral, el virus puede permanecer en dicho organismo formando una infección persistente, o bien salir de este para infectar a otros organismos. Para salir de este organismo puede utilizar las mismas vías por las que ha ingresado. Los factores que favorecen la transmisión viral son: ▪ Estabilidad y concentración viral, donde los virus desnudos son más estables. ▪ Excreción viral asintomática. ▪ Respuesta inmune inefectiva. Modos de transmisión: ▪ Horizontal: La transmisión entre poblaciones susceptibles ocurre en cualquier momento luego del nacimiento y puede ser por: − Contacto directo entre un animal infectado y uno susceptible. − Contacto indirecto: Mediante fomites (elementos inanimados), vehículo común (agua y alimentos), vía aerógena (aerosoles, polvo) o vía vectores. Dichos vectores pueden ser mecánicos, donde no existe ingreso del virus al vector o biológicos, donde si existe infección y replicación interna. Se llama arbovirus a aquellos virus que utilizan vectores biológicos. La transmisión vertical se da de madre a hijo, por intercambio de sangre a través de la placenta, por vía congénita, genómica o por vía calostral/leche. Se habla de transmisión iatrogénica cuando la infección es causada por el profesional. Tipos de infecciones in vivo: ▪ Infección inaparente, subclínica o asintomática: No hay manifestación de signos clínicos. ▪ Infección sintomática: Posee todas las características típicas de la enfermedad. ▪ Infección viral aguda: El virus alcanza un pico en corto tiempo, produciendo las lesiones. Luego desaparece en corto tiempo. ▪ Infección viral crónica: El virus posee un pico agudo y luego persiste de forma intermitente durante largos periodos. ▪ Infección viral latente: Existe una infección aguda, para luego quedar latente en algún sitio blanco, durante ese tiempo no se detecta presencia de virus, pueden volver a reactivarse. 18  ▪ Infección viral lenta: Carecen de infección aguda, dura largos periodos hasta manifestarse. ▪ Infecciones transformantes: Se produce una transformación de las células normales a tumorales, esto ya que el virus puede insertar secuencias virales cerca de los genes celulares involucrados en el crecimiento celular (c-onc). A su vez presentan oncogenes virales (v-onc) e inactivan genes supresores de tumores. Estas células transformadas pierden la inhibición por contacto y anclaje, contienen antígenos virales, presentan alteraciones a nivel del cromosoma e inducen tumores cuando se inyectan en animales susceptibles. Epidemiología viral La epidemiología de las enfermedades virales es el estudio de los factores determinantes, de la dinámica y de la distribución de las enfermedades virales en las poblaciones. El riesgo de infección o enfermedad en una población está determinado por las características del virus, del hospedador y de la población susceptible, así como por factores de comportamiento, ambientales y ecológicos que afectan la transmisión viral desde un hospedador a otro (triada ecológica). La epidemiología intenta combinar estos factores en una unidad integral. 19 El término persistencia viral hace referencia a la supervivencia de los virus dentro de sus hospedadores durante largos períodos. Este concepto puede abordarse en tres aspectos o dimensiones diferentes: o Nivel celular: La infección y la destrucción celular se encuentran limitadas. Los genomas virales se replican en forma equilibrada con la multiplicación celular. o Nivel organismo: Esto dependerá de lo que sucede a nivel celular y de la evasión de los mecanismos de defensa del hospedador. Dentro de las estrategias se encuentran: − Virus de ARN: ▪ Mutaciones: Para lograr cambios en el rango de hospedadores y escapar a la respuesta de anticuerpos y linfocitos T citotóxicos. ▪ Tolerancia inmunológica: Los virus de ARN no utilizan enzimas celulares, algunos se transmiten verticalmente, inducen tolerancia inmunológica infectando al hospedador en la etapa previa al desarrollo del sistema inmunológico durante la gestación; de esta manera persisten en el individuo infectado replicándose sin interferencia del sistema inmune. -por ejemplo del virus de la diarrea viral bovina –Familia Flaviviridae-. ▪ Infección de células del sistema inmunológico: Infectan células inmunes, pasando desapercibidas y alcanzando el órgano blanco con facilidad. ▪ Vehiculización en células del sistema inmunológico: Como el virus del moquillo canino, virus de la diarrea viral bovina, etc. ▪ Producción de señuelos: Los de la familia VII, Hepadnaviridae, producen proteínas que entretienen al sistema inmune mientras se replica. − Virus de ADN: ▪ Latencia: Como los herpesvirus, quedan latentes, invisibles para el sistema inmune para luego reactivarse. ▪ Integración al genoma celular: Como los retrovirus (ARN con transcriptasa reversa), una vez en el genoma persisten allí. ▪ Inhibición de la expresión de MMHC I. ▪ Producción de homólogos de interleuquinas, receptores de FC solubles. ▪ Pueden utilizar las enzimas celulares y replicarse en forma ocasional sin una gran necesidad de transcribir su material genético a proteínas estructurales, las que podrían estimular a la respuesta inmunológica. Esta estrategia es utilizada por virus como los retrovirus y por papillomavirus y herpesvirus. o En la naturaleza: Los virus persisten en la naturaleza cuando poseen la capacidad de ser transmitidos de un hospedador a otro, sin importar la especie. 20 Para permitir esta persistencia, algunos virus han desarrollado una gran adaptabilidad a un amplio rango de hospedadores susceptibles. A su vez, la persistencia prolongada de un virus en la naturaleza se encuentra condicionada por: − Influencia del estado clínico del hospedador: La diseminación dependerá de los tipos de infecciones in vivo. Al no haber signos aparentes, las enfermedades subclínicas son más importantes como fuente de diseminación viral que aquellas que resultan clínicas. En la mayoría de las infecciones agudas, el virus posee un título demasiado alto, lo que también sería una gran fuente de diseminación, existiendo signos clínicos o no. Por otro lado, las infecciones persistentes permiten la perpetuación de las infecciones en la naturaleza por largos periodos de tiempo. − Influencia de la virulencia del virus: La virulencia condiciona directamente la probabilidad de transmisión. Las cepas virales ubicadas en los extremos del espectro de virulencia no podían persistir en la naturaleza, mientras que las cepas de virulencia intermedia han circulado en la naturaleza durante mucho tiempo. − Influencia del tamaño y densidad de la población: La supervivencia de los virus durante largos periodos requiere que sea transmitido continuamente de un hospedador a otro, en algunos casos se requiere de una población susceptible muy grande para permitir este ciclo. Incluso el virus podría desaparecer si se agota su abastecimiento de huéspedes, en medida que estos adquieren inmunidad. Si una población se encuentra muy dispersa sobre un área, la tasa de diseminación es menor y la epidemia durará más tiempo, esto debido a la menor densidad poblacional de individuos susceptibles para mantener la cadena de transmisión. En este tipo de situaciones, es muy probable que se produzca un corte en la cadena de transmisión. − Influencia de la inmunidad de la población hospedadora: Al dispersarse la inmunidad en forma masiva, conduce a establecer inmunidad en la población hospedadora, afectando o interrumpiendo la transmisión viral. Algunos virus poseen la capacidad de variación antigénica. Se denomina infección endémica cuando la infección está circulando constantemente en el ambiente. Mientras que la infección epidémica es cuando se producen brotes de enfermedades que no estaban, es abrupto. − Influencia de los ciclos de transmisión zoonóticos: Existen virus que pueden infectar múltiples hospedadores y diseminarse infectando diferentes especies de un mismo filum del reino animalia. Las especies animales que replican estos virus sin presentar síntomas se denominan reservorios. Zoonosis se usa para describir aquellas infecciones que afectan hospedadores múltiples que son transmisibles de los animales al hombre. 21  − Influencia de los ciclos de transmisión con artrópodos: Mediante los arbovirus, estos han evolucionado afectando un amplio rango de hospedadores en diferentes filum del reino animalia. Los arbovirus (arthropod borne virus) tienen dos clases de hospedadores, vertebrados e invertebrados. Algunos de estos arbovirus son transmitidos por garrapatas, mosquitos u otros insectos. En los artrópodos, la transmisión puede ser mecánica o biológica (arbovirus). Familias virales de interés en Veterinaria que incluyen arbovirus entre sus miembros: ▪ Asfarviridae: Género Asfivirus. Virus de la peste porcina africana. ▪ Reoviridae: Género Orbivirus. Virus de la lengua azul. ▪ Togaviridae: Género Alfavirus. Virus de la encefalitis equina del este. Virus de la encefalitis equina del Oeste. Virus de la encefalitis equina venezolana. ▪ Flaviviridae: Género Flavivirus. Virus de la fiebre amarilla. Virus del dengue. Virus de la encefalitis de San Luis. Virus del Nilo Occidental. ▪ Peribunyaviridae: Género Orthobunyavirus. Orthobunyavirus Akabane ▪ Rabdoviridae: Género Vesículovirus. Virus de la estomatitis vesicular. Factores que evitan la extinción viral: ▪ Variantes virales ▪ Estabilidad de la partícula fuera del hospedador ▪ Quasiespecies ▪ Carga viral ▪ Tipos de infecciones 22  Zoonosis La ONU definió como zoonosis a las enfermedades e infecciones que se transmiten naturalmente entre vertebrados y humanos. Ciertas enfermedades infecciosas causadas por virus como el de la rabia (Familia Rhabdoviridae, Género Lyssavirus) y el de la fiebre amarilla (Familia Flaviviridae, Género Flavivirus), conocidas desde hace siglos, son zoonosis que no han podido ser erradicadas a pesar de enormes esfuerzos. 60% de todas las enfermedades infecciosas en humanos son transmitidas por animales, y el 75% de las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes provienen de animales. Clasificación de las zoonosis: − Según agente infeccioso: ▪ Virales ▪ Bacterianas ▪ Parasitarias ▪ Fúngicas ▪ Priónicas − Según reservorio: ▪ Zooantropozoonosis: Infecciones transmitidas al humano por otros vertebrados. ▪ Antropozoonosis: Infecciones transmitidas por el humano a los animales. ▪ Anfixenosis: Son transmitidas en ambos sentidos. − Según mecanismo de transmisión: ▪ Zoonosis directas: Se transmiten de huésped a huésped susceptible por contacto directo, objeto contaminado o vector mecánico, no viéndose modificado el agente infeccioso durante la transmisión. Como por ejemplo la rabia. ▪ Metazoonosis: Infecciones transmitidas mediante arbovirus, habiendo replicación en él. ▪ Ciclozoonosis: Para completar su ciclo evolutivo, requiere de más de un hospedador vertebrado. Es el caso de las tenias humanas y equinococosis, no existiendo virus en esta. ▪ Saprozoonosis: Tienen huéspedes vertebrados y un lugar de desarrollo no animal, como en materia orgánica, suelo, etc. Son ejemplo de algunas micosis, no existen virus en esta. Ejemplos de zoonosis virales según la clasificación de Baltimore: o Virus de tipo I: − Familia Poxviridae, Subfamilia Chordopoxvirinae, Género Parapoxvirus ▪ Virus de la viruela bovina: En humanos produce el nódulo de los ordeñadores. ▪ Virus Orf: Produce ectima contagioso en ovejas, cabras y humanos, es ocupacional. 23  − Orden Herpesvirales, Familia Herpesviridae, Subfamilia Alphaherpesvirinae, Género Simplexvirus ▪ Hespesvirus simiae: Afecta monos y humanos, presenta cápside icosahédrica con proteínas globulares fuera de ella, llamándose tegumento. Recubriendo la cápside hay una envoltura de numerosas glicoproteínas. Se transmite por mordeduras, arañazos, fomites, contacto de mucosas, aerosoles. Poca prevalencia en humanos, alta mortalidad. Posee latencia. o Virus de tipo II: − Familia Parvoviridae, Subfamilia Parvovirinae, Género Admovirus ▪ Virus de la Enfermedad Aleutiana del visón: Afecta visones y humanos no está confirmada. o Virus de tipo IV: − Orden Nidovirales. Familia Coronaviridae, Género Coronavirus ▪ SARS-CoV: Virus del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (gato civeta/humanos) ▪ MERS-CoV: Síndrome Respiratorio de Oriente Medio (camellos/humanos). ▪ SARS-CoV2: COVID-19. (murciélago?/pangolín?/humanos) − Familia Flaviviridae, Género Flavivirus. ARN simple+, policistrónicos, metazoonosis y arbovirus. ▪ Virus de la fiebre amarilla urbana y selvática (monos/mosquitos/humanos) ▪ Virus del Dengue (mosquitos/humanos) ▪ Virus del Oeste del Nilo (aves/equinos/mosquitos/humanos) ▪ Virus de la Encefalitis de San Luis (roedores/aves/mosquitos/humanos) − Familia Togaviridae, Género Alphavirus ARN simple+, policistrónicos, metazoonosis y arbovirus. Aves/equinos/mosquitos/humanos. ▪ Virus de Encefalitis equina del este: Hábitats pantanosos, ciclo enzoótico entre aves reservorio y huéspedes amplificadores. Las aves poseen alta viremia, no así los hospedadores finales. ▪ Virus de Encefalitis equina del oeste: Ciclo enzoótico entre aves y mosquito. En el ciclo epizoótico, las aves participan como amplificadores. ▪ Virus de Encefalitis equina Venezolana: Transmisión enzoótica entre roedores y otros vertebrados reservorio. En el ciclo epizoótico, los mosquitos actúan de vectores y los huéspedes amplificadores son los equinos. − Orden hepelivirales, familia Hepeviridae, género Ortohepevirus, especie Orthoepevirus A ▪ Virus de la Hepatitis E: ARN simple+ policistrónico, (cerdo/humanos). Este desde el cerdo al humano se contagia de forma esporádica mediante el consumo de carne del cerdo mal cocida. − o Virus de tipo V: 24  − Orden Mononegavirales. Familia Rabdoviridae, Género Lissavirus ▪ Virus de la Rabia: Este virus helicoidal envuelto, de ARN simple- afecta todas las especies de sangre caliente, siendo una zoonosis directa. El reservorio son los murciélagos frugívoros, insectívoros y hematófagos. Posee una letalidad de casi 100%. Posee ciclos rurales, silvestres, aéreos, rural, terrestre y urbano. − Orden Mononegavirales. Familia Paramixoviridae, Subfamilia Paramixovirinae, Género Henipavirus ▪ Virus Hendra: Zoonosis rara y grave. Afecta equinos/humanos/murciélagos fructíferos, siendo estos últimos los reservorios. Letalidad de 75% en equinos y 57% en humanos provocando encefalitis. ▪ Virus Nipah: Afecta porcinos/humanos/murciélagos fructíferos, causando encefalitis, es una zoonosis grave. ▪ Virus de la Enfermedad de Newcastle: Zoonosis leve, afecta aves/humanos, causando en estos últimos conjuntivitis. − Orden Mononegavirales. Familia Filoviridae, Género Filovirus ▪ Virus Ébola: Afecta humanos/monos/murciélagos, estos últimos son los reservorios, la propagación más importante es de hombre a hombre. Muy peligroso y altamente transmisible. ▪ Virus de Marburg: Causa enfermedad grave y mortal, murciélagos reservorio, transmisión de hombre a hombre. Ambos causan fiebres hemorrágicas, ambos requieren de nivel 4 de aislamiento. − Orden Bunyavirales. Familia Hantaviridae, Género Hantavirus Todos presentan ARN simple- circular. ▪ Virus sin nombre: Causa síndrome pulmonar por Hantavirus, los roedores son reservorio. ▪ Virus Andes: Causa síndrome cardiopulmonar por Hantavirus, síndrome renal y hemorrágico, se transmite por el ratón colilargo y único de transmisión persona a persona. Presente en Chile y Argentina. ▪ Virus Hantaan: Produce fiebre hemorrágica con síndrome renal. (ratones/humanos) − Orden Bunyavirales. Familia Arenaviridae, Género Arenavirus ▪ Virus Junín: Fiebre hemorrágica Argentina o mal de los rastrojos, reservorio es el ratón maicero o de los pastizales. ▪ Virus de la Coriomeningitis linfocitaria: Transmitida por roedores, incluso los caseros como hámsteres. (ratones/humanos). 25  − Familia Ortomixoviridae, Género Influenza A (reordenamientos frecuentes) ▪ Virus de la gripe: Se subdividen en varios subtipos en base a la combinación de dos proteínas, la hemaglutinina (H) de 18 subtipos y la neuraminidasa (N) de 11 subtipos. Afectan aves, cerdos y humanos. En aves se encuentra la Influenza A (H5N1, H7N9, H9N2), en cerdos la más importante es la Influenza A H1N1 y existiendo la H3N2. Como particularidad, en el cerdo se pueden recombinar los virus de aves, cerdos e incluso humanos provocando nuevas cepas. Zoonosis causadas por priones: Los priones son proteínas celulares normales mal plegadas, capaz de transmitir su forma mal plegada a otras variedades de la misma proteína. Se los considera virus no convencionales al no tener material genético. Estos causan encefalopatías espongiformes transmisibles, afectando bovinos, ovinos, felinos, humanos, visones y ciervos. Son enfermedades crónicas y progresivas sin respuesta inmune. Las PrPc (proteína celular) poseen 43% de α-hélice y 3% de lámina-β, son glicoproteínas de membrana presentes en casi todos los tejidos, mayor expresión en el sistema nervioso y son solubles y sensibles a proteasas. Mientras que las PrPSC (proteína priónica SCarpie) poseen un 43% de lámina-β, son insolubles y presentan resistencia parcial a proteasas, a su vez resisten la inactivación por nucleasas, formalina, radiaciones, ebullición, álcalis y solventes orgánicos pudiendo sobrevivir incluso a autoclave a 132º por más de 2hs. Estas proteínas se acumulan formando placas amiloides, las que terminan desencadenando los daños nerviosos. Los priones producen una neuro invasión por las vías nerviosas del tracto digestivo luego de ser ingeridas por vía oral. Para diagnóstico se hace examen histopatológico de SNC, western blot para determinar presencia de PrPSC y no existe prueba in vivo. − Encefalopatía espongiforme bovina o mal de la vaca loca: Esta enfermedad es la única causada por priones que esté demostrada que además de afectar a bovinos y rumiantes exóticos como antílopes también es zoonótica. Cuando el hombre se contagia de esta a partir de la carne infectada, se da una nueva variante de su propia encefalopatía espongiforme, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. A su vez se encuentran encefalopatías espongiformes potencialmente transmisibles en diversas especies como: ▪ Scrapie en ovinos y caprinos. ▪ Encefalopatía espongiforme felina. ▪ Encefalopatía transmisible del visón. ▪ Enfermedad de desgaste crónico o ciervo zombie. 26  Niveles de riesgo biológico en virología ▪ Riesgo: Posibilidad de injuria, daño o pérdida. ▪ Riesgo biológico: Posibilidad de riesgo a partir del manejo de biológicos, como microorganismos. Existen 4 diferentes niveles de riesgo biológico, siendo 1 el mínimo y 4 el máximo: ▪ Riesgo I: Riesgo individual y poblacional nulo o escaso. Como hepatitis canina, no afecta al humano. ▪ Riesgo II: Riesgo individual moderado y poblacional bajo. Como el Poxvirus bovino, Parvovirus, Vesículovirus, Herpesvirus equino y canino, Virus Influenza (no aviar), Retrovirus, virus con virulencia modificada. ▪ Riesgo III: Riesgo individual elevado y poblacional moderado. Por ejemplo, Herpesvirus simiano, Virus de la Enfermedad de Newcastle, Virus de la Fiebre Amarilla, Virus del Dengue, Virus de la Encefalitis de San Luis, Virus de la Encefalitis Equina Venezolana, del Este y del Oeste, Virus del Nilo Occidental, SARS, Virus de la Rabia, Virus de la Fiebre Aftosa. ▪ Riesgo IV: Riesgo individual y poblacional elevados. Como Virus Ébola, Virus Hendra, Virus Nipah, Virus Junín, Hantavirus. La asignación de niveles de riesgo biológico tiene como finalidad proponer requerimientos claros de contención para cada uno de ellos. Se define como bioseguridad al conjunto de métodos tendientes a minimizar el riesgo asociado al manipuleo de los microorganismos mediante la protección de trabajadores, entorno, animales y el medio ambiente. Involucra tanto técnicas de laboratorio como equipos de seguridad, diseño de instalaciones, etc. 27  Enfermedades virales emergentes y re-emergentes ▪ Enfermedad emergente: Enfermedad producida por un agente que es observado por primera vez. ▪ Enfermedad re-emergente: Enfermedad que reaparece luego de haber estado presente en una localización determinada y haber sido controlada o erradicada. Muchas de las enfermedades emergentes son zoonosis, e incluso el 30% de ellas causadas por arbovirus. Los virus pueden transformarse en patógenos emergentes por su capacidad de adquirir nuevas características biológicas que les permiten sobrevivir infectando nuevos hospedadores y adaptándose a nuevos nichos ecológicos. Factores que influyen en la emergencia y re-emergencia: o Factores inherentes al virus: Los virus de ARN son los principales causales de las enfermedades emergentes y re-emergentes, esto se debe a: ▪ Alta capacidad de mutación ▪ Rápidos ciclos de replicación ▪ Genomas pequeños ▪ Abundante progenie viral o Factores no inherentes al virus: ▪ Cambios demográficos y sociales: Superpoblación, guerras, cambios en el comportamiento. ▪ Globalización: Aumento comercio, transporte de animales, viajes. ▪ Cambios ambientales: Deforestación, el niño, sequías, inundaciones, intensificación de producciones (priones). La deforestación permitió la re-emergencia de las fiebres hemorrágicas en Argentina (virus Junín), Bolivia (virus Machupo) y Venezuela (virus Guanarito). ▪ Actividades médicas: Trasplante de órganos y tejidos, uso indiscriminado de antibióticos, siendo los cerdos los más adecuados. ▪ Invasión de nichos ecológicos silvestres: Como por ejemplo el ébola. ▪ Adaptación y cambio de los microorganismos: Incremento de virulencia, adaptación, resistencia, permitiendo el salto de las barreras de defensa de las especies (HIV-1 y 2). 28  ▪ Variabilidad genética: Permite evadir la respuesta inmune y vacunal, confiere resistencia a antivirales y permite aumentar rango de hospedadores. − Mutación: Se deben a los errores inducidos por la ARN polimerasa viral. − Recombinación: Tanto en ARN como ADN, involucra intercambio de material genético, pudiendo ser entre virus o virus y células. − Reordenamiento de genes: Adquisición de nuevos segmentos genómicos durante la co-infección celular. Como los virus de la gripe, donde la adquisición de nuevos genes de la hemaglutinina y neuraminidasa (antígenos virales más importantes) lleva a que estos antígenos no sean reconocidos por los anticuerpos neutralizantes presentes en la población humana. Este cambio en la especificidad antigénica se lo conoce como “cambio antigénico mayor” (antigenic shift) Ejemplos de enfermedades virales emergentes y re-emergentes: o Orden Bunyavirales: − Flia Hantaviridae: No son arbovirus, los roedores son los reservorios. El virus se disemina por orina, heces y saliva por largos periodos. La transmisión al hombre ocurre por inhalación o contacto directo con material contaminado. Transmisión entre seres humanos infrecuente. Único del orden que no vectoriza. Asociada a los cambios climáticos, donde generan condiciones favorables para aumentar la alimentación y reproducción de los roedores, aumentando la incidencia de la enfermedad. La enfermedades ocasionadas en el hombre se agrupan en dos síndromes: ▪ Fiebre hemorrágica con síndrome renal (hantavirus de Europa y Asia). ▪ Fiebre hemorrágica con síndrome pulmonar (hantavirus de América). El hantavirus Sin Nombre es el más común en América del Norte y el virus Andes es más prevalente en Argentina y Chile. − Flia. Peribunyaviridae: ▪ Shamoda – Sathuperi Orthobunyavirus (Virus de Schmallenberg, SBV): Emergió en Europa en 2011 como agente de malformaciones fetales en rumiantes. El virus ocasiona efectos teratogénicos en la hembra gestante luego de la transmisión vertical al feto. Los animales pueden ser abortados o morir poco después del nacimiento como consecuencia de la infección. La severidad de las lesiones fetales depende del momento de la gestación en el que se produzca la infección, siendo más grave cuando el tejido nervioso se está diferenciando. Son arbovirus al igual que muchos de la familia Bunyavirales. − Flia. Phenuiviridae: ▪ Género Bandavirus: (Previamente denominado Virus Huaiyangshan o virus del síndrome de la fiebre severa con trombocitopenia [SFTSV]). Se han identificado 5 especies de garrapatas capaces de transmitir al virus. A pesar de que la enfermedad se creía erradicada en Agosto de 2020 se registraron nuevos casos mortales 29  − Flia. Arenaviridae: ▪ Género Mammarenavirus: − Fiebre hemorrágica argentina: Mammarenavirus argentino (virus Junín). − Fiebre hemorrágica boliviana: Mammarenavirus Machupo (virus Machupo). − Mammarenavirus Chapare (virus Chapare). El virus Chapare es el agente causal de un brote reciente que ocasionó 3 muertes recientes en Bolivia (2019). Este virus ocasionó un primer brote hace 16 años en una localidad rural de la zona tropical de Cochabamba; aún no se logró identificar al reservorio animal (roedor). − Fiebre hemorrágica brasilera: Mammarenavirus brasilero (virus Amapari) − Fiebre hemorrágica venezolana: Mammarenavirus Guanarito (virus Guanarito). Otros Arenavirus emergentes y re-emergentes: − Mammarenavirus Lassa: Virus de la fiebre de Lassa (África) − Mammarenavirus de Coriomeningitis linfocitaria (mal de los rastrojos): Encefalitis en hombre, baja letalidad, transmisión por roedores, estos tienen transmisión vertical. Nivel de bioseguridad IV. − Flia. Paramyxoviridae: ▪ Virus Menangle: No ha sido asignado a ningún género. Según caracterización molecular pertenecería a los Rubulavirus. Defectos congénitos y muerte en cerdos, reservorio en murciélagos de la fruta, zoonosis con síntomas gripales. ▪ Género Henipavirus: − Hendra Henipavirus (virus Hendra), es un virus zoonótico, su reservorio es el murciélago de la fruta o zorro volador. Ocasiona signos respiratorios severos en equinos, muerte de 1 a 3 días y mortalidad del 75%. Infección al hombre por contacto con equinos infectados, provocando neumonía, forma crónica es la meningoencefalitis. − Nipah Henipavirus (virus Nipah): Trastornos respiratorios y nerviosos en cerdo, zoonosis, reservorio murciélago frugívoro. Encefalitis en humanos, mortalidad del 40-70%. − Langya Henipavirus: Agosto de 2022, se asocia a fiebre, tos, vómito y presencia de leucopenia y trombocitopenia seguido de deterioro hepático y renal. Al ser reciente, no hay reservorio esclarecido, se sospecha de la musaraña. o Orden Mononegavirales: − Flia Filoviridae ▪ Género Ebolavirus, virus del Ébola: Especies del virus Ébola: − Virus del Ébola Zaire − Virus del Ébola Sudán − Virus del Ébola Reston − Virus del Ébola Tai Forest 30 Estos virus tienen alto índice de mortalidad, produce fiebre hemorrágica fatal, afectando humanos y primates no humanos. Se sospecha de murciélagos como reservorio, esta enfermedad reaparece luego de largos periodos de silencio epidemiológico, sugiriendo la existencia de un reservorio no identificado. La infección inicial al hombre ocurriría por exposición a los fluidos corporales de los reservorios y/o hospedadores intermediarios. Luego, la transmisión ocurriría por contacto persona a persona. Existen 2 vacunas aprobadas contra este virus. ▪ Género Marburgvirus: − Virus de Marburg: Infección originada a partir de manipulación de tejidos de monos africanos infectados. Se aisló de murciélago africano de la fruta, quienes pueden propagar el virus a personas que interactúan con ellos. No existe tratamiento ni vacunas. − Flia. Flaviviridae: ▪ Género Flavivirus: Este género contiene a los arbovirus más distribuidos globalmente. − Virus de la fiebre amarilla: Fallo renal y hepático, declinación en la vacunación aumento la incidencia en América y África. Los reservorios son los primates (ciclo silvestre), de los que pasa al hombre a través de los mosquitos (ciclo urbano). − Virus del dengue: Existiendo 5 serotipos virales s (DEN-1, 2, 3, 4 y DEN-5), el DEN-2 es el más virulento. Infección con otro serotipo puede incrementar la severidad. Enfermedad re- emergente asociada a mosquitos. Se la consideraba una enfermedad tropical, actualmente los movimientos poblacionales (migraciones, turismo) son vehículos importantes para la diseminación de cepas virales. − Virus Zika (ZIKV): Transmitida por mosquitos, agente causal de infecciones esporádicas benignas en seres humanos, circula en primates salvajes. Se lo asocia a anomalías neurológicas congénitas, fiebre, dolores musculares, eritema, e incluso síndrome de Guillain- Barré, enfermedad autoinmunitaria del sistema nervioso periférico. Los anticuerpos contra ZIKV tienen la capacidad de hacer más severa la infección por el virus del dengue. Transmisión sexual y transfusiones. − Virus del Nilo occidental (WNV): Arbovirus transmitido por mosquitos, zoonosis de ciclo natural involucrando al virus, vector invertebrado, hospedador o reservorio vertebrado. Enfermedad se mantiene en ciclo enzoótico ave-mosquito, siendo las aves el principal reservorio y amplificador. La transmisión requiere de alta viremia, por lo que humanos y equinos se consideran hospedadores finales por la baja viremia. Generalmente la enfermedad es asintomática o se observan síntomas similares a la gripe. En un bajo porcentaje de casos puede causar una enfermedad neuro invasiva severa. 31  Los brotes más importantes son ocasionados por cepas del Linaje 1 de mayor distribución geográfica. Las cepas del linaje 2 son menos virulentas y se restringen al continente africano. Las aves migratorias se consideran la principal fuente de translocación del WNV. Presenta alta adaptabilidad genética, lo que favorece el incremento en el rango vectorial. Hay vacunas disponibles para el control del WNV en caballos en los Estados Unidos. − Virus de la Encefalitis Japonesa (JEV): Solo un serotipo, al menos cientos de genotipos. Virus circula en aves, cerdos y mosquitos. Equinos principales afectados, zoonótica. Garzas y garcetas son reservorios de alta viremia. Causa encefalitis aguda. − Virus de la encefalitis de San Luis (SLEV): Afecta principalmente a humanos, equinos y otros animales pueden sufrir las encefalitis, siendo todos los hospedadores terminales de la infección. Transmitido por numerosas especies de mosquito, amplificándose en algunas aves. Cepas agrupadas en 8 genotipos. Reaparición en Argentina asociada a varios factores como el aumento de poblaciones de torcazas, especie amplificadora. − Flia. Togaviridae: ▪ Gro. Alphavirus: − Virus Chikungunya: Arbovirus transmitido por mosquitos, causa fiebre y artralgia, también se han reportado síntomas neurológicos. Rápida emergencia asociada a expansión de los mosquitos sumado a las mutaciones de CHIKV. No se transmite persona-persona. o Orden Nidovirales: − Flia. Coronaviridae: − Subflia. Orthocoronavirinae: Se caracterizan por alta diversidad genética y capacidad de infectar numerosas especies debido a su alta frecuencia de mutaciones y recombinaciones. Los coronavirus emergentes pertenecen al género betacoronavirus. La glicoproteína S spike es el principal determinante antigénico, que forma un trímero en la superficie del virión dándole la apariencia de corona a su estructura. Esta proteína tiene dos dominios: ▪ S1, responsable de la unión al receptor celular y por lo tanto es importante para la determinación del tropismo y rango de hospedadores de los coronavirus ▪ S2, necesario para la fusión. − Coronavirus del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV): Gato civeta fue el hospedador intermedio, siendo un coronavirus de los murciélagos el transmisor primario. La mutación en una proteína de la superficie viral permitió la unión al receptor humano y el salto de especie desde el hospedador intermediario al humano. 32 − Coronavirus del Síndrome Respiratorio de Medio Oriente (MERS-CoV): Ocasiona una enfermedad respiratoria fatal. Los camellos dromedarios están implicados en la transmisión del virus a los seres humanos. Al igual que para SARS-CoV, se considera que MERS-CoV se originó a partir del murciélago. A diferencia del SARS-CoV que es altamente transmisible entre los humanos, MERS-CoV tiene una alta tasa de mortalidad pero es menos eficiente en su transmisión. − Enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) (SARS-CoV2): La comparación del genoma del SARS-CoV2 con los otros SARS-CoV reveló que la secuencia que codifica la proteína S presenta sustituciones de aminoácidos, principalmente en el dominio de unión al receptor. El SARS-CoV-2 está estrechamente relacionado (88% de similitud) con dos CoV similares al SARS derivados del murciélago y es genéticamente distinto del SARS-CoV (79% de similitud) y MERS-CoV (casi el 50%). El virus se habría originado en los murciélagos y un hospedador amplificador sería el responsable de la transmisión a los humanos. El receptor celular de SARS-CoV2 es la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2). − Flia. Retroviridae: − Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV/SIDA): Existen el HIV-1 y HIV-2. Fueron contagiadas al hombre a partir de los monos, sin especificar la vía. La variabilidad del virus, la utilización de drogas y la conducta sexual influyen en el incremento de la incidencia de la enfermedad. Esta situación se agrava debido a las dificultades en el tratamiento, su elevado costo y la ausencia de una vacuna. − Flia. Orthomyxoviridae: − Virus de la gripe o Influenza: De ARN simple- segmentado, se clasifican en tipo A, B y C. Todos afectan al ser humano y solo el A afecta a los animales. Se ha descubierto el tipo D en bovinos. Las aves acuáticas son reservorio de 15 subtipos de influenza A que replican en el intestino, excretándose en las heces y se transmiten por contaminación de agua por aves migratorias. Este reservorio asegura la perpetuación en la naturaleza. Los cerdos poseen receptores para los virus humanos (ácido siálico con uniones α2,6 a galactosa) y aviares (ácido siálico con uniones α2,3 a galactosa). Por lo tanto, los cerdos pueden actuar como “cocteleras” en los cuales los virus de la gripe pueden reordenar sus genes, mutarse, adaptarse y adquirir la capacidad de infectar a los seres humanos. La pandemia ocasionada por el virus de la gripe H1N1 en 2009 es un ejemplo de cómo un virus de ARN puede saltar las barreras de especies y emerger en nuevos huéspedes, en este caso con transferencia del virus del cerdo al humano. 33  − Flia. Poxviridae: − Subflia. Chordopoxvirinae: ▪ Género Orthopoxvirus: El Poxvirus de los monos o viruela, presenta erupciones cutáneas, asociado a lesiones genitales. La mayoría de las veces, los síntomas desaparecen, pero son fatales en el 3%. Se lo ha asociado a encefalitis y meningoencefalitis. Se transmite por contacto físico, mucosas y otras superficies. Asociado al tráfico de macacos. − Flia. Hepeviridae: − Orthoepevirus A: O hepatitis E, virus de ARN de cadena simple, desnudo. Se lo clasifica en 4 genotipos. El HEV es responsable de hepatitis aguda autolimitante, pudiendo ocasionar hepatitis fulminante en mujeres embarazadas (transmisión vertical) y personas mayores. El virus se considera endémico en los países en desarrollo, principalmente en áreas tropicales y subtropicales. En los países desarrollados suelen presentarse casos esporádicos o brotes epidémicos. La vía fecal-oral a través de agua y alimentos contaminados es la principal forma de transmisión en los países subdesarrollados. Sin embargo, en los países desarrollados, la hepatitis E se considera una zoonosis, siendo el cerdo principal reservorio del HEV. La transmisión ocurre principalmente a partir de alimento de origen porcino mal cocido. Diagnóstico viral Los métodos de diagnóstico pueden utilizarse para reconocer la presencia del virus, alguno de sus constituyentes (antígenos como proteínas o genoma viral) o la respuesta inmune por parte del hospedador. Métodos diagnósticos para identificar agente viral: o Aislamiento e identificación viral: Método que posibilita la recuperación del virus, conservando su cepa a partir de una muestra problema al ofrecerle un sustrato adecuado para su replicación, como pueden ser: 34  − Cultivos celulares: Son técnicas con alta sensibilidad y especificidad sobre poblaciones celulares uniformes. Se mantiene a las células en botellas o placas de cultivo, con un medio enriquecidos que supla sus requerimientos, existe agregado de suero fetal bovino que contiene factores de crecimiento que permitirán el crecimiento y multiplicación celular. A su vez los medios poseen antibióticos y antifúngicos para solo permitir desarrollo de los virus. Existen líneas específicas para cada virus. ▪ Cultivos primarios: A partir de células, tejidos u órganos del organismo, pueden subcultivarse 1 o 2 veces. Conservan cromosoma e índice mitótico, se usan si no existen líneas adecuadas. ▪ Líneas celulares diploides: Líneas celulares capaces de subcultivarse 50 veces o más y conservan por lo menos un 75% el cariotipo de la especie de la que provienen. Homogéneas. ▪ Líneas celulares continuas: Son las más usadas, se propagan indefinidamente, han sido transformadas artificialmente. Generalmente no conservan morfología, son menos diferenciadas y han perdido características bioquímicas. Dan una población uniforme, permitiendo análisis y estudios de replicación. MDBK (de riñón bovino), BHK-21 (de riñón de hámster bebé), HEp-2 (de epitelio humano), Vero (de riñón de mono verde africano), MT-2 (de linfocitos humanos) ▪ Manejo de los cultivos celulares: Se requiere flujo laminar y estufas de cultivo para replicar las condiciones que permitan el desarrollo de las células (microaerofília). Para observar se usan microscopios ópticos invertidos. Para el control de viabilidad de las células se usan generalmente 2 tipos de colorantes: ▪ Naranja de acridina-bromuro de etidio, que 3 tiñe de verde fluorescente las células vivas y de naranja las muertas ▪ Azul tripán, que deja incoloras las células vivas y tiñe de azul las muertas. Este es el más usado ya que la visualización se realiza en un microscopio de luz blanca; para el naranja de acridina-bromuro de etidio se necesita un microscopio de luz fluorescente. Los cultivos celulares pueden conservarse congelados, bajo condiciones óptimas, y descongelarse para ser utilizados posteriormente. Para ser congeladas, las células tienen que tener al menos un 80% de viabilidad; se colocan en medio de cultivo nuevo con al menos 20% de SFB y el agregado de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), que es un protector de membranas celulares, en un criotubo. El congelamiento debe ser progresivo, pueden conservarse varios años o décadas. El descongelado de las células debe ser rápido para evitar el daño de las membranas celulares. Conviene siempre hacer un control de viabilidad celular luego del descongelado. − Huevos embrionados: Para cultivar virus propios de las aves como el Virus de la Influenza Aviar. − Animales de laboratorio: Prácticamente reemplazados por los cultivos celulares aunque se siguen utilizando para estudios de patogénesis viral, reacción del sistema inmune y desarrollo y prueba de vacunas y drogas. 35 Luego del inoculado, se incuba a 37ºC y se observa diariamente para determinar presencia de efecto citopático (ECP). Se usan cultivos celulares no inoculados como control y comparación para cualquier cambio morfológico observado en los demás cultivos inoculados. Los efectos citopáticos son cambios morfológicos que ocurren en las células producidas por la acción del virus, entre los que se encuentran: ▪ Sincitios: Paramixovirus, Virus sincitial respiratorio. ▪ Vacuolización: Virus de la diarrea viral bovina (BVDV). ▪ Lisis: Virus de la fiebre aftosa, BHV-1 (Bovine herpesvirus-1). ▪ Redondeamiento: Adenovirus. ▪ Cuerpos de inclusión: Virus de la rabia. Cuando los virus no producen ECP como los arbovirus, se puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia su presencia en el cultivo, la más utilizada es la IFD, aunque existen otras como: ▪ Hemadsorción: Algunos virus expresan en la membrana del huésped hemaglutininas, que son glicoproteínas capaces de unirse a receptores en la membrana de los eritrocitos. Por lo que se agregan eritrocitos a un cultivo inoculado, pudiendo poner en evidencia la infección a través de la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular. ▪ Hemaglutinación: Se pone en evidencia las hemaglutininas con el mismo fundamento que para la hemadsorción. − Desventajas del aislamiento: ▪ Baja sensibilidad ▪ Requiere de confirmación ▪ Existen virus difíciles de aislar o lento crecimiento como el parvovirus canino. ▪ Los resultados pueden demorar de 6-7 días o incluso más de 14. ▪ Proceso laborioso, requiere de personal capacitado y de infraestructura específica. ▪ Se debe trabajar en esterilidad, utilizando cabinas de flujo laminar. o Microscopía electrónica: Permite visualizar estructuras virales, morfología y tamaño del virión, ayudando para identificar la taxonomía. Métodos diagnósticos para identificar ácidos nucleicos: − o Polimerase chain reaction (PCR): Se utiliza para la detección de ácidos nucleicos. Sirve para amplificar un fragmento de ADN, siendo más fácil identificar el genoma viral. Para virus de ARN se da el paso a ADN mediante un paso previo llamado retro transcripción mediante uso de la transcriptasa reversa. 36 Se requiere de la Taq polimerasa, primers, ADN molde y nucleótidos. Estos ingredientes se colocan en un tubo junto a los cofactores necesarios para la enzima y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis de ADN. Los resultados de un PCR se visualizan al utilizar electroforesis en un gel de agarosa, separando los fragmentos de ADN según su peso, quedando agrupados los fragmentos amplificados en una banda. o Southern Blot, Northern Blot y Western Blot: La técnica de Southern Blot se usa para identificar ADN, la de Northern Blot para ARN y Western Blot para identificación de proteínas. Estas técnicas comienzan con una electroforesis para separar moléculas por tamaño, para proteínas se usa gel de poliacrilamida y agarosa para ácidos nucleicos. Luego se da la transferencia de las bandas desde el gel a una membrana de nitrocelulosa para identificar la molécula de interés. El siguiente paso es la adición de anticuerpos radiactivos para el caso de proteínas o sondas radiactivas de ácidos nucleicos para ADN y ARN. Luego se coloca la membrana sobre una placa fotográfica y se revela. Técnicas para la detección de antígenos virales: o Inmunofluorescencia directa: Se pone en contacto la muestra problema con un anticuerpo marcado con fluoresceína. Si se encuentra el antígeno específico para el anticuerpo marcado, se formará el inmunocomplejo, si luego de los lavados el inmunocomplejo permanece, la reacción será positiva al emitir fluorescencia ante la lectura del microscopio de fluorescencia. o ELISA: Uno de los complejos se fija en la placa, se agrega el otro componente no fijado marcado con una enzima. Se da la revelación al agregar un sustrato sumado a un cromógeno que producirá la variación de color al estar formado el inmunocomplejo. Se puede evaluar a simple vista o mediante espectrofotometría. ▪ ELISA directo: Las placas se preparan con la solución problema (sospechada de Ag) en los pocillos, se coloca luego Ac marcado. 37  ▪ ELISA sándwich o de captura: Se liga a la placa un Ac monoclonal o policlonal como captura para el antígeno. Se agrega la muestra problema sospechada de contener Ag y se añaden posteriormente los Ac específicos anti-ag marcados con la enzima. o Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica: Permite evaluar presencia de Ag específicos sobre tejidos o células. Se utilizan enzimas como marcadores para el Ac, se reconoce la presencia de inmunocomplejo al adicionar el sustrato y el cromógeno. Técnicas inmunológicas para detección de anticuerpos: Se utilizan técnicas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA indirecto, donde se encuentran fijadas células que expresan el Ag, se agrega el suero problema y luego un Anti-Ac marcado para control. Existen otras técnicas como son: o Seroneutralización: Detección de Ac neutralizantes en un suero problema. Se colocan sueros diluidos en el medio de cultivo con el virus a neutralizar en placas previamente sembradas con células. Estas diluciones seriadas se incuban en estufa a 37ºC y se determina presencia o no de ECP. Al realizar diluciones del suero es posible determinar título de anticuerpos. El título de anticuerpos se determina como la dilución más alta que presenta inhibición completa del ECP después de 72 horas de incubación. o Inmunodifusión en gel de agar (IDGA): Permite difusión de Ag y Ac, al encontrarse en proporciones óptimas, interaccionan formando un banda de precipitado visible. Resulta la prueba oficial de SENASA para la anemia infecciosa equina (Test de Coggins). 38  Inhibición de la hemaglutinación: Hay virus que poseen hemaglutininas que aglutinan eritrocitos, como el virus del Parvovirus porcino. Para evaluar la presencia de Ac de un suero problema, se mezclan el suero con el virus, y si el suero tenía Ac se van a unir al virus y cuando lo enfrentamos a eritrocitos, el virus no se podrá unir a este ya que los sitios de unión se encuentran ocupados por los Ac neutralizantes, por lo tanto no va a hemaglutinar y se observará en el pocillo un punto rojo pequeño. Cuando no existe presencia de Ac y si se produce la hemaglutinación de los eritrocitos, se produce un punto mucho más grande. Momentos óptimos para la recolección de muestras para detección de Ac: Toma de muestras, recolección y conservación: La calidad del diagnóstico está condicionada por la calidad de la muestra: ▪ Tipo de muestra depende de la patología y virus. ▪ Tiempo de muestra debe estar dentro de los 7 días de iniciado el cuadro clínico. Para serología también a los 14 y 21 días. ▪ Para la calidad se debe asegurar la viabilidad viral (medios de transporte), integridad del genoma, presencia de inhibidores de flora acompañante y biopsias del lugar de foco. 39  Virus relacionados a síndromes digestivos Los virus entéricos pueden ocasionar enfermedades asintomáticas como sintomáticas dependiendo del grado de lesión que ocasionen al enterocito. Una de las principales vías de diseminación es la vía fecal-oral, ya que se encuentran en la materia fecal en alto título y permanecen allí durante períodos prolongados. Las células blanco para los virus entéricos incluyen los enterocitos maduros de las vellosidades intestinales y las células inmaduras, en división, de las criptas. Algunos virus como reovirus, picornavirus, astrovirus, entre otros, pueden infectar las células epiteliales especializadas como las células M del tejido linfoide del intestino delgado. Cuando el virus posee tropismo por el epitelio de las vellosidades o a las células de la cripta se producen síntomas locales: ▪ La destrucción de las microvellosidades de los enterocitos origina un proceso de malabsorción, y la consiguiente carga osmótica intraluminal culmina en diarrea. ▪ La infección de las células de las criptas, quienes darán lugar a las células de absorción, resulta también en la pérdida de capacidad de absorción, produciendo diarreas más abundantes y sanguinolentas al existir desprendimiento celular. Los virus entéricos deberán sobrepasar ciertas barreras naturales que posee el organismo, como por ejemplo: ▪ Acidez estomacal (pH=1-3) ▪ Sales biliares ▪ Enzimas proteolíticas ▪ Mucus intestinal ▪ Evitar inactivación por IgA secretoria ▪ Macrófagos y células linfoides Los virus desnudos serán más resistentes a las condiciones de pH, existiendo excepciones, donde los virus envueltos se aprovechan del buffer de la leche para superar el pH. El efecto del pH puede observarse en diferentes especies de picornavirus, como los rinovirus, quienes son sensibles a pH bajos, donde su cápside se altera liberándose ARN y perdiendo infectividad. Otros miembros de la familia Picornaviridae (enterovirus) son resistentes a esta degradación de la cápside y pueden producir infecciones entéricas en condiciones de acidez. Luego en algunos casos, las enzimas proteolíticas secretadas por las células gástricas y pancreáticas pueden potenciar la infectividad de varios virus, induciendo cambios conformacionales o exponiendo nuevos determinantes funcionales que facilitan eventos como la penetración, unión de receptores, fusión de membranas, activación transcripcional, etc. Como por ejemplo el efecto observado en el clivaje proteolítico de las proteínas de la cápside externa de los Reovirus que da como resultado la producción de partículas infecciosas. Este es el caso de la proteína VP4 de los rotavirus que potencia la penetración directa sobre el enterocito. 40 Las sales biliares son otro factor inhibidor en el ingreso viral, siendo las envolturas virales susceptibles a la digestión por acción de estas, mientras que los desnudos no lo son tanto. El sistema inmune entérico es otro factor a sortear, ya que la infección viral induce a una rápida producción de anticuerpos, predominando los IgA secretorios, a su vez se ve aumentada la producción de LT citotóxicos y LTh. Familia Parvoviridae: o Subfamilia Parvovirinae - Género Protoparvovirus - Especie Protoparvovirus de carnívoros 1 Genoma ADN lineal simple (CII), icosahédrico y desnudo. Ingresan a la célula por endocitosis, su replicación nuclear al carecer de ARN polimerasa, dejando grandes cuerpos de inclusión intranucleares. Replican en células con alto índice mitótico ocasionando la lisis celular (prácticamente irreproducible in vitro). Poseen tropismo hacia linfocitos y precursores hematopoyéticos de rápida división y por células germinales de la mucosa intestinal. Aunque en los cuadros digestivos, las principales células atacadas son las células intestinales de las criptas, siendo la vía de ingreso fecal-oral directa o indirecta. Virus muy estables, resistentes a temperaturas de 60ºC durante 60’ y variaciones de pH de 3 a 9, siendo la mayoría hemaglutinantes. Parvovirus han sido aislados de pollos, conejos y fetos equinos. Enfermedades digestivas de animales domésticos causadas por agentes de esta familia: ▪ Felinos: Panleucopenia felina (panleucopenia, cuando son infectados vía intrauterina provoca hipoplasia cerebelar, enteritis). ▪ Caninos: Gastroenteritis hemorrágica (gastroenteritis, miocarditis, panleucopenia). ▪ Visón: Enteritis del visón (enteritis, panleucopenia). ▪ Aves: Hepatitis. Familia Coronaviridae: o Subfamilia Coronavirinae: - Género Alphacoronavirus - Especie Alphacoronavirus 1 Poseen un genoma de ARN lineal simple + (CIV), son helicoidales y envueltos de replicación citoplasmática. Poseen tropismo por las células de las vellosidades, siendo las gastroenteritis más leves. A su vez producen enfermedades respiratorias. Enfermedades digestivas de animales domésticos causadas por agentes de esta familia: ▪ Gastroenteritis transmisible porcina ▪ Peritonitis infecciosa felina: Ingresa por vía oral, si replica en macrófagos produce vasculitis y diseminación sistémica ocasionando síntomas digestivos, nerviosos, respiratorios u oculares. Si la replicación es entérica, se da la eliminación del virus por materia fecal. ▪ Gastroenteritis canina ▪ Diarrea neonatal en bovinos 41  Familia Adenoviridae: - Género Mastadenovirus - Especie Mastadenovirus canino A - Género Aviadenovirus - Especie Fowl Aviadenovirus A (aves) Poseen ADN doble cadena lineal (CI), utilizando la polimerasa II celular para replicar en el núcleo, icosahédricos desnudos. Enfermedades digestivas de animales domésticos producidas por agentes de esta familia: ▪ Caninos: Hepatitis infecciosa canina, la cual ingresa vía oro-nasal, efectúa una infección primaria en amígdalas y ganglios linfáticos regionales. La replicación secundaria es en endotelios de órganos como riñones, córneas, úveas y son eliminados por todas las secreciones y excreciones, permaneciendo hasta 6 meses post-infección en orina. Comparte vacuna con el adenovirus de tipo II que ocasiona bronquitis. ▪ Aves: Producen mortalidad súbita, decaimiento, plumaje erizado, letargia, hepatomegalia, hidropericardio, presencia de cuerpos de inclusión intranucleares en hígado. - Hepatitis a cuerpos de inclusión en gallinas. - Enfermedad del bazo marmolado y enteritis en pavos. - Hepatitis en patos. Familia Reoviridae: La familia Reoviridae (respiratory-enteric-orphan viruses) incluye dos subfamilias y varios géneros. o Subfamilia Sedoreovirinae: - Género Rotavirus - Especie Rotavirus A-I o Subfamilia Spinareovirinae: - Género Orthoreovirus - Especie Orthoreovirus aviar Viriones icosahédricos con triple cobertura proteica sin envoltura lipídica. Genoma de ARN doble lineal (CIII) distribuidos en 10 a 12 segmentos. Posee ARN polimerasa ARN dependiente, pudiendo replicar en el citoplasma. En los diferentes géneros difiere el número y medida de los segmentos de ARN y la estructura de la cápside externa. Los orthoreovirus y los rotavirus son resistentes a los solventes lipídicos y estables a un amplio rango de pH, pero los orbivirus (otro de los géneros de esta familia) tienen una estrecha zona de estabilidad respecto al pH (6-8) y pierden infectividad si son expuestos al éter. No todos los desinfectantes son efectivos contra los rotavirus, aunque los yodóforos y los componentes fenólicos los inactivan. El hipoclorito de sodio no es eficaz. Las enzimas proteolíticas, en general, aumentan la infectividad de los orthoreovirus y rotavirus; por ejemplo, la quimotripsina que se encuentra en el intestino delgado, produce la activación de proteínas de la cápside externa. 42 Dentro del género Orbivirus se encuentran especies que son arbovirus. Enfermedades digestivas de animales domésticos producidas por agentes de esta familia: ▪ Orthoreovirus aviar: Enteritis en gallinas, pavos y gansos. ▪ Rotavirus: Enteritis en varias especies (muy importante en potrillos y terneros), tropismo por células de las vellosidades y células M. Familia Flaviviridae: - Género Pestivirus - Especie virus de la diarrea viral bovina 1 y 2 Viriones icosahédricos envueltos, poseen ARN simple lineal + (CIV) de replicación citoplasmática. Ingresan por endocitosis, producen bajos títulos virales siendo difícil su detección. Ensamblaje en el retículo endoplasmático, liberándose por exocitosis y lisis celular. Son inestables en condiciones ambientales y fácilmente inactivados por calor y desinfectantes. La estabilidad del virus de la peste porcina clásica (Pestivirus), en los productos y residuos alimentarios puede ser de semanas y hasta meses. Enfermedades digestivas de animales domésticos producidas por agentes de esta familia: ▪ Bovinos: Virus de la diarrea viral bovina, provoca enfermedad de las mucosas con presencia de cuadros digestivos. Genera inmunosupresión, siendo susceptibles a otras enferm