Microbiology Chapter 7: Culture, PDF

LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 1. Facteurs influençant la croissance : i. Concentration en solutés (= pression osmotique) et activité de l’eau : . Rappel : concentration * en elevei substance chimiques dissouter La bactérie doit-être dans une solution où la pression osmotique est relativ...

LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 1. Facteurs influençant la croissance : i. Concentration en solutés (= pression osmotique) et activité de l’eau : . Rappel : concentration * en elevei substance chimiques dissouter La bactérie doit-être dans une solution où la pression osmotique est relativement proche de la pression osmotique cytoplasmique de la bactérie. a) Si la pression osmotique de la solution entourant la bactérie est hypotonique, c’est un stress pour elle. → De l’eau va vouloir rentrer dans son cytoplasme, ce qui n’est pas très bon pour elle La bactérie a mis en place plusieurs moyens pour résister à ces stress : 1. La paroi : la structure de peptidoglycane se retrouvant à l’extérieur de la membrane cytoplasmique (ligne verte sur le schéma) est rigide et permet à la bactérie de résister à une solution hypotonique. → Cela empêche donc à l’eau de rentrer dans la bactérie et de la faire exploser. Si la bactérie n’avait pas cette paroi, en condition isotonique (même pression osmotique à l’intérieur qu’à l’extérieur), la bactérie aura tune forme 70 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 indifférenciée et lorsque cette bactérie serait en condition hypotonique, de l’eau rentrerait dedans et induira son éclatement. ➔ C’est cela qu’il se passe lorsqu’on utilise des inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne (pénicilline et lysozyme). 2. Canaux mécano-sensibles : Ces canaux se trouvent dans la membrane cytoplasmique et quand la bactérie est soumise à un stress osmotique, sa membrane cytoplasmique est étirée et va ouvrir ces canaux dont le job est de relâcher des solutés. Cela permet de corriger/ moduler la pression osmotique cytoplasmique de la bactérie en relâchant des solutés. → Donc, la bactérie sait +/- moduler sa pression cytoplasmique. 3. Vacuoles : pas chez les bactéries Il y a des protistes qui n’ont pas de paroi mais qui, lorsqu’il y a trop d’eau autours d’elles, utilisent des vacuoles contractiles qui vont écoper l’eau. b) Si la pression osmotique de la solution entourant la bactérie est supérieure à la pression osmotique du cytoplasme de la bactérie = hypertonique, c’est un stress pour elle. → De l’eau va vouloir sortir de son cytoplasme, ce qui n’est pas très bon pour elle. La bactérie a mis en place plusieurs moyens pour résister à ces stress : 1. Synthèse de solutés compatibles : Elles vont synthétiser des solutés compatibles avec les réactions métaboliques (ces molécules ne peuvent pas tout faire et ne doivent pas gêner le fonctionnement du métabolisme) pour augmenter la pression osmotique du cytoplasme. • Osmotolérant = bactéries qui se développent dans une large gamme de pressions osmotiques extérieures et d’activité de l’eau. • Osmophile = bactéries préférant une activité d’eau faible et une pression osmotique élevée. • Halophile = cas particulier d’osmophile. Ce sont les bactéries qui nécessitent une concentration de NaCl élevée. Donc, pour éviter le développement de bactérie, on doit sucrer et saler nos aliments pour que la pression osmotique soit importante et que l’activité d’eau soit faible. → Cela empêche le développement bactérien. 71 LIKIN Salomé ii. Bac 3 VT 2019-2020 Le PH : On a différents types de bactéries : - Acidophile : bactérie qui apparait dans un PH acide. Ces bactéries possèdent des mécanismes de protection pour se protéger du PH acide extérieur : ➢ Des imports de cations (K+) pour limiter l’entrée de H+ dans le cytoplasme bactérien. ➢ Elles savent aussi, éventuellement, exporter des H+ par une pompe à proton. ➢ Elles sont équipées de protéine appelée « acid shock and heat shock proteins » qui sont des chaperonnes qui évité la dénaturation des protéines par chute de PH. ➔ Attention que ce n’est pas parce qu’une bactérie pousse à un PH très faible que le PH cytoplasmique de cette bactérie est acide. Cela est indépendant l’un de l’autre. Le PH cytoplasmique est TOUJOURS proche de la neutralité. - Neutrophile : bactérie qui apparait dans un PH autours de 7. - Alcalophile basophile : bactérie qui apparait dans un PH neutre. Ces bactéries possèdent des mécanismes de protection pour se protéger du PH basique extérieur : ➢ Elles peuvent échanger des K+ et NA+ internes contre des H+ externes par le système antiport. Donc, ces bactéries doivent utiliser des « astuces » et dépenser de l’énergie pour que le PH de leur cytoplasme reste neutre. Donc, pour protéger nos aliments contre le développement bactérien, et bien on conserve nos aliments dans un PH acide ou basique (exemple des cornichons dans le vinaigre blanc). iii. La température : Les bactéries ne savent pas contrôler leur température internet et ont donc la température de leur milieu externe. = Ce sont des poïkilothermes. On distingue donc toute une gamme de bactérie : - 72 Psychrophile : bactéries qui poussent dans les milieux les plus froids. LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 La membrane de ces bactéries doit rester fluide à des basses températures et s’est donc adaptée pour cela. Par exemple, elles utilisent des ARNt légèrement modifiés qui leur apporte la fluidité et leur permettent de fonctionner à ces basses températures. - Hyperthermophile : bactéries qui poussent dans les milieux les plus chauds. Ces bactéries se sont adaptées pour pousser à ces températures et ont des lipides ramifiés et des cycles dans leur membrane, leurs permettant d’avoir une fluidité de la membrane et une membrane qui reste stable à ces hautes températures. Elles ont aussi des protéines qui résistent à cette température et des protéines qui aident d’autre protéines à rester stables. Cela est important puisqu’il ne faut pas oublier que la vitesse des réactions métaboliques augmente avec la température mais que la haute température dénature les protéines et fait fondre leur membrane. - Mésophile : bactéries qui poussent à des températures proches de 30-37°C → Cela est typiquement le cas de tous nos pathogènes qui poussent à des températures proches de celle de leurs hôtes. L’optimum de température : les bactéries poussent dans une gamme de température qui se trouve autours de cet optimum. Donc, pour protéger nos aliments contre le développement bactérien, et bien on conserve nos aliments au froid dans notre frigo vu que la plupart de nos bactéries sont mésophile. Le froid va permettre de ralentir le développement bactérien et non pas le combattre puisque le froid ne va jamais dégrader des bactéries. iv. La concentration en oxygène : L’oxygène est l’accepteur final des électrons. - Aérobe obligé : ces bactéries ne poussent qu’en présence d’un certain pourcentage - 73 en oxygène. Microaérophile : bactérie aillant besoin d’une concentration en oxygène relativement plus faible. Ces bactéries ne se développent donc pas directement à la surface d’un tube à essais mais juste un peu en dessous, là où la concentration en oxygène est réduite. LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 - Anaérobe facultatifs : bactéries qui ont une flexibilité anabolique. L’oxygène ne leur - est pas nécessaire parce que s’il n’est pas présent, ces bactéries vont utiliser un autre accepteur d’électron mais il est bénéfique pour la croissance de la bactérie. Anaérobe aérotolérant : bactéries n’utilisant pas l’oxygène mais qui ne sont pas gêné par celui-ci. Anaérobe obligé : pour ces bactéries, l’oxygène est toxique. Donc, pour protéger nos aliments contre le développement bactérien, et bien on conserve nos aliments sous vide et on prive l’accès à l’oxygène. Parfois, l’oxygène est la source des ROS (reactive oxygen species) = déchet / accident du métabolisme et de la respiration. Lorsqu’on a le transporteur d’électron qui transfert les électrons à l’accepteur final, et bien parfois, ça ne se passe pas correctement et on génère ces fameux radicaux superoxyde ou eau oxygénée (sont des espèces oxygéno réactives). → Cela abime les molécules des cellules. À un moment où un autre, il y a forcément génération de ces ROS. Et bien les bactéries qui respirent ont différentes enzymes pour s’en protéger : 74 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 La catalase et la peroxydase sont présentent dans des nombreuses bactéries anaérobes facultatives mais rarement présent chez des bactéries anaérobes obligées (c’est normal elles ne respirent pas). Ces enzymes sont aussi utilisées pour protéger les pathogènes des cellules immunitaires. En effet, nos cellules immunitaires vont utiliser des espèces oxygéno-réactives pour détruire les bactéries. Et ces bactéries vont s’en protéger grâce aux enzymes ci-dessus. v. La pression et les radiations : • La pression influence la croissance des bactéries. Barophile = piézophile : bactéries ont besoin d’un milieu avec autre chose qu’une Atm de pression. - Les bactéries qui vivent à des pressions plus élevées ont une composition de la membrane adaptée pour que celle-ci puisse rester fluide à ces pressions. En prime, elles ont aussi des protéines chaperonnes. Généralement, ces bactéries sont sensibles aux UVs parce qu’elles vivent dans un milieu sans lumière et n’ont donc pas l’équipement pour survivre à la présence d’UVs. • Les radiations influencent la croissance des bactéries. Les rayons ionisants (RX et Rɣ) et UV ont une haute intensité énergétique. Ces photons véhiculent avec eux de l’énergie. Lorsqu’on expose des molécules biologiques à ces radiations, on va abimer le génome de la molécule et créer un stress oxydatif qui abimera les molécules organiques de la bactérie ou de n’importe quelle cellule. Les rayons ɣ sont ceux qui véhiculent l’énergie la plus importante. Donc, pour protéger nos aliments contre le développement bactérien, et bien on peut irradier nos aliments. Cela permet de détruire le génome des bactéries (et des aliments) se trouvant sur l’aliment. À noter que l’on a quand même trouvé une bactérie : Deinococcus radiodurans qui résiste à 5000x la dose mortelle de radiation pour un homme ! 75 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 À retenir : - Osmotolérant, osmophile, halophile. Acidophile, neutrophile, alcalophile/basophile Psychrophile, psychrotrophe, mésophile, thermophile, hyperthermophile. Aérobe obligé, microaérophile, anaérobe facultatif ≠ aérotolérant ≠ obligé, ROS, catalase, SOD. Barotolérant, barophile = piézophile Conservation des aliments : basse T, absence d’O2, pH acide, π elevée, activité de l’eau basse. 2. Culture : i. Milieu de culture : On va mettre les bactéries dans un milieu de culture où on leur fournit des nutriments qui vont fournirent de l’énergie à ces bactéries. Ces nutriments sont les bases du renouvellement des constituants cellulaire. Nutriments : - Macroéléments : C, H, O, N, P, et S (g/l) Cations K+ Ca2+ Mg2+ Fe2+ Fe3+ (mg/l) - Microéléments = oligoéléments Zn Co Mo Ni Cu Mn (µg/l) Les milieux de cultures peuvent-être : - Définis = synthétiques : on connaît la composition précise du milieu. - Complexes (extrait de levures, peptones = hydrolysats de protéines de viandes, de soja…) : on ne sait pas ce qu’il se trouve dans ce milieu. ➔ Cela va constituer la « nourriture » pour les bactéries cultivables. Ces composants, on va, soit les laisser dans un milieu liquide, soit on va mélanger ses composants avec de l’agar et en faire un milieu solide. - Non-sélectif = milieu qui permet la croissance d’un grand nombre de - 76 microorganismes différents. Sélectif = favorise la croissance de certains microorganismes. Par exemple : les sels biliaires inhibent les Gram + et pas les Gram -. LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 - Différentiel = permet la discrimination visuelle de microorganismes différents parce que le milieu va se colorer si on a une espèce particulière qui pousse dessus. Par exemple : si la bactérie est capable de fermenter le lactose qui est mit dans le milieu, l’indicateur PH va faire virer le milieu en rouge et dès lors, on sait que la bactérie rouge est une bactérie capable de fermenter le lactose. Le choix du milieu (des milieux) sera orienté en fonction du type d’échantillon de départ (fèces, urine, eau de distribution…). En effet, on ne va pas utiliser une gélose contre les champignons si on est persuadé que l’on a une infection bactérienne. Donc, nous allons choisir notre gélose en fonction de l’anamnèse et la matrice que l’on va utiliser. ii. Isolement de cultures pures : Souvent, lorsqu’on collecte un échantillon, il y a de bonne chance que ce que cet échantillon contienne essentiellement (uniquement) le pathogène que l’on souhaite observer (urine, sang,). Lorsqu’on prend de l’urine, du sang ou un tissu, normalement on ne doit pas trouver de bactérie là-dedans et il y a de grande chance que ce qu’il se trouve dans l’échantillon ne soit que le pathogène que l’on souhaite étudier. À l’inverse, si notre échantillon est de la matière fécale ou un prélèvement buccal, il y a toute la flore qui est mélangée à notre pathogène. Et là il faudra faire le tri entre l’origine de notre maladie et tout le microbiote de base. Donc, quand on aura un mélange de bactérie, il va falloir les séparer les unes des autres. Une des méthodes pour séparer les bactéries d’un mélange est celle d’ensemencement part striation : 1. Au départ on pose un mélange de bactérie sur la gélose. 2. On l’étale en faisant des sortes de lignes. Ensuite, on passe notre plaque sous la flame → stérilisation. 77 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 3. On reprend l’échantillon là où il était dilué au niveau des lignes et on restérilise. 4. On continue à aller rechercher des colonies dans la deuxième série de ligne et on re dilue en stérilisant. 5. Toujours pareil. Ce sont en fait des dilutions. On va diluer jusqu’à ce qu’on dépose une cellule seule et puis on incube pendant 48h et on aura, in fine, une belle petite colonie. Cela nous permet d’isoler nos bactéries et de faire des cultures pures. Un autre moyen plus simple est l’ensemencement en profondeur par dilutions successives : On dilue successivement notre échantillon et puis on ensemence nos dernières dilutions jusqu’à avoir un tapis bactérien assez résolus que pour aller pêcher les colonies qui nous intéresse. Parfois, notre échantillon de départ contient très peu de bactéries et nous n’avons donc pas besoin de le diluer mais on a plutôt besoin de l’enrichir. En effet, ça arrive que la présence de certaines bactéries dans des aliments soit très faibles mais que malgré cela, ça cause des problèmes sanitaires. Donc, on va prendre notre échantillon et on va le mettre dans un milieu d’enrichissement. Ce milieu est un milieu très riche qui fait pousser à peu près tout. iii. Culture d’anaérobes : Cela arrive que l’on soit obligé de cultiver des bactéries anaérobes strictes. Pour se faire, nous allons mettre notre bactérie sur une gélose dans une boite de pétri. Ensuite, on met ces boites dans un conteneur hermétique qui possède un système capable de décomposer l’oxygène en eau. 78 LIKIN Salomé iv. Bac 3 VT 2019-2020 Courbe de croissance en système fermé : Si on cultive des bactéries dans un système fermé, il va y avoir une phase de latence le temps que nos bactéries s’habituent au milieu et puis une phase de croissance exponentielle. Les bactéries vont croitre et se diviser. La vitesse de division dépend de l’espèce bactérienne et du milieu. Ensuite, il y a un moment où les bactéries arrêtent de croître parce qu’il n’y a plus assez de nutriment/ il y a une accumulation de déchet. Et pour finir, la population bactérienne va donc décroitre suite à cela. v. Culture continue de microorganismes : Si on veut que notre population bactérienne se multiplie à l’infini, et bien on utilise ce qu’on appelle des chémostat qui est un système ouvert où les nutriments sont fournis en continus et où les déchets sont éliminés en continu. vi. Mesure de la taille de la population microbienne : a. Chambre de comptage : On met une lame en verre avec un cadrillage d’une taille bien définie sur laquelle on pose une lamelle couvre objet. Entre ces 2 lamelles ont place la solution contenant les bactéries à dénombrer. Ensuite, il ne reste plus qu’à s’amuser à compter le nombre de bactérie dans un volume pour avoir la concentration bactérienne. 79 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 b. Compteur électronique : Il y a des systèmes automatiques qui comptent eux-mêmes. c. Cytomètre en flux : C’est un appareil qui fait passer des cellules les unes après les autres devant un laser. Quand la cellule passe devant le laser, elle bloque le faisceau lumineux et permet à la machine de compter. Le désavantage avec ces méthodes de comptage est qu’on ne sait pas si nos bactéries sont vivantes ou mortes. Une alternative pour ça est de prendre notre milieu de culture, le filtrer afin que toutes nos bactéries restent collées sur le filtre. Ensuite, on va déposer ce filtre sur une boite de pétri et on pourra donc, in fine, compter la quantité de bactérie vivante (les bactéries mortes ne se multiplieront pas en colonie). Une autre méthode de dénombrement viable des bactéries est qu’on met la solution de bactérie sur une boite de pétri, après dilution. Si on ne cherche pas forcément le nombre exact de bactérie dans un échantillon mais plutôt une indication on peut mesurer d’une autre façon : la mesure de la turbidité. 80 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 On prend le milieu de culture, on l’inocule, on l’agite et on l’incube pendant 24 à 48h à 30-37°C pour que notre milieu devienne turbide (il devient turbide parce qu’il y a des milliards de bactérie dans cette soupe). Nous allons estimer la turbidité mettant l’échantillon dans un spectromètre = appareil qui mesure la quantité de lumière transmise. vii. Bactérie et archées non cultivables : La grande majorité des bactéries (et archées et eucaryotes) ne sont pas cultivables par les techniques actuelles. On sait qu’on ne sait pas les cultiver parce que quand on regarde ces bactéries au microscope, on voit plein de chose. Par contre, quand on prend ces « plein de choses » et qu’on essaye de les cultiver, on n’arrive pas à en cultiver beaucoup. Beaucoup de monde pense que ça vaut la peine d’essayer de cultiver des bactéries non cultivables. Le problème est que lorsqu’on découvre un antibiotique, il ne faut pas longtemps avant qu’il n’y ait développement d’une résistance. Actuellement ça fait un petit temps que l’on n’a pas su cultiver de nouveaux antibiotiques. Dès lors, il serait peut-être intéressant de cultiver des bactéries non cultivables vu qu’elles pourraient, peut-être, nous fournir de nouveaux antibiotiques. Parfois, on a besoin d’une bactérie « helper » pour cultiver d’autres bactéries. Donc ici on a une bactérie helper et autours d’elle des bactéries que l’on essaye d’isoler. Sans la bactérie helper, la population bactérienne ne se développera pas. La bactérie helper fourni aux autres bactéries quelque chose qui leur permet de croitre. Donc, associer des bactéries va peut-être nous permettre de découvrir des bactéries qui étaient, jusqu’à présent no cultivables. 81 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 À retenir : - Nutriments fournissent énergie et sont les bases des constituants cellulaires. Macroéléments C H O N P S (g/l), cations K+ Ca2+ Mg2+ Fe3+ (mg/l), microéléments Zn2+… (µg/l) Milieu liquide ou gélose. Milieu non-sélectif, sélectif, différentiel, milieu d’enrichissement. Ensemencement par striation ou en profondeur par dilutions successives -> culture pure. Culture continue (chémostat). Mesure de la taille de la population microbienne (chambre de comptage, mise en culture après dilution, turbidité). Problématique des ‘non cultivables’. 3. Identification : i. Colorations : La chose la plus simple à faire pour identifier des bactéries est de les colorer. - - Coloration simple : cela nous donnera une indication sur les morphologies de celle-ci et cela nous permettra d’avoir une première petite indication sur ce que ça pourrait être. Coloration différentielle : Le marquage de Gram : ce marquage permet de faire la distinction entre les monodermes et les didermes et est basé sur l’utilisation de 2 colorants. La première chose à faire est de venir déposer nos bactéries sur la lame après les avoir émulsionnés dans un liquide physiologique. Ensuite, on va les sécher et les fixer. 82 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 Après cela, on rajoute un 1er colorant : le cristal violet et du mordant (le lugol). → Ces 2 colorants vont colorer toutes les bactéries (Gram+ et Gram-) en mauve. Ces colorants vont se lier aux parois de peptidoglycanes des bactéries : - Les Gram + ont une paroi bien plus grande → Donc, quand on va utiliser un agent de décoloration (Ethanol), les Gram + vont rester mauves et les Gram – vont se décolorer et devenir incolore. - Suite à cela on va contre-colorer en ajoutant la safranine qui va colorer ce qui n’est pas déjà coloré en rose. → Les Gram – seront donc roses. ii. Tests biochimiques : Il y a une quantité de tests qui évalue les capacités métaboliques des bactéries. Cela a un vrai pouvoir discriminatoire. En fonction de ce que la bactérie utilise comme nutriment, ces tests nous indiquerons pas mal de choses sur l’identité de la bactérie. Exemple d’un test biochimique faisable sur gélose : on test l’hémolyse – la capacité à la bactérie à lyser les GR. Il y a différents types d’hémolyse : alpha, beta et gamma. La bactérie va lyser des globules rouges parce que ce sont une source de Fer. Ce test métabolique, nous donnera donc un indice sur le type de bactérie. Nous pouvons faire ces tests sur boite, dans des petits tubes ou grâce à des kits « galeries API »(Analytical Profile Index). 83 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 Dans chacun de ces petits contenants, il y a tous les réactifs nécessaires aux tests. Donc on a notre culture pure et pour savoir quel est le nom de la bactérie, on dépose ces bactéries dans les petits contenants et puis on ensemence. Ensuite, on incube pendant 48h à 37°C. Le liquide va, parfois, changer de couleur. Ensuite on suit le mode d’emploie qui nous dit que si le liquide est rouge ou jaune c’est + ou -. Ensuite, on additionne les chiffres lorsqu’on a des + et on supprime lorsqu’on a des -. Pour le premier chiffre du test ci-dessus par exemple +4 = 4. Lorsqu’on a le « code-barre » final avec tous les chiffres on le cherche dans une espèce de gros livre contenant le nom de notre lignée. Il y a plein de galerie API et ce sont les colorations faites auparavant (et d’autres tests biochimiques simples) qui nous permettent de choisir la bonne galerie API. iii. Tests moléculaires : Ces tests sont des tests ne nécessitant pas forcément une culture. On va ici s’intéresser à la composition génomique, en protéine, en lipide, en sucre,… de nos bactéries. Lors de ces tests, on utilise donc la composition moléculaire pour permettre l’identification des bactéries. Le premier test le plus utilisé est le séquençage du gène codant pour la sous-unité 16S de l’ARN ribosomial. On séquence ce gène parce qu’il est très conservé et tout juste assez peu conservé dans certaine région que pour nous renseigner le type de bactérie dont il s’agit. Voici le gène qui code pour l’ARN ribosomial 16 S. En vert, ce sont les section très conservées → L’ARN ribosomial entre nous et une bactérie possède la même séquence. Par contre, les régions grises sont des séquences différentes entre espèce bactérienne. Nous allons donc aller séquencer ces régions variables pour identifier les bactéries. Séquencer ces régions variables : 1. Extraire l’ADN : on prend notre suspension bactérienne et on la mélange dans une solution organique de phénol et de chloroforme pour lyser les cellules et répartir l’ADN dans la phase aqueuse polaire vu que l’ADN est chargé négativement. Les protéines dénaturées se retrouveront, quant à elles dans la phase organique apolaire étant donné qu’elles sont apolaires. 84 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 2. On récolte la phase polaire contenant l’ADN et on va le précipiter avec de l’éthanol – on va l’assécher et neutraliser les charges avec de l’acétate de sodium et in fine, récolter un culot contenant l’ADN de bactérie. ➔ On a isolé l’ADN de nos bactéries. 3. Maintenant il reste à séquencer ce fameux gène codant pour l’ARN 16S. Avant de le séquencer il va falloir l’amplifier en utilisant une PCR qui utilisera des amorces qui seront placées sur les séquences concernées. Ces amorces vont s’hybrider dans les régions conservées de ce gène. On fait donc la réaction de PCR qui n’a que comme but d’amplifier un fragment du matériel. → On augmente donc le nombre de copie du fragment de gène de l’ARN 16S. 4. On va séquencer cette région variable – on va la lire. En fonction du chromatogramme on pourra identifier la séquence de l’ARN 16S. 5. Avec cette séquence, on va dans nos banques de donnée et on saura dès lors à quelle bactérie on a à faire. Il est possible qu’on se retrouve parfois face à ce genre de chromatogramme. Cela arrive lorsqu’on ne sépare pas nos cultures bactériennes. Ce problème peut être solutionné grâce au séquençage à haut débit qui peut séquencer un mélange PCR. 85 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 Il y a d’autre machine permettant de séquencer à haut débit sans pour autant prendre trop de place. Effectivement, il y a, maintenant, des séquenceurs tout petit dont le fonctionnement est complétement différent puisque ça sera la différence de potentielle mesurée entre 2 électrodes qui permettra de savoir quelle base est lue et de définir la composition de notre mélange de séquence. ➔ Cela est utilisé dans les épidémies d’Ébola pour séquencer le virus sans pour autant avoir trop de matériel. Le séquençage à haut débit permet de s’affranchir de l’étape de culture → Cela fait gagner du temps et permet d’avoir un vison bien plus large de ce que l’on a dans notre échantillon. Donc, ce séquençage à haut débit permet l’avènement de la métagénomique = on peut analyser du contenu génétique d’échantillons issus de l’environnements complexes prélevés dans la nature (sol, airs,…) Un autre test moléculaire fréquemment utilisé dans les laboratoires est le MALDI-TOF MS : = Matric Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry. On va déposer nos colonies de bactéries sur une petite plaque et un laser va sublimer (transformer ces bactéries en composé gazeux) et charger les peptides et protéines bactériens. Ces ions seront accélérés par un champ électrique et emmené vers un détecteur de masse par temps de vol. Cela fournis des spectres. Plus la protéine lysée est grande et plus elle mettra de temps à atteindre le détecteur. Ensuite, on va comparer le spectre de notre échantillon avec une banque qui a été réalisée avec tout un tas de bactéries connues et on va comparer les 2 pour savoir identifier notre bactérie. iv. 86 Tests immunologiques : LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 Les tests immunologiques = essayer d’identifier une bactérie avec des anticorps. Lorsqu’on utilise un anticorps, c’est lui qui va détecter un déterminant antigénique bien spécifique. C’est le fonctionnement de l’Elisa : on a un antigène bien spécifique qui est reconnu par un anticorps et on a couplé une enzyme à cet anticorps qui, quand on ajoute du substrat va colorer le milieu. Donc, concrètement on a une culture bactérienne qu’on va lyser → donc, on détruit les bactéries et on les sépare. Ici on aura donc une soupe d’antigène que l’on va déposer sur une plaque Elisa. Chaque puit de la plaque est recouvert avec des anticorps qui reconnaissent des protéines de la bactérie que l’on veut identifier. Donc lorsqu’on utilise le test Elisa c’est parce qu’on suspecte que ça soit un type bactérien particulier. On ne peut pas faire ce test si on ne suspecte pas une bactérie. Ainsi, si l’espèce bactérienne que l’on suspecte est présente, il va y avoir, dans cette soupe de bactérie, la protéine reconnue par notre anticorps. Donc, la protéine bleue sera fixée par le premier anticorps présent sur la plaque. Et puis on rajoutera un deuxième anticorps qui lui aussi reconnaîtra la protéine bleue de manière très spécifique. Cet anticorps est en fait couplé à une enzyme qui, quand on ajoutera le substrat, va provoquer la coloration de notre puit. Au plus la substance est colorée, au plus la concentration en protéine est importante et donc au plus la concentration de notre bactérie était importante. L’avantage de ce test est qu’il est semi-quantitatifs puisque plus le puit est coloré, plus on sait qu’il y avait de bactérie. Et en plus ce test est extrêmement spécifique puisqu’on utilise des anticorps spécifiques d’une protéine de notre bactérie. → Ce type de test ne se trompe pas. 87 LIKIN Salomé v. Bac 3 VT 2019-2020 Tests résistance aux phages : Les bactériophages sont les virus des bactéries. - Phage typing = on peut voir quel phage peut infecter notre population bactérienne. Ici nous avons différentes souches de bactéries et certaine sont sensibles à d’autre phage et d’autres pas. Là où il y a un trou dans le tapis bactérien, c’est là où on a inoculé le phage. Donc, la bactérie est sensible à certain phage et n’est pas sensible à d’autre. Et en fonction du profil e sensibilité à différent phage, on va pouvoir donner un nom précis à la souche de bactérie. vi. Tests résistance aux antibiotiques : Cela n’est pas pour identifier la souche bactérienne en tant que tel mais plutôt pour savoir si la souche bactérienne que nous avons identifiée est +/- sensible aux antibiotiques ou pas. En effet, ça ne servirait à rien d’utiliser des antibiotiques si ceux-ci ne fonctionnent pas sur une bactérie dans une boite de pétri. 88 LIKIN Salomé Bac 3 VT 2019-2020 Donc ici on a inoculé la gélose avec une bactérie. Celle-ci va faire un beau petit tapis. Avant de mettre la boite de pétri à 37°C, on va coller sur la boite des petites pastilles contenant des antibiotiques. Ensuite on incube pendant 24-48h. On voit que dans photo 2 il y a des zones où il n’y a pas eu de croissances bactériennes. Celle-ci a été inhibée par l’ammoxicilline. Par contre, à d’autre endroit on voit qu’il y a une croissance jusqu’à la frontière de la pastille antibiotique → La bactérie est résistante à cet antibiotique. La taille du rond d’inhibition autours de l’antibiotique est une information qui signifie que plus le rond est grand, plus l’antibiotique est efficace parce qu’à proximité de la pastille, la quantité d’antibiotique est élevée et puis quand on s’en éloigne, la concentration diminue. Dès lors, un grand cercle autours de la pastille nous montre que l’antibiotique est efficace même avec une faible concentration. Sur l’image ci-dessus, on voit une synergie entre 2 antibiotiques (flèche rouge) : à cet endroit-là, la bactérie doit faire face à 2 antibiotiques. 1. Principes du contrôle microbien : 89 • • Stérilisation = procédé qui tue TOUT : cellules vivantes, virus, spores, prions,… Désinfections = destruction, inhibition ou élimination des microorganismes (sauf endospore) pathogénique. - Désinfectants = composés chimiques pour désinfecter les objets.