Microbiologia Speciale PDF

[email protected] CEPPO: individuo che ha caratteristiche particolari per cui si differenzia all’interno di una stessa specie. In 1 ml di mosto ci sono decine di milioni di individui diversi. Magari tutti della stessa specie, ma all’interno della stessa specie (es. Saccharomyces cerevisiae) poss...

[email protected] CEPPO: individuo che ha caratteristiche particolari per cui si differenzia all’interno di una stessa specie. In 1 ml di mosto ci sono decine di milioni di individui diversi. Magari tutti della stessa specie, ma all’interno della stessa specie (es. Saccharomyces cerevisiae) possiamo avere una grande diversita intraspecifica. Sia la FA che la FML possono essere indotte da colture starter che hanno proprieta intraspecifiche Non e importante sapere solo quali microrganismo sono presenti ma e anche importante sapere cosa fanno nella nostra matrice (succo d’uva). Non bisogna imparare a memoria le reazioni chimiche ma bisogna capire perche un microrganismo fa una reazione piuttosto che un altro. L’obiettivo di un microrganismo e riprodursi, e quindi produrre energia, molecole di ATP e potere riducente, al fine di riprodursi. Le reazioni metaboliche vanno lette in chiave di vantaggio del microrganismo. Scopo della conta microbica: sapere la concentrazione idonea in un certo quantitativo di mosto per condurre una buona fermentazione. I MICRORGANISMI NEL PROCESSO DI VINIFICAZIONE 1. Il processo di vinificazione 2. I gruppi microbici associati al processo di vinificazione e loro ruolo 3. Le possibili interazioni tra microrganismi nel processo di vinificazione DEFINIZIONI DI MICROBIOTA E MICROBIOMA MICROBIOTA: Si riferisce a una popolazione di microrganismi (batteri, funghi, archeobatteri, protozoi) e di virus che vivono e colonizzano uno specifico ambiente in un determinato tempo. I virus non sono microrganismi. MICROBIOMA: invece indica la totalita del patrimonio genetico (genoma) posseduto dal microbiota, cioe i geni che quest’ultimo e in grado di esprimere Il microbioma si studia facendo un’estrazione del DNA totale. Prendiamo un campione di suolo dal vigneto ed estraiamo il DNA. QUALITA: e l’aspetto che guida per lo piu le scelte dell’enologo in cantina Ruolo delle vespe nei vigneti: le vespe trasportano i lieviti all’interno del loro intestino. All’interno dell’intestino le vespe possono riprodursi, quindi generare nuovi elementi con un patrimonio genetico differente e aumentare la ricombinazione genica DIFFERENZA TRA MOLTIPLICAZIONE E RIPRODUZIONE Quando c’e riproduzione c’e anche un evento di ricombinazione genica: riproduzione sessuale. Le cellule figlie hanno un patrimonio genetico diverso Nella moltiplicazione non c’e ricombinazione genica Tutti questi fattori vanno a incidere sulla qualita del vino. Quindi quando si fa questo percorso dal vigneto alla cantina si va a trasportare tutto cio che e associato all’uva in cantina, dove e presente un altro microbiota. Quello che porto in cantina mi condiziona le scelte che faccio in cantina. Sapendo cio che porto in cantina posso fare scelte gestionali e operative diverse, a seconda, appunto, del microbiota dell’uva. Il microbiota dell’uva e fortemente dipende dal clima: temperatura, pioggia, vento; dallo stato sanitario: danni causati da insetti, uccelli, muffe; dai trattamenti antimicrobici: fungicidi, fertilizzanti, irrigazione, tipo di suolo; e dal grado i maturazione. Se tutti questi fattori influenzano il microbiota delle uve, in cantina troviamo un altro microbiota. In cantina si trova essenzialmente il lievito Saccharomyces cerevisiae che ogni anno puo rimanere. Se rimane o meno dipende dai trattamenti si pulizia e sanitizzazione, e dalla natura delle superfici: irregolari o danneggiate. E molto piu difficile sanitizzare una botte rispetto a un vaso vinario in acciaio. Nelle botti di legno ad esempio abbiamo problemi di Brettanomyces. La peculiarita del Brettanomyces ad esempio e che forma un biofilm (una sorta di tappeto di cellule tutte vicine). Il biofilm e molto piu difficile da rimuovere attraverso i trattamenti di sanitizzazione. Questa capacita del Brett, che si vede al microscopio, incide sul microbiota che trovo in cantina. Dal punto di vista dei lieviti principalmente si trova in ogni caso Saccharomyces cerevisiae. I batteri sono piu semplici da eliminare tramite i protocolli di sanitizzazione. C’e una variabilita del microbiota associato all’uva ma i gruppi sono sempre quelli: muffe (funghi filamentosi), batteri (lattici e acetici) e lieviti (funghi unicellulari). Muffe: funghi filamentosi, che formano delle ife Lieviti: funghi unicellulari. E una cellula che si moltiplica per gemmazione. Si moltiplica perche la gemmazione non da ricombinazione genica Tra questi gruppi microbici possono esserci interazioni, quello che un gruppo microbico fa da solo, non necessariamente lo fa anche quando e in qualche tipo di interazione con altri gruppi. Quando vengono prodotte certe sostanze e anche possibile che una popolazione smetta di moltiplicarsi, un segnale di stop. Quindi il risultato finale di un consorzio microbico non sempre e prevedibile. E molto importante anche il contatto tra una cellula e un’altra. Meccanismo cell to cell. Magari a causa dello spazio limitato dovuto al contatto tra due cellule puo portare a diversi metabolismi. Sfruttando questi meccanismi siamo andati a studiare ceppi microbici per la bioprotezione. La bioprotezione e l’impiego di ceppi microbici per evitare lo sviluppo di altri microrganismo non desiderati. Oltre alle interazioni tra i diversi gruppi abbiamo anche interazioni tra lievito e lievito e all’interno dello stesso tipo di lievito, tra ceppo e ceppo. L’impronta metabolomica e l’insieme di tutti i prodotti chimici che derivano dal metabolismo microbico MUFFE: Sono sempre negative per il vino eccetto per i vini botritizzati. Contaminazione uve, vini “botritizzati”, muffe tossigene, odore di “tappo”. le muffe producono l’ ocratossina A: e cancerogena e deve essere per legge sotto il limite di 2microgrammi al litro LIEVITI: Fermentazione alcolica, autolisi, disacidificazione, alterazioni BATTERI LATTICI Fermentazione malolattica: positiva Alterazioni: negativa BATTERI ACETICI Alterazioni BACILLUS spp. Batteri sporigeni a volte trovati nei depositi fecciosi. Nel processo di vinificazione non ha un ruolo preciso VIRUS - BATTERIOFAGI Non sono microrganismo. Il ruolo negativo e relativo al fatto che possono determinare la lisi e quindi la morte dei batteri lattici e quindi portare a un arresto della FML. Questo e un fattore che viene tenuto presente per le colture starter per la FML, cercando batteri resistenti all’attacco fagico. I batteri lattici naturalmente presenti spesso sono piu adattati alle condizioni ostili del vino e quindi magari sono piu robusti rispetto a quelli delle colture starter. INTERAZIONI MICROBICHE Nel processo di vinificazione coesistono diverse comunita microbiche che interagiscono tra loro attraverso associazioni positive, negative o neutre A. Interazioni dirette: contatto fisico tra microrganismi B. Interazioni indirette: non richiedono contatto fisico A. INTERAZIONI DIRETTE Parassitismo: un microrganismo si serve di un altro organismo, detto ospite, per le sue richieste nutrizionali o il proprio ciclo vitale. es: Batteriofagi nei confronti dei batteri lattici nel ciclo lisogeno = i virus introducono nella cellula batterica il loro DNA che si inserisce nel DNA batterico e si replica insieme sfruttando la cellula ospite. Dal ciclo lisogeno possono passare al ciclo litico in seguito a variazioni ambientali come nel vino puo essere un abbassamento di pH ) Abbiamo un contatto fisico tra virus e batteri. B. AZIONI INDIRETTE Si suddividono in: - interazioni che influenzano entrambi i microrganismi → mutualismo (+) e competizione (-) - interazioni che influenzano un solo microrganismo → commensalismo (+) e amensalismo (-) Competizione: le popolazioni microbiche hanno bisogno dello stesso nutriente, quindi lo sviluppo di entrambi i microrganismi e penalizzato dalla coesistenza. Il livello iniziale di crescita di ogni microrganismo influenza l’esito della competizione. Es Tiamina e Arginina. Tiamina: vitamina che e cofattore dell’enzima piu importante per la FA, la piruvato decarbossilasi. La tiamina e una vitamina che puo determinare una competizione nutrizionale tra i lieviti non Saccharomyces e il lievito Saccharomyces cerevisiae. All’inizio della fermentazione alcolica i non-Saccharomyces sono maggioritari e possono utilizzare la tiamina creando una carenza. La tiamina infatti puo essere aggiunta al mosto (limite legale 60 mg/hL) Arginina: e un aminoacido che puo determinare una competizione nutrizionale tra il lievito Saccharomyces cerevisiae e i batteri lattici Mutualismo: ogni microrganismo produce un composto benefico per la crescita dell’altro. La coesistenza porta vantaggio per entrambi i microrganismi. I batteri lattici sono chemiorganotrofi e microaerofili ed esclusivamente fermentati, non possono respirare, se c’e CO2 loro stanno meglio. Quindi entrano in un rapporto di mutualismo con i batteri che producono anidride carbonica. Commensalismo: il composto prodotto da un microrganismo ha un effetto positivo sull’altro. Una specie trae beneficio dalla presenza dell’altra senza danneggiarla. Le vitamine prodotte dai lieviti possono essere utili ai batteri lattici, oppure i polisaccaridi prodotti sempre dai lieviti, o ad esempio le mannoproteine presenti nella parete del lievito che se liberate assorbono degli acidi grassi a catena corta che sono negativi per i batteri lattici Le vitamine del gruppo B possono essere rilasciate nel mezzo dai lieviti a fine fermentazione e favorire così lo sviluppo dei batteri lattici I polisaccaridi parietali rilasciati dai lieviti nel mezzo favoriscono i batteri lattici che sono in possesso di enzimi che scindono le mannoproteine Amensalismo: interazione negativa. Il composto prodotto da un microrganismo ha un’azione inibitorio su un altro. Lo sviluppo di una specie e penalizzato dalla presenza dell’altra Es: - L’etanolo prodotto dal lievito S. cerevisiae inibisce la crescita dei lieviti non-Saccharomyces e dei batteri lattici - Alcuni lieviti producono una proteina (fattore killer) che inibisce lo sviluppo di altri lieviti - Metschnikowia pulcherrima produce acido pulcherriminico che chela il ferro = azione negativa. Legandosi al ferro sottrae il ferro sottraendolo agli altri lieviti. Adesso usiamo questo lievito direttamente sulle uve, perche così gli si da il tempo di moltiplicarsi e inibire lo sviluppo di lieviti indesiderati. Tutte queste proprieta possono essere studiate in laboratorio In questa piastra si vede l’effetto di un lievito killer. TASSONOMIA E IDENTIFICAZIONE DEI LIEVITI Lieviti: funghi unicellulari. Unicellulari significa che almeno in una fase del ciclo vitale sono unicellulari. Le muffe invece sono funghi filamentosi I lieviti hanno dimensione tra 1-5 x 3-30 μm. Sapere la dimensione e importante per sapere cosa stiamo allontanando durante le filtrazioni, in base alla dimensione delle maglie del filtro. I lieviti si moltiplicano per via vegetativa per gemmazione, tutti eccetto per un solo genere che si moltiplica per scissione binaria (scissione della cellula madre). C’e un limite di cellule figlie che ogni cellula madre puo generare. Quando si forma la cicatrice, la cellula non puo piu gemmare. L’unico genere che si riproduce per scissione binaria e lo Schizosaccharomyces. Si possono riprodurre anche per via sessuata mediate la formazione di spore che si distinguono in: Ascospore, racchiuse in un asco → Divisione o Phylum Ascomycota Basidiospore → divisione o Phylum Basidiomycota (pochi in enologia) Spore rotondeggianti sono classiche del S. cerevisiae. Numero e forma delle spore possono essere utili a riconoscere i tipi di lieviti, perche sono diversi in funzione della specie Le spore oltre a un mezzo per riprodursi sono una forma di resistenza. I lieviti che producono spore riesco a rimanere piu a lungo nell’ambiente. I lieviti in passato si suddividevano in:  Teleomorfi: quando presentano il ciclo vitale vegetativo e sessuale → sporigeni Anamorfi: quando presentano solo il ciclo vitale vegetativo → asporigeni Le specie di lieviti fino al 2012 potevano avere 2 nomi validi: uno per la forma teleomorfa ed uno per la forma anamorfa. Esempio: Hanseniaspora uvarum (teleomorfa) Kloeckera apiculata (forma anamorfa Ora c’e solo un nome valido. Considerando che in base a studi sul DNA entrambe le forme sono raggruppate in uno stesso clade, le regole della nomenclatura dei lieviti sono cambiate e dal 2012 non e piu usata la "doppia" nomenclatura, ma gli stati sessuale e asessuale sono inclusi in gruppi monofiletici che hanno quindi un unico “nome di genere” comune secondo il principio “un fungo-un nome” Tra le due specie non ci sono differenze di alcun tipo nel metabolismo, l’unica differenza e nel ciclo vitale e quindi sulla capacita o meno di produrre spore, che comunque e una caratteristica importante. CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE - Tipologia e colore della colonia - Forma della cellula - Tipologia gemmazione - Formazione spore - Forma delle spore TIPOLOGIE DI COLONIE Le colonie verde scuro appartengono ai lieviti apiculati (immagini slide 7 file 3) Mentre i lieviti ellittici hanno colonie color crema/bianche Anche la morfologia e diversa: a cupola o liscia, questo ci aiuta a riconoscere i generi Rodotorula: l’unico Basidiomicete. FORMA DELLA CELLULA Si dividono tra ellittici e apiculati. Ellittici: forma ellittica, sferica e cilindrica (tipica solo dello Schizosaccaromyces) Apiculati: a limone GEMMAZIONE Multilaterale – gemma su due punti contemporaneamente (“Mickey Mouse” – a forma di topolino) → lieviti ellittici Uni- o bipolare → lieviti apiculati FORMAZIONE DI PSEUDOMICELIO O MICELIO Lo pseudomicelio non e formato da ife settate, ma legate attraverso legami. Puo essere rudimentale o ramificato. La capacita di produrre pseudomicelio e importante perche gli permette di produrre dei biofilm e questo li rende difficili da rimuovere attraverso la sanificazione della botte. CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE-BIOCHIMICHE Tra queste caratteristiche rientrano la capacita di assimilare o fermentare le diverse fonti di carbonio e azoto. L’assimilazione avviene in condizioni di respirazione aerobica, quindi e un’attivita che il lievito fa per crescere. Tra queste proprieta rientrano anche la crescita a diverse temperature, in assenza di vitamine… TEST MINIATURIZZATI → sistema che consente di identificare i lieviti che utilizzano 32 fonti di carbonio diversi. Va standardizzato l’inoculo, utilizzato un mezzo di coltura senza fonte di C, inoculato il lievito e riempito il pozzetto con le varie fonti di C. Va incubato 2 gg e se il pozzetto e opaco significa che c’e stata moltiplicazione. Chiave tassonomica dicotomica: dicotomica perche ci mette sempre di fronte a due scelte Con le tecniche classiche per identificare un lievito sono necessarie 3-4 settimane, quindi tempi molto lunghi. Ora infatti si utilizzano metodi molecolari (es. PCR) PRINCIPALI LIEVITI DI INTERESSE ENOLOGICO DIVISIONE o PHYLUM ASCOMYCOTA: Sapere i generi e le specie. (classe ordine e famiglia non e necessario) In genere i lieviti vinari si distinguono in: A. lieviti non-Saccharomyces B. lieviti Saccharomyces E importante sapere la concentrazione di questi lieviti che arrivino in cantina, a prescindere dal tipo di vinificazione che vuole condurre l’enologo. perche la concentrazione dei lieviti che arrivano in cantina puo dettare comportamenti diversi dell’enologo I principali lieviti non-Saccharomyces sono: [capitolo 7 del libro microbiologia della vite e del vino] Kloeckera apiculata/Hanseniaspora uvarum Metschinowia pulkerrima → non tollerano grandi concentrazioni di etanolo, anche se ultimamente si stanno selezionando dei lieviti che tollerano concentrazioni piu alte di quello che si pensava. Si parla di bioprotezione perche si utilizzano microrganismi viventi che conosciamo per limitare e ostacolare organismi indesiderati. La Metschinowia pulkerrima e molto usata per bioprotezione. Quindi non e vero che i non Saccharomyces sono necessariamente negativi Torulaspora delbrueckii → si utilizza per aumentare l’aroma di un vino e controllare l’acidita Starmerella bacillaris (Candida zemplinina) → ha un’elevata alcol tolleranza, lo possiamo trovare anche fino a 10 vol%. si trova soprattutto nei vini Tokay, da uve passive, ma non solo. La frequenza a concentrazioni elevate nel mosto di partenza puo rappresentare delle criticita, perche puo far partire una fermentazione indesiderata, che poi anche se inoculiamo del S.cerevisiae va incontro a una carenza di nutrienti Candida stellata → puo avere una certa resistenza all’etanolo ma minore alla Starmerella Pichia membranifaciens → puo formare biofilm, e il lievito responsabile della fioretta Brettanomyces / Dekkera bruxellensis → fino qualche anno fa si diceva che fosse un lievito di cantina e che si trovasse solo nelle botti, ma in realta si porta in cantina con le uve, quindi si faceva particolare attenzione alla sanificazione delle botte. Si dice che e assente perche quando facciamo le analisi e sotto il detection limit, quindi non lo si vede, ma in realta c’e. Zygosaccharomyces bailii → ha un’elevata osmotolleranza. E molto importante per i vini passiti. Lievito che resiste ad alte concentrazioni di etanolo. Saccharmoyces ludwigii → resistente a grandi concentrazioni di solforosa. Da aromi acetati, molto pungenti, quindi non e per niente desiderato Schizosaccharomyces pombe → e in grado di degradare l’acido malico in etanolo, quindi puo essere utilizzato per fare una malo-alcolica. Tanti ceppi pero hanno una tendenza di produrre grandi quantita di acido acetico, quindi se decidiamo di usarlo bisogna fare attenzione a scegliere un ceppo che produce poco acido acetico. Da questo lievito possono essere anche estratti prodotti biologici utili in cantina. Brettanomyces/Dekkera bruxellensis Lieviti Saccharomyces: Prima del 2017: erano 8 di cui 5 isolate da ambienti naturali, ovvero isolate da un ambiente in cui non c’e stata un’azione dell’uomo, antropica (boschi, piante…) Specie Saccharomyces isolate da ambienti naturali: - Saccharomyces arboricolus - Saccharomyces cariocanus - Saccharomyces kudriavzevii - Saccharomyces mikatae - Saccharomyces paradoxus → (e l’unica specie dotata di buona capacita fermentativa) L’unica specie isolata in ambienti naturali interessante e il Saccharomyces paradoxus. E l’unica specie con buone capacita fermentative, ed e il progenitore del cerevisiae, infatti hanno similarita per il 50% nella sequenza ITS Il S. paradoxus e fenotipicamente differente dal S. cerevisiae. Forma ibridi con le specie “domesticate”, ovvero quelle specie trovate in ambienti condizionati dall’uomo (es. cantina), anche se le progenie non sono fertili. Frequentemente isolato in natura principalmente dalle querce e dal suolo circonstante. Saccharomyces sensu stricto sono specie con caratteristiche ecologiche simili isolate da ambienti artificiali associati a fermentazione alcolica. Sono 3 specie: cerevisiae, bayanus/uvarum, pastorianus S. bayanus e S. uvarum sono state isolate da fermentazioni spontanee per la produzione di: vino, sidro, boza (bevanda turca a base di grano o mais fermentato Dopo il 2017 le specie sono sempre 8 ma diverse. Troviamo in piu il S. eubayanus e S.jurei. Non c’e piu il bayanus perche si e capito che e un ibrido naturale, così come il S. pastorianus, che e anche chiamato S. carlsbergensis, che e quello usato per la birra. L’uvarum ora e una specie a se. Quindi ora ci sono 8 specie e 2 ibridi naturali. 8 specie biologicamente distinte: 1. S. cerevisiae 2. S. paradoxus 3. S. uvarum 4. S. mikatae 5. S. kudriavzevii 6. S. arboricola 7. S. eubayanus 8. S. jurei 2 ibridi naturali: 1. S. pastorianus (S. cerevisiae x S. eubayanus) syn S. carlsbergensis 2. S. bayanus (S. cerevisiae x S. eubayanus) Saccharomyces eubayanus → criotollerante S. pastorianus: - ibrido alloploide → contiene cromosomi delle due specie diverse - ben adattato alle basse temperature. E il lievito delle birre lager IDENTIFICAZIONE DI LIEVITI DI INTERESSE ENOLOGICO CON TECNICHE MOLECOLARI Riassociazione del DNA nucleare (o ibridazione del DNA) Metodo PCR-RFLP rDNA ITS detto anche RFLP-ITS (Restriction Fragment Length Polymorphism dell’Internal Transcript Spacer) [rivedere la tecnica pcr] PCR – amplificazione di una zona di DNA. l’RNA ribosomiale e identificato dalle regioni 28S e 18S, perche sono le regioni che la maggior parte degli organismi hanno conservata. Laddove ci sono delle regioni variabili all’interno della regione conservata c’e stata la differenziazione della specie ITS1 e ITS4 sono primer universali, definiti così perche identificano tutti i funghi. I primer servono a identificare le zone 18S e 28S. Essendo universali con un’unica amplificazione, e un unico protocollo, possiamo identificare tutti i funghi. L’analisi PCR dura un paio d’ore. Per vedere i risultati della PCR bisogna fare l’elettroforesi su gel di agarosio, una matrice gelatinosa attraverso il quale il DNA passa a causa del campo elettrico che viene creato. Il DNA si muove verso il polo opposto in modo inversamente proporzionale alla sua dimensione. Quello piu grande si trovera piu vicino al punto di carica, quello piu piccolo, piu lontano. Il DNA e visibile grazie a dei coloranti. Ai lati della vasca ci sono dei marker, quindi bande colorate a una certa altezza riferite a una specifica dimensione di DNA. Se ci sono bande alla stessa altezza significa che solo l’ITS non e in grado di differenziarli, ma va fatta la digestione del DNA, attraverso degli enzimi. Ogni enzima riconosce una sequenza specifica. In corrispondenza della specifica sequenza tagliano. All’interno del genere Saccharomyces ho 4 specie che hanno tutte 850 paia di basi, attraverso l’enzima Hae III vengono tagliate in specifici frammenti, quindi 2 vengono tagliati in 3 altri in 4. Percio ancora non e sufficiente. Percio fino poco tempo fa per distinguere pastorianus dal bayanus e cerevisiae dal paradoxus era necessaria la differenzazione fisiologica. Il S.cerevisiae differenzia da paradoxus perche non cresce nel Mannitolo. In generale il metodo RFLP-ITS e quello piu utilizzato per riconoscere le diverse specie di lievito. IDENTIFICARE: Significa definire la specie CARATTERIZZARE: Significa distinguere un individuo dall’altro all’interno della stessa specie. Differenziazione intraspecifica, differenziazione di ceppo. Individui diversi all’interno della stessa specie ci sono ceppi diversi, con comportamenti diversi (si parla di ecologia dei ceppi). IL MICROBIOTA DELLE UVE 1. FUNGHI FILAMENTOSI O MUFFE Sono microrganismi eucarioti e sono funghi filamentosi Le cellule filamentose costituiscono le ife (Ø 2-10 μ) che intrecciandosi formano il micelio vegetativo (sotto la superficie) o aereo (visibile) Sono dotate di conidiofori che portano i conidi (spore asessuate) attraverso le quali le muffe si diffondono. Le muffe che possono essere presenti sulle uve non tutte possono essere in grado di svilupparsi, possono essere attive prima di risultare evidenti. Quindi si possono identificare con metodi molecolari o chimici che vanno ad individuare i metaboliti. Microrganismi chemiorganotrofi, aerobi, sviluppano a 15-30°, con optimum 20-25° quindi in Italia non hanno problemi. spp. Termofile o termoresistenti (55°) Hanno un forte adattamento agli stress: alta concentrazione di zuccheri, bassi pH, ambienti disidratati. Quindi bisogna fare molta attenzione alle uve passite. Utilizzano tanti composti organici complessi (amido, cellulosa), azoto organico e inorganico. Quindi se si posano sulla bacca possono ridurre il contenuto in azoto del mosto Specie dannose (alterazioni) o pericolose (produttrici di tossine) PRINCIPALI MUFFE DELLE UVE Genere Botrytis Genere Aspergillus → forma ad aspersorio Genere Penicillium → forma a pennello. I conidi sono riconoscibili al microscopio 2. Botrytis cinerea Molto diffusa in natura, puo essere saprofita o patogeno per diverse piante. Nel caso della vite: patogeno → “muffa grigia” ruolo positivo → “muffa nobile” Muffa grigia: Si diffonde soprattutto nello stadio di uva matura, sui quali si sviluppa formando un micelio che determina il marciume molle dei tessuti se la stagione e umida, o l’avvizzimento degli acini se la stagione e secca L’attacco sulle foglie si manifesta con macchie clorotiche che tendono a diventare brunastre e a necrotizzare. Condizioni favorevoli allo sviluppo L’ambiente caldo-umido e la presenza di ferite aperte. Pioggia forte o grandine che puo provocare lesioni seguita da giornate calde e soleggiate favorisce molto lo sviluppo della botrite e la sua rapida diffusione. Umidita elevata Piogge, rugiade, nebbie Temperature: 5 – 32°C, ottimo 20-24°C ferite: grandine, oidio, tignola varieta non resistenti ubicazione del vigneto (fondovalle) → sembra che i vigneti di fondovalle siano piu soggetti alle infezioni da botrite Il mosto di uve infette presenta contenuti piu alti di acido gluconico, acido citrico e acido succinico e contenuti minori di acido tartarico e malico, quindi si ha una diminuzione dell’acidita totale. L’acido gluconico si forma per ossidazione del glucosio. L’acido gluconico viene utilizzato come marcatore di infezione da botrite, nel caso in cui non si manifesti nella bacca. Perche se abbiamo semplicemente avvizzimento degli acini le cause potrebbero essere anche altre. Oltre a queste molecole si forma anche il glicerolo per reazioni redox degli zuccheri La botrite aumenta l’attivita di enzimi ossidanti, come la tirosinasi (presente nella buccia) e la laccasi (prodotta dal fungo) che agiscono sui fenoli determinando l’imbrunimento del mosto. Il colore e direttamente colpito dalla presenza della botrite. Difesa: lotta biologica Negli ultimi anni si cerca di effettuare una lotta biologica, l’utilizzo in via preventiva di microrganismi come Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Trichoderma harzianum, Ulocladium oudemansii e Aureobasidum pullulans che diventano antagonisti della muffa grigia, dal punto di vista nutrizionale e di ingombro fisico, in condizioni di bassa pressione del patogeno. L’Aerobasidium pullulans e presente soprattutto al momento dell’invaiatura e se studiato puo essere utilizzato come antibotrite ma anche come antagonista di altre muffe, e infatti capace di degradare l’ocratossina A. E peraltro un microrganismi naturalmente presente nel microbiota dell’uva al momento dell’invaiatura, successivamente viene sostituito dal altri microrganismi. Si puo utilizzare per la lotta biologica anche la Metschinikowa fructicola MARCIUME ACIDO: e causato da lieviti e batteri acetici e causa fermentazioni in campo con produzione di acido acetico. Grappoli affetti da marciume acido rilasciano odore pungente. Gli agenti di questa alterazione sono diversi da quelli della botrite, benche i sintomi sono simili nella prima fase dello sviluppo. Muffa nobile: Un andamento climatico che permetta le infezioni ma non la sporificazione del fungo favorisce, al momento della vendemmia, la comparsa di una forma larvata del fungo (muffa nobile) La Botrytis penetra nella buccia dell'acino maturo senza evidenti danni, si formano macchioline scure o una sorta di fine polvere grigiastra Non si vede il micelio cotonoso all’esterno, si vede una polvere grigia, ma e tutto all’interno. Si parla infatti di forma larvata. All’interno dell’acino avviene l’evaporazione dell'acqua contenuta nell’acino, c’e un aumento della concentrazione di zuccheri e di glicerolo, mentre gli acidi organici diminuiscono, utilizzati dal fungo con aumento del pH. Aumenta il glicerolo per ossidazione del glucosio Viene prodotta la botriticina che inibisce la crescita dei lieviti e porta quindi a interazioni negative. Così, un vino “muffato” risultera estremamente morbido grazie al glicerolo e agli zuccheri che si trasformano in glicerolo durante la fermentazione, ma non eccessivamente dolce, e con elevato contenuto alcolico (vini passiti) Condizioni favorevoli per lo sviluppo della muffa nobile: cultivar a maturazione precoce con buccia spessa, clima temperato tale che durante la notte e al mattino ci sia sufficiente umidita, mentre durante il giorno deve essere caldo e asciutto. Il vento favorisce l’asciugatura del grappolo, così come anche la conformazione, se e spargolo si asciuga prima L’uva deve giungere a maturazione perfettamente sana, e favorita dalla bassa T e dal vento che asciuga i grappoli 3. MUFFE PRODUTRICI DI OCRATOSSINA A Fa parte delle micotossine = metaboliti secondari prodotti da funghi filamentosi che persistono della morte del fungo Sono un gruppo eterogeneo di sostanze chimiche di natura non proteica, per lo piu lipofile e a basso peso molecolare con diversa attivita biologica L’Ocratossina A e stata classificata dallo IARC (International Agency for Research on Cancer ) come "possibile agente cancerogeno per l'uomo” (gruppo 2B) OCRATOSSICOSI: patologie renali che comportano la degenerazione dei tubuli prossimali seguita da fibrosi interstiziale e degenerazione glomerulare (nefropatia tubulo-interstiziale cronica dei Balcani, malattia segnalata circa 30 anni fa in Bulgaria e Croazia) Azione nefrotossica, epatotossica, teratogenica ed immunotossica su diverse specie animali; causa tumori al fegato e al rene in topi e ratti Tumori a carico del tratto urinario superiore OCRATOSSINA A Il nome chimico dell’ocratossina A e: 7-carbossi-8-idrossi-3,4 diidro-3-metil-isocumarina, legata, attraverso il gruppo 7-carbossilico, alla L-fenilalanina con un legame amidico. Da un punto di vista chimico: OTA = pentachetide ciclico costituito da una di-idrocumarina legata a una fenilalanina (aminoacido aromatico) Nella molecola: due gruppi funzionali ionizzabili, il gruppo carbossilico (-COOH) della fenilalanina e il gruppo idrossifenolico che conferiscono alla tossina deboli proprieta acide L’OTA e una sostanza incolore che emette fluorescenza blu quando colpita da luce ultravioletta Puo essere degradata da esterasi microbiche con formazione di ocratossina alfa (non tossica) MUFFE PRODUTTRICI DI OTA: Aspergillus ochraceus: prima specie da cui e stata isolata l’OTA e da cui deriva il nome, e piu comune nei climi caldi ma e isolato sporadicamente nelle uve Aspergillus carbonarius e niger Maggiormente responsabili della formazione di OTA sulle uve. A. niger e la specie piu diffusa ma i ceppi produttori di OTA sono pochi, mentre i ceppi tossigenidi A. carbonarius sono numerosi, rappresenta la specie piu temuta per la sua presenza nell’uva. Predominano nei vigneti con clima mediterraneo, con temperature elevate e scarsa piovosita Penicillium verrucosum: si trova in climi piu freddi ma sempre con una T abbastanza mite, climi temperati. Si trova anche sulle uve ma con una frequenza piu bassa rispetto al carbonarius. Soprattutto queste molecole si trovano nei cereali L’ OTA viene prodotta sulle bacche prima della raccolta anche in una fase precoce di maturazione. La presenza di danni da tignola aumenta la presenza di specie fungine ocratossinogene. Laddove ci sono ferite e piu facile che si sviluppino, perche sono microrganismi ubiquitari. L’ OTA e piu elevata nei vini rossi. NORMATIVA OIVE: Organizzazione italiana della vite e del vino Una volta che la risoluzione e stata pubblicata poi ogni paese la puo recepire in tempi diversi. REGOLAMENTO NORMATIVO : (CE) n. 123/2005 *: limite massimo di OTA ammesso nel αmosto d’uva a partire dalla vendemmia 2005: 2,0 µg/Kg o µg/L D.M. 16 maggio 2006 *: Adozione del «Codice di buone pratiche vitivinicole». Quindi in Italia e stato recepito un anno dopo. Dal 2005 c’e un regolamento dell’UE che ha rivisto alcuni limiti legali dell’OTA ma per quanto riguarda il vino e rimasto invariato. Interventi che possono essere adottati per limitare l’OTA Durante le fermentazioni alcolico o malolattiche e possibile avere una riduzione per assorbimento da parte di lieviti e batteri. I lieviti secchi attivi o i lieviti inattivi possono aiutare a ridurre il livello di OTA. L’affinamento su feccia puo aiutare a diminuire il tasso di OTA Caso studio: riduzione di OTA da parte di ceppi di batteri lattici Quelli cerchiati in rosso sono ceppi di batteri malolattici utilizzati come starter. Diminuzione OTA: range 20-50% → capacita ceppo-dipendente. Quindi e molto importante conoscere il microrganismo che sto somministrano, perche svolgono azioni differenti. Ci sono dei ceppi che diminuiscono l’OTA in seguito a adsorbimento, mentre altri la degradano. Si puo dire che ci sono 2 meccanismi che portano alla diminuzione di OTA. Anche in questo caso abbiamo una capacita ceppo-dipendente 4. LIEVITI E BATTERI Abbiamo variazioni qualitative e quantitative. QUALITATIVE: Prima dell’invaiatura: lieviti oligotrofici → capaci di sopravvivere i ambienti con bassi livelli di nutrienti. Rodotorula mucillaginosa, Aurebasidium pullulans, Lactobacillus spp Durante la maturazione: lieviti copiotrofici → capaci di sopravvivere in ambienti piu ricchi di nutrienti Kloeckera apiculata Starmerelle bacillaris: e un lievito non Saccharomyces fruttosofilo, degrada prevalentemente il fruttosio al posto del glucosio. E resistente all’etanolo. Inoltre e un lievito che produce piu glicerolo a parita di concentrazione zuccherina, questo significa che si produrra meno etanolo. Infatti puo essere sfruttato per ottenere vini a gradazione alcolica piu bassa, e puo essere utile perche con l’innalzamento delle temperature si arrivano a gradazioni zuccherine molto alte. Anche un solo grado alcolico piu basso e una possibilita tecnologica interessante. Acetobacter spp. QUANTITATIVE: Incremento in termini numerici delle popolazioni Popolazioni di lieviti e batteri acetici fortemente influenzate dallo stato sanitario delle uve: Uve sane e mature: [vanno ricordati questi dati] Lieviti = 102-106 UFC/g Batteri acetici = 103-105 UFC/g Batteri lattici = 102 -104 UFC/g 5. PRINCIPALI LIEVITI PRESENTI SULLE UVE La superficie esterna dell’acino e ricoperta di uno strato di materiale ceroso che influenza la capacita adesiva delle cellule microbiche e la loro possibilita di colonizzare la superficie del frutto La presenza e l’accrescimento dei microrganismi sulla superficie dell’acino e influenzata da pioggia, temperatura, varieta dell’uva e dai trattamenti I lieviti risultano principalmente collocati sulla parte di superficie dell’acino dove un po’ di succo puo fuoriuscire: il peduncolo I lieviti provengono dalla vite, dal terreno, dall’aria, dalle piante circostanti o da animali vettori Gli insetti sono il principale vettore per il trasferimento dei lieviti. Tra gli insetti soprattutto le vespe sociali e i calabroni.  La colonizzazione dell’acino da parte dei lieviti e influenzata dal grado di maturazione del grappolo, ovvero aumenta con la maturazione Nell’ambiente vigneto (terreno, corteccia, foglie) prevalgono lieviti a metabolismo ossidativo obbligato (Sporobolomyces, Cryptococcus, Rhodotorula ) e Aureobasidium pullulans che e un lievito-fungo (yeast like fungi) che produce biofilm I lieviti fermentanti (Hanseniaspora/Kloeckera, Metschnikowia, Candida stellata, Candida zemplinina) ed altri lieviti a metabolismo ossidativo (Candida, Pichia) sono in genere predominanti su uve sane e mature. Uve sane e mature: popolazioni microbiche di lieviti: 102-106 UFC/g. Il principale lievito vinario, S. cerevisiae, è POCO PRESENTE su uve sane (presente su 1 acino su 1000). Quello che determina una fuoriuscita del succo d’uva puo portare alla formazione di S. cerevisiae. FATTORI CHE INFLUENZANO I LIEVITI PRESENTI SULLE UVE: - Fattori abiotici - Fattori biotici - Pratiche viticole → es. defogliazione Fattori biotici: Le vespe sociali trasportano i lieviti all’interno dell’intestino, e all’interno di esso i lieviti possono andare incontro a ibridazione e quindi ricombinazione genica tra i ceppi I lieviti S. cerevisiae vivono nell’intestino dei calabroni e delle vespe sociali durante tutto l’anno. I ceppi di lievito all’interno dell’intestino delle vespe raccolte in uno specifico areale erano simili/gli stessi a quelli ritrovati nelle cantine di quell’areale. Questo per ogni areale, quindi significa che per ogni areale ci sono ceppi di lievito specifici. Questi insetti rappresentano quindi il loro vettore piu importante, essendo in grado allo stesso tempo di ospitare e disperdere il lievito anche quando le fermentazioni non sono in atto, ovvero nei mesi invernali e primaverili (da dicembre a febbraio) Quando i frutti maturano, gli insetti sono attratti dal loro odore, li rompono e inoculano i microrganismi al loro interno Il microbiota, ovvero l'insieme delle specie fungine dei calabroni, nel mese di settembre contiene le stesse specie che si trovano sulla superficie delle uve all'inizio della fermentazione vinaria. La scoperta piu interessante e avvenuta confrontando in base ad analisi genetiche i ceppi di lievito dei calabroni con altri ceppi di lievito isolati da uve e fermentazioni naturali delle aree d'isolamento degli insetti, rispetto a una collezione di oltre 400 ceppi isolati da ambienti naturali e industriali in Francia, Stati Uniti, Cile, Nuova Zelanda e Giappone. L'analisi ha indicato come i ceppi isolati da vespe sociali, in particolare calabroni, uve e vini di una determinata area geografica fossero maggiormente correlati fra loro rispetto a ceppi di aree diverse, identificando una biodiversita microbica caratteristica di una vigna o di una regione. Altri fattori che influenzano: La varieta dell’uva Il livello di maturazione Le condizioni climatiche L’integrita della bacca (attacco da parte di muffe o insetti o uccelli) L’uso di fungicidi Le popolazioni di lieviti variano anche in zone diverse di uno stesso vigneto sia per densita cellulare (cellule per grammo di uva) sia per la tipologia di specie Le popolazioni di lieviti variano in funzione dell’annata anche in condizioni climatiche simili La Kloechera apiculata e la Metschnikowia pulkerrima sono sempre presenti Andando avanti coi giorni la concentrazione dei lieviti aumenta  Variabilita nella stessa annata e nello stesso vigneto A seconda della zona del vigneto (alto/centro/basso) ho una concentrazione di lieviti diverse Le concentrazioni consigliate di starter sono 2 milioni. Quando vado a fare l’inoculo mi puo essere utile sapere quanti lieviti diversi ci sono gia nel mio mosto. La specie che aumenta di piu e la K. apiculata ed e molto diverso portare 3.3 x106 UFC/mL di lievito apiculato o 5.7x104 La pioggia si pensa che dilavi via i lieviti invece la concentrazione aumenta 6. CARATTERISTICHE PRINCIPALI DEI BATTERI DI INTERESSE ENOLOGICO Sono microrganismi procarioti di dimensioni inferiori agli eucarioti I principali batteri di interesse enologico sono i batteri lattici e i batteri acetici Le cellule possono avere diversa morfologia: a bastoncino, a cocco e possono formare aggregati come catenelle, tetradi Possono essere mobili (dotati di flagelli): batteri acetici o immobili: batteri lattici I batteri lattici sono Gram + e i batteri acetici sono gram – I batteri lattici e acetici non sono sporigeni Nei confronti dell’ossigeno i batteri lattici sono microaerofili o aerobi facoltativi e i batteri acetici sono aerobi obbligati. Gli acetici sono aerobi ma tollerano bene anche condizioni di ossigeno basse. Ai batteri lattici basse cocnentrazioni di ossigeno li favorisce Sono chemiorganotrofi, ma i batteri lattici sono dotati di metabolismo esclusivamente fermentante Nei confronti della temperatura sono mesofili (opt. 25-30°) ma devono resistere anche temperature basse che si trovano in cantina 13-15°C I batteri lattici sono responsabili della fermentazione malolattica ma possono anche avere effetti negativi sulla qualita del vino e i batteri acetici sono responsabili di alterazioni Il numero dei batteri lattici aumenta notevolmente alla fine della maturazione dell’uva. Al momento della vendemmia abbiamo un rapporto 1:10 tra batteri lattici e lieviti, quindi molto alto. 102 – 104 cell/mL Fra i batteri lattici, i lattobacilli sono piu numerosi rispetto ai cocchi Il Pediococcus spp si trova in uve molto mature, gradazione zuccherina elevata e pH alti Il dominante e il Lactobacillus spp. L’Oenococcus oeni e quello utilizzato per l’inoculo starter ma non lo troviamo nelle uve Al momento della vendemmia i batteri acetici sono presenti a concentrazioni comprese tra 103 e 105 cell/mL Fra i batteri acetici, le specie del genere Gluconobacter sono predominanti sulle specie del genere Acetobacter IL MICROBIOTA IN CANTINA Ambiente di cantina: significa aria, muri, pavimenti, attrezzature (presse, pompe, tubi), vas vinari, linee di imbottigliamento Il maggior fattore che influenza il microbiota nell’ambiente di cantina e il grado di pulizia e igiene che viene raggiunto nell’ambiente di cantina e anche dalla natura delle superfici. Superfici lisce sono piu facili da sanificare. Per lo studio dei microrganismi presenti nell’ambiente cantina vengono effettuati tamponi sulle superfici dei vasi vinari e sulle attrezzature che vengono portati in laboratorio di analisi per la semina in piastra, oppure vengono sottoposte ad analisi microbiologica le acque di lavaggio delle botti. Si fanno dei tamponi, solitamente in aree di 10 cm2. La soluzione fisiologica nella quale viene disciolto il tampone viene poi messo su piastra. Una volta sviluppate le colonie possiamo determinare le UFC x cm2 e valutare le pratiche di sanitizzazione adottate e capire le popolazioni che abitano quell’ambiente Oltre ai tamponi si possono analizzare anche le acque di lavaggio, anche quelle con soda. Oltre alle superfici si puo analizzare anche l’aria con il SAS – surface air system. E un aspiratore che raccoglie l’aria e fissa gli organismi su una capsula petri agarizzata fissata sotto la bocca dell’aria. Nell’ambiente cantina troviamo soprattutto Saccharomyces cerevisiae, che invece e scarso nell’uva. Grazie all’ambiente antropico il S. cerevisiae e il prevalente e puo anche conservarsi da un’annata all’altra perche puo sporificare. Per questo si parla mi microrganismo domesticato. Lieviti flor: della specie S. cerevisiae che si trovano nelle cantine dove vengono fatti i vini affinati biologicamente. I lieviti flor non sono da confondere con i lieviti della fioretta. Altre specie che si trovano in cantina sono della specie Brettanomyces bruxellensis. Si possono trovare poi altri lieviti fermentanti che hanno un ruolo negativo Alcuni di questi lieviti possono essere eliminati col trattamento alla solforosa, mentre lo Zygosacc e Saccharomycodes sono + resistenti alla solforosa. Fonte di lieviti che si aggiungono ai lieviti indigeni sono le colture starter di ceppi selezionati di S. cerevisiae utilizzati per inoculare i mosti IL MICROBIOTA DELL’UVA La microflora presente sull’uva e la microflora di cantina, composta da muffe, batteri e lieviti appartenenti a specie e ceppi diversi, vanno a costituire le popolazioni microbiche iniziali presenti nel mosto d’uva dopo la pigiatura Il mosto d’uva pero e un ambiente selettivo, difficile per lo sviluppo microbico per cui solo alcuni microrganismi riescono a moltiplicarsi. Quindi viene esercitata subito un’elevata pressione selettiva a causa del basso pH e dell’alta concentrazione di zuccheri. Questo fa sì che si selezionino i lieviti come i mo piu idonei allo sviluppo nel mosto I principali fattori che rendono il mosto d’uva un ambiente selettivo sono: - Elevata acidita (pH basso tra 2,8 e 3,8): i lieviti e le muffe sono microrganismi acidofili mentre i batteri in genere hanno necessita di pH piu elevati per cui solo alcuni batteri (lattici ed acetici) si possono sviluppare. Lieviti e muffe sono piu acidofile, ma il fatto che ci sia anche un’elevata concentrazione zuccherina fa si che siano poi i lieviti quelli che si sviluppano meglio - Elevata concentrazione zuccherina (250 g/L e fino a 400 g/L in alcuni vini - passiti): questo determina una elevata pressione osmotica - La riduzione progressiva di ossigeno: questa e determinata dalla produzione di anidride carbonica in seguito alla fermentazione alcolica degli zuccheri presenti nel mosto e dalla forma delle vasche che sono piu alte che larghe per cui il contatto del mosto con l’aria e ridotto. Inoltre, l’anidride carbonica “spinge” verso l’alto l’ossigeno e così il mosto diventa rapidamente un ambiente anaerobico dove i lieviti sono i microrganismi favoriti. L’anidride carbonica effettua un’azione di “strippaggio” In conclusione, queste condizioni difficili del mosto permettono solo ad un numero limitato di microrganismi di sopravvivere e di svilupparsi. Sono favoriti i lieviti. MOSTI AL RIEMPIMENTO DEI TINI ALL’INIZIO DELLA VENDEMMIA All’inizio della vendemmia, al riempimento delle prime vasche, la microflora presente nel mosto e simile a quella riscontrata sulle uve utilizzate. Se siamo all’inizio della vendemmia, le uve sono sane e vengono portate rapidamente in cantina, il microbiota del mosto rispecchia il microbiota dell’uva e della cantina Il numero, la tipologia e l’abbondanza relativa delle specie di lieviti presenti nel mosto e paragonabile a quelle delle uve, se le operazioni di raccolta, conferimento e pigiatura delle uve condotte correttamente e velocemente. La temperatura di raccolta puo influenzare il microbiota del mosto, quello che influenza maggiormente pero e il tempo di vendemmia. Temperatura: le uve vengono conservate nelle cassette prima di essere trasformate in mosto Se il tragitto e lungo puo capitare che si rompono gli acini, con fuoriuscita del mosto e sviluppo dei microrganismi. Anche solo qualche ora puo fare la differenza Anche il clima puo influenzare il microbiota sulle uve Dove non ci sono stati problemi durante il trasporto abbiamo valori analoghi a quelli sulle uve Ma il clima differente ha un influenza importante, soprattutto dal punto di vista quantitativo. Una maggiore umidita favorisce la Candida zemplinina (o starmerella bacillaris) mentre il clima secco favorisce gli apiculati. LIEVITI IN MOSTO AL RIEMPIMENTO DEL 1° TINO Dal punto di vista speceologico, le specie sono quelle, ma per quanto riguarda l’aspetto quantitativo possiamo avere notevoli differenze tra un anno e l’altro Nel mosto finche non c’e l’intervento dell’enologo abbiamo sempre la prevalenza di lieviti non-Saccharomyces, di diversa specie, piu o meno fermentanti Il lievito S.cerevisiae nelle condizioni naturali nei primi tini riempiti all’inizio della vendemmia e minoritario Popolazionedi S. cerevisiae(UFC/mL) al riempimento dei tini nel corso di una vendemmia Col progredire della vendemmia la concentrazione di S.cerevisiae aumenta Durante lo svolgimento della vendemmia la concentrazione cellulare del lievito Saccharomyces cerevisiae, al momento del riempimento delle vasche che vengono via via allestite, aumenta, indipendentemente dal materiale della vasca. Nel corso delle operazioni di cantina, con il procedere della vendemmia, si verifica una “contaminazione” naturale del S. cerevisiae nell’ambiente per cui la sua concentrazione cellulare al riempimento dei tini aumenta progressivamente DURATA DEL TRASPORTO Durante il trasporto gli acini si possono rompere e nel mosto che percola si sviluppano lieviti e batteri acetici che raggiungono popolazioni numericamente diverse da quelle presenti sulle uva prima del trasporto Tra la composizione dei lieviti nelle uve e nel mosto appena riempito c’e una bella differenza. Nel percolato i dati sono superiori a qualche milione di ml di percolato. Questo e sicuramente dovuto alla rottura degli acini e alla moltiplicazione dei lieviti nell’arco di mezza giornata. In questo caso il trasporto e quello che ha determinato l’incremento anche nei batteri acetici CASO STUDIO: ISOLAMENTO DI LIEVITI S. cerevisiae indigeni in una cantina Recentemente molte aziende cercano di ottenere ceppi di lievito che possano esprimersi al meglio in una determinata area geografica andando a selezionare dei ceppi indigeni, autoctoni Se siamo all’inizio della vendemmia la prima cosa da fare e utilizzare delle vasche che vengono posizionate in punti diversi della cantina e fare dei campionamenti in momenti diversi Col procedere della vendemmia abbiamo un incremento di S. cerevisiae Ad esempio la vasca riempita il 15° giorno conteneva solo S. cerevisiae. Da quella vasca si isola il ceppo indigeno. La cosa migliore sarebbe anche quella di ripetere questo approccio per 2/3 anni per vedere quali ceppi si sono insediati nell’ambiente, perche quelli insediati hanno sicuramente piu probabilita di dominare sugli altri ceppi METABOLISMO DEI LIEVITI durante la trasformazione del mosto in vino CATABOLISMO: molecole complesse vengono decomposte in molecole piu piccole per ottenere energia (ATP) ANABOLISMO: sintesi di molecole complesse a partire da molecole semplici con consumo di energia (ATP) Tutti i modi per ottenere energia e il potere riducente sono i motori del metabolismo microbico. Il vantaggio del microrganismo si traduce sempre nella produzione di ATP o NADH o NAD+ Gli intermedi biosintetici per il mo sono prodotti di scarto. Durante il catabolismo abbiamo anche la liberazione di calore, che incide molto sulla cinetica di fermentazione ad esempio. COMPOSIZIONE CHIMICA DELLA CELLULA La composizione chimica tiene conto anche dell’acqua, che e preponderante rispetto le altre macromolecole Molecole % peso umido Acqua 70 Macromolecole tot. 26 proteine 15 polisaccaridi 3 lipidi 2 DNA 1 RNA 5 Monomeri tot. 3 aminoacidi e prec. 0.5 zuccheri e prec. 2 nucleotidi 0.5 Ioni inorganici 1 TOTALE 100% COMPOSIZIONE ELEMENTARE DELLA CELLULA Elemento % peso secco Carbonio 50 Ossigeno 20 Azoto 14 Idrogeno 8 Fosforo 3 Zolfo 1 Sodio 1 Potassio 1 Calcio 0,5 Magnesio 0,5 Cl 0,5 Ferro 0,2 Cu,Zn Mb,Bo,Se, Ni,Cr,Co,Mn,W 0,3 100 % Tutti questi elementi, sia quelli presenti in concentrazione maggiore sia quelli presenti in concentrazioni minori hanno la stessa importanza. Si suddividono in: Macronutrienti: : richiesti in grande quantita. Es. C,O,N,H P,S,K,Mg,Ca,Na Micronutrienti: richiesti in piccola quantita o in tracce. Es. metalli (Cu, Zn, Mb, Cr, Ni, Co, Mn,Se,Fe ecc.) Fattori di crescita: : composti organici necessari in piccole quantita (da 0,01 a pochi mg/l) Es. vitamine, aminoacidi, purine, pirimidine, ecc. I fattori di crescita sono fattori indispensabili ASSIMILAZIONE DEI NUTRIENTI NELLA CELLULA Il microrganismo deve avere una membrana citoplasmatica funzionante. La funzione fondamentale della membrana citoplasmatica e quella di avere una permeabilita selettiva. La membrana deve essere integra e non aver subito modificazioni come composizione per essere funzionante e svolgere in maniera corretta la funzione di barriera selettiva tra ambiente esterno e citoplasma. Diffusione semplice o passiva → la cellula non spende energia, varia in base al gradiente di concentrazione. Solo H2=, gas e piccole molecole idrofobiche possono entrare nella cellula per diffusione passiva. Consente di raggiungere una concentrazione di nutrienti all’interno della cellula = a quella esterna Diffusione facilitata → senza consumo di energia, ATP. La molecola ha bisogno di un carrier per entrare Trasporto attivo → consumo di ATP. Consente di raggiungere una concentrazione di nutrienti all’interno della cellula maggiore di quella esterna. Esistono vari tipi di trasporto attivo: sinporto, antiporto e uniporto Soltanto a fronte di zuccheri, aminoacidi e zolfo si formano tantissimi composti di scarto delle numerosissime vie metaboliche che si possono percorrere, a seconda dello stato biologico, dell’ambiente di fermentazione. A seconda che un mo prenda una via o un’altra determina la formazione di una serie specifica di sostanze di scarto che sono quelle che caratterizzano il prodotto. PRINCIPALI COMPOSTI DEL MOSTO D’UVA (Questi numeri non sono da imparare) C’e una grande variabilita Uno stesso lievito puo produrre metaboliti diversi sia dal punto di visto qualitativo e quantitativo, ci sono dei range ampi. I numeri non sono da imparare ma avere un’idea delle quantita all’incirca e necessario. Glucosio e fruttosio sono solitamente in concentrazione 1:1 o comunque dovrebbero esserlo in condizioni ottimali. Ultimamente c’e uno spostamento del rapporto a favore del fruttosio, questo potrebbe essere un problema perche il S. cerevisiae e glucosofilo, quindi favorisce il glucosio. Il fruttosio ha un potere dolcificante doppio del glucosio quindi il residuo zuccherino (dato appunto dal fruttosio non fermentato) e percepibile dal consumatore. Acidi organici: - Acido tartarico → con cui si esprime l’acidita totale - Acido malico → puo avere concentrazioni molto diverse in funzione della varieta e della maturita - Acido citrico →presente in tutti i mosti a concentrazioni piu basse (500-600 mg/L). Anche se e a concentrazione molto basse e fondamentale per dare dei metaboliti percepiti anche in piccole concentrazioni Composti azotati: - Ammonio - Polipeptidi e proteine non vanno a influenzare l’azoto disponibile per i lieviti, non e utilizzabile. A seconda di come viene trattata la vigna possiamo avere quantita diverse di azoto. Ma le quantita di azoto ammoniacale e amminoacidico (le due forme di azoto utilizzabile dai lieviti) sono sempre circa costanti. L’azoto amminoacidico e quello piu presente nel mosto ma i lieviti preferiscono l’ammoniacale. Le vitamine vanno da microgrammi a mg/mL e sono molto diverse tra loro Antociani e polifenoli dal punto di vista microbiologico sono importanti solo perche se presenti in grandi quantita hanno un potere antimicrobico Sali minerali naturalmente presenti nel mosto: fosfato, solfato, K, Mg, Mn, Zn, Cu, Ca VITAMINE Teoricamente S. cerevisiae e in grado di sintetizzare le vitamine di cui necessita ma l’anaerobiosi puo indurre un fabbisogno di alcune vitamine per cui e necessario che siano presenti nel mosto e possono essere aggiunte. E qualora non fossero presenti possono essere aggiunte direttamente attraverso l’inoculo TIAMINA Vitamina B1 – fondamentale, sottoforma di tiamina pirofosfato TPP E un cofattore della piruvato decarbossilasi, il primo enzima coinvolto nella FA che come substrato di partenza ha il piruvato (il piruvato ce lo da la glicolisi). Questa vitamina ha un limite legale, perche oltre una certa concentrazione ha un effetto negativo per le cellule. E l’enzima che nella fermentazione alcolica catalizza la reazione che trasforma l’acido piruvico in acetaldeide. La sua presenza determina un incremento della velocita della fermentazione alcolica. Nel mosto varia da 0,1 a 1 mg/L ma puo essere degradata dalla solforosa per cui viene aggiunta (limite LEGALE in mosto = 0,6 mg/L). BIOTINA Vitamina B5 – Acido pantotenico La biotina interviene nella sintesi dell’acido pantotenico, che e un costituente del coenzima A; ne consegue che tutti i processi biosintetici in cui interviene il coenzima A possono essere danneggiati da una carenza di questa vitamina. Gli effetti diretti sono sulla funzionalita delle membrane cellulari, sull’efficienza fermentativa e sulla produzione di acido acetico, acetaldeide, acidi grassi a media catena, H2S e SO2. Se il lievito sta bene e da vita ad altre cellule il coenzima A produce lipidi. Se il lievito non si sviluppa in modo ottimale, il coA puo formare acido acetico. Tutte le condizioni di stress portano alla formazione di acido acetico. NICOTINAMMIDE Amide dell’acido nicotinico -vitamina PP Costituente del NADH (nicotinamide adenindinucleotide) e del NADPH (nicotinamide adenin dinucleotide fosfato), coenzimi che intervengono nei processi di trasferimento di un atomo di idrogeno. Molti lieviti apiculati non possono svilupparsi in assenza di questa vitamina Le concentrazioni delle varie vitamine variano molto a seconda della vitamina stessa RIBOFLAVINA La riboflavina puo essere considerata un catalizzatore di una reazione che e stimolata dalla luce solare e consiste nel coinvolgimento di un a AA solforato, la metionina. La riboflavina con la metionina genera metionale che e sensibile ai raggi di luce, andando a sviluppare acroleina e metantiolo che ha odore di cavolo cotto e cipolla. Tutto viene indotto dalla luce, quindi bisogna evitare l’esposizione alla luce, solo che molto spesso questa vitamina si trova per lo piu nei vini bianchi e rosati, molto spesso in bottiglia trasparente. Parlando di metabolismo del carbonio: Tutti i lieviti possono utilizzare: glucosio, fruttosio, mannosio (monosaccaridi). Il mannosio non e importante nel settore enologico Puo essere utilizzato: Galattosio ma occorre adattamento enzimatico Molti lieviti possono utilizzare disaccaridi: Saccarosio (glucosio+fruttosio), Maltosio (glucosio + glucosio), Melibiosio (galattosio + glucosio) ma affinche il lievito possa utilizzare questi zuccheri devono essere idrolizzati prima di entrare nella cellula dalle specifiche idrolasi (es. il saccarosio deve essere scisso in glucosio e fruttosio dall’invertasi che e localizzata nello spazio periplasmatico tra parete e membrana citoplasmatica ma non e presente in tutti i lieviti vinari per cui per lieviti per spumante deve essere saggiata la presenza) In generale NON vengono utilizzati PENTOSI (che rimangono disponibili per i batteri lattici) ma fa eccezione il Brettanomyces bruxellensis. Il Brettanomyces bruxellensis e un lievito non desiderato che rimane preferenzialmente in cantina e non ha tante altre fonti di carbonio se non i pentosi. Quindi anche se presenti in concentrazioni basse sono capaci a sviluppare queste cellule di lievito. I pentosi pero possono essere utilizzati dai batteri lattici, quindi se si fa una malolattica in cui i batteri usano i pentosi il Brettanomyces puo trovarsi piu in difficolta per svilupparsi Gli zuccheri nei lieviti vengono in genere trasportati da PERMEASI = (proteine di trasporto) in genere per diffusione facilitata secondo gradiente di concentrazione e senza dispendio di energia. Alcuni lieviti hanno anche il trasporto attivo, e in base al trasporto abbiamo lieviti crabtree positivi e crabtree negativi. TRASPORTO DI GLUCOSIO E FRUTTOSIO In S. cerevisiae il glucosio ed il fruttosio vengono trasportati dalla stessa proteina, permeasi, ma in genere ha una maggiore affinita per il glucosio. Questo e il motivo per cui il glucosio viene degradato piu velocemente del fruttosio per cui S. cerevisiae viene definito «lievito glucosofilo» a differenza di altre specie come Starmerella bacillaris (syn. Candida zemplinina) definito «lievito fruttosofilo» perche degrada preferenzialmente il fruttosio I primi giorni di fermentazione il fruttosio non viene utilizzato  A G lu c o s io - F r u t t o s io ( g /L ) 8.5 8.0 140 Lievito fruttosofilo 120 7.5 (○) = popolazione C. zemplinina, (▲) = glucosio, (□) = fruttosio L o g U F C /m L 100 7.0 80 6.5 60 6.0 40 5.5 5.0 20 0 0 3 6 9 12 15 T e m p o ( g io r n i) Il contenuto in steroli, soprattutto ergosterolo, e il grado di insaturazione degli acidi grassi nella membrana citoplasmatica sono correlati al trasporto preferenziale del glucosio. L’ergosterolo e una molecola che si intercala nel doppio strato fosfolipidico e si intercala nella membrana dei lieviti. E indispensabile per il buon funzionamento della membrana. Per la sua sintesi e indispensabile che il lievito abbia a disposizione l’ossigeno L’ossigeno favorisce la sintesi degli steroli e degli acidi grassi migliorando la permeabilita della membrana citoplasmatica e quindi l’entrata del glucosio. Questo fatto giustifica l’influenza positiva che l’areazione del mosto, ottenuta nelle prime fasi della FA con i rimontaggi all’aria, ha sul completamento della degradazione degli zuccheri. Queste pratiche sono fondamentali per permettere al lievito di sintetizzare queste molecole. Quindi o mettiamo il lievito in condizioni tali da poterlo produrre o glielo facciamo trovare gia pronto (insieme ai nutrienti possiamo fornire anche direttamente ergosterolo) E importante che l’ossigenazione venga effettuata il secondo giorno dall’inizio della fermentazione, ovvero durante la fase di crescita esponenziale della popolazione di lieviti, in quanto in questa fase avviene la sintesi dell’ergosterolo nei mitocondri, mentre quando l’areazione avviene nelle fasi avanzate della FA i lieviti non traggono benefici. L’ossigenazione al secondo giorno della fermentazione determina uno sviluppo maggiore dei lieviti (7,5x107 cell/mL) ed una maggiore degradazione degli zuccheri (98%) I rimontaggi all’aria vengono effettuati soprattutto per i vini rossi, mentre per i vini bianchi sono meno usati per timore di ossidazione del mosto e di modificazioni dell’aroma. Oltre ai rimontaggi all’aria si puo utilizzare anche la microossigenazione, che sicuramente per i vini bianchi e meno rischiosa L’ossigeno ha una funzione diversa a seconda di quando viene aggiunto. Le parti sottolineate evidenziano il momento migliore per effettuare la somministrazione, ovvero una piccola aerazione nel secondo giorno. Se lo somministriamo troppo tardi non c’e un evidente effetto In S. cerevisiae il trasporto degli zuccheri e regolato in modo complesso e sono stati descritti 20 geni che codificano la sintesi di proteine trasportatrici di esosi (hexose transporters). La concentrazione del glucosio regola l’espressione di tali geni e puo sia indurre che reprimere la sintesi di queste proteine. Le proteine di trasporto sono diverse e sono sintetizzate in maniera diversa seconda delle condizioni ambientali, soprattutto alle concentrazioni di glucosio e fruttosio. Il fatto che il S. cerevisiae abbia altre proteine di trasporto che non sono inibite dall’alta concentrazione di glucosio fa sì che possa modulare la risposta per esprimere a livelli diversi queste proteine rende piu efficace il trasporto degli zuccheri all’interno della cellula. La presenza di tipi diversi di trasportatori diversamente regolati permette un rapido adattamento alle diverse condizioni ambientali. C’e quindi una capacità di adattamento del S. cerevisiae che in base alle diverse condizioni ambientali sintetizza differenti proteine. Non solo la concentrazione di zuccheri influenza la sintesi delle proteine, ma anche l’etanolo. Lo stress indotto dall’etanolo nelle fasi finali della FA favorisce il trasporto del glucosio a svantaggio del fruttosio, questa e un’altra causa per cui il S. cerevisiae e glucosofilo. I singoli ceppi rispondono in maniera diversa all’etanolo. Un altro fattore che influenza il trasporto degli zuccheri e l’azoto. Una maggiore concentrazione di azoto nel mosto favorisce l’utilizzazione del fruttosio. In altre specie (S. bayanus, S. pastorianus) esistono trasportatori specifici per il fruttosio che agiscono per simporto protonico, ovvero trasporto attivo che insieme allo zucchero porta uno ione H+ Dato che il fruttosio ha un potere dolcificante doppio rispetto al glucosio la sua presenza come zucchero residuo ha un effetto piu marcato sul vino. Se ci sono residui zuccherini solitamente sono dovuti al fruttosio. I lieviti sono microrganismi chemiorganotrofi (utilizzano composti organici come fonte di carbonio e ottengono l’energia da reazioni di riduzione) e anaerobi facoltativi I processi metabolici a cui i lieviti possono andare incontro sono la respirazione aerobica o la fermentazione alcolica FORMULE DA IMPARARE: RESPIRAZIONE AEROBICA: C6H12O6 + 6O2 → 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP. maggiore energia = maggiore biomassa FERMENTAZIONE ALCOLICA: C6H12O6: → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP. Minore energia = minore biomassa Quando vengono prodotti gli starter i lieviti vengono messi in condizioni di respirare, il processo metabolico e la respirazione. La coltivazione industriale delle colture di S. cerevisiae deve essere effettuata in presenza di ossigeno e bassissime concentrazioni di zucchero, che deve essere fornito in coltura continua. LA RESPIRAZIONE AEROBICA Glucosio + 6 O2 = 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP Produzione di energia (ATP) con completa ossidazione del substrato da parte dell’ O2 che e l’accettore finale di e- Comprende: - GLICOLISI (da GLUCOSIO a PIRUVATO+ ATP+ NADH). La glicolisi avviene nel citoplasma - CICLO degli ACIDI TRICARBOSSILICI (TCA o di Krebs) (da PIRUVATO A CO2 ,NADH, FADH2). Avviene nelle creste mitocondriali - SISTEMA di TRASPORTO di ELETTRONI e ATP-asi e OSSIGENO = ENERGIA (ATP) e H2O Ciclo di Krebs = TCA FADH2 e NADH2 sono il potere riducente che entra nella catena di trasporto degli elettroni la fosforilazione ossidativa avviene nelle creste mitocondriali. Il trasporto degli e- e alimentato dalla forza proton motrice che attiva l’ATP- asi Il TCA produce anche intermedi per la biosintesi cellulare (es. acido citrico per gli acidi grassi, acido α-chetoglutarico per gli aminoacidi ) FERMENTAZIONE Glucosio (C6H12O6) = 2 Etanolo (C2H5OH) + 2 CO2 + 2 ATP Le molecole di NAD ossidato sono le molecole che servono per far procedere la glicolisi, quindi degradare le molecole di zucchero che portano alla produzione di ATP Quindi alla fine abbiamo un guadagno netto di 2 ATP REGOLAZIONE RESPIRAZIONE/FERMENTAZIONE Nei LIEVITI la respirazione aerobica e la fermentazione vengono regolate in funzione delle condizioni redox, delle esigenze nutrizionali della cellula e delle condizioni ambientali in cui opera I due processi hanno in comune la GLICOLISI che avviene nel citoplasma  Il piruvato e un trioso - RIVEDERE LA GLICOLISI – TUTTI I PASSAGGI Aldolasi: enzima fondamentale della glicolisi, scinde il fruttosio 1,6 difosfato nei due triosi: diidrossi aceton fosfato e gliceraldeide 3 fosfato, in percentuali molto differenti. Ma poi l’equilibrio si sposta verso la gliceraldeide 3 fosfato La gliceraldeide 3 fosfato subisce un’ossidazione con utilizzo del NAD+ che si riduce a NADH. E questa la reazione a cui serve il NAD ossidato L’acido 1,3 difosfoglicerico viene trasformato in acido 3 fosfoglicerico con sintesi di ATP – si chiama anche fosforilazione a livello di substrato Il prodotto finale della glicolisi sono 2 molecole di acido piruvico e 2 di ATP La glicolisi avviene nel citoplasma L’acido piruvico puo prendere 2 vie a questo punto: A. Piruvato deidrogenasi → se c’e tanto ossigeno B. Piruvato decarbossilasi → se c’e meno ossigeno, oppure se c’e comunque ossigeno ma c’e una concentrazione di glucosio > 2-20 g/L (caso della FA) piruvato deidrogenasi (sn): produzione di NADH, acetil CoA e CO2 Nella piruvato decarbossilasi (dx): c’e produzione di CO2 e aldeide acetica, senza produzione di NADH EFFETTO PASTEUR Pasteur per primo osservo che l’areazione fa aumentare la produzione di biomassa e diminuire la produzione di etanolo per cui concluse che l’ossigeno inibisce la Fermentazione alcolica (EFFETTO PASTEUR). Questo effetto e stato in parte spiegato dal fatto che la piruvato decarbossilasi, che e l’enzima coinvolto nella via fermentativa, ha una affinità minore per il piruvato rispetto alla piruvato deidrogenasi che e l’enzima coinvolto nella via respiratoria. Nelle primissime fasi in cui il lievito si trova a disposizione il glucosio, si trova di fronte alla piruvato deidrogenasi che lo indirizzerebbe alla via respiratoria. Ma poi prevale la piruvato decarbossilasi EFFETTO CRABTREE Il S. cerevisiae e un lievito Crabtree positivo. L’effetto Crabtree consiste nel fatto di optare per la FA anche in presenza di ossigeno. Crabtree noto che alcuni lieviti, tra cui S. cerevisiae, anche in presenza di ossigeno quando la concentrazione di zuccheri e superiore ad un range di 2-20 g/L, attuano la fermentazione alcolica. (EFFETTO CRABTREE, o Repressione da cataboliti): la respirazione e inibita a favore della fermentazione alcolica. Questi lieviti sono appunto detti crabtree positivi o glucosio sensibili In presenza di concentrazioni di glucosio maggiori di 2 g/L per S. cerevisiae o maggiori di 20 g/L per altre specie di lievito viene inibita la piruvato deidrogenasi, e quindi viene inibita la respirazione, si blocca l’ossidazione del piruvato e il ciclo degli acidi tricarbossilici (ciclo di Krebs) e i mitocondri degenerano. Gli enzimi della via respiratoria sono comunque presenti nella cellula. Ci sono specie di lieviti crabtree negativi o glucosio insensibili Il piruvato formato dalla glicolisi arrivato in questa fase e come se dovesse passare attraverso un imbuto (figura rossa)e poi seguire o la fermentazione o la respirazione. Se il lievito e crabtree positivo si verifica la situazione C Un lievito e definito crabtree positivo o negativo in funzione della concentrazione intracellulare di piruvato. La concentrazione intracellulare dipende dal tipo di trasporto del glucosio. Se il trasporto e attivo abbiamo che via via il glucosio all’interno della cellula non si accumula, perche la cellula non spende energia. Quando invece il trasporto e passivo, diffusione facilitata, abbiamo un accumulo all’interno della cellula e quindi abbiamo tanto zucchero. La cellula poi non e piu in grado di degradare tutto questo zucchero con la respirazione e opta per la fermentazione. Se la quantita di glucosio che entra nella cellula e tale da passare sottoforma di piruvato tutta all’interno dell’imbuto, prevale la respirazione (Crabtree negativo) Se invece la concentrazione di glucosio saturera l’imbuto (livello limite), le molecole in eccesso saranno fermentate e verra prodotto etanolo e nella cellula si ha repressione dei geni che codificano gli enzimi del ciclo di Krebs, degenerano i mitocondri (Crabtree positivo). Quindi il comportamento metabolico del lievito dipenderà dalla concentrazione intracellulare di glucosio Da cosa dipende la diversa concentrazione intracellulare in un lievito ? La concentrazione intracellulare dipende dal tipo di trasporto del glucosio Lieviti Glucosio sensibili (Crabtree positivi) → Con la diffusione facilitata rimangono residui di glucosio e avviene saturazione della capacita respiratoria Lieviti glucosio insensibili (Crabtree negativi) → Con il trasporto attivo non rimangono residui di glucosio perche la concentrazione intracellulare e regolata in funzione della loro attivita metabolica, non avviene saturazione per cui respirano S. cerevisiae e Crabtree positivo e in condizioni enologiche (concentrazione di zuccheri maggiore di 2 g/L) puo soltanto FERMENTARE anche se c’e ossigeno. Altre specie di lieviti Crabtree positivi fermentano in presenza di ossigeno quando la concentrazione e maggiore di 20 g/L Un catabolita del glucosio o lo stesso glucosio determina repressione dei geni che codificano per gli enzimi della respirazione → infatti l’effetto crabtree viene anche detto “repressione da cataboliti” Quindi quando si producono le colture starter si deve tenere sempre lo zucchero sotto 1 gr/L che deve essere fornito in continuo per far sì che le cellule continuino a moltiplicarsi LA FERMENTAZIONE ALCOLICA DEI LIEVITI Avviene nel CITOPLASMA: C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2 NAD+ + 40 Kcal E una reazione esoergonica, infatti si liberano 40 Kcal L’acido PIRUVICO subisce una decarbossilazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi (che ha come cofattore la Tiamina pirofosfato =TPP e magnesio) e si forma ALDEIDE ACETICA e ANIDRIDE CARBONICA (Fig. 1) L’ALDEIDE ACETICA accettando elettroni in una reazione catalizzata dalla alcool deidrogenasi (che ha come cofattore zinco) porta alla formazione di ETANOLO e NAD ossidato che serve per fare procedere la glicolisi (Fig. 2) I lieviti usano parte dell’energia per sintetizzare le 2 molecole di ATP (= 14,6 kcal), L’energia rimanente (25,4 kcal) viene dissipata causando riscaldamento del mosto in fermentazione L’energia (2 ATP) si forma mediante fosforilazione a livello di substrato L’etanolo a fine FA (in presenza di poco piruvato) puo essere riossidato ad acetaldeide (vini tipo sherry) Per l’enologo tutti i prodotti secondari che si formano a causa delle varie vie metaboliche che la fermentazione prende sono molto importanti per le note sensoriali del prodotto finito. Dalla fermentazione di 1 grammo di zucchero dovrei ottenere 0,51 g di etanolo e 0,49 g di CO2 ma in realta il glucosio viene convertito in altri prodotti e in materiale cellulare Quindi noi possiamo calcolare quanta anidride carbonica e quanto etanolo si formano da 1gr di zucchero. Non tutto il piruvato viene indirizzato a etanolo nella FA e parte del carbonio che e presente nel glucosio viene utilizzato per la sintesi di cellule. Quindi se parto da una concentrazione di glucosio e arrivo ai prodotti finali della FA ho meno C, ovvero quello utilizzato per produrre le cellule, la biomassa I principali prodotti dalla fermentazione alcolica di 100g di glucosio: il glicerolo e il composto secondario a piu alta concentrazione dopo l’etanolo Il glicerolo si forma durante la Fermentazione glicero- piruvica A partire da acido piruvico si formano i seguenti prodotti secondari: Acido succinico, acido α-chetoglutarico (Ciclo TCA) Acetaldeide Acido acetico → pungente, non desiderato Diacetile, acetoino, 2,3-butandiolo. Insieme vengono chiamate Acido D-lattico → un po’ di acido lattico viene comunque prodotto dai lieviti durante la FA Secondo Genevois (1950) fra glicerolo e gli altri sottoprodotti della fermentazione alcolica esiste un rapporto costante secondo la seguente equazione espressa in moli: 2A+B+2M+H+5S = Σ = G dove: A = acido acetico B = 2,3 butandiolo M = acetoino H = acetaldeide S = acido succinico G = glicerolo FERMENTAZIONE GLICEROPIRUVICA (FGP) L’acetaldeide avendo un gruppo CHO si lega alla solforosa e non viene ridotta ad etanolo per cui non si forma NAD ossidato → CH3–CHO + HSO3 → CH3–CHOH–SO3H La solforosa anche prodotta naturalmente dai lieviti si lega all’acetaldeide, quindi l‘acetaldeide non e piu un substrato disponibile per produrre etanolo, questo significa che non si riesce a produrre NAD ossidato, quindi la FA rallenta la cellula si attiva e trova un altro sistema per produrre NAD ossidato All’inizio della FA i 2 enzimi , piruvato decarbossilasi e alcol deidrogenasi, sono inibiti dalla elevata concentrazione di zuccheri e quindi si forma, in ogni caso, poco NAD ossidato Quando la cellula non ha NAD ossidato l’equilibrio tra diidrossiacetone fosfato e aldeide 3 fosfato si sposta a sinistra e avviene la FGP con formazione di GLICEROLO (vedere lo schema della glicolisi). La cellula sposta questo equilibrio per ottenere NAD ossidato. Si forma il glicerolo proprio in modo tale che la cellula abbia a disposizione il NAD ossidato per portare a termine la glicolisi e formare il piruvato La formazione di glicerolo infatti avviene nelle prime fase della vinificazione, perche la solforosa prodotta dal lievito si lega all’acetaldeide, ma poi l’acetaldeide continua a prodursi, rendendosi disponibile alla formazione di NAD+ che poi porta alla formazione di etanolo. La FGP porta alla formazione di GLICEROLO ed e attiva soprattutto nelle prime fasi della FA quando nei mosti solfitati l’acetaldeide si combina con la solforosa. Le cellule trovano una via diversa per riformare NAD+. Il diidrossiacetone-P viene ridotto a glicerolo-3P, con consumo di NADH, e poi convertito in GLICEROLO Guadagno in termini di ATP = 0 → quindi non c’e un guadagno energetico per la cellula nel fare la FGP ma le consente di portare a termine la glicolisi ottenendo la molecola di NAD+ Il glicerolo conferisce rotondità e corpo a un vino La fermentazione dei primi 100 g di esosi genera la maggior parte del glicerolo prodotto GLICEROLO : sapere la formula LA PRODUZIONE DI GLICEROLO SERVE ALLA CELLULA PER: – Rigenerare NAD+ – Riequilibrare potenziale di ossido riduzione endocellulare: eliminazione del NADH in eccesso dovuto a 1) sintesi aminoacidi, 2) ossidazioni che generano prodotti secondari – Risposta allo stress osmotico in quanto viene utilizzato per mantenere un adeguato turgore quando le condizioni ambientali tenderebbero a richiamare acqua all’esterno della cellula. PRODUZIONE DI GLICEROLO IN VINO In media nei vini bianchi secchi= 4-6 g/L, nei vini rossi secchi = 6-8 g/L, in cui la F.A. e stata condotta da S. cerevisiae ma c’e variabilita in funzione del ceppo Alcune specie di lievito come Candida stellata e Starmerella bacillaris producono quantita di glicerolo maggiori rispetto a S. cerevisiae. Maggiore e la concentrazione di zuccheri e piu glicerolo viene formato in risposta allo stress osmotico. Nei vini dolci glicerolo = 15-20 g/L Il piruvato prodotto dalla glicolisi non viene utilizzato solo per formare etanolo e glicerolo ma viene trasformato in prodotti secondari come Acetaldeide, acido succinico, alcoli superiori, acido acetico, acetoino, diacetile , 2,3 butandiolo etc.. Alcoli superiori: hanno un numero di molecole di carbonio superiore a quello dell’etanolo. Isobutanolo, alcol isoamilico, alcol amilico attivo, 2-feniletanolo, n-propanolo ACIDO SUCCINICO E il terzo per quantita dopo etanolo e glicerolo. Ci sono 2 vie che portano alla produzione di acido succinico, non e stata descritta in modo univoco la sintesi dell’acido succinico. Sono state ipotizzate 2 vie metaboliche: una riduttiva e una ossidativa, che coinvolgono gli enzimi del ciclo di krebs, del ciclo degli acidi tricarbossilici TCA. Le reazioni del TCA sono possibili grazie a questi enzimi che rimangono nel citoplasma, non nei mitocondri, Infatti, anche se in anaerobiosi i mitocondri non sono attivi, permangono gli enzimi Tutte le vie metaboliche dipendono dalla disponibilita degli enzimi. La maggior parte degli enzimi vengono sintetizzati in base all’esigenza della cellula. Nel ramo di sinistra abbiamo un consumo di NADH, quindi via riduttiva Nella parte destra abbiamo la via ossidativa con produzione di NADH o NADPH che vengono facilmente ossidate nella fermentazione glicero piruvica. Acido succinico VIA OSSIDATIVA In condizioni anaerobiche la via di entrata del piruvato nel ciclo avviene nel citoplasma, ma il ciclo non puo essere completato In condizioni anaerobiche: l’Ossalacetato si combina con acetil-CoA formando acido citrico, poi isocitrato ossidato dal NAD a acido α-chetoglutarico che a sua volta subisce una ossidazione formando succinilCoA Passando da succinil co-A ad acido succinico si ha la produzione di una molecola di ATP quindi e conveniente per la cellula. Attraverso una fosforilazione a livello di substrato si forma ACIDO SUCCINICO e GTP Il ciclo si blocca perche l’enzima succinato deidrogenasi (6 in fig) necessita come cofattore del coenzima FAD che e strettamente respiratorio, necessita di ossigeno. Quindi non e disponibile nel citoplasma. Non essendoci l’enzima la reazione non viene catalizzata e il succinato si accumula nella cellula e poi esce L’ACIDO SUCCINICO si accumula a livelli di 0,5- 2 g/L e il NADH generato viene riossidato nella FGP dalla formazione del glicerolo a partire dal diidrossiacetone -P Anche queste reazioni, così come la FGP avvengono nei primi giorni della fermentazione, dopodiche la concentrazione rimane abbastanza costante. Secondo alcuni autori l’enzima α-chetoglutarato deidrogenasi ha una attivita molto bassa in anaerobiosi per cui ritengono che il ciclo si fermi ad acido α-chetoglutarico e che l’acido succinico si formi attraverso una via riduttiva VIA RIDUTTIVA Avvengono in sequenza due reazioni di riduzione a partire da acido ossalacetico. L’acido ossalacetico prima viene ridotto ad acido malico, che si trasforma in fumarato che viene ridotto a succinato. CARBOSSILAZIONE del PIRUVATO ad opera della piruvato carbossilasi il cui gruppo prostetico e la biotina con consumo di 1 ATP e CO2 e formazione di acido ossalacetico Avvengono due reazioni di riduzione: la prima a carico dell’acido ossalacetico con formazione di acido malico, e la seconda a carico dell’acido fumarico con formazione di ACIDO SUCCINICO Questa via metabolica dovrebbe essere una via minore perche e stato dimostrato (Oura, 1977) che solo la via ossidativa del ciclo di krebs puo mantenere stabile il bilancio redox NAD+ /NADH durante la fermentazione. L’acido succinico viene prodotto dai lieviti e ha come funzione quella di aumentare la stabilita microbica: aumenta l’acidita, abbassando il pH. Ha anche un effetto sul mantenimento del colore e delle proprieta sensoriali dei vini. La quantita di acido succinico che viene prodotta da S. cerevisiae vanno da 200 mg/L a 1 g/L. la soglia di percezione e 35mg/L quindi e comune che si possa sentire e ha un sapore amaro-salato. Quantita eccessive possono avere un impatto negativo in bocca. Concentrazioni maggiori di 1gr/L di acido succinico possono inibire la popolazione di Oenococcus oeni, quindi la degradazione di acido malico avviene piu lentamente. Concentrazioni vicine a mezzo gr/L invece tendono a stimolare la degradazione di acido malico da parte di Oenococcus oeni. ACIDO ACETICO Si forma per ossidazione dell’acetaldeide. Quando il piruvato viene decarbossilato ad acetaldeide non tutta l’acetaldeide viene ridotta ad etanolo ma in parte viene ossidata dal NAD+ in acetato (acido acetico) in una reazione catalizzata dall’aldeide deidrogenasi. L’acetato formato e necessario per formare l’acetil CoA quando il complesso della piruvato deidrogenasi (che e l’enzima coinvolto nella via respiratoria) e represso in seguito all’assenza di ossigeno e/o per l’elevata concentrazione di zuccheri. La reazione puo fermarsi ad acido acetico ed essere liberato oppure continuare e trasformare l’acido acetico in acetil CoA. Quando i lieviti sono in fase di crescita attiva viene liberato meno acido acetico all’esterno perche e di piu quello che porta alla formazione di CoA. L’acetil CoA viene utilizzato per la sintesi dei lipidi. L’acetil CoA puo essere prodotto per necessita biosintetiche. La concentrazione di acido acetico e maggiore proporzionalmente alla quantita di zuccheri FATTORI INCIDONO SULLA QUANITTA DI ACIDO ACETICO NEI VINI ❖ Specie e ceppo di lievito ❖ Tenore iniziale di zucchero ❖ Valori di pH molto bassi o alti ❖ Temperature troppo elevate in fase di moltiplicazione del lievito (vini rossi) ❖ Carenze in certe vitamine e aminoacidi ❖ Chiarifica dei mosti troppo spinta (vini bianchi) ❖ Nei mosti di uve sane con concentrazione di zuccheri di 220 g/L, ❖ S. cerevisiae produce una quantita relativamente bassa di acido acetico (da 100 a 300 mg/L) ❖ All’aumentare della concentrazione di zuccheri aumenta la produzione di acido acetico (es. vini passiti) ❖ Carenze di azoto e di vitamine determinano una maggiore produzione di acido acetico perche si ha minore crescita cellulare Tutte le volte che abbiamo un parametro che porta al rallentamento dello sviluppo cellulare abbiamo una maggior produzione di acido acetico In generale, l’acido acetico viene prodotto in misura maggiore quando i lieviti sono sottoposti a stress nutrizionali, termici, osmotici A volte l’acido acetico puo conferire al vino un profilo aromatico piu distintivo, soprattutto grazie alla produzione di esteri proprio a partire dall’acido acetico Tutti i lieviti non saccharomyces producono quantita di acido acetico maggiori rispetto al S. cerevisiae. L’H. uvarum e quello che ne produce di piu. Ma anche all’interno del S. cerevisiae stesso ci sono ceppi che ne producono piu e altri che ne producono meno ACIDO LATTICO L’acido lattico e un prodotto minoritario e deriva per riduzione dell’acido piruvico ad opera delle lattato deidrogenasi del lievito (200-300 mg/L) L’acido lattico si trova sempre nella forma di acido L-lattico I lieviti dall’acido piruvico formano anche ACETOINO, DIACETILE, 2,3 BUTANDIOLO (dette sostanze acetoiniche) Tale processo inizia con la condensazione di due molecole di acido piruvico con formazione di anidride carbonica e acido α-acetolattico → decarbossilazione : ossidativa (diacetile) e non ossidativa (acetoino). L’acetoino a sua volta e in equilibrio col 2,3 butandiolo. Si sposta da una parte all’altra in base alla necessita del potere redox della cellula. Dal punto di vista organolettico bastano delle concentrazioni minime per avere un impatto importante. Per l’acetile bastano dai 7-10mg con sentori importanti quali aroma di burro ALCOLI SUPERIORI REAZIONE DI EHRLICH Dalla degradazione degli zuccheri si forma un α-chetoacido, una molecola in comune con la via di degradazione degli aminoacidi. La reazione di Ehrlich ha un ramo a destra e uno a sinistra, il ramo sinistra ha una doppia freccia, ovvero e reversibile. L’α-chetoacido viene formato in quantita elevate quando abbiamo una carenza di aminoacidi, quindi dalla glicolisi va verso il ramo a destra. Perche una carenza di aminoacidi e una situazione non desiderata per la cellula e quindi cerca di provvedere, e cerca di sintetizzarli. Per sintetizzare gli AA il primo passaggio e la transaminazione, ovvero la reazione tra l’acido α-chetoglutarico con ammino-transferasi A formare l’α-chetoglutammico. Dagli zuccheri quindi si forma un α-chetoglutarato (viene dalla formazione dell’acido succinico) che puo essere decarbossilato, e quindi diventare aldeide, che poi viene ridotta ad alcol → alcol superiore. Se invece gli aminoacidi sono in concentrazioni elevate, in parte vengono usate per la sintesi proteica, in parte per la produzione di alcoli. Gli AA subiscono una deaminazione formando α-chetoacido e poi segue la stessa reazione, decarbossilazione → aldeide → riduzione → alcol superiore. Quindi gli alcol superiori si possono formare sia da un eccesso di aminoacidi, che da un