PRACTICA FINAL DE LABORATORIO OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES PDF

FINAL LABORatorio  OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES Estructura celular de la célula con mayor tamaño: NÚCLEO Estructura con mayor cantidad presente: MITOCONDRIAS El fraccionamiento celular es el conjunto de procedimientos que tienen como principal objetivo obtener fracciones de...

FINAL LABORatorio  OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE FRACCIONES CELULARES Estructura celular de la célula con mayor tamaño: NÚCLEO Estructura con mayor cantidad presente: MITOCONDRIAS El fraccionamiento celular es el conjunto de procedimientos que tienen como principal objetivo obtener fracciones de un determinante componente celular , como núcleos , mitocondrias , lisosomas, peroxisomas También pueden ser restos de la membrana celular o complejos multiproteicos como el citoesqueleto de actina , microtúbulos y poros nucleares EXISTEN 3 ETAPAS Homogenizado Filtrado Centrifugado 1) homogenizado Ruptura de células y tejidos para obtener un lisado celular sin que estos sufran mayores daños y puedan estar en condiciones adecuadas para su purificación Usamos un buffer tris a un Ph 7.5, Los buffers sirven para mantener un pH relativamente constante Homogenizador potter: Es muy suave y se lo utiliza para el aislamiento de estructuras y moléculas lábiles en tejidos animales. 2) Filtrado Consiste en la separación de componentes no deseados presentes en la suspensión celular, mediante un medio poroso, que retire sólidos y permita el pasaje del líquido Después de la homogeneización se realiza una filtración gruesa a través de una gasa para eliminar los restos del tejido o las células intactas que no hayan sido fraccionadas. COMPONENTES SÓLIDOS: tejido conectivo tejido nervioso tejido fibroso y celulas que no se rompieron decantación ( tubo a otro) sobrenadante pellet o sedimento 3) centrifugado Esta técnica nos ayudará a separar fracciones existen dos tipos de centrifugado : centrifugado por la gradiente de densidad y centrifugación diferencial. En una solución las partículas con una densidad mayor que la del medio circundante tienen a irse al fondo (sedimentan); cuando su densidad es menor las partículas flotan. Cuanto mayor es la diferencia entre las densidades, más fácil es la sedimentación. Para acelerar este proceso se puede colocar un tubo contenuendo esta suspensión en un rotor giratorio CONDICIONES DE CENTRIFUGADO: Velocidad Tiempo Temperatura (0-5°C) , esto evitará perder actividad biológica PARA PODER OBSERVAR LAS MUESTRAS: Mitocondrias : Verde de Janus Núcleo: Azul de metileno  a) centrifugado por gradiente de densidad B) Centrifugación diferencial ( la que usamos) ▪ En muchos casos se logra una purificación adicional ▪ Es una serie de centrifugados, que se realizada cada mediante centrifugación de una de las fracciones vez a mayor velocidad y a mayor duración. utilizando una gradiente de densidad. ▪ Aquí componentes subcelulares son separados por su ▪ La gradiente de densidad se logra utilizando una tamaño y densidad. solución que al mezclarse con buffer distribuye el ▪ La sedimentación es más rápida con componentes contenido de la muestra en varias capas o fracciones de más grandes y más densos que con componentes más acuerdo con su densidad. pequeños y menos densos.  RESPIRACIÓN CELULAR Las células usan las moléculas producto de estos procesos como fuente para elaborar energía que es necesaria para la actividad celular, los procesos son: desaminación de aminoácidos, la beta-oxidación de los ácidos grasos y por último la glucólisis que tienen como objetivo la formación del ácido pirúvico. Nos centraremos en el proceso llamado GLUCOLISIS GLUCOLISIS: va a dos rutas metabólicas 1) Ruta aeróbica o catabolismo aerobio: Se realiza en las mitocondrias , con presencia de CO2. 2) Ruta anaeróbica o catabolismo anaeróbico: Sin presencia de CO2 transforma el ácido pirúvico en otras moléculas. Fermentación láctica o catabolismo láctico : el lactato desidrogenasa se forma ácido láctico Fermentación alcohólica o vía alcoholica : ácido pirúvico se descarboxila formando el acetaldehído y este es reducido por el NADH a etanol (alcohol etílico) PRÁCTICA Nos centramos en las fermentaciones, usamos un respirometro artesanal , que luego observaremos la reacción de cada carbohidratos , tenemos a monosacáridos(glucosa , fructuosa) , disacáridos (sacarosa) y polisacaridos (almidón). El que más CO2 produjo fue la fructuosa debido a que posee 5 átomos de carbono , mientras que la glucosa 6 , por eso es más rápido y hay mayor producción de CO2 Usaremos el antimetabolito o inhibidor que serpa el NaF a diferentes concentraciones (0.1 0.5 0.10) y esta inhibirá una etapa en la glucólisis , tenemos que tener en cuenta que a más cantidad de flúor mayor será la inhibición ¿COMO ACTUA EL INHIBIDOR? GLUCOSA 2 FOSFOGLICERATO FOSFOENOLPIRUVATO PIRUVATO enolasa La enolasa siempre trabaja con el magnesio El FLUOR inhibe al magnesio por lo tanto hay menor producción de enolasa Mg (magnesio) A) FERMENTACIÓN LÁCTICA NADH NAD Bacteria que causa la fermentación láctica: Lactobacillus PIRUVATO ÁCIDO LÁCTICO ÁCIDO LÁCTICO DESIDROGENASA B) FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA NADH CO2(g) Levadura de pan : Saccharomyces cerevisiae NAD PIRUVATO ACETALDEHÍDO ETANOL PIRUVATO ALCOHOL DESCARBOXILASA DESIDROGENASA  EXTRACCIÓN DE ADN La extracción de ADN es la base para los estudios en biología molecular Sirve para : terapia genética , análisis de diversidad molecular de especies, análisis forense y de paternidad Existen dos tipos: Extracción tradicional y por kits ( esta fue la que utilizamos en la practica de laboratorio) Tenemos que tener en cuenta de que no existe solo un método para la extracción - Material biológico a estudiar. -Tejido disponible seleccionado y estado de conservación. ( por ejemplo el cabello , que solo se puede extraer de la raíz) -La técnica molecular que se empleará posteriormente. PROCESO GENERAL DE LA EXTRACCIÓN: - Infraestructura del laboratorio y Recursos económicos. -Tiempo para obtener los resultados. DIFERENCIAS ENTRE LA EXTRACCIÓN TRADICIONAL Y LA EXTRACIÓN POR KITS: EXTRACCIÓN TRADICIONAL EXTRACCIÓN POR KITS Más pasos por lo tanto hay Precio elevado más posibilidad que salga mal Mayor precisión ya que no Demora más tiempo son muchos pasos El ADN no es tan puro Más rápido Podemos recolectar mayor Menos tiempo cantidad de ADN Más barato UNA MUESTRA INTEGRAL ES EL ADN SIN CONTAMINANTES HOMOGENIZADO PROCESO DE LABORATORIO Usamos dos tubos : tubo colector y columna ( contiene la membrana EXISTEN ETAPAS IMPORTANTES: de sílice que funciona como un filtro) 1. Maximizar la recuperación de ADN 2. Eliminar inhibidores ponemos la columna dentro del tubo colector 3. Eliminar o inhibir nucleasas Necesitamos romper la membrana celular y para eso usamos el 4. Maximiza la calidad del ADN buffer lisis Proteinasa K ( es una proteasa) , rompe las proteínas ( el adn está EXISTEN DOS TIPOS envuelto de histonas) , si se rompe el ADN quedará libre. Homogenización química: Luego lo paso a otra columna con una micropipeta (decantación), La muestra debe mantenerse a altas tendré ADN y proteínas temperaturas en presencia de: Luego agregamos buffer de unión ( este activa El ADN está cargado Detergentes (ejm: buffer lisis) , romper positivamente la membrana de sílice) y se atraen negativamente por el grupo células con los detergentes ya que la por tanto el ADN se queda unido a la membrana fosfato que posee para membrana esta compuesta de fosfolípidos Posteriormente agregamos buffer de lavado A menor temperatura el ADN se conserva mejor y los detergentes desestabilizan (permite que lo demás se filtre porque el ADN Espectrofotómetro Proteasas (ejm: proteinasa K) Rompe las ya está “pegado” a la membrana) , botamos el nanodrop (cuantificar el histonas resto ADN) Alicuotas ( preparar varios Agentes caotrópicos Finalmente usamos el buffer de elución ( el tubos ADN precipita) Homogenización mecánica: minutos : 4°C Vórtex ayuda a mezclar más rapido Trituración horas/días : -20°C Nitrógeno líquido Homogeneizadores años: -80°C Sonicación (rompe membranas por ondas) RNasa: Enzimas que cortar el material genético que es ARN COLUMNA ( tiene la membrana sílice) TUBO COLECTOR PREGUNTAR A ANGEL  FUNDAMENTOS DE PCR Las siglas significan Reacción de la Cadena de la MASTER MIX: Polimerasa. GEN USADO ( BCL-2) Buffer 10X Primers o cebadores: Forward y Esta técnica se basa en la replicación del ADN Reverse ( Mantiene el PH constante) (obtener una buena cantidad de material genético), es Enzima Taq polimerasa una técnica artificial. Técnica “In vitro” Nucleótidos (dNTPs) - dinucleotidos trifosfato Creada por Kary mullis en 1986 , su idea era usar 3 MgCl2 cambios de temperatura y ganó el premio nobel Agua bidestilada ( Agua ultra pura) Termociclador: Amplifica el material genético ADN molde El PCR es importante para el diagnostico de enfermedades, diagnostico de cáncer, análisis forense La TAQ polimerasa funciona con un , pruebas de paternidad. cofactor , IONES DE El gran poder del PCR reside en su elevada MAGNESIO , que especificidad, sensibilidad y en su versatilidad activa la enzima , sin ella no podría haber Taq Polmerasa: Nombre debido a una bacteria que el proceso de soportaba altos grados de temperatura llamada replicación Thermophilus aquaticus es una bacteria que vive en ambientes de 50-80°C El PCR tiene 3 etapas: ANILLAMIENTO , HIBRIDACIÓN unión de los “primers” por complementariedad) bajamos temperatrura a 56°C 40-50 seg Los “primers” son fragmentos de DNA sintético de corta longitud (~ 20 nucleótidos). ELONGACIÓN O EXTENSIÓN DESNATURALIZACIÓN INICIAL Actua la polimerasa Ya tenemos las copias de ADN que necesitamos 2-10 min para que equipo se pueda Elevamos la temperatura a 72 °C para que la polimerasa calentar el equipo (termociclador) pueda extender las cadenas de DNA. Activda la ADN polimerasa La polimerasa extiende las cadenas hasta que se alcanza Degrada algunas bacterias el extremo del DNA o las condiciones de temperatura cambian. CICLO copias de ADN : 2 EXTENSIÓN FINAL a la n ( n es el DESNATURALIZACIÓN: A cargo de la numero de ciclos) separación de las hebras del DNA) polimerasa, finalización Amplicones:2 a la 95°C n-2xn de la polimerización 15 a 30 seg Temperatura baja a 4°C COmparación PCR CONVECIONAL ( ESTE FUE EL QUE USAMOS) PCR EN TIEMPO REAL  ELECTROFORESIS Es una técnica que permite la separación de moléculas como proteínas y ácidos nucleicos a través una matriz (gel), la cual va a funcionar como un filtro o matriz molecular permitiendo separar moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo con el tamaño o peso molecular. La distancia recorrida por cada fragmento de ADN inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Los materiales usados como matriz o soporte son los polímeros como la agarosa, la poliacrilamida, papel (celulosa), almidón y acetato de celulosa. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) tienen un grupo fosfato (carga negativa) Se encuentra en una solución a pH neutro o básico, entonces los fragmentos de ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo o ánodo. La separación de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula a través de la concentración de agarosa (o poliacrilamida) del gel y el voltaje aplicado durante la corrida electroforética. Por lo que los fragmentos de menor tamaño migran más rápido hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño y el incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel. Arne Tiselius creador de la electroforesis +CARGA, -MASA = MIGRARÁ MÁS RÁPIDO -CARGA, +MASA = MIGRARÁ MÁS LENTO TIPOS DE MATRIZ (GEL) POLIACRILAMIDA AGAROSA (ALGA) - Gelidium spp Soporte muy usado cuando se realiza una electroforesis de Solución agarosa: 2% - 1g de agarosa + 50 ml BUFFER DE muestras de ácidos nucleicos, es muy tóxico, pero tiene mayor CORRIDA resolución Se forman por polimerización de la acrilamida con la % de agarosa tamaño del poro bisacrilamida. Estos geles suelen emplearse cuando los fragmentos de ADN que van a ser visualizados son de bajo PASAN FRAGMENTOS PEQUEÑOS (CORREN MÁS LENTO) peso molecular (menos de 1000 pares de base), mientras que para fragmentos de mayor peso molecular se emplea los geles de agarosa. % de agarosa tamaño del poro Es transparente, elástico, tienen una porosidad controlable y permiten una buena visualización de las bandas durante un PASAN FRAGMENTOS GRANDES (CORREN MÁS RÁPIDO) tiempo prolongado. Suelen emplearse cuando los fragmentos de ADN que van a (más de 1000 pares de base), para fragmentos de mayor peso ser visualizados son de bajo peso molecular (menos de 1000 molecular se emplea los geles de agarosa. pares de base).  MATERIALES EN GEL DE AGAROSA Muestra de ADN obtenida de la práctica anterior (PCR) 5 µL Marcador de peso molecular (100-1000 pb)- LADDERS (compuestos de material genético de diversos tamaño) 1 cámara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla niveladora, etc.). 1 Fuente de poder. Micropipetas para volúmenes de 0.5 - 10 μL 50 puntas para volúmenes de 0.5 - 10 μL 100 mL de agarosa al 2 %. 1 L de Buffer Tris – acetato – EDTA 1X (TAE) pH 8-8.3. 1.5 mL de Buffer carga para ADN. 40 µL Colorante Sybr green 1 Transiluminador de luz UV (fotodocumentador)  PROCEDIMIENTO EN GEL DE AGAROSA Preparar 50 mL de agarosa al 2% y adicionar 20 μL de colorante Sybr green, dejar polimerizar por 10 min aproximadamente. BUFFER TAE 1X (TRIS ÁCIDO ACÉTICO GLACIAL EDTA), al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer Sobre un pedazo de lámina extensible de parafilm, preparar una mezcla de 5 μL ADN con 1μL de buffer carga repartida en alícuotas de acuerdo al número de muestras que se colocarán en los pocillos (considerar el uso de un marcador de peso molecular estándar de ADN) Da densidad a la muestra (glicerol o sacarosa) Contienen colorantes que permiten monitorear el progreso de la corrida electroforética (azul de bromofenol y xilenecianol) Con el uso de puntas de 20 μL proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo contiguo Finalizada la colocación de las muestras ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado (puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios). Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis.  PROCEDIMIENTO EN GEL DE AGAROSA Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconexión de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa. Desplazar el gel hacia el transiluminador para el revelado, encender el equipo y verificar que este a una longitud de onda de 420 nm. Dejar hasta que empiecen a aparecer las bandas y registrar el resultado final. ADN CONTAMINADO aplicaciones de electroforesis Factores que determinan la velocidad de migración en geles agarosa Diagnóstico molecular: Enfermedades infecciosas Tamaño molecular de ADN Enfermedades genéticas Concentración de agarosa Enfermedades oncológicas Conformación del ADN Voltaje aplicado Buffer de electroforesis Presencia de colorantes intercalantes mas pesado mas pequeño mas grande mas ligero  CICLO CELULAR Las celulas se generan a partir de otra celula y la unica forma de producir mas celulas es por division de las celulas ya existentes, a este proceso de reproduccion celular en el cual la celula duplica su contenido y luego se divide en dos es conocido como CICLO CELULAR datos adicionales Allium cepa COLORANTE: Orceína aceto- clorhidrica Todo esta en 400x interfase G1: Crecimiento celular (duplicación G2: Síntesis de proteínas (se prepara de organelas) para la división. Se produce mucha actividad en la Sigue sintetizando ARN y proteínas. célula ( por eso aumenta su tamaño). Cambios visibles en el microscopio que Sintetiza nuevo material citoplasmático indican el inicio de mitosis o división sobre todo proteínas y ARN (las cuales celular. son necesarias). S: Replicación del ADN Cuando acabe esta etapa el núcleo contiene el doble de proteínas nucleares y ADN. Cada cromosoma ahora tiene dos cromátidas hermanas.  La CARIOCINESIS ocurre en división celular (mitosis) células somáticas PROFASE ANAFASE Cromosomas se preparan para la Cromátides hermanas se separan separación e inician su movimiento a polos Material genético se condensa opuestos Inicia la formación del huso mitótico Acortamiento de las fibras del Se Desintegra la membrana nuclear huso (carioteca) División de cinetocoro Centriolos viajan a los polos Citoesqueleto se desensambla y el huso miótico se ensambla. TELOFASE Cromátides llegan a los polos y METAFASE comienzan a descondensarse Se reconstruye la membrana Los centriolos llegan a los polos nuclear (CARIOTECA) al rededor Los cromosomas se alinean en la de cada conjunto cromosómico lo placa ecuatorial (PLACA cual definirá los nuevos nucleos METAFÁSICA) hijos. Huso mitótico se ancla al cinetocoro FRAGMOPLASTO Las células hijas se forman por citocinesis MEIOSIS Es un tipo de división celular. La dotación cromosómica queda dividida en la mitad. Ocurre en las células germinales, localizados en los órganos reproductores. Formación de células sexuales o gametos. Ocurre la formación de cuatro células haploides (n) a partir de una célula diploide ( 2n) 1ra division es REDUCCIONAL (2n-n) 2da division es ECUACIONAL (n-n) ETAPAS DE LA MEIOSIS Le Cigo a Paquita Día a Día PROFASE i Cigoteno (sinapsis) Fase más compleja y larga de la meiosis y se divide Cromosomas homólogos se aparean a en 5 fases: través del complejo sinaptonémico Comienza la unión de cromosomas Leptoteno (filamentos) bivalentes (4 cromátides = TETRADAS) Bouquete Duplicación de centrómero, formación Paquiteno (crossing over) del huso, disgregación de la envoltura A medida que los cromosomas homólogos continúan nuclear y nucléolo. acortándose y engrosándose, se puede observar que estas Los cromosomas compuestos por dos formaciones están formadas por 4 cromátidas y se les cromátidas empiezan a condensarse denomina TÉTRADAS. Cromosomas homólogos (1 frente al Hay recombinación genética otro) Termina la unión de cromosomas centrómero Diploteno ( quiasmas ) Diacinesis (quiasmas en extremos) Los cromosomas homólogos Los quiasmas se desplazan hacia los empiezan a separarse, pero extremos del bivalente, fenómeno llamado quedan unos puntos de unión TERMINALIZACIÓN. entre ellos, denominados Los cromosomas se unen a las fibras del QUIASMAS. huso. Los quiasmas son la manifestación Desintegra la membrana nuclear citológica de donde se produjeron Cromosomas se condensan al máximo entrecruzamiento. Centriolos llegan a los extremos ETAPAS DE LA MEIOSIS METAFASE i ANAFASE i Cromosomas homólogos llegaron al centro de Los cromosomas homólogos (tétradas) se la célula y forman la DOBLE PLACA separan totalmente y se mueven hacia polos ECUATORIAL (cromosomas homólogos que opuestos guiados por las fibras del huso. siguen unidos por quiasmas en los extremos) Desaparecen los quiasmas. La membrana nuclear desaparece, las Aumenta la variabilidad genética tétradas se ordenan en el plano ecuatorial, se forma el huso acromático Los centríolos, están en los polos. ETAPAS DE LA MEIOSIS TELOFASE i CITOCINESIS i Los cromosomas se ubican en cada polo de la División del citoplasma en dos células hijas. célula. No hay interfase, la segunda división empieza Los cromosomas empiezan a descondensarse, inmediatamente se forma la envoltura nuclear, dando lugar a núcleos que poseen un número haploide de cromosomas, cada uno formado por dos cromátidas. Forma anillo contráctil ETAPAS DE LA MEIOSIS proFASE Ii METAFASE Ii Comienza a desaparecer la envoltura nuclear y Las fibras del huso se unen a los cinetocoros el nucléolo, la cromatina comienza a de los cromosomas y los dirigen hacia el plano condensarse, los centriolos se desplazan hacia ecuatorial de la célula. los polos, se forma el huso. ETAPAS DE LA MEIOSIS ANAFASE Ii TELOFASE Ii El centrómero se divide y las cromátidas Cada uno de los polos recibe un juego hermanas son desplazada hacia polos haploide de cromosomas, se forman los opuestos arrastradas por las fibras del huso. nuevos núcleos. ETAPAS DE LA MEIOSIS CITOCINESIS Ii Que origina cuatro células, cada una con DATOS ADICIONALES número haploide de cromosomas (n) y Cromosomas de maíz: constituidas de una sola cromátide. Estas 20 cromosomas células formarán los gametos. Nombre científico: zea mays