Práctica No. 8 Tiempos de Coagulación 2 PDF

PRÁCTICA No. 8 PRUEBAS DE COAGULACIÓN DETERMINACIONES INCLUÍDAS 1. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP). 2. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa). INTRODUCCIÓN La vida del hombre depende del sistema circulatorio y una lesión de los vasos sanguíneos puede ser gr...

PRÁCTICA No. 8 PRUEBAS DE COAGULACIÓN DETERMINACIONES INCLUÍDAS 1. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP). 2. TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (TTPa). INTRODUCCIÓN La vida del hombre depende del sistema circulatorio y una lesión de los vasos sanguíneos puede ser grave y potencialmente mortal. La hemostasia es el mecanismo que emplea el organismo para impedir la pérdida de sangre y mantener la circulación sanguínea tras un traumatismo o lesión vascular. En ella intervienen los siguientes procesos: vasoconstricción local, formación del tapón plaquetario, coagulación y fibrinólisis. La hemostasia para su estudio se divide en Primaria y Secundaria. La hemostasia primaria se refiere a los procesos mediante los cuales se lleva a cabo la formación del tapón plaquetario a través de la adhesión, activación, secreción y agregación plaquetaria. La hemostasia secundaria involucra la activación del sistema enzimático de coagulación (Tabla 1), cuyo principal objetivo es la formación de trombina y fibrina para la estabilización del coagulo. Tabla 1. FACTORES DE LA COAGULACIÓN. Factor Nombre I. Fibrinógeno. II. Protrombina. III. Factor tisular, factor hístico. IV. Ca2+. V. Proacelerina, factor lábil, globulina aceleradora. VII. Proconvertina, acelerador de la conversión de protrombina sérica, cotromboplastina. VIII. Factor A antihemofílico, globulina antihemofílica (AHG). IX. Factor B antihemofílico, factor de Christmas, componente de tromboplastina plasmática. X. Factor de Stuart-Prower. XI. Antecedente de tromboplastina plasmática (PTA). XII. Factor de Hageman. XIII. Factor de Laki-Lorand (FLL), factor estabilizante de fibrina (FSF), fibrinoligasa. El modelo clásico de la coagulación la divide en tres vías: Vía extrínseca, Vía Intrínseca y Vía final común (Figura 1 y 2). VÍA EXTRÍNSECA. La vía extrínseca utiliza el factor tisular (factor hístico), factor VII, factor X, Ca2+ y conduce a la formación del factor Xa. La vía extrínseca comienza en el sitio de la lesión con la expresión del factor tisular (factor hístico) en las células endoteliales y sobre monocitos activados. El factor tisular (factor hístico) activa, al factor VII. El factor tisular (factor hístico), actúa como un cofactor en la activación del factor X catalizada por el factor VIIa. El factor VII, es una glucoproteína (serina proteasa, contiene Gla y es sintetizada en el hígado) activado por cantidades mínimas de trombina y Ca2+ a factor VIIa. La asociación del factor hístico (factor tisular o factor III) y el factor VIIa se llama complejo de factor hístico. La reacción mediante la cual el factor Xa se activa requiere el montaje de componentes, denominados el complejo tenasa extrínseco, sobre una superficie de membrana que expone al fosfolípido procoagulante fosfatidilserina; estos componentes son: Ca2+, el complejo de factor hístico (factor hístico y factor VIIa), y el factor X. El factor VIIa rompe el enlace Arg-Ile en el factor X en presencia de Ca2+ para producir el factor Xa. Fig. 1 Vía extrínseca y vía común de la coagulación. VÍA INTRÍNSECA. La vía intrínseca implica los factores XII, XI, IX, VIII y X, así como precalicreína, cininógeno de peso molecular elevado (cininógeno de HMW), Ca2+ y fosfolípidos plaquetarios. El resultado es la producción del factor Xa. Esta vía comienza con la fase de contacto, donde la precalicreína, el cininógeno de HMW, factor XII y factor XI, se exponen a una superficie activadora con carga negativa. Cuando los componentes de la fase de contacto se ensamblan en la superficie activadora, el factor XII se activa a factor XIIa, por proteólisis debido la acción de la calicreína. Este factor XIIa, generado por la calicreína, ataca a la precalicreína para formar más calicreína, estableciéndose una activación recíproca. El factor XIIa, una vez formado, activa al factor XI a factor XIa y además libera bradicinina (nonapéptido con potente acción vasodilatadora) a partir del cininógeno de HMW. El factor XIa en presencia de Ca2+ activa al factor IX a factor IXa. El factor IXa a su vez rompe un enlace Arg-Ile para producir la serina proteasa de dos cadenas, el factor Xa. La activación del factor X requiere el ensamblaje del componente llamado, el complejo tenasa en la superficie de las plaquetas activadas, constituido por: fosfolípidos plaquetarios aniónicos, Ca2+, el cofactor VIIIa, así como los factores IXa y X. VÍA FINAL COMÚN. El factor Xa, producido tanto por la vía intrínseca como por la vía extrínseca, activa a la protrombina (II) a trombina (IIa), esta última convierte el fibrinógeno (I) en fibrina (Ia). La activación de la protrombina tiene lugar en la superficie de las plaquetas activadas y requiere el ensamblaje del complejo protrombinasa, constituido por: fosfolípidos plaquetarios aniónicos, Ca2+, factor Va, factor Xa y protrombina (II). Funciona como cofactor de manera análoga al cofactor VIII en el complejo tenasa. Cuando el cofactor V se activa a cofactor Va por acción de oligocantidades de trombina, se une a receptores específicos sobre la membrana plaquetaria y forma un complejo con el factor Xa y protrombina (II). Al momento de unirse al complejo formado por los factores Va y Xa en la membrana plaquetaria, la protrombina (II) es dividida por el factor Xa en dos sitios, para generar la molécula de dos cadenas, la trombina (IIa), que luego se desprende de la superficie plaquetaria. CONVERSIÓN DE FIBRINÓGENO A FIBRINA. La trombina (IIa) hidroliza los cuatro enlaces Arg-Gli entre los fibrinopétidos y las porciones  y  de las cadenas A y B del fibrinógeno. El desprendimiento de los fibrinopéptidos expone los sitios de fijación, permitiendo que las moléculas de los monómeros de fibrina se agreguen de manera espontánea en un ordenamiento regular, formándose así un coágulo de fibrina insoluble. Es precisamente la formación de este polímero de fibrina, lo que atrapa plaquetas, eritrocitos y otros componentes, que llegan a formar trombos blancos y rojos. El coágulo inicial de fibrina es muy débil y se conserva unido sólo por enlaces no covalentes de los monómeros de fibrina. La trombina además de convertir el fibrinógeno en fibrina, también transforma el factor XIII en factor XIIIa. El factor XIIIa es una transglutaminasa que une de forma covalente y mediante puentes cruzados las moléculas de fibrina, esto da como resultado un coágulo de fibrina más estable con una mayor resistencia a la proteólisis. Fig. 2 Vía intrínseca y vía común de la coagulación Dentro de las pruebas que se realizan para examinar la funcionalidad de los factores que intervienen en la cascada de coagulación, se encuentran el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa). El TP es la determinación del tiempo de coagulación del plasma, tras la adición de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. Sirve para medir la vía extrínseca de la coagulación, así como la vía común, se utiliza para monitorear el efecto de los anticoagulantes orales antagonistas de la vitamina K (acenocumarol, warfarina), calculando una razón normalizada internacional (INR) en función del tipo de tromboplastina utilizada (ISI). El resultado de la prueba se puede expresar en porcentaje o en segundos. El tiempo de protrombina se encuentra prolongado en casos de deficiencias congénitas o adquiridas de los factores VII, V, X, protrombina o fibrinógeno (por déficit de vitamina K, enfermedades hepáticas, tratamiento con algunos anticoagulantes orales, hiperconsumo), así como en el caso de inhibidores frente algún factor de la coagulación de la vía extrínseca o de la vía común. El TTPa consiste en medir el tiempo de coagulación del plasma, en contacto con calcio y fosfolípidos. Mide la vía intrínseca de la coagulación y la vía común, y es útil para valorar la actividad global de todos los factores de la coagulación, excepto el VII y el XIII. Resulta especialmente sensible para los defectos de los factores VIII y IX. Además, es la prueba que se emplea para monitorear la anticoagulación con heparina no fraccionada. Patologías asociadas con algunos factores de la coagulación Hemofilias Las hemofilias A y B son causadas por deficiencias hereditarias de los factores VIII y IX respectivamente, debido a trastornos recesivos ligados al cromosoma X, se presenta en 1 de cada 10,000 nacimientos en varones para la hemofilia del tipo A y en 1 de cada 50,000 para la hemofilia del tipo B, a nivel mundial. De acuerdo a la Federación de Hemofilia de la República Mexicana, A.C., para enero de 2016 se tenían registrados 5,221 pacientes en México y aproximadamente 1,092 madres portadoras.3 Ambas hemofilias se deben a la menor producción del factor deficiente, la producción de un factor con menor actividad funcional o una combinación de estas dos anomalías. En pacientes con hemofilia, la formación del coágulo se retarda debido a que la generación de trombina se encuentra demasiado disminuida. El coágulo que se forma es ineficaz para la hemostasia, lo que lleva a hemorragia excesiva. Tabla 2. Clasificación clínica de las hemofilias A y B. Clasificación Hemofilia A Hemofilia B Características clínicas Nivel del factor VIII Nivel del factor IX Grave ≤ 1% de lo normal ≤ 1% de lo normal 1. Hemorragia (≤0.01 U/ml) (≤0.01 U/ml) espontanea desde la infancia temprana. 2. Hemartrosis espontáneas frecuentes y otras hemorragias que requieren remplazo del factor de coagulación. Moderada 1 a 5% de lo normal 1 a 5% de lo normal 1. Hemorragia (0.01 a 0.05 U/ml) (0.01 a 0.05 U/ml) secundaria a traumatismo o cirugía. 2. Hemartrosis espontánea ocasional. Leve 6 a 30% de lo 6 a 40% de lo 1. Hemorragia normal (0.06 a 0.30 normal (0.06 a 0.40 secundaria a U/ml) U/ml) traumatismo o cirugía. 2. Hemorragia espontánea poco frecuente Trombofilias La definición de trombofilia se ha ampliado, incluyendo a cualquier paciente que presente una tendencia anormal a desarrollar fenómenos trombóticos. El diagnóstico inicial de trombofilia se hace inicialmente sobre bases clínicas cuando el paciente presenta algún evento trombótico recurrente por historia familiar, puede deberse también secundario a un estímulo como el embarazo, si presenta resistencia a la heparina o trombosis arterial y venosa en sitios inusuales. Entre los pacientes que se presentan clínicamente como portadores de trombofilia se puede distinguir dos categorías: (a) aquellos portadores de condiciones protrombóticas heredables o trombofilia hereditaria, en los que esta condición es el resultado de un defecto específico a nivel de los mecanismos anticoagulantes naturales o de proteínas procoagulantes (tabla 3) y (b) los pacientes portadores de una serie heterogénea de condiciones clínicas que se asocian a un aumento del riesgo de desarrollar trombosis, lo que se conoce como trombofilia adquirida. En estos casos, la fisiopatología es compleja y generalmente obedece a una combinación de defectos del sistema hemostático. Tabla 3. Causas de trombofilia Trombofilias hereditarias Trombofilias adquiridas Factor V de Leiden Síndrome antifosfolípido Mutación G20210A del gen de Cáncer protrombina Deficiencia de antitrombina Síndromes mieloproliferativos Deficiencia de proteína C Hemoglobinuria paroxística nocturna Deficiencia de proteína S Síndrome nefrótico Disfibrinogenemia Deficiencia de factor XII La trombofilia hereditaria se podría definir como una tendencia al tromboembolismo venoso, determinada genéticamente. Los defectos dominantes o combinaciones de defectos leves se pueden presentar a edades tempranas, en forma recurrente y con historia familiar, sin embargo, debido a la naturaleza episódica de los eventos trombóticos, este requiere interactuar con otro factor (genético o adquirido) para precipitar la enfermedad clínica. La trombofilia adquirida es un factor de riesgo específico de tromboembolismo venoso, el que comparado con aquellos que no lo presentan es bajo en relación con otros factores adquiridos de mayor frecuencia que se resumen en la tabla 4. Tabla 4. Factores de riesgo para tromboembolismo venoso. Cirugía o trauma mayores Historia de tromboembolismo venoso Trombofilia adquirida Anticuerpos antifosfolípidos Anticuerpos anticardiolipinas elevados Inhibidores no específicos (ej. Anticoagulante lúpico) Cáncer Enfermedad médica mayor con hospitalización Edad > 50 años Embarazo Terapia estrogénica Contraceptivos orales Terapia reemplazo hormonal Moduladores de receptores de estrógeno selectivo Tamoxifeno Raloxifeno Obesidad Mixto (hereditario, adquirido) Hiperhomocisteinemia Para el diagnóstico de las trombofilias, se pueden utilizar pruebas como los tiempos de coagulación TP y TTPa que se ven acortados, además de la determinación del dímero D, TT y fibrinógeno. OBJETIVOS 1. Conocer la utilidad clínica del tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa). 2. Explicar la importancia de estas pruebas en el diagnóstico de los trastornos de la coagulación tales como hemofilias, trombolifias, deficiencia de vitamina K y enfermedad de von Willebrand, entre otras. MATERIAL Y EQUIPO Tubo vacutainer (tapón azul con citrato de sodio al 3.2%). Tubos de ensaye 13 x 100 mm. Pipetas de volumen regulable de 100 L y 1000L. Pipeta de transferencia. Reactivo para la determinación de TP. Reactivos para la determinación de TTPa. Centrífuga clínica. Baño serológico Cronómetro FASE PREANALÍTICA: No es necesario que el paciente presente ayuno. METODOLOGÍA 1. En condiciones antisépticas obtener la muestra de sangre con el equipo de extracción y llenar el tubo hasta la marca, homogenizar por inversión de 3 a 4 veces, posteriormente centrifugar 10 minutos a 2500 r.p.m., separar el plasma con una pipeta de transferencia cuidadosamente y depositarlo en un tubo de ensaye seco y limpio. Nota importante: Cuando se obtenga la muestra se debe de llenar el tubo hasta donde nos indique la marca, para guardar una relación 1:9 (anticogulante: muestra) para evitar resultados erróneos. (Fig. 3) Fig. 3 Llenado correcto del tubo citratado. Tiempo de protrombina (TP) 1. Preincubar la tromboplastina activada y el plasma a 37 ºC por 2 minutos. 2. En un tubo de ensaye limpio y seco adicionar hasta el fondo 0.1 mL de plasma. Posteriormente adicionar 0.2 mL de tromboplastina activada de la misma forma y simultáneamente active el cronómetro. 3. Agitar el tubo incubado a 37 ºC por 2 o 3 segundos, dejándolo reposar unos segundos (no más de 10 segundos). 4. En seguida sacar el tubo manteniéndolo cerca de una fuente de luz, inclinándolo suavemente una o dos veces para detectar la aparición del primer filamento de fibrina (coágulo). Es ese momento parar el cronómetro y anotar los segundos que marco. índice Internacional Normalizado (INR) El INR representa una manera de estandarizar los resultados del tiempo de protrombina, sin importar el método de análisis. Permite a entender los resultados de la misma manera, incluso cuando provienen de diferentes laboratorios y diferentes métodos de análisis. En algunos laboratorios, solo se informa el INR y no se informa el PT. 𝑇𝑃 𝑝𝑎𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐼𝑆𝐼 𝐼𝑁𝑅 = ( ) 𝑇𝑃 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙 ISI: Índice Internacional de sensibilidad. Es reportado para cada lote de reactivos de tromboplastina. Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) 1. Preincubar el cloruro de calcio 0.02 M, el reactivo de TTPa y el plasma a 37 ºC por 2 minutos. 2. En un tubo de ensaye limpio y seco adicionar hasta el fondo 0.1 mL del reactivo TTPa y 0.1 mL de plasma, mezclar bien e incubar a 37 ºC por 5 minutos. Los tiempos de incubación superiores a 5 minutos pueden ocasionar pérdida de los factores V y VIII. 3. Posteriormente adicionar 0.1 mL de cloruro de calcio 0.02 M y simultáneamente active el cronómetro. Mezclar bien y después de 20 segundos, sacar el tubo manteniéndolo cerca de una fuente de luz, inclinándolo suavemente una o dos veces para detectar la aparición del primer filamento de fibrina (coágulo). Es ese momento parar el cronómetro y anotar los segundos que marco.  REPORTE DE RESULTADOS BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE MEDICINA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA PRUEBAS DE COAGULACIÓN FECHA: NÚMERO DE MATRÍCULA: PRUEBAS DE COAGULACIÓN RESULTADO 1 RESULTADO 2 VALORES DE REFERENCIA TIEMPO DE PROTROMBINA, 11 – 14 (segundos): % DE ACTIVIDAD DEL FACTOR INR 28 – 34 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA, (segundos): INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ RESPONSABLE: CUESTIONARIO 1. ¿Por qué se requiere vitamina K para la generación de factores de la coagulación con actividad biológica óptima? 2. ¿Qué otras pruebas de laboratorio se pueden realizar para evaluar los procesos hemostáticos en el cuerpo? 3. Un paciente llega a consulta por presentar episodios recurrentes de hemorragias ¿cómo podrías determinar si la causa de sus hemorragias es por la presencia de un inhibidor Anti – factor o algún tipo de hemofilia? 4. ¿Qué diferencia existe entre la enfermedad de Von Willebrand y la hemofilia A y que datos de laboratorio te ayudarían a diferenciar una de otra? 5. ¿Cómo esperarían encontrar los tiempos de coagulación, si el tubo azul se llenara únicamente a la mitad de su capacidad y por qué? 6. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de Dímero-D en la actualidad? 7. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de fibrinógeno? 8. ¿Cuál es la importancia clínica de la determinación de Tiempo de Trombina (TT)? CASO CLÍNICO Masculino de 3 años es llevado a urgencias debido a un traumatismo, presenta hemartrosis en la pierna derecha y epistaxis, los padres del pequeño comentan que su abuelo paterno sufrió de hemorragias espontáneas a lo largo de su vida y además falleció a los 47 años debido a una hemorragia profusa por una extracción dental. Se le realizan los tiempos de coagulación (TP y TTPa), y se obtienen los siguientes resultados: Parámetro Resultado Valor de referencia TP, seg 13 11 – 14 TTPa, seg 78 28 – 34 F. VIII, % 124 51 – 209 F. IX, % 4 67 – 209 F. XI, % 83 51 – 158 F.XII, % 96 36 – 159 1. ¿Cuál es el posible diagnóstico? Explica tu respuesta: 2. Según tu diagnóstico ¿Qué otro nombre recibe este trastorno de la coagulación? 3. ¿En qué nivel de gravedad se encuentra el trastorno diagnosticado? 4. Define hemartrosis y epistaxis: REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bolton-Maggs PH, Pasi KJ. Haemophilias A and B. Lancet. 2003; 361: 1801-9. Extraído de: http://www.hemofilia.org.mx/files/reporte-sobre-hemofilia- mexico.pdf Lichtman M., et al. (2014) Hematología clínica de Williams. México D.F.: McGrawHill. Prieto Valtueña J., Yuste Ara J. (2015) Balcells La clínica y el laboratorio. Barcelona: Elsevier.