M2 (S1) UE : Ingénierie Microbienne PDF

M2 (S1) IM UE : Ingénierie Microbienne Coordonnées et infos : - 19 septembre à 11h30 = entraînement à l’analyse d’article scientifique (EU RTM) - 6 séances de 4h donc prévoir toutes nos ma...

M2 (S1) IM UE : Ingénierie Microbienne Coordonnées et infos : - 19 septembre à 11h30 = entraînement à l’analyse d’article scientifique (EU RTM) - 6 séances de 4h donc prévoir toutes nos manipe (protocol à faire nous même) - cahier électronique = C’EST NOTÉ !!! - UE fini en septembre !! à travailler le plus tôt  M2 (S1) IM Jeu. 31 août 2023 E. Gueguen Chapitre : Production de protéine et outils de biologie moléculaire Objectif biologie de synthèse: réduction des coûts/ ressources non renouvelable/ rejet dans l’eau ↳ ex: riboflavine produite par B. subtilis à partir de source de glucose I- Organisation et expression génique Procaryote Eucaryote traduction co-transcriptionnelle traduction post-transcriptionnelle 1 seul ARN polymérase 3 ARN polymérases gène continu (pas d’intron) gène discontinu (intron) ARNm (polycistronique → opéron) ARNm uni protéique 1 SEULE ARN polymérase 3 ARN polymérase II- Zoom sur la TRANSCRIPTION 1. Structure promoteur bactérien - boîte -10: souvent TATAAT - boîte -35 : souvent TTGACAT la transcription en ARN débute TJR au niveau du +1 de transcription 2. INITIATION de la transcription 1/ Fixation du facteur σ entre -35 et -10 2/ Recrutement et positionnement de l’ARN pol 3/ Ouverture de la double hélice par le facteur σ 4/ Début de transcription sur 2-9 nucléotides 5/ Libération du facteur σ (= ARN bloqué) M2 (S1) IM 3. ELONGATION de la transcription 1/ Arrivé des nucléotides par un tunnel 2/ Ajout par complémentarité avec matrice 3/ Élongation dans le sens 5’ → 3’ 4. TERMINAISON de la transcription rho dépendante rho indépendant protéine rho dissocie duplex ADN/ ARN conformation en structure tige-boucle reconnaissance d’un motif “rut” “UUUUU” important car liaison H moins forte terminaison prévisible/ designable ⇒ séquence fixation de rho ou motif épingle à cheveux III- Zoom sur la TRADUCTION 1. INITIATION de la traduction 1/ Petite sous-unité reconnais le RBS 2/ Fixation de l’ARNt méthionine (AUG ou GUG) 3/ Recrutement de la grande sous-unité RBS = riche en G et A (8 à 10 base en amont de l’ATG) sur l’ADN matrice 2. ELONGATION de la traduction - site A : amène l’ARNt suivant (prochain aa) - site P : formation de la liaison peptidique et la chaîne - site E : permet translocation et sorti de l’ARNt distance entre RBS et codon start TRÈS important pour que ça tombe dans la poche du ribosome M2 (S1) IM Ne jamais faire confiance à la bioinfo car prédiction pas toujours bonne Prédiction Vérification à la main distance entre RBS et ATG trop grande (= erreur) bonne distance entre RBS et ATG (= c’est good) 3. TERMINAISON de la traduction 1/ Aucun ARNt correspondant au codon stop 2/ Fixation d’un facteur de terminaison interaction entre protéines néfaste (ex: protéase) si protéine toxique on peut coller une étiquette de dégradation (protéine fusionné tag) IV- Les opérons 1. L’opéron lactose - lacZ = code l’enzyme qui catabolisme le lactose - lacY = code un permease permettant l’entré du lactose - lacI = code le répresseur de l'opéron - O = opérateur qui bloque transcription - P = promoteur qui transcrit - lactose (~IPTG) lève la répression de l’opéron M2 (S1) IM 2. Les opérons synthétiques def: des gènes sous contrôle d’un même promoteur non présent naturellement Transcription : - A et B = même contrôle transcriptionnelle - gènes A et B entre UN promoteur et Term Traduction : - A = son propre contrôle traductionnelle (RBS) - B = son propre contrôle traductionnelle (RBS) 3. Le code génétique (a) Niveau ARNt - ARNt en multicopie dans le génome donc certains ARNt rare/ commun - ces proportion d’ARNt diffère entre les microorganismes (b) Niveau codon - pls codon pour un même aa donc certains codon rare/ commun (dépend de l’organisme) - codon rare à la suite = fin de traduction (UTILISER LE MOINS DE CODON RARE) Solution - un plasmide Pcodon qui code des codons rares - optimisation du code génétique pour un organisme (existe logiciel) VIII- Les fusions Transcriptionnelle Traductionnelle - GFP sous contrôle du promoteur du gène cible - GFP sous contrôle promoteur et traduction - supprime UTR (post-transcript. → inconnu) - supprime STOP gène cible et ATG fusion GFP - possède son propre RBS/ ATG et STOP - garde UTR du gène (post-transcript. → connu) - étudier activité et force promoteur - étudier localisation/ stabilité/ régulation post. M2 (S1) IM IX- Les plasmides 1. Type de plasmides - naturel: énorme (40-80kb) ⇒ sans gros intérêt industrielle - manipulable: plus petit (1-10kb) ⇒ simple à extraire et transformer/ conjugué 2. Les éléments d’un plasmide manipulable (a) Obligatoire ORI = origine de réplication - multicopie (800 copies) = énorme intérêt industrielle (quantité d’ARNm énorme) - monocopie (1 copies) = complémentation fonctionnelle (b) Optionnelle MCS = site multiple de clonage - zone avec énormément de site de restriction (franc/ asymétrique) - chaque site de restriction est présent 1 seul fois Régulateur génique - transcription (avec un promoteur et terminateur en amont et aval du MSC) - traduction (avec un codon start et un codon stop en amont et aval du MSC) Marqueur de sélection ([ATB] dépend du chassis bactérien) - conservervation du plasmide (maintient pression de sélection) - sélectionner des cellules qui ont intégré le plasmide (criblage) ORIt = origine de transfert (50aine base pour transfert conjugatif) 3. Les plasmides de type PSEVA - plasmide construit toujours de la même manière - tous les PSEVA possèdent le même MCS (donc mobile entre plasmide) - avec enzyme possibilité de transfert (promoteur+gène) dans un nouveau PT7 - parfois promoteur et terminateur directement intégrée sur plasmide 4. Transfert de plasmide Transformation Conjugaison : - naturelle (Acinetobacter/ Legionella) - utilisé chez les souches difficiles à transformer - chimique (pore dans la membrane) - Pseudomonas dure transformer ( → conjugaison) - electroporation - nécessite une ORIt et souches compatible (gène pir) M2 (S1) IM X- Les promoteurs 1. Les types de promoteurs (a) Promoteur inductible def: activité maximale du promoteur dans une condition donnée Plac (promoteur de l’opéron lactose) - inductible avec IPTG (non utilisable comme source de C) - LacI se fixe et encombrement spatial du promoteur Ptac (promoteur opéron tryptophane inductible à l’IPTG de l’opéron lactose) - opéron tryptophane (plus forte expression que le promoteur) - opéron lactose (permet induction avec IPTG) Ptet (promoteur de la tétracycline) - inductible avec un analogue de la tétracycline (anhydro tetracycline) - régulateur TetR ⇒ fort pouvoir “OFF” (totalement éteint sans analogue) PT7 (promoteur de l’ARN pol T7) - le pouvoir d’expression du PT7 est EXTRÊMEMENT fort - biologie de synthèse = gène ARN pol T7 placé sous contrôle de Plac (IPTG) - inductible IPTG et forte capacité de mise en “ON” et “OFF” sans IPTG - E. coli BL21 (DE3) = gène chromosomique ARN pol T7 placé sous contrôle de Plac (IPTG) (b) Promoteur constitutif def: activité maximale ou normal quelque soit la conditions (pas d’induction particulière) 2. Régulation des promoteurs (a) Force promotrice def: contrôle de la quantité d’expression d’ARNm par le promoteur Séquence -10 Séquence -35 Affinité de σ Niveau d’expression TATAAT TTGACAT +++++ +++++ TATACT TTGACAT ++ ++ TATAAT TTGACAG ++ ++ TATACT TTGACAG + + variabilité des boîtes MAIS séquence consensus pour expression maximale (b) Facteurs σ - σ70 avec la plus forte expression (ménage chez bactérie ⇒ -10 et -35) - permet le positionnement de l’ARN pol au niveau du promoteur + ouverture hélice - d’autre facteurs σ ont des affinité +/- forte et pour des gènes différents  M2 (S1) IM (c) Les régulateurs Activateur Represseur - activateur = en amont du promoteur - répresseur = à l'intérieur du promoteur 3. Régulation des promoteurs on peut choisir sur des sites les promoteurs qui sont de variantes promoteur ~ 35pb RBS ~ 20aine pb donc possible d’inclure le promoteur dans une queue flanquante et aussi de prendre le gène + le RBS natif dans la PCR TOUT CE QUI FAIT MOINS DE 100pb ONT PEUT LE mettre dans un oligo (= amorce) MAIS ADN qui fait moins de 100pb très peu de résolution et extraction XI- Riboswitch seul cas où régulateur se fixe directement sur l’ARN ⇒ normalement se fixe sur promoteur ARN peut avoir structure qui réprime la traduction 1/ SAM = conduit terminaison prématuré de la transcription lié à la structure → si on a du SAM dans le milieu 2/ lorsque SAM se fixe formation d’une boucle qui emprisonne le RBS (empêche traduction) XII- sRNA ARN activateur ou répresseur se fixe la plupart du temps dans le 5’UTR X- Les différentes RBS catalogue de RBS avec +/- d’affinité on peut commander ce qu’on veut (tester par gène rapporteur)  M2 (S1) IM XIII- Exem term tableau avec biobrick Q= créer un promoteur inductible (R= Plac + LacI ⇒ sans LacI c’est un promoteur constitutif) → attention au contexte (promoteur ? répresseur ? activateur ? analogue) Eucaryote = pas d’epissage des intron chez les procaryotes (donc impossible chez bactérie) → 1/ faut cloner l’ADNc eucaryote (séquence final et épissé) → 2/ synthèse de gène sans les introns (juste exon) ⇒ 80euro/ kb (taille max de 4kb) OU clonage TEDA/ Gibson → 3/ IVA clonning ADN disponible = on peut faire une PCR ADN indisponible = on fait de la synthèse de gène beaucoup les TPs (très peu de cours) → cours c’est surtout pour illustrer Comment réguler (+/-) la production d’une protéine ? - force promotrice (séquence -10 et -35) - choix du promoteur (inductible/ constitutif) - RBS plus ou moins fort - facteurs sigma ??? ⇒ ???? XIII- Bilan Exercice diapo 10 adapté gène eucaryote vers bactérie ⇒ ADNc ou nouvel synthèse lorsque création de voie qui n’existe pas naturellement ⇒ effet toxique secondaire un intermédiaire du produit peut être modifier par une enzyme de la bactérie en produit toxique suppression du gène codant l’enzyme qui interfèrent (Knock out/ promoteur KO)  M2 (S1) IM XIII- Les clonages Le Gibson = dans un tube - ADN polymérase très processive - Taq polymérase ADN + ligase - T5 exonucléase qui grignote les extrémité 20 à 25pb de recouvrement entre les fragment a liée température optimale après ajout des 2 fragments dans les tubes la polymérase comble les trous (après association des brin par complémentarité) mais c’est la ligase qui permet de fermer complètement les 2 fragments c’est ultra efficace pour cloner des 100aine de fragment en même temps → formation d’un ADN circulaire avec les fragments qui s’associe Le TEDA utilisation de la ligase naturelle de E. coli ⇒ on peut supprimer la Taq DNA ligase (qui coute super chère) on peut aussi enlever l’ADN polymérase puisque E. coli en possède une (mais celle de coli est processive/ erreur) Méthode TLTC : - T5 ⇒ 3nt/ min à 0°C - homologie ⇒ 15-25pb - ratio insert:vecteur ⇒ 3:1 - insert ⇒ 120 fmol PCR IVA on a déjà un plasmide avec le gène d'intérêt mais pas le bon promoteur utilisation d’oligo sur le gène mais avec une queue flottante correspondant au promoteur (35pb) l’amplicon correspond au plasmide linéaire avec le promoteur au bout de chaque extrémité on transforme et dans 1 cas/ 100 millions on à un crossing-over spécifique (RecA independant) c’est très rare mais on s’en fou on veut que ça arrive et on a juste besoin d’une paire d’oligo et une bactérie  M2 (S1) IM Préparation des plasmides A l’ancienne Digestion puis purification (pour éliminer l’enzyme) Linéarisation par PCR = imposé pour le sujet utilise des amorces avec des bout flanquants l’amplicon obtenu est le plasmide linéaire (en plus concentration exponentielle) + =pas besoin de faire une mini-prep pour extraire le plasmide - = l’ADN polymérase peuvent introduire des mutations (mais utilise des enzymes très fidèle) DpnI = enzyme magique qui détruit plasmide d’origine (encore méthylé) site = GATC mais reconnaît uniquement le site méthylé plasmide d’origine est méthylé car E. coli possède une méthylase les amplicons dans le tubes ne sont pas méthylé (car pas de méthylase)  M2 (S1) IM Le projet : cahier électronique à plusieurs ⇒ google doc A METTRE A JOUR TOUS LES JOURS et doit être détaillé horaire stricte (on fini à 18h) donc pas de rabe stratégie expérimentale = plan de ce qu’on va mettre en place et les grande étape répartition des tâches peut pas faire de la synthèse mais des PCR (PEUT commander des amorces) Date limites Vend 8 septembre = commande des amorces Lund 2 octobre midi = rendu du cahier de labo electronique Vend 13 octobre à midi = rendu du compte rendu de projet Lund 18 septembre = rendu du 18 septembre Evaluation cahier de labo + projet = 30% entretien individuelle = 20% 50% examen terminal réussite du projet ne rentre pas dans la notation Protéomique quantitative poussé dans 2 condition (4°C et 25°C) lyse et extraction des protéines puis quantification par spectro MS → identification ET quantification (on a des ∆ 4°C-25°C) Accession number = base de donnée pour UNIPROT colonne “AC” = ratio abondance (quantité prot 25°C / quantité prot 4°C) BIEN REGARDER L’ORGANISATION SUR LE CHROMOSOME DU GÈNE (operon/ gène simple) → si gène dans un opéron avéré ou putative ( → importer génome de Pectobacterium) 1 < on a plus de prot à 4°C log2 = valeur négatif 1 > on a plus de prot à 25°C log2 = valeur positive réplicat donc statistique ⇒ p-value classé par ordre croissant = prot du haut c’est la plus fortement fold-exprimé à 4°C parmis les protéines fold-exprimé ⇒ peut avoir l’explication de la résistance à 4°C mais raisonnement inverse possible ⇒ les moins réprimé peuvent être important pour survit à 4°C Dickeya dadantii très proche de Pectobacterium mais Dickeya NE PEUT PAS à 4°C → si gène commun avec dadantii ⇒ pas responsable survit 4°C puisque dadantii pousse pas promoteur + gène(s) ⇒ entre un site de restriction UNIQUE (pour exporter dans un autre SEVA)  M2 (S1) IM Lun. 02 sept 2022 A. Rodrigue Chapitre : Introduction à la biologie de synthèse et biotechnologie I- Historique et définition objectif ingénierie: produire des composants assemblé de manière fiable et prédictible dans système tjr plus compliqué - 1= design de composé biologique nouveau - 2 = amélioration de design déjà existant Historique biologie synthèse 1953 = structure physique de l’ADN 1967 = déchiffrage du code génétique 1978 = découverte et domestication des enzymes de restriction 1990 = concept de Biobrick 2002 = premier génome fonctionnel d’un virus 2008 = synthèse complète d’un génome bactérien 2010 = première bactérie avec un génome synthétique II- Ingénierie génétique 1. Les types d’approches Traditionnelle Biologie de synthèse - bioinformatique prédit modèle interaction - bioinformatique prédit modèle interaction - perturbation système biologique (validé) - réflexion perturbation artificielle à approtté - création de mutant (analyser interaction) - assemblage et création biobrick (validé) 2. Chemin type biologie synthèse 1/ On design un modèle synthétique 2/ On construit physiquement 3/ On test notre modèle 4/ On déploie OU on réitère M2 (S1) IM 3. Abstraction isolé une propriété en la détachant de ses détermination ou de ses relations ADN = acide nucléique composant Parts = identification propriété (bioinformatique) Devices = assemblage de plusieurs BioBrick Système = assemblage des devices (complexe) 4. Standardisation def: respect de critère pré-établie qui définit comment on assemble les “parts” et la compatibilité BioBrick: séquence ADN codant fonction biologique pouvant être associer avec d’autre BioBrick ↳ ex: promoteur/ RBS/ séquence terminatrice/ gène marqueur/ etc… BioBrick composite: assemblage de plusieur BioBrick ↳ ex: “araC-pBAD” (répresseur AraC et promoteur arabinose) LE standard BioBrick 1= “parts” sont porter sur des plasmides 2= “parts” mobilisable (clive enzymes flanquante) 3= EcoRI et XbaI (compatible) ⇒ reforme site mixte 4= Site mixte M (assemblage puis réutilisation) 5= plasmide obtenu avec même sites initiale Séquence préfixe et suffixe BioBrick avec un préfixe et un suffixe zone spécifique qui permet d’amplifier des “parts” permet également d’ajouter des enzymes de restriction flanquant la biobrick Igem = catalogue de “parts” et “devices” pour construire des systèmes 5. Contrôl qualité et limites 1/ cahier des charges ⇒ exprime des besoins à satisfaire 2/ Spécification = découlant du cahier des charges (caractéristique du produit) 3/ Contrôl qualité vérification de la conformité des spécifications et exigence établit  M2 (S1) IM CONCLUSION - commande ou synthèse des “parts” - assemblage de “part” en “device” - intégration “device” dans un génome pas de PCR possible (on créer → ça n’existe pas donc aucune matrice) ⇒ synthèse d’ADN de novo IV- Exemples d’application Interrupteur (Toggle switch) avec 2 états “ON” et “OFF” promoteur du 1 contrôle le 2èm répresseur promoteur du 2 contrôle le 1èr répresseur utilisation d’inducteur pour mettre en ON et OFF Ex: répresseur lacI inductible à l’IPTG répresseur Ci inductible à la chaleur Repressilator lacI inhibe cI qui inhibe tetR qui inhibe GFP permet l'expression cyclique autonome (nécessite une induction → taux de base suivant régulateur) Circuit d'autorégulation promoteur naturelle avec légère expression constante (= bruit de fond) tetR en opéron avec GFP ⇒ OFF parfait ?? anydotetracycline = inducteur empêchant tetR d’agir  M2 (S1) IM Les promoteurs : Promoteur Répresseur Inducteur Analogue inducteur Opéron lactose LacI Lactose IPTG Inductible Opéron arabinose AraC Arabinose ?? Tetracycline TetR Tetracycline Anydrotetracycline Constitutif T7 ARN polymérase issus phage T7 utiliser pour surexpression (car taux de transcription supérieur ARN pol bactérienne) forte production du gène d’interet placé sous son contrôle clivage de la T7 pol (N-term et C-term) nMag en N-term et pMag en C-term ⇒ en fonction de la zone de clivage production +/- importante ⇒ optimisation du système pour avoir un système synthétique assemblage = photorécepteur qui dimérise à la lumière bleu ré-assemblage de la T7 pol si on ajoute lumière bleu Mesure de la qualité de l’eau biosensor d’arsenic ⇒ repose sur création de 3 devices système inductible au lactose ⇒ conduit uréase (qui augmente pH) device 1: absence arsenic = lactose induit expression uréase ⇒ pH entre 9-10 device 2: un peu arsenic = inducteur d’un régulateur qui réprime promoteur uréase ⇒ pH neutre device 3: forte arsenic = device 2 réprime tjr et pH encore plus faible ⇒ permet avec un milieu chromogène (suivant pH) dose l’arsenic dans le sol En SANTÉ (traitement de tumeur) cycle de lyse bactrien synchronisé pour donné des médicament in vivo module de délivrance = Hémolysine E ⇒ protéine anticancéreuse module rapporteur = sfGFP (variant qui se replie super rapidement) module activateur = QS (LuxI et LuxR) ⇒ LuxR contrôle les promoteur module lyseur = phiLI = protéine d’un phage qui lyse 1/ Les cellules croient (production d’Hémolysine E) 2/ Lorsque QS atteint ont à apparition de GFP et lysine 3/ Délivrance de l’Hémolysine et soigner 4/ Quelque bactérie survivent et re-amorce le cycle  M2 (S1) IM ⇒ synchronisation de la lyse et production d’anticancéreux protéine de lyse bactérienne sous contrôle du QS ⇒ synchronicité → toxine besoin d’être relargué pour avoir une action In vivo chez les souris on utilise la luciférase fluorescente car visible à travers la peau SLC = réponse immunitaire (encore plus rapide) SLC apoptotique = c’est msn efficace Hémolysine Hémolysine = c’est au milieu TRIPLE = super efficace pas d’effet sur la perte de poids (EN LYSE SYNCHRONISE) → si expression constante = perte de poid clc = pas besoin d’ajouter motif de sécrétion sur les protéines (on lyse = on délivre) souche avec lyse synchronisé = empêche septicémie car régulation (mais si mutation du système → dangereux) ????? IBD A et B = biomarker produit lorsqu’on est malade fixation de IBD A et B ⇒ production recombinase (IBD A) détection cancer colon bactérie Acinetobacter baylyi modifié ⇒ homologie avec ADN cancéreux recombinaison avec ADN cancéreux ⇒ résistance antibiotique pas de recombinaison ADN cancéreux ⇒ sensibilité antibiotique IV- Partages des connaissances et DIY 1. dd 2. Exemples d’application (biosensor d’arsénique) 3. Utilisation d’aptamères ARN fluorescents 4. Fin du diapo  M2 (S1) IM Lun. 02 sept 2022 H. Boubakri Chapitre : Production de métabolites secondaires et gene trapping I- Introduction 1. Présentation des métabolites secondaires métabolisme 1ère = CENTRAL ⇒ indispensable pour l’organisme (métabolite indispensable) métabolisme 2èm = SPÉCIALISER ⇒ optionnelle et avantageux en condition de labo (moins vrai en labo) précurseur et intermédiaire identifier pour chaque métabolisme (Ier ou IIer) et métabolisme cependant la barrière de transition naître les deux reste flou Caractéristique très petite molécule diversité de structure chimique ⇒ diversité de fonction biologique nombreux avec fonctions inconnues (dû méthode de criblage ou conditions) certains généralisé espèce mais certaines métabolites IIère spécifique à la souche 2. Organismes producteurs producteur = plantes (+++)/ champignon (++)/ bactérie (++)/ animaux (+) fonction utile pour l’homme ≠ fonction pour microorganisme homme = anticholestérol/ antidiabétique/ herbicide microorganisme producteur = sidérophore/ antimicrobien antibiotique = jamais en concentration létale dans la nature → fonction pour MO serait plutôt l’expression de certains gènes 3. Métabolites secondaires chez les plantes génome des plantes très lourd et gros donc accessible plus tard que MO pour les plantes on s’est basé sur la structure des molécules nicotine/ caféine/ drogue ⇒ souvent très stimulant et faible dose ⇒ addiction caroténoïde = protection contre UV phytohormone (gibbéréline  M2 (S1) IM II- Métabolites secondaires chez les microorganismes 1. Fonctions ammensalisme = compétition spatial protection contre pathogène différentiation cellulaire (Strectomyces ⇒ antibiotique induit l'apoptose ⇒ oblige sporulation) chélateur de métaux cocaoine = pour homme c’ets une drogue mais pour la plante un insecticide 2. Familles et voies de biosynthèse : NRPS/PKS/terpènes Pas basé sur la structure des molécule mais voie de synthèse - NRPS = synthèse non ribosomal - terpène = présence d’un terpène synthase - PKS = polykétide synthase NRPS et PKS ⇒ retrouver uniquement chez MO (intéressant en biologie synthèse) Actinomycète (bactérie) ⇒ Streptomyces (le plus gros synthétiseur) gène métabolites = en cluster et regroupe dans génome (régulateur/ transporteur/ résistance) → gène de résistance des producteur peuvent être transférer ⇒ pose problème BGC (Biosynthetic Gene Cluster) Actinobactérie = plus de métabolites caractérisé mais aussi bcp prédiction dans son génome → prédiction du génome montre aussi ⇒ Pseudomonas/ Baccilus 3. Streptomyces bactérie qui ressemble fortement à un champignon hyphe végétatif = chercher des nutriment production antibiotique (par QS) antibio induit formation de hyphe aérien production de spore (dispersal spatial et temporelle) Rôle dans intéraction symbiotique guêpe = Streptomyces sur leur antennes ⇒ permet la protection des larves fourmi = fourmis cultivent des champignons bénéfique (qui inhiber un champignon néfaste) pour faire de la biologie de synthèse ⇒ il faut bien connaître les voies de biosynthèse → travail de bioinformatique et génétique → caractérisation des voies = traçage isotope stable antismash = permet caractérisation d’une voie de biosynthèse surproduction = plus simple c’est changer de promoteur (transcriptionnel) M2 (S1) IM 4. Voie des NRPS N’UTILISE PAS LES RIBOSOME (condense les acides aminé) traduction pour la production des enzymes qui interviennent dans la voie cascade d’enzyme qui ajoute un acide aminé et ainsi de suite peptide non ribosomique à la fin car synthèse enzymatique Métabolites IIère très variable car - avec NRPS on à 500 acide aminés (contre 21 pour protéines) - utilisation d’acide aminés “inhabituel” (non ribosomique) - peuvent en plus subir des modification (oxydation/ épimérisation) Exemple d'assemblage voie d’assemblage des acides aminées (par condensation) reconnaissance module = partie qu’on retrouve dans une enzyme (un ou pls module/ enzyme) - avec un domaine (fonction particulière pour l’assemblage) - succession de module ⇒ formation du peptide 3 types de modules - module initiation ⇒ 2 domaines minimum (A et PCP + nE) - module élongation ⇒ 3 domaines minimum (C, A et PCP + nE) - module de terminaison ⇒ 4 domaines minimum (C, A, PCP et Te + nE) Les domaines - domaine A = reconnaissance des aa (permet spécificité du module) - domaine PCP = liaison et fixation des peptides - domaines C = récupère peptide d’autre module puis donne à son PCP - domaine Te = terminaison (thioesterase) qui clive la liaison thioester (C~S) - domaine E = accessoire qui permet modifications module spécifique d’un aa ⇒ domaine A de chaque module 5 modules = ajout de 5 acides aminés enzymes qui va chercher les aa (pas d’intervention d’ARNt) PERMET EN BIOLOGIE DE SYNTHÈSE UNE IMMENSITÉ DE POSSIBILITÉ M2 (S1) IM 5. Voie des PKS pas de condensation d’acide aminé mais de précurseur condensation de module en module (depuis le module initiation) ajout de dérivé de l’Acetyl-CoA Fonctionnement des PJS de type I précurseur initiation = souvent Acetyl-CoA ⇒ 2 domaines - domaine reconnaissance = AT - domaine fixation des aa = ACP précurseur extension = souvent Malonyl CoA ⇒ 3 domaines minimum - domaine de condensation = KS - mais également les 2 précédents (AT et ACP) précurseur terminaison = souvent ??? - domaine de tio-estérase = TE domaine accessoire de modification de la structure de la molécule PKS de type II (voie itérative) itération = pls lecture d’un module ET/ OU d’un domaine lecture de pls fois d’un module ou domaine ajout de pls aa spécifique d’un module PKS de type III condense les précurseur sans passé par la fixation sur ACP PARFOIS CROISEMENT DES VOIE (mixte de NRPS et PKS) III- Déclin de la recherche de composés naturels 1. Les différentes alternatives biologie de synthèse pour répondre aux problématiques épuisement des composé naturelle (de moins en moins d’antibiotique) désintéressement des industrielle car non économique (traitement spontanée) apparition de résisatnce hémisynthèse = amélioration de l’activité/ réduire la toxicité/ élargir spectre/ facilité accès cible 2. Cluster cryptique cryptique = silencieux (gène non exprimé dans le génome) Streptomyces coelicolor ⇒ 5 métabolites secondaire connu MAIS 25 cluster identifié M2 (S1) IM Réveiller les cluster cryptique demande connaissance des voies de biosynthèse listing des éléments (promoteur potentielle/ gènes/ régulateurs) BASE DE DONNÉE Forward si production chimique d’un métabolite ⇒ prédiction des voies de biosynthèse soulmet génome d’une souche ⇒ caractérise les voies de biosynthèse Reverse = apporte le plus de donnée pour améliorer la spécificité de la banque Vitesse d’évolution mutation n'importe où sur un gène (silencieuse ou non silencieuse) ce qui joue sur mutation silencieuse ou non ⇒ pression de sélection pression neutre = 1 (pas de pression) > 1 (pression positive ⇒ mutation non silencieuse ⇒ force apparition d'innovation) < 1 (pression négative ⇒ élimine mutation non silencieuse ⇒ lorsque délétère) Biologie de synthèse - modifier ordre des modules - inversé modules (substitution) - suppression de modules - insertion délétion de domaines des modules - ajouter des domaines accessoire aux modules - échanger et ajouter pls modules existe une limite de taille ⇒ 2 aa (min) et ?? aa (max) Methode 3 assembly 2 enzymes avec un site de restriction extrêmement proche SpaI et XbaI ⇒ formation d’un site multiple (SpaI ou XbaI) → introduction d’une mutation précise dans les amorces 3 gène à cloner doivent avoir des gène de résistances différentes les 3 gènes ne doivent pas contenir les sites de restriction SpaI/ XbaI  M2 (S1) IM Lun. 02 sept 2022 E. Gueguen Chapitre : ANALYSE D’ARTICLE (UE RTM) RTM = télécharger le papier MAIS AUSSI supplementary data → doit faire des choix (peut pas tout présenter) → si pas expertise on peut juste mentionner mais sans montrer figure (bio-info et spectrométrie) → parfois déconstruction du papier (parceque ne se prête pas pour l’oral) Diapo 1 = titre/ nom auteur/ journal/ UE RTM/ logo univ Contexte et données actuelles toute figure ou photo qui vient d’ailleurs critique = bioremédiation (NON) → séquestration MAIS pas modification du mercure en forme moins toxique → “pour moi il s’agit plus de biosorption que de bioremédiation” ⇒ on a le droit de critiquer Puis présentation article et ce qu’il apporte de nouveau → prendre référence dans intro (et aller chekcer) MAIS aussi un rapide google shcolar → avant = système inductible à l’IPTG ⇒ auteur propose promoteur inductible Mercure présente MerR (régulateur transcriptionnele en présnece de mercure) → comment vous avez récupérer le plasmide snapgene (si pas dans supp data) 1= Création d’un biosenseur (GFP sous ocntrol de pMER avec MerR sur même plasmide) → activable suivant concentration mercure → congo red = fixe sur fibre et fibrille (colore production de curli) raconter la technique et la figure PUIS APRÈS on explique et commente la figure (math&meth PUIS résultats) 2= Création d’un chassi bioremédiation Figure S3 A = met en évidence le gout métabolique de la synthèse de curli qui est néfaste à partir de 1000 ppb → production de curli indepednat d’autre métaux (donc bien puisque in situ y’aura d’autre métaux) → possibilité de récupérer le mercure en récupérant CONCLUSION schéma de conclusion c’est bien → système très sensible (à 1 000 000 000) ⇒ lorsque conta sol (1 000 000) donc c’est TOP → par contre leur truc expérimental loin de réalité (aurait dû tester à concentration réel) → peu être utilisé toxine induite en phase stationnaire (quand ne sequestre plus) PERSPECTIVES = ne pas oublié !!!! extrêmement importante (dans papier ou alors nos idées)  M2 (S1) IM curlis = protéine de surface qui permet adhésion à des surfaces pour formation de biofilm MerR = régulation de l’opéron mercure (opéron qui code pour enzyme de détoxification du mercure) - sans mercure = MerR sur promoteur ⇒ pas expression opéron - avec mercure ⇒ MerR change conformation ⇒ pas sur promoteur ⇒ lever de repression ⇒ expression merT et merP = code transporteur du mercure ⇒ essentiel pour sequestration du mercure avant = système existant qui utilise induction IPTG ⇒ mais ducou pas applicable dans environnement ici = objectif est de mettre un promoteur inductible au mercure ⇒ s’active seul en présence biofilm = produit des large gel qui peuvent sequestrer le mercure (bactérie absorbeuse de mercure par ECM) Chassis - détecte mercure de l'environnement ⇒ MerR (repression du curli operon) - séquestration matrice extracellulaire ⇒ synthèse de “curli” Figure 2 = si pas operon “curli” ne pousse pas ⇒ meurt (dose de mercure létal ??) → à partir de 1 000ppb impacte négatif sur souche curli ⇒ pas dû mercure → forte expression gènes sous control du promoteur (désavantage énergétique) → même observation avec promoteur fort (inductible IPTG) ⇒ désavanage écologique ⇒ D’OU LE BESOIN D’EXPRIMER UNIQUEMENT EN PRESENCE MERCURE (promoteur inductible) → curli applicable à plusieurs type de milieui (liquide ou solide) → seuil d’induction basé sur concentration polluant sur site (utile rémédiation) Capture du mercure : → chassis = capture 4,5X plus de mercure que témoin avec vecteur vide → importantde mettre vecteur vide et pas WT (car plasmide peut avoir un cout energétique) → souche avec GFP sous contrôle pMercure ⇒ basse activité (donc séquestration bien dû au curli) ⇒ séquestration du mercure grâce au curli et pas autres choses → cellule sous forte [Mercure] ⇒ sequestre plus de Mercure ⇒ car sur-production de curli (système auto-régulé) Mecanisme séquestration : → souches capable de garder mercure jusqu’à 10 jour même après plusieurs lavages → mécanisme de sequestration peu clair ⇒ hypothèse liaison électrostatique Cross-activation : → MerR connu pour être activanle par d’autre métaux mais à des concentration 2-3X supérieur au mercure → test de 4 métaux divaleents ⇒ mais aucun n’active expression si seul dans culture → mais avec Cd et Cu il à étéobserver une augmentation de curli supplémentaire (quand couplé avec mercure) ⇒ hasard interessant car site pollué par mercure proche de mines de cuivre  M2 (S1) IM Floculation : → mercure induit formation de biomasse en suspension (flocaulation) → forme des culots et sédimente ⇒ interessnat pour milieu liquide comme lyxiviat ou résiduts minier Limitations : → cout energétiue d’expression des curlis → expression constitutive ⇒ gaspille énergei et produit protéine toxique a [forte] Utilisation → bioslurry avec traitelent en bioreacteur après excavation de sol pollué → bioaugmentation plus rentable ⇒ arreter page 8