FC12c Enzymologie Past Paper PDF 2023-2024

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N°12c DATE : 28/09/2023 SOMMAIRE I. ORIGINE DE L’ENERGIE EN CHIMIE ET BIOCHIMIE (SUITE) ........................................................................................................ 1 II. LE CONCEPT D’ENERGIE D’ACTIVATION (EA) ..........................

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N°12c DATE : 28/09/2023 SOMMAIRE I. ORIGINE DE L’ENERGIE EN CHIMIE ET BIOCHIMIE (SUITE) ........................................................................................................ 1 II. LE CONCEPT D’ENERGIE D’ACTIVATION (EA) ........................................................................................................................... 3 1. BARRIERE D’ENERGIE ................................................................................................................................................................ 3 1. CATALYSE .............................................................................................................................................................................. 5 2. ÉNERGIE D’ACTIVATION ET THEORIE DES ETATS DE TRANSITION ............................................................................................................ 5 A. L’énergie d’activation en enzymologie ............................................................................................................................ 7 B. Influence de la température sur la vitesse d’une réaction enzymatique ........................................................................... 7 3. LE CYCLE DU FUMARASE .......................................................................................................................................................... 10 III. LE COUPLAGE DES REACTIONS ............................................................................................................................................. 13 1. PRINCIPE ............................................................................................................................................................................. 13 2. DEFINITIONS ET NATURE DES COMPOSES RICHES EN ENERGIE ............................................................................................................. 13 IV. NOTION DE SITE ACTIF......................................................................................................................................................... 15 1. LE COMPLEXE ENZYME-SUBSTRAT .............................................................................................................................................. 15 2. LES MODELES DE SITES ACTIFS ................................................................................................................................................... 15 3. EXEMPLE D’INDUCED FIT DANS L’HEXOKINASE ............................................................................................................................... 16 V. DESCRIPTION CINETIQUE D’UNE REACTION SIMPLE : ÉQUATION DE HENRI-MICHAELIS ET MENTEN.................................... 17 1. POSTULATS SIMPLIFICATEURS .................................................................................................................................................... 17 2. ÉQUATION OBTENUE .............................................................................................................................................................. 18 3. LA CONSTANTE DE MICHAELIS, KM ............................................................................................................................................. 18 4. ÉQUATION DE HENRI-MICHAELIS ET MENTEN ............................................................................................................................... 19 En cas de questions sur ce cours, vous pouvez écrire à l’adresse suivante : [email protected] Les règles de courtoisies sont à respecter lors de l’envoi d’un mail. L’équipe des tuteurs se réserve le droit de répondre ou non à un mail. En cas de questions récurrentes, les tuteurs pourront faire un point lors des colles hebdomadaires. Contenu des cours d’enzymologie : • • • Des cours magistraux : généralités, thermodynamique : équilibre et catalyse, approche cinétique et inhibition, modalités de régulation Un enseignement dirigé : entraînement au concours avec correction d’annales et réalisation d’exercices types Un polycopié d’exercices corrigés Objectifs et préparation à l’examen final : Entraînement ✪✪✪ I. Comprendre en cours ✪✪✪ II. Apprendre avec le polycopié III. Beaucoup s’entraîner avec l’enseignement dirigé à venir et les exercices ✪✪✪ IV. Savoir manipuler des chiffres et des données V. Savoir tracer des données expérimentales avec du papier millimétré qui sera fourni le jour de l’examen (outils appropriés : crayon, gomme, règle pour résolution graphique) ✪✪✪ VI. Attention ! Calculatrice interdite et non nécessaire. Savoir faire du calcul mental et savoir situer les ordres de grandeur ✪✪✪ VII. Savoir remplir méticuleusement les grilles de QCM En cas de questions sur ce cours, vous pouvez écrire à l’adresse suivante : [email protected] Les règles de courtoisies sont à respecter lors de l’envoi d’un mail. L’équipe des tuteurs se réserve le droit de répondre ou non à un mail. En cas de questions récurrentes, les tuteurs pourront faire un point lors des colles hebdomadaires. I. Origine de l’énergie en chimie et biochimie (suite) Relation énergie de liaison et affinité : Pour une valeur environ égale à 1,5 cela va correspondre à 10 dans des déplacements d’équilibre Les équilibres en revanche sont peu influencés par les variations de températures dans des conditions usuelles de travail en revanche celles-ci jouent un rôle majeur sur les vitesses. REACTION FAVORABLE / DEFAVORABLE Une réaction spontanée est une réaction exergonique (ΔG0 < 0). Mais spontané ne signifie pas observable Exemple 1 • Si on met une mole de glucose sur le bureau avec de l’oxygène autour, elle ne va pour autant s’embraser alors que c’est une réaction extrêmement favorable sur le plan thermodynamique (ΔG0 = -686 kcal/mol). C’est donc une réaction spontanée mais pas observable. Exemple 2 • Alors que la chute d’un objet est une réaction spontanée et observable (immédiat). Le terme spontané ne veut donc pas dire que les choses se produisent nécessairement dans l’immédiat, c’est pourquoi, on préfère le terme favorable. La Valeur du ∆𝐺0 ne présage pas la vitesse de la réaction mais uniquement du déplacement de l’équilibre. L’enzyme abaisse l’énergie d’activation (en théorie, en pratique elle ne l’abaisse pas réellement) qui dépend de l’état de transition de la transformation, l’enzyme vient accompagner la transformation 1 POTENTIEL D’ÉNERGIE D’ACTIVATION À température ambiante Si la barrière d’énergie est inférieure à cette valeur • Les molécules à l’état initial ne sont pas totalement figées • Elles ont un certain potentiel d’énergie d’activation, ce qui leurs donne une capacité à osciller dans la crevasse de potentiel d’une hauteur de 1 kcal/mol • Il peut accéder facilement à l’état de transition (= pas besoin d’enzyme) mais on peut encore la catalyser pour accélérer la réaction L’enzyme n’est donc pas nécessaire dans ce cas mais elle peut être utiliser pour augmenter la vitesse de la réaction (S → P) • On peut calculer la valeur du déplacement en fonction de ΔG 0 mais cela ne donne aucune information sur la direction du déplacement • Il facilite l’atteint de l’état de transition sans le modifier. Si l’enzyme doit franchir un mur conséquent • La catalyse ne modifie pas la valeur de Keq mais augmente la vitesse de réaction (rapport de la vitesse catalysée sur la vitesse non catalysée > 106) • Elle facilite l’atteinte de l’état de transition et augmente autant la probabilité de la transformation S vers P que de P vers S • En présence d’une enzyme, l’énergie d’activation disponible à la température du milieu suffit à déclencher la réaction. 2 II. Le concept d’énergie d’activation (Ea) 1. Barrière d’énergie Pour qu’une réaction ai lieu, il faut qu’elle soit favorable sur le plan thermodynamique. BARRIERE D’ENERGIE D’ACTIVATION • Si l’on pose la bille à un état initial sur un plan incliné l’amenant directement à l’état final, on aurait une réaction spontanée, immédiate et observable : l’état initial migrerait vers l’état final. Le problème est que la bille est située dans une cuvette de potentiel. La bille a donc besoin d’aide pour sortir la bille de la crevasse. Exemple de la bille • On a besoin d’enzymes pour passer d’un état à un autre. L’existence de cette crevasse peut être caractérisée par sa profondeur, c'est-à-dire par la hauteur du mur à franchir et donc de la quantité de travail que l’enzyme doit fournir pour passer le substrat de l’état initial à l’état de transition. À partir de cet état, on peut revenir à l’état initial ou aller à l’état final aisément. Le travail que l’enzyme doit fournir est le franchissement de ce mur que l’on appelle la barrière d’énergie d’activation. Ainsi, l’énergie d’activation est symbolisée par le mur à franchir et le travail fourni par l’enzyme représente le franchissement de ce mur. 3 LA BARRIÈRE ÉNERGÉTIQUE • Le substrat est en 1 dans la crevasse et a besoin d’une enzyme Substrat position initial État de transition Énergie fournie • Pour en sortir il a besoin de l’énergie d’activation • L’énergie d’activation est l’énergie nécessaire pour atteindre l’état de transition • On peut soit retomber dans la crevasse soit évoluer vers l’état final • La vitesse dépend de la probabilité d’atteindre cet état là • Dans l’état de transition, le niveau énergétique est supérieur à l’état initial et à l’état final. Selon la taille de la « crevasse » l’enzyme aura besoin de fournir plus ou moins d’énergie • L’énergie d’activation est liée à la température. Avec la température le substrat est capable d’osciller dans la crevasse. Dans le corps, l’énergie d’activation disponible est de 1kcal/mol La nature de l’équilibre dépend de la valeur de ΔG0 (variation de l’énergie libre de la réaction) Généralement en biochimie l’énergie d’activation nécessaire est d’environ 10kcal/mol. SI L’ÉNERGIE D’ACTIVATION NÉCESSAIRE POUR ATTEINDRE L’ÉTAT DE TRANSITION EST INFÉRIEUR À 1 • L’atteinte de l’état de transition est possible (position 3) mais le pourcentage de molécules l’atteignant est faible Sans enzyme • Ex : glucose avec de l’oxygène à environnement atmosphérique o C’est favorable, cela peut se produire mais très lentement • On se trouve en position 2, la barrière d’énergie est plus basse, plus facile à atteindre donc la réaction est accélérée Avec enzyme • Toutefois on remonte aussi la barrière au niveau du produit en 4, c’est-à-dire qu’il est aussi plus facile de produire du substrat à partir du produit Attention en réalité l’enzyme n’abaisse pas réellement la barrière d’énergie mais apporte l’énergie nécessaire. 4 1. Catalyse LA CATALYSE • Ne modifie pas la valeur de Keq : Définition o ↑ vitesse de réaction (Kcat/Kuncat > 106) : Facilite l’atteinte de l’état de transition X o ↑ autant la probabilité de S->P que P->S En présence d’Enzyme, Ea disponible à T° du milieu suffit à déclencher la réaction. 2. Énergie d’activation et théorie des états de transition • L’énergie d’activation est liée à la température en chimie. Elle est procurée par chocs intermoléculaires dont la fréquence et la violence augmente avec la température (on chauffe le milieu réactionnel pour accélérer une réaction) • Les chocs induisent la réaction car ils placent les réactifs dans des configurations appropriées les uns par rapport aux autres (angle approprié, force suffisante) pour obtenir une conformation intermédiaire entre S et P • L’énergie d’activation reste la même que l’on soit dans une réaction catalysée ou non Cette conformation est l’état de transition. Exemple de SN2 : M. Gonzalo utilise une transformation que vous voyez en chimie pour expliquer ce qu’est un état de transition. En milieu alcalin, on assiste à la transformation du chlorure de méthyle en méthanol. Cela est due à une attaque nucléophile de OH- (car le chlore est beaucoup plus électronégatif que le carbone) à l’opposé du groupe partant. Le chlore déplace le doublet électronique vers lui ce qui vient inverser la configuration du carbone car on obtient cet état de transition instable (hésitation de transition) où le carbone est pentavalent. NB : Lire le schéma de droite à gauche 5 TRAVAIL DE L’ENZYME EN FONCTION DE LA TEMPÉRATURE • Enzymes extrêmement rigides à basses ou moyennes températures o Possèdent des facteurs augmentant leur stabilité : plus de liaisons hydrogènes, plus de ponts disulfures Enzyme travaillant à haute température Enzyme travaillant à basse température • Ainsi pour avoir la même flexibilité, elles auront besoin d’être placés dans de hautes températures. • Elles ne se dénaturent pas mais sont totalement rigides à moyennes et basses températures = elles n’ont aucun pouvoir catalytique • C’est bien la nature de la protéine elle-même et non le fait qu’elles aient des conformations différentes qui est responsable du fait qu’elles ont soit une structure renforcée pour résister aux hautes températures soit une structure naturellement très flexible à de faibles températures • Enzymes très flexibles à très basses températures car elles ont moins de liaisons hydrogènes et de liaisons covalentes (moins de liaisons qui font qu’elles gardent leur conformation) dans leur structure • Placés dans un milieu à basses températures, la flexibilité de la molécule est exagérée (peu de structuration interne), ce qui entraîne la dénaturation de l’enzyme (la structure explose) • Ainsi, si on place les protéines de notre corps dans un milieu à hautes températures, elles vont se détruire car on a abusé de leur flexibilité interne et on les a dénaturées. 6 L’équation d’Arrhenius : L’énergie d’activation est déterminée empiriquement en mesurant les vitesses de réaction (k) à des températures différentes (T). On considère que T2 > T1, alors k2 > k1. La relation d’Arrhenius permet de calculer directement l’énergie d’activation à partir de la représentation graphique, en étant vigilant aux valeurs prises. log ( 𝑘2 𝐸𝑎 𝑇2 − 𝑇1 )= ) × ( 𝑘1 2,3 × 𝑅 𝑇2 × 𝑇1 A. L’énergie d’activation en enzymologie Si les enzymes abaissaient l’énergie d’activation, alors elles permettraient d’atteindre un état de transition différent avec une énergie d’activation plus basse ? Cela suppose que l’enzyme « invente » un mécanisme réactionnel différent. Ea est indépendante de la catalyse, Elle est donc propre à la réaction puisqu’elle dépend de l’état de transition et donc puisque l’énergie d’activation est la même l’état de transition est le même Cela est FAUX : La chimie de la réaction et l’énergie d’activation de la réaction restent les mêmes avec ou sans enzyme. L’enzyme apporte donc l’énergie d’activation nécessaire grâce aux remaniements de conformation. Ce qui explique pourquoi la vitesse augmente quand la température augmente, c’est parce que la température facilite les changements de conformations (rend l’enzyme plus flexible). B. Influence de la température sur la vitesse d’une réaction enzymatique On observe la vitesse maximale de la réaction en fonction de l’augmentation de la température pour se rapporter à l’équation d’Arrhenius. • En gardant les concentrations en substrat et en enzyme identiques, on observe qu’au-delà d’une certaine température (ici 50°), la réaction décélère • En reportant les valeurs précédentes sur un graphique, cela met en lumière la notion d’optimum thermique = température optimale : il correspond à la limite entre activation (à gauche de la température optimale) et de dénaturation (à droite de la température optimale) de la molécule o La dénaturation est un processus irréversible car on est allé au-delà des limites de flexibilité naturelle de la protéine • On voit qu’en augmentant la température, on rentre dans une phase d’activation, mais que celle-ci augmente aussi la probabilité pour la protéine de se casser • Au-delà de l’optimum, il y a plus de protéines dénaturées que de protéines actives. Ainsi même si les protéines actives travaillent de plus en plus vite, elles sont de moins en moins nombreuses, ce qui ralentit la vitesse de réaction 7 Pour passer d’un état stable à un état encore plus stable, on doit passer par un état de transition très instable (contrenature). Cela signifie que l’état de transition se situe sur le plan thermodynamique à un niveau d’énergie supérieur aux états initiaux et finaux. C’est ce qui explique que la barrière d’énergie corresponde à l’atteinte de l’état de transition. L’état de transition correspond à une valeur d’énergie d’activation et à une structure conformationnelle particulière. L’enzyme a une flexibilité interne importante pour son activité ce qui lui permet de passer d’une configuration à une autre pour réaliser son cycle catalytique. Quand on étudie les protéines dans des organismes vivants à basses, moyennes et fortes températures, on constate que les protéines sont très ressemblantes puisqu’elles réalisent les mêmes opérations. Lorsqu’on étudie la façon dont elles se structurent sur le plan tridimensionnel, elles ont la même structure mais la rigidité des enzymes n’est pas la même pour une température donnée. On transforme les températures en Kelvin pour se rapporter à l’équation d’Arrhenius et avoir le facteur d’augmentation qui correspond. On peut ensuite faire le tracé de log (Vmax) en fonction de 1/T (ce qui permet de linéariser la zone d’activation du graphique précédent. Attention : On travaille en inverse de température donc les températures basses sont à droite et les températures hautes sont à gauche. La représentation graphique est indispensable pour éliminer la composante dénaturation. • Comme on obtient une partie linéaire (aucune protéine ne se dénature et chacune travaille de plus en plus vite), on peut calculer la pente et retrouver l’énergie d’activation • On observe une zone de fragilité (limite de stabilité de la protéine) : une partie des protéines se dénature et les autres continuent à augmenter leur vitesse de réaction • Si on augmente encore la température, toutes les protéines se dénaturent et la vitesse s’effondre (plus de réaction) Aussi, à l’optimum thermique, il y a davantage de protéines qui se détruisent qu’aux valeurs de températures précédentes. Donc la température qui limite le fonctionnement est en réalité une température plus basse que l’optimum thermique. Le point situé avant l’optimum thermique est donc la température optimale réelle. 8 L’énergie d’activation est environ égale à 11,5 kcal/mol. C’est une valeur usuelle (ordre de grandeur de la plupart des réactions de notre corps) et est très supérieure à l’énergie disponible dans un milieu réactionnel à 37°C (1 kcal/mol). Ainsi la réaction est non observable en absence d’enzyme. Q10 est le rapport des vitesses à 10°C d’écart : Il évalue la vitesse en fonction de la température : V = f(T°C). On observe une proportionnalité entre Q10 et l’énergie d’activation. Ici, Q10= 1,86 (≈2) ce qui est une valeur forte et habituelle et qui n’est plus valable quand on quitte la partie linéaire de la courbe car la dénaturation a commencé. (Il n’est pas vital de connaître la formule. En effet comme vous n’avez pas droit à la calculatrice les calculs demandés ne peuvent pas être trop compliqué. Retenez que le Q10 dépend de l’énergie d’activation Ea) Dans le cas des réactions biologiques habituelles, l’énergie d’activation est de l’ordre de 10 kcal/mol. La vitesse va augmenter d’un facteur 2 chaque fois que l’on augmente la température de 10 degrés. Cas concrets : - Aliments mis au frais : pour que les enzymes ne se dégradent pas - Hypothermie des alcooliques dans le froid : sodium rentre dans les cellules. Applique de la pression contre la boîte crânienne, le cerveau va ainsi sortir par le trou occipital et provoquer le décès du patient. Lors d’une noyade il n’y a plus assez d’oxygène pour produire suffisamment d’ATP. On retrouve aussi des œdèmes cérébraux dans les noyades à cause du déficit de la production de l’ATP. Ainsi une variation faible de température (10°C) peut entraîner des conséquences désastreuses sur l’organisme. 9 3. Le cycle du fumarase CYCLE DU FUMARASE • Fumarase est une enzyme du métabolisme • Réaction d’hydratation • Le fumarate (composé participant au cycle de Krebs) possède une grande symétrie interne autour de la double liaison qui est capable de s’hydrater. Généralités • Dans ce cas-là, on assiste à un hydroxylation de l’un des carbones. Cette réaction est stéréospécifique, ce qui fait que l’on fabrique du S-malate. • Contient une double liaison : là où la molécule d’eau va « attaquer » • Réaction déplacée dans le sens du malate car ΔG0 = - 4,7 kcal/mol o Représente un déplacement d’équilibre de l’ordre de 100 à 1000 (kcal/mol : 103 = 1000). Sur le plan thermodynamique • Ainsi à l’état d’équilibre thermodynamique, on aura entre 100 et 1000 fois plus de malate que de fumarate. • Elle contribue à faire fonctionner le cycle de Krebs dans le bon sens à condition qu’il soit bien catalysé. Si le fumarate est dans l’eau à 37 degrés cela ne va pas fabriquer du malate tout seul. Le fumarase est nécessaire. • Le ΔG0 doit être négatif pour que la réaction ait lieu. Rappel • « Réaction déplacé dans le sens de … » signifiée qu’à l’équilibre on n’aura pas la même quantité de produit et de réactif. 10 CYCLE DU FUMARASE TRANSFORMATION DE S EN P DU POINT DE VUE DE S ET P 1. Le fumarate libre entre dans le site actif de l’enzyme, ce qui l’active. On a donc la formation d’un complexe ES* instable (1ère flèche) 2. Puis le complexe ES se stabilise à partir d’eau (2ème flèche) 3. Puis on passe à l’état de transition, on a formation d’un complexe intermédiaire : EX*, et on obtient du L-malate et du fumarate (3ème flèche) 4. Formation du malate (4ème flèche) 5. Le malate sort du site actif (5ème flèche) 6. Enfin il y a la relaxation / régénération de l’enzyme (6ème flèche) • Les valeurs associées à chaque transition (+4 ; -0,5 …) correspondent au ΔG0 associé à la transformation. • Ainsi, lorsque la réaction est terminée, l’énergie potentielle du produit est moins élevée que celle du substrat qu’on avait au début de la réaction. • Le complexe enzyme substrat est un état instable (plus instable que lorsqu’ils sont libres) mais pour le substrat, cela correspond à une phase d’activation : Attention o Quand il se lie, il modifie sa conformation vers un état qui est plus instable mais qui le rend apte à exécuter la réaction. Il est véritablement actif quand l’eau est aussi fixée sur l’enzyme (= état de transition). • État transition : l’enzyme lie le substrat et l’eau rentre dans l’enzyme. CYCLE DU FUMARASE TRANSFORMATION DE S EN P DU POINT DE VUE DE E • L’enzyme gagne en stabilité quand il est lié au S ou au P. Biologiquement, il a de l’affinité pour S et P, mais c’est lorsqu’il est lié à X* que l’enzyme est le plus stable. L’enzyme a une affinité maximale pour l’état de transition et il termine le cycle de façon inchangée. L’enzyme est la plus stable au moment de l’état de transition, c’est-à-dire au moment où le substrat, lui, est au contraire le plus instable. 11 • Fumarate + malate • Résultante de l’activation de S par E et de la fixation de S sur E. État de transition X* • Pour faire un cycle catalytique, l’enzyme doit être capable de passer par les 4 états conformationnels (libre, complexé au substrat, à l’état de transition et au produit). • L’énergie d’activation résiduelle est inférieure à 1 kcal/mol = énergie disponible dans le milieu. L’enzyme a effacé la barrière énergétique. • Quand on couple les points de vue de l’enzyme et du substrat (superposition des courbes précédentes), on va niveler l’énergie d’activation. Superposition (E+S) • Ensuite, la réaction évolue spontanément vers l’équilibre thermodynamique = formation du malate. Quand l’enzyme se sépare du produit, il atteint à nouveau le potentiel de départ pour accueillir un autre substrat. Origine de l’énergie d’activation • L’activation de S correspond à une stabilisation de E par liaison de S. L’affinité préférentielle de l’enzyme pour l’état X favorise ensuite la transformation de S vers X. Démonstration par un Anticorps catalytique • La fixation de S sur E est possible car elle stabilise E (même si elle rend moins stable S). • De même, atteinte de l’état de transition est possible car c’est dans cette conformation que l’enzyme est la plus stable (même si cela correspond à un niveau d’instabilité maximal de S). Résumé • Et enfin la transition de EX vers EP est possible car elle correspond à une stabilisation du point de vue de S et P (même si elle rend plus instable E). • En somme, lorsque qu’une transformation entraine une déstabilisation de S et P elle permet de stabiliser E. Des étapes avec des ΔG0 > 0 du point de vue du substrat sont donc possible car elles sont négatives pour l’enzyme. 12 III. Le couplage des réactions Important pour le métabolisme 1. Principe Découvert par Fritz Lipmann. Il étudié la structure des composées. Ainsi, il a découvert les liaisons riches au niveau de l’ATP et du coenzyme A. Structure du coenzyme A : Molécule complexe composé de soufre : fini en une cystéamine (dérivé decarboxylé de la cystéine) et un groupement SH. Fabrique une liaison thioester qui est une liaison riche en oxygène. Concept de liaison riche : contient plus de liaison que les liaisons covalentes. Cependant, sont plus facile à rompre, que C-C ou C-O. Se forme et se détruisent rapidement. 2. Définitions et nature des composés riches en énergie • Les composés riches en énergie comportent des liaisons dites riches en énergie. Ces liaisons correspondent en fait à des liaisons covalentes fragiles dont la rupture correspond à un ΔG 0 au moins égal à -7 kcal/mol. • Cette valeur est fixée à partir de l’hydrolyse de l’ATP. En effet lors de l’hydrolyse ATP en ADP on a ΔG0 = -7 kcal/mol. Comme l’ATP est considéré comme « le composé riche en énergie le plus basique » ; on utilise -7 kcal/mol comme référence. • Ainsi si la rupture de liaison covalence au sein d’un composé est associée à un ΔG0 < -7 (donc -8 …) alors le composé d’est dit « composé riche en énergie » • Liaison covalence classique 100 kcal/mol Exemples de réactions impliquant des composés « riches en énergie » : (L’ondulation représente la liaison riche en énergie) et des liaisons riches Liaisons entre des acides (anhydride phosphorique) : entre chaque phosphate, liaison riche en énergie. Avec anyhydride mixte phosphorique carboxylique : façon d’activer les animo acide pour les fixer sur les TNR A (voir cours de biocell) 13 Couplage des réactions • Coupler l’énergie d’une réaction exergonique (favorable) avec celle d’une réaction endergonique (défavorable). • La réaction obtenue n’est favorable que si ΣΔG0 < 0 • Dans certaines réactions de biochimie on consomme 2 liaisons riches en énergies : dans le pyrophosphate, on ne sait pas récupérer l’énergie de cette liaison • Le pyrophosphate va s’hydrolyser pour donner deux molécules de phosphates et l’énergie de ces liaisons-là seront perdue. • Par exemple : Pour refabriquer de l’ATP, il faut rephosphoryler de l’AMP pour donner de l’ATP puis rephosphoryler de l’ADP pour donner de l’ATP = consommation de 2x7kcal/mol (retenir le principe car on peut vous demander combien dans un processus on crée ou on consomme de liaisons riches en énergies) Exemple d’une réaction couplée • L’activation de l’amino-acide : elle survient en 2 étapes 1. Hydrolyse ATP en AMP : libère de l’énergie ΔG0 < 0 / la réaction est exergonique 2. Liaison AMP et acide aminé : consomme de l’énergie ΔG0 > 0 / la réaction est endergonique • La réaction exergonique est l’hydrolyse de l’ATP en AMP et pyrophosphate et la deuxième réaction est rendue possible par le couplage des deux réactions pour que ΔG0 soit négatif. 14 IV. Notion de site actif 1. Le complexe enzyme-substrat L’existence du complexe enzyme-substrat a été montrée expérimentalement, ainsi : • On a une saturabilité des enzymes (rappel : lorsqu’elles sont incubées avec des quantités très importantes de substrat, la vitesse reste constante et en vitesse maximum) • Forte spécificité du substrat pour l’enzyme • Protection de l’inactivation de l’enzyme par leurs substrats (résidus catalytiques très réactifs à l’intérieur du site actif de l’enzyme aident les réactions à avoir lieu) On disait alors que « l’enzyme se conserve mieux en présence de son substrat ». 2. Les modèles de sites actifs • Ce modèle rigide de site actif de l’enzyme, de type antigène (Ag) – anticorps (Ac) exprime l’idée qu’il y a une reconnaissance spécifique du substrat pour l’enzyme. Le modèle « Lock and Key » (Fischer, 1894) • C’est-à-dire la capacité d’une grosse molécule (la protéine ou l’enzyme) de lier une petite molécule (l’antigène ou le substrat). • Cependant, ce modèle n’explique pas la catalyse. • Leurs fonctions sont différentes : o Le but d’un Ac est de ne pas lâcher son Ag, o L’enzyme a une complémentarité avec le substrat mais doit le lâcher et le transformer. • De nouvelles données apparaissent grâce à la radiocristallographie, découverte de la structure tridimensionnelle des protéines (Perutz et Kandrew : cristallo myoglobine et hémoglobine) Le modèle de l’« induced fit» (Khosland, 1960) • Dans le modèle de l’« induced fit », ou « ajustement induit », l’enzyme modifie sa structure pour s’adapter à son substrat et gagne en stabilité au niveau du site actif quand elle lie le substrat et le produit. o Ainsi, la présence du substrat déforme l’enzyme (induced fit = ajustement induit), qui va se replier sur le substrat pour gagner en compacité (il est alors plus stable). o Des liaisons se forment donc entre l’enzyme et le substrat. En comparant des structures libres et liés au substrat : l’ensemble de la structure est conservé. 15 • Ce modèle met en avant le fait que le substrat possède une conformation instable au sein de l’enzyme : c’est l’état de transition. • Réciproquement, l’enzyme est stabilisée par son substrat. Le modèle de l'« orbital steering » (Miltsien et Cohen) Pilotage des orbitales • Le substrat change lui aussi de conformation pour adopter un état instable qui va permettre la transformation en produit. • L’enzyme et le substrat ont donc des actions l’un envers l’autre : o Le substrat déforme l’enzyme o L’enzyme déforme le substrat pour l’emmener à l’état de transition (impossible à observer), le substrat perd en stabilité. o Puis le substrat va atteindre son état d’équilibre (A, B, C et D vont choisir d’aller d’un côté ou de l’autre pour aller vers la forme la plus stable, ils vont ainsi se retrouver sur un même plan) • Ce modèle explique la catalyse. • À partir de l’état de transition, l’enzyme évoluera pour donner soit le composant de gauche, soit celui de droite. 3. Exemple d’induced fit dans l’hexokinase État de base de l’enzyme • L’enzyme est relaxée quand le glucose n’est pas dedans. • Si le glucose se met dedans : des liaisons se créent. • Dans l’hexokinase, l’induced fit joue un rôle très important : o Le glucose, en entrant en premier, ferme le site actif et chasse l’eau. o La fixation de l’ATP suit nécessairement la fixation du glucose car c’est la face hydrophobe de l’adénine qui se lie (donc l’ATP doit rentrer après le glucose sinon il s’hydrolyse) État de l’enzyme lié au glucose o La liaison de Mg++ ou Mn++ est indispensable à la liaison de la chaine phosphate (il vient se lier aux résidus négatifs de cette chaîne) o L’absence d’eau dans le site actif permet d’éviter l’hydrolyse de l’ATP en ADP +Pi. o Grâce à ce mécanisme, le phosphate est transféré sur l’OH en 6 du glucose et l’ATP n’est pas gaspillé o L’ordre de liaison des substrats est donc essentiel pour l’efficacité catalytique de l’Ez. • Ce mécanisme général est retrouvé dans toutes les kinases. • Bleu : sans glucose, rouge : avec 16 V. Description cinétique d’une réaction simple : Équation de HenriMichaelis et Menten 1. Postulats simplificateurs • L’équation S→P : o Dans le cas le plus simple, avec un substrat et produit unique, existence de ES : o Si plusieurs substrats : Équation de départ ▪ Il faut les étudier séparément, et placer les autres substrats à concentration saturante ainsi l’équitation devient : o La vitesse de la réaction ne dépend que du substrat dit limitant. o Sur le plan cinétique, le but est de simplifier cette équation complexe qui contient plusieurs constantes (à chaque nouvel équilibre). K1 : vitesse d’association K2 : vitesse de dissociation • On considèrera que : o L’étape limitante est la formation du complexe enzyme-substrat. ▪ En effet, la transformation et la libération du produit sont des étapes très rapides par rapport aux états d’association de l’enzyme et du substrat. ▪ On ne tiendra compte que d’une seule constante de vitesse, à savoir Kcat, qui est la constante catalytique, prenant en compte toutes les transitions entre le stade de complexe enzyme-substrat et le stade enzyme + substrat. o On se place dans des conditions où il n’y a pas de sens retour de la réaction vers le substrat P à S : ▪ L’enzyme ne fonctionne que dans un seul sens. Trois postulats simplificateur ▪ Il ne faut pas poursuivre la réaction trop longtemps, car au bout d’un certain temps du produit se forme, et il peut être retransformer en substrat. ▪ Donc la concentration finale en produit doit être inférieure à 5% de la concentration initiale en substrat pour que la réaction soit dite « équilibrée ». o On se place dans des conditions d’équilibre rapide : ▪ En pratique, on fait en sorte que le complexe enzyme-substrat soit déjà formé, donc que la concentration en complexe enzyme-substrat soit constante. La formule de la vitesse initiale dans ces conditions est alors : V=Kcat x [ES] ▪ Ainsi la vitesse est directement proportionnelle à la constante catalytique et à la concentration du complexe [enzyme-substrat] 17 2. Équation obtenue • On appelle k1 la constante d’association et k-1 la constante de dissociation. • On rappelle que l’étape de formation du complexe enzyme-substrat (ES) est l’étape limitante de la réaction et que Kcat tient compte de toutes les transitions qui ont lieu entre le complexe enzyme-substrat et l’étape enzyme + substrat. • On se place à l’équilibre cinétique, avec [ES]=constante, cela veut dire qu’il se forme autant de complexe enzyme substrat qu’il s’en détruit. Dans ces conditions : La vitesse de destruction de ES (VD) est égale à la vitesse de formation de ES (V F) : VD = (k-1 + Kcat). [ES] VF = k1.[E].[S] (k-1 + Kcat).[ES] = k1.[E].[S] 3. La constante de Michaelis, KM (𝑘−1 + 𝑘𝑐𝑎𝑡 ) ([ 𝐸 ] × [ 𝑆 ] ) = = 𝐾𝑀 𝑘1 [𝐸𝑆] 𝑃𝑜𝑢𝑟 ∶ 𝐸 + 𝑆 ↔ 𝐸𝑆 [𝐸 ] × [𝑆] 𝑘−1 = = 𝐾𝑑 𝑘1 [𝐸𝑆] Définition • La constante de Michaelis = KM n’est pas une constante d’affinité mais une constante d’efficacité. o Elle représente la capacité de l’enzyme à transformer son substrat. • Elle est toujours supérieure à KD = constante de dissociation (affinité de E pour S : KD petit = grande affinité de l’enzyme pour son substrat). • KM est d’autant supérieure à K D que l’activité catalytique Kcat est plus forte. • Le KM est donc intéressant quand il est très fort (on demande de l’enzyme qu’elle ait une forte capacité à transformer le substrat en produit). • On souhaite donc des enzymes à Kd bas et Km élevé (et donc Kcat très fort). On ne cherche pas une affinité, mais un bon pouvoir transformant ! 18 4. Équation de Henri-Michaelis et Menten Equation de Henri-Michaelis et Menten Démonstration (pas à savoir) • On a 2 égalités, donc on divise de chaque côté par [Et], puis on remplace [ES] et ensuite on factorise. On obtient l’équation de Michaelis et Menten. (Comprendre les simplification plus que le calcul) 19