Ejercicio 8 BIOL 4605 SDS PAGE PROTEÍNAS TOTALES.pdf

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 8. Electroforesis de proteínas- SDS-PAGE OBJETIVOS 1. Discutir los principios básicos de la electroforesis de proteínas SDS PAGE. 2. Calcular los m...

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 8. Electroforesis de proteínas- SDS-PAGE OBJETIVOS 1. Discutir los principios básicos de la electroforesis de proteínas SDS PAGE. 2. Calcular los microlitros necesarios para preparar la muestra de proteínas totales del citoplasma de las células trabajadas. 3. Detectar las proteínas totales de mayor y menor peso molecular después de la electroforesis y la tinción con Coomassie Blue. INTRODUCCIÓN Aspectos teóricos de la electroforesis de poliacrilamida La separación de macromoléculas en un campo eléctrico se denomina electroforesis. Un método común para la separación de proteínas utiliza un gel de poliacrilamida como soporte y SDS para desnaturalizar la proteína. El sistema más utilizado para separar proteína por electroforesis en gel fue formulado originalmente por Laemmli (1971) Este método es llamado “Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis” (SDS-PAGE). La electroforesis (SDS-PAGE) se utiliza para: Identificar una proteína específica o de interés basado en tamaño o peso molecular Monitorear el proceso de lisis y recuperación Monitorear el proceso de purificación de una proteína Detectar modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación, acetilación y proteólisis Mecanismo de la formación del gel La molécula de acrilamida por sí sola forma polímeros lineales. La bisacrilamida introduce enlaces cruzados entre las cadenas de poliacrilamida. El TEMED y el persulfato de amonio ayudan en el proceso de polimerización. El TEMED cataliza la descomposición del persulfato de amonio para formar los radicales (SO4-) que se muestran en la siguiente figura. Los radicales libres SO4- activan el monómero de acrilamida. El monómero activado activa otro monómero inactivado para formar una cadena alargada. Durante el crecimiento de la cadena, la bisacrilamida entrecruza los monómeros de acrilamida resultando en la formación de un polímero en forma de red, con una porosidad característica. El oxígeno atrapa los radicales libres SO4-, por lo que interfiere con la polimerización del gel. Para evitar que el oxígeno afecte el proceso de polimerización: añadir etanol al 95% sobre el separating gel, y agitar la mezcla lentamente a medida que se añaden los diferentes componentes. El tamaño que tenga el poro depende de la concentración de acrilamida. Mientras mayor es el porcentaje de acrilamida menor es el tamaño del poro del gel. De modo que un gel a 12% tiene poros de menor tamaño que un gel al 4%. El porcentaje del gel que se prepare dependerá de la proteína o muestra que desee caracterizar. La siguiente tabla muestra las resoluciones óptimas de separación que obtendrá de acuerdo con el porcentaje de acrilamida. El sistema discontinuo fue originalmente desarrollado por Laemmli (1971) y consiste en dos geles: uno de separación (separating gel, resolving gel) y otro de montaje (stacking gel). Los dos geles poseen pH y porosidad distinta. El stacking gel: tiene un pH de 6.8 se prepara al 4% los poros son más grandes las proteínas totales se acomodan 2 El separating gel: tiene un pH de 8.8 se prepara al 12% los poros son más pequeños las proteínas totales se separan por peso molecular (Da, o KDa). Las proteínas migran de mayor a menor peso molecular. El buffer de corrida (Tris-Cl glycine SDS) tiene un pH de 8.3. El Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE), es la electroforesis de proteínas más ampliamente utilizada. Se trata de un tipo de electroforesis desnaturalizante. Las proteínas son desnaturalizadas antes de correr la electroforesis. Para la desnaturalización las muestras son expuestas a calor (95oC del heat block) y agentes químicos como SDS y β-mercaptoetanol. El Laemmli Buffer utilizado para preparar las muestras contiene SDS, βmercaptoetanol, glicerol (densidad a la muestra) y bromofenol azul (visualizar la migración/corrida). El SDS es un detergente aniónico que le da carga negativa a la proteína. Además, es un agente desnaturalizante que altera su estructura terciaria, interrumpiendo los puentes de hidrógeno, interacciones van der Waals, interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos. El β-mercaptoetanol o ditiotreitol (Dithiothreitol) (DTT), rompe los puentes disulfuro de la proteína alterando también la estructura terciaria de la proteína. 3 El calor contribuye al rompimiento de los puentes de hidrógeno afectando estructura terciaria y secundaria. El calor ayuda también a inactivar proteasas que puedan estar presentes. Al final se obtienen proteínas con conformación lineal y con carga negativa. La separación de las proteínas totales del citoplasma de las células trabajadas se realizará por peso molecular ya que todas las proteínas tienen carga negativa. Para confirmar la presencia de las proteínas totales en la gel de poliacrilamida se estará utilizando el tinte Coomassie Blue. EQUIPOS Y MATERIALES Cámara de electroforesis Mini-PROTEAN 3 4 Muestra de proteínas totales del citoplasma de las células trabajadas (-80ºC) 4 botellas de jabón de cristalería Beakers 50 mL Microtubos estériles 1.5 mL *Acrilamida/Bisacrilamida (30%/2.67%) (almacenar a 4oC) 1.5M Tris-HCl pH 8.8 (importante verificar el pH) 0.5M Tris-HCl pH 6.8 (importante verificar el pH) 10% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) (almacenar a temperatura ambiente) (fresco) 10% Persulfato de amonio (almacenar a -20oC) (fresco) Alcohol (etanol) al 95% TEMED (almacenar a 4oC) Agua desionizada estéril 5X Sample buffer, Laemmli (Tris-Cl pH 6.8, glicerol, SDS, Mercaptoetanol, bromofenol azul) Electrophoresis buffer 10X Tris-Cl-glycine-SDS Buffer pH 8.3 (Electrode Buffer-Corrida) (Se utiliza 1X) Bio Safe Coomassie Blue Marcador molecular- Broad Range Marker NOTA: LA ACRILAMIDA ES NEUROTÓXICA. DEBE TRABAJAR CON GAFAS Y GUANTES. CUALQUIER PORCIÓN NO POLIMERIZADA QUE RESTE SE DEBE MEZCLAR CON AGENTE CALÍTICO. PROCEDIMIENTO Parte I: Preparación de los cristales donde se realizará la polimerización del gel (soporte del gel) 1. Se deben utilizar guantes para evitar tocar los cristales con la mano. 2. Los cristales deben limpiarse primero con agua y jabón y después con abundante agua desionizada. Luego, volver a limpiar, pero con etanol y un kimwipe. 3. Coloque el cristal más corto sobre el cristal largo con los separadores. (El separador que utilizaremos es el de 0.75mm) 4. Abra las ventanillas del soporte verde (casting frame) y coloque los cristales en el soporte. El cristal más corto debe quedar hacia el frente. Verificar que ambos cristales estén nivelados. Ajuste los cristales cerrando las ventanillas hacia fuera. 5. Coloque la goma gris en el soporte transparente (casting stand). 6. Coloque el soporte verde con los cristales encima de la goma gris y verifique que quede ajustado correctamente en el soporte transparente. La parte superior de los cristales se ajustará con la palanca con resorte. Parte II. Preparación del gel de separación 1. Coloque la peinilla para formar las fosas en el gel. En el cristal corto trazar una línea a una distancia de 0.5 (anteriormente 1 cm) por debajo del borde de la peinilla. La mezcla del gel de separación se añadirá hasta ese nivel. 5 2. Prepare el gel de separación al 12%, mezclando los reactivos como se indica en la tabla (el persulfato de amonio y el TEMED debe añadirse al final). Tabla I. Soluciones para la preparación del gel de separación pH 8.8 (separating gel) Reactivo Acrilamida/bisacrilamida (30%, 2.67%) Agua ultrapura 1.5 M Tris-HCL pH 8.8 10% SDS 10% Persulfato de amonio TEMED Volumen total 8% 2.6 ml 10% 3.3 ml 12% 4.0 ml 15% 5.0 ml 4.7 ml 2.5 ml 100 µl 100 µl 5 µl 10 ml 4.0 ml 2.5 ml 100 µl 100 µl 5 10 ml 3.3 ml 2.5 ml 100 µl 100 µl 5 10 ml 2.3 ml 2.5 ml 100 µl 100 µl 5 10 ml 3. Añadir el persulfato de amonio y TEMED y agitar suavemente para evitar la formación de burbujas (O2) que puede afectar la polimerización. 4. Transferir lentamente la solución entre los cristales con una micropipeta P1000. Coloque la pipeta entre las esquinas del cristal y añada 1000L en un extremo del gel y 1000L en el otro extremo. Evite que se formen burbujas. Llenar poco a poco hasta alcanzar la marca de 0.5 cm. Dejar la solución restante en un “beaker” para observar la polimerización. 5. Añada 100L (volumen total) de etanol al 95% a la superficie del gel. En lugar de etanol se podría utilizar agua ultrapura. El mismo debe añadirse lentamente procurando que la superficie del gel no se distorsione. Para evitar esto añada 50L en un extremo del gel y 50L en el otro extremo. El etanol y el agua evitan que el oxígeno inhiba la polimerización del gel. 6. Dejar polimerizar por lo menos 45 minutos. No mover el gel durante el proceso de polimerización. 7. Si ya ha polimerizado el gel de separación, inclinar el soporte verde para descartar el etanol. En caso de haber utilizado agua ultrapura este paso no se realiza. 8. Remover el exceso de etanol con 100 µL agua ultrapura (opción: 50 µL en cada extremo). Remover el agua ultrapura con un kimwipe. Parte III. Preparación del stacking gel 1. Prepare el “stacking gel” al 4% siguiendo la información de la tabla 2. 6 Tabla 2. Soluciones para la preparación del stacking gel pH 6.8 Reactivo Acrilamida/bisacrilamida (30%, 2.67%) Agua ultrapura 0.5 M Tris-HCL pH 6.8 10% SDS 10% Persulfato de amonio TEMED Volumen total 4% 0.65 ml 3.0 ml 1.25 ml 50 µl 25 µl 10 µl 5 ml 2. Transferir lentamente 1000 L de la solución entre los cristales con una micropipeta colocada en una de las esquinas del cristal, evitando que se formen burbujas. Deje la solución restante en un “beaker” para observar la polimerización. 3. Inserte la peinilla lentamente en el “stacking gel”. Permita que la solución polimerice durante 30 minutos. Parte IV. Preparación de la cámara de electroforesis 1. Abra las ventanillas y remueva los cristales con el gel polimerizado del casting frame. 2. Coloque los cristales con el gel en el soporte del electrodo (electrode assembly), con el cristal más corto hacia adentro. Verifique que ambos lados del soporte del electrodo tengan los cristales bien colocados. 3. En el cristal largo (externo) trazar una línea a una distancia de 0.5 cm (anteriormente 1 cm por debajo de la peinilla. El voltaje se cambiará cuando alcance ese nivel. 4. Trazar una línea debajo de cada fosa de la peinilla o trazar la forma de la misma peinilla. Esto le servirá de guía para cuando cargue la fosa con la muestra. También se puede utilizar el Sample loading guide (Bio Rad). 5. Coloque el soporte del electrodo dentro del soporte de desarrollo (clamping frame). Presione hacia abajo el soporte del electrodo a medida que cierra los sujetadores del soporte de desarrollo. 7 6. Coloque el soporte de desarrollo dentro de la cámara de electroforesis (mini tank). 7. Añada 140 mL de 1X Tris-Cl-glycine-SDS Buffer pH 8.3 (Electrode Buffer) al depósito interior de la cámara. No remueva la peinilla hasta verificar que el nivel del buffer no baje. 8. Añada 200 mL o hasta la marca indicada (2 gels) de “Electrode Buffer” al depósito exterior evitando la formación de burbujas. 9. Retire cuidadosamente la peinilla permitiendo que las fosas se llenen con el amortiguador. Ahora los carriles están listos para ser servidos con las muestras. Parte V. Preparación de las muestras (Las muestras pueden prepararse mientras se polimeriza el stacking gel) 1. Rotule los microtubos a utilizar (Proteínas totales, grupo). 2. Determine el volumen de la muestra a utilizar. En este laboratorio la cantidad que se estará utilizando de la muestra de proteínas totales será 5 o 7 µg. El profesor decidirá la cantidad de microgramos (µg) a utilizar dependiendo de las concentraciones obtenidas de proteínas totales en el experimento de BCA. Ejemplo 1: Muestra de proteínas totales del citoplasma de las células trabajadas La concentración de proteínas totales de la muestra del citoplasma usando el método BCA fue: 1844 µg/mL. a. Realizar conversión de µg/mL a µg/µL. 1844 µg = 1.844 µg/µL b. Utilizar la siguiente fórmula para obtener los microlitros (µL) a usar de la muestra. En este laboratorio la cantidad de proteínas totales que se estará utilizando es 1 µg. µg/ µL x µL= 1µg µL= 1µg /1.844 µg/ µL = 0.5 µL 8 3. Añada cada componente en el siguiente orden: agua ultrapura, muestra y Laemmli buffer (sample buffer) 5X. 4. Prepare el Broad Range Marker a una dilución 1:20. El volumen total a preparar es de 100 µL. Añadir 95 µL de Laemmli Buffer y 5 µL del marcador. Se designará a un estudiante para preparar el marcador. 5. Caliente las muestras y el marcador durante 5 minutos en el “Heat block” a 95C. Coloque un “lid lock” para evitar la evaporación de la muestra. Esta alta temperatura ayuda a desnaturalizar las proteínas. Después de calentar la muestra no se debe colocar en hielo. Concentración Concentración (µg/ml) (µg/µl) 1844 1.844 Agua (µl) 15.5 Muestra (µl) 0.5 Laemmli (µl) 4 Total (µl) 20 20 Para obtener el volumen del agua ultrapura: Volumen (µL) de muestra de proteínas + volumen del Laemmli buffer Ej. 0.5+ 4 =4.5 µL Volumen total – valor calculado anteriormente Ej. 20-4.5= 15.5 El marcador Broad Range tiene una mezcla de las siguientes proteínas: Miosina-200 kDa -galactosidasa-116 kDa Fosforilasa b- 97kDa Albúmina de bovino (BSA)- 66 kDa Ovoalbúmina (huevo)- 45 kDa Anhidrasa carbónica- 31 kDa Inhibidor de tripsina (soya)- 21kDa Lisozima- 14kDa Aprotinina- 6.5kDa A pesar de no poder determinar con certeza la presencia de la proteína de interés GAPDH (Gliceraldehido 3- fosfato deshidrogenasa, 37 kDa), ¿entre que proteínas del marcador se esperaría encontrarla? 6. Centrifugue todas las muestras a 4,000 rpm durante 30 segundos. 7. Coloque (sirva) las muestras en el gel según la tabla a continuación. Para el marcador servir 5 µL. Para las muestras 10 µl. 9 Parte VI. Corrida de la electroforesis y tinción del gel 1. Coloque la cubierta para que los electrodos tengan la orientación correspondiente. Conectar el power supply. 2. Ajuste el voltaje a 90 voltios y permita que la electroforesis proceda hasta que alcance el nivel del gel de separación. (Esto permite que las muestras se acomoden en la fosa y se introduzcan al gel de poliacrilamida lentamente). 3. Presione el pause o stop para detener la corrida. 4. Cambie el voltaje a 120 voltios. Pulse Run para continuar la corrida hasta que la línea azul de bromofenol alcance la parte inferior del gel. (Nota: permita que el tinte migre has alcanzar el borde del cristal para alcanzar la máxima resolución posible). 5. Cuando la electroforesis se haya completado, desconectar el power supply y quitar la tapa superior. 6. Remueva el soporte de desarrollo, el soporte del electrodo y remover los cristales del soporte. 7. Separar los cristales con cuidado utilizando la espátula verde del equipo de electroforesis o una de las espátulas metálicas disponibles en el laboratorio y la botella de lavado con agua destilada. En este punto el gel se quedará sobre uno de los cristales. Debe manejar cuidadosamente el gel ya que es delgado (0.75 mm) y puede partirse con facilidad. 8. Utilizando el cristal como apoyo corte el stacking gel con la espátula verde. 9. Despegue suavemente el gel del vidrio utilizando la botella de lavado con agua ultrapura. 10. Coloque el gel en un envase de lavados y añada BioSafe Coomassie Blue hasta cubrir su gel. 11. Deje en agitación lenta en el Maxi rotator a temperatura ambiente. Luego de 30 minutos remueva el tinte (este puede descartarse en el fregadero). Realice de 3-4 lavados. 12. El gel puede mantenerse en agua desionizada toda la noche y retratar usando el CHEM DOC Imaging System (BIORAD) al día siguiente. 13. Todo el equipo de electroforesis debe ser lavado con agua desionizada. Los cristales y peinillas deben lavarse con detergente y enjuagarse con agua potable 5 veces y con agua desionizada 2 veces. 2024 10