Technique d'immunofluorescence PDF

**Institut National de Formation Supérieure Paramédicale de Blida** **Enseignement du module d'Anatomie et Cytologie pathologiques** **LA TECHNIQUE D'IMMUNOFLUORESCENCE** Dr. W. ABDALLAH CHU BLIDA **Année pédagogique 2024/2025** I. **Introduction** II. **Microscope à fluorescence** III. **P...

**Institut National de Formation Supérieure Paramédicale de Blida** **Enseignement du module d'Anatomie et Cytologie pathologiques** **LA TECHNIQUE D'IMMUNOFLUORESCENCE** Dr. W. ABDALLAH CHU BLIDA **Année pédagogique 2024/2025** I. **Introduction** II. **Microscope à fluorescence** III. **Principe de l'IFD** IV. **Avantages / Inconvénients** V. **Protocole technique** VI. **Analyse du signal** VII. **Difficultés d'interprétation** VIII. **Sensibilité de l'IFD et contrôle positif** IX. **IF/IHC** I. **Introduction :** **La fluorescence:** est la propriété que possèdent certains corps ou molécules d'émettre une lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie à fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise **La technique d'immunofluorescence :** est une technique d\'immunomarquage qui utilise des Ac spécifiques à la molécule d\'intérêt ainsi que des fluorochromes **Un anticorps** est une protéine complexe utilisée par le système immunitaire pour détecter et neutraliser les agents pathogènes de manière spécifique **Un fluorochrome** est une substance chimique capable d\'émettre de la lumière fluorescente après excitation **L'immunofluorescence** permet de déceler une réaction Ag /Ac sur des cellules en suspension, des frottis cellulaires, des microorganismes ou des coupes d'organe Il faut opposer l'immmunofluorescence directe à l'immunofluorescence indirecte (IFI), qui s'effectue à partir d'un sérum du malade à la recherche d'anticorps circulants II. **Microscope à fluorescence** La technique en microscope à fluorescence est la même qu'un microscope optique, sauf que la lumière utilisée n'est pas blanche, mais possède une gamme définie de longueur d'onde Toutefois, en général, la lumière arrive sur l'échantillon par le haut (épi-fluorescence) et non par-dessous Le microscope en fluorescence permet de visualiser des objets qui sont naturellement fluorescents (chlorophylle...) ou des molécules rendues fluorescentes pour mieux les observer (protéines couplées à la GFP, DAPI pour l'ADN, fluorochromes...)  III. **Principe de l'ID :** L'immunofluorescence directe est une technique de marquage immunohistochimique, qui consiste à révéler des motifs antigéniques, présents sur une structure cellulaire ou tissulaire, par application d'anticorps (AC) spécifiques du motif antigénique à révéler, rendu préalablement fluorescents par couplage à un fluorochrome Applications en Anatomie et Cytologie pathologiques - Dermatopathologie (Dermatoses bulleuses) - Pathologies auto-immunes - Vascularites - lupus -C'est une méthode qui s'effectue en un seul temps, l'Ag est recherché directement par l'Ac spécifique marqué. → Recherche des dépôts d'Ig ou de complément dans les tissus \***Anticorps utilisés:** Cinq anticorps sont utilisés en routine détectant: les Ig A, les Ig G, les Ig M, les fractions C1q et C3 du complément IV. **Avantages / Inconvénients :** **\*Avantages:** **-**protocoles rapides -grande sensibilité -colocalisations possibles **\*Inconvénients:** **-**montage aqueux : disparaît au cours du temps -sensibilité à la lumière : stockage à 4°C -extinction du signal microscope spécialement équipé, chambre noire -marche mal en paraffine -Les UV altèrent la réaction V. **Protocole technique :** 1. **[Siège du prélèvement :]** -La qualité du prélèvement est fondamentale pour un examen en IFD -Les biopsies doivent être suffisamment larges (3 à 5 mm) et profondes (jusqu'à l'hypoderme) faites au bistouri ou au trépan, et le site biopsique doit varier en fonction du diagnostic ; ainsi, dans les maladies bulleuses, la biopsie doit être faite au niveau de la peau péri-lésionnelle (et non la bulle elle-même), à quelques millimètres du bord de la bulle (ne dépassant pas un centimètre), généralement en peau saine 2. **[Fixation et transport du fragment biopsié]** -Acheminement immédiat (Laboratoire à proximité) dans une compresse imbibée de sérum physiologique -Ou bien mettre le fragment dans du liquide de Michel qui est un milieu de transport spécial (Solution de sulfate d'ammonium tamponnée). Ce milieu permet d'acheminer vers le laboratoire spécialisé le fragment biopsique à température ambiante pendant plusieurs jours (deux à dix jours), donnant des résultats comparables à l'acheminement immédiat -Avant d'être fixé, le fragment sera rincé avec une solution tampon neutre -Au laboratoire, le fragment destiné à l'IFD subit immédiatement une fixation par le froid (congélation). Il est placé dans un tube, dans un récipient en plastique ou dans un petit réceptacle en aluminium avant d'être plongé dans l'azote liquide et stocké à -20°C (quelques mois) ou mieux à -70°C -La congélation est une étape indispensable à la préparation des échantillons à étudier, elle a pour but de conserver une bonne antigénicité tissulaire et d'augmenter la rigidité tissulaire indispensable à la coupe. -Mais la congélation ne permet pas une bonne conservation histologique, elle est donc peu recommandée pour les cas où l'analyse morphologique est importante 3. **[La coupe :]** La biopsie congelée est sectionnée en coupes de 4 à 6 microns au cryostat, puis les coupes sont placées sur lames et congelées à -50°C 4. **[Technique :]** -Sortir les lames du congélateur et les sécher 5 min à l'air ou au ventilateur -Fixer les coupes 10 mn à l'acétone à +4°C · -Sécher les coupes 2 mn à l'air -Laver dans un tampon phosphate salé (P.B.S) pH 7,2 pendant 10 mn -Incuber avec les conjugués fluorescents centrifugés : anticorps fluorescents, anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-C3, et antiC1q. Cette incubation dure 30 min à température ambiante et à l'obscurité. -Chaque conjugué est appliqué sur une lame à part. -Laver dans du tampon P.B.S P pH 7,2 deux fois 15 mn pour éliminer les réactifs non liés -Monter les lames à la glycérine tamponnée et les laisser à l'obscurité jusqu'à la lecture VI. **Analyse du signal :** -Le site principal des dépôts immuns et leur immunomorphologie (linéaire, granulaire, fibrillaire, continu, discontinu...) -L'existence d'un autre site de dépôt en plus du site principal. -La composition des dépôts : classe des immunoglobulines (Ig), complément et fibrine -Le nombre des dépôts immuns, et si multiples la nature du dépôt le plus intense -La dernière étape consiste en une confrontation du résultat de l'IFD avec le contexte clinique, histologique et biologique -Celle-ci permettra d'intégrer les données de l'IFD dans son cadre pathologique et de poser le diagnostic VII. **Difficultés d'interprétation :** **\* [Fluorescences parasites :]** - **L'autofluorescence :** c'est le nom donné à la fluorescence naturelle des tissus non traités soumis aux ultraviolets (UV) et au système optique utilisé. Elle est particulièrement marquée au niveau de la couche granuleuse, des fibres de collagène ou de l'élastine. Cette autofluorescence est liée à l'antigénicité du tissu qui est définie comme la capacité de ce dernier à fixer les anticorps. L'antigénicité d'un tissu dépend de la nature physicochimique, de la structure tridimensionnelle de l'antigène, et peut être altérée par les processus de préparation de l'échantillon - **Le marquage non spécifique ou « bruit de fond» :** on l'attribue à la présence de fluorochromes libres dans le tissu investigué et à la capacité des composants tissulaires à créer des liaisons ioniques sans spécificité - **Le marquage spécifique non désiré :** dû à la présence d'anticorps excédentaires dans les immunoglobulines marquées utilisées pour cette étude (problème de la pureté des réactifs) VIII. **Sensibilité de l'IFD et contrôle positif :** Respect du 1.site approprié de la biopsie, 2.fixation et transport correct de l'échantillon, 3\. technique rigoureuse 4\. lecture des lames sans retard. Des difficultés dans l'une de ces étapes peuvent causer la survenue de « faux-négatifs » -En pratique, il est indispensable de posséder un contrôle positif qui permet d'évaluer la sensibilité de chaque technique -En IFD, le meilleur contrôle est interne, représenté par des cellules de la peau normale adjacente connues pour exprimer l'antigène recherché, sinon, une coupe d'un autre tissu contenant le motif antigénique peut également être utilisée. IX. **Inconvénients de l'IFD :** -Nécessité d'utiliser des tissus frais et congelés. -Décroissement rapide de la fluorescence lors de l'exposition des coupes à la lumière UV (fading), peut être partiellement palliée par l'utilisation de milieux de montage spéciaux contenant des agents antioxydants -Absence d'examen histologique conventionnel de la coupe, auquel on peut remédier par la coloration de la coupe congelée par l'hématoxyline-éosines Mais la qualité des coupes obtenues après fixation dans le liquide de formol reste meilleure, d'où la pratique simultanée de l'histologie conventionnelle et de l'IFD. -Présence relativement fréquente, au sein des tissus, de substances fluorescentes pouvant être confondues avec la fluorescence spécifique. Une contre collaboration au bleu d'Evans efface en grande partie ces fluorescences parasites. -Coût élevé. X. **IF/IHC :** - **IMMUNOFLUORESCENCE :** **Avantage :** faible coût et technique facile et rapide mais -ne permet pas la conservation des lames \- peu informative sur la morphologie - **IMMUNO-HISTOCHIMIE :** **Les 2 avantages majeurs** c'est qu'elle : **-**permet d'apprécier la morphologie des lésions \- permet la conservation des lames