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10/09/2023 Génétique- Biologie Moléculaire 1 Cours #3 : Mutants. Crible. Sélection. Fabrice CONFALONIERI Sébastien BLOYER Licence 2 2023-2024 On obtient des mutants (nouveaux phénotypes) : ces mutants sont dus à des mutations dans leur ADN dirigées par les conditions expérimentales ? Le test de f...

10/09/2023 Génétique- Biologie Moléculaire 1 Cours #3 : Mutants. Crible. Sélection. Fabrice CONFALONIERI Sébastien BLOYER Licence 2 2023-2024 On obtient des mutants (nouveaux phénotypes) : ces mutants sont dus à des mutations dans leur ADN dirigées par les conditions expérimentales ? Le test de fluctuation d’après Luria et Delbrück (1943) Le principe: les bactéries sont sensibles à des bactériophages: Si on réalise plusieurs cultures est-ce que le nombre de bactéries [λR] obtenus spontanément sera comparable d’une culture à une autre ? 1 10/09/2023 Le test de fluctuation d’après Luria et Delbrück (1943) Hypothèse #1 : Les mutations sont induites par la sélection naturelle = théorie transformiste : le milieu provoque les mutations qui permettent l'adaptation des espèces au milieu. Nombre de bactéries [λR] devra être +/- identique par expérience Le test de fluctuation d’après Luria et Delbrück (1943) Hypothèse #2 : Les mutations surviennent de manière aléatoire, et permettent l’adaptation au milieu = théorie de la sélection naturelle de Darwin sous-clone #1 sous-clone #2 Nombre de bactéries [λR] deviendra très fluctuant d’une expérience à l’autre 2 10/09/2023 Résultat Le test de fluctuation d’après Luria et Delbrück (1943) Hypothèse #1 : Les mutations sont induites par la sélection naturelle Hypothèse #2 : Les mutations surviennent de manière aléatoire Le nombre de bactéries [λR] très fluctuant d’une expérience à l’autre Les mutations sont aléatoires et non dirigées Conclusion - Les mutations sont aléatoires et non dirigées par les conditions expérimentales - Certaines mutations permettent de s’adapter aux conditions imposées, d’autres sont neutres, d’autres encore sont délétères - On observe dans une condition de culture donnée qu’un nombre limité de mutants produits 3 10/09/2023 Les mutations peuvent prendre des formes différentes Exemple : Alignement de 2 séquences homologues • CTGGGCCCAGATC • AACAGGGCCCAAATC - - C T G G G C C C A G A T C A A C A G G G C C C A A A T C * . Inser7on/ délé7on =indel * * * * Match * * * . * * * Mutation Comment alors isoler les mutants ? • Toute cellule ou tout organisme dont la séquence du génome diffère par rapport à la séquence de référence. • la mutation ne doit pas être neutre. • Il faut être dans des conditions expérimentales qui permettent d’observer l’effet de cette mutation et donc de pouvoir « trier » les organismes mutants des organismes sauvages 4 10/09/2023 Première étape : les faire croitre ! séparer les organismes, les compter Méthode pour Bactéries et levures Après dilu5on, étalement sur boites de Pétri Chaque cellule formera une colonie Milieu liquide ou solide 5 10/09/2023 • Quelles cellules (mutant/sauvage) arrivent à croitre sur : • Un milieu minimum ? Les cellules sauvages ne possédant aucune auxotrophie. • Un milieu riche ? Toutes les cellules sauf celles dont la mutation affecte un gène essentiel à sa croissance qui ne peut être complémentée avec ce qu’elles trouvent dans le milieu de culture (exemple, protéines de réplication, synthèse des ARN, traduction…) • Un milieu défini ? Les cellules sauvages et les mutants qui trouvent dans le milieu ce qu’elles ne peuvent plus synthétiser. Sélection de variants On prélève une colonie que l’on fait croitre dans un milieu liquide. A priori ce sont des clones cellulaires min + glu min + glu 102 bact 100 colonies 106 bact Tapis confluent min + glu 102 bact 106 bact 0 colonies quelques colonies min + glu + cycloheximide Apparition de deux clones [CycloR] avec une fréquence faible 6 10/09/2023 Caractère héritable >>> Mutant On prélève une colonie [CycloR] que l’on fait croitre à nouveau en milieu liquide [cyclor] min + glu 102 bact 106 bact 102 bact 100 colonies Tapis confluent 100 colonies min + glu 106 bact Tapis confluent min + glu + cyclo RAPPEL Mutants spontanés: mutations dues aux erreurs d'incorporation de la polymérase, aux modifications chimiques des bases à d’autres lésions... qui n’ont pas été réparées. Mutants induits: mutations aléatoires dont on augmente la fréquence grâce à des agents mutagènes chimiques ou physiques Mutagènes augmentent taux général de mutations Taux de mutations (nb_mutants/gène ou organisme/génération) Fréquence de mutants (nb_mutants/nb_cell_obs) 7 10/09/2023 Trois types de mutants très étudiés en microbiologie - Mutants de résistance à des antibiotiques ou d’autres molécules (Ampicilline, Kanamycine, Chloramphénicol, G418, streptomycine, cycloheximide, tetracycline…) Pourquoi les cellules deviennent résistantes à un antibiotique ? - L’antibiotique ne peut plus entrer (transporteur muté) ou est refoulé (mutation dans une pompe à efflux) - Mutation dans la cible de l’antibiotique qui ne la reconnaît plus - Mutation dans une enzyme qui devient capable de dégrader l’antibiotique ou acquisition un ADN codant cette enzyme. Trois types de mutants très étudiés en microbiologie - Mutants de résistance à des antibiotiques ou d’autres molécules (Ampicilline, Kanamycine, Chloramphénicol, G418, streptomycine, cycloheximide, tetracycline…) - Mutants auxotrophes. Exemple [Trp-]. Les souches ne peuvent pas synthétiser le Tryptophane et donc ne peuvent pas synthétiser les protéines. Par contre si on rajoute dans le milieu du Trp elles vont croître. -Incapacité à utiliser un sucre comme source de carbone: exemple: mutants [Gal-]. Mutants dans la voie d’assimilation ou de dégradation du Galactose. Donc même si on rajoute dans le milieu du Galactose, les mutants ne peuvent pas croître). (il existe beaucoup d'autres types de mutants) 8 10/09/2023 Comment isoler ces différents types de mutants ? • Crible positif • Crible négatif Comment isoler ces différents types de mutants ? 1- Mutant de résistance à un antibiotique 9 10/09/2023 Crible positif: sélection directe des mutants 106 bact min + glu + Cycloheximide "Tuer les parents": c'est-à-dire tuer les cellules non mutantes Dans le cas de la transformation avec un plasmide ? Site Multiple de Gène de résistance à un an8bio8que Permet la sélection positive des bactéries transformées Clonage (MCS ou « Polylinker ») Permet l’insertion d’un fragment d’ADN Origine de réplication bactérienne Permet la réplication et la multiplication du plasmide 10 10/09/2023 Crible positif: sélection directe après transformation Bactéries transformées avec le plasmide et donc exprimant le gène de résistance à un antibiotique min + glu + Antibiotique (ampicilline, chloramphenicol, kanamycine, tetracycline…. dépend du gène de sélection) "Tuer les parents": c'est-à-dire tuer les cellules non transformées Comment isoler ces différents types de mutants ? 1- Mutant de résistance à un antibiotique Crible positif 11 10/09/2023 Comment isoler ces différents types de mutants ? 2- Mutant d’auxotrophie Prototrophie - auxotrophie 12 10/09/2023 Crible négatif: Problème: Un mutant auxotrophe pour un acide aminé ne se différencie pas d'un sauvage sur milieu riche et sur milieu sans l’acide aminé, il ne croit pas. Comment le repérer et l’isoler ??? Crible négatif Sélectionner ce qui ne pousse pas dans certaines conditions >> technique des répliques 13 10/09/2023 Technique des répliques velours Crible négatif Application: Recherche de mutants [Lys-] Méthode applicable chez les procaryotes et les levures [Lys+ ou Lys-] [Lys+] 14 10/09/2023 Comment isoler ces différents types de mutants ? 2- Mutant d’auxotrophie Crible négatif Comment isoler ces différents types de mutants ? 3- Mutant d’assimilation ou de dégradation 15 10/09/2023 Mutant d’assimila-on ou de dégrada-on clone [Gal-] milieu contenant du glucose milieu contenant du galactose clone [Gal+] Mutants d’assimilation ou de dégradation : Problème: Un mutant d’assimilation ou de dégradation ne se différencie pas d'un sauvage sur milieu riche et il ne croit pas sur milieu avec le produit. => SELECTION/ ENRICHISSEMENT 16 10/09/2023 Crible négatif avec répliques sur velours Milieu contenant un sucre assimilable Milieu contenant le sucre étudié Comment isoler ces différents types de mutants ? 3- Mutant d’assimila9on ou de dégrada9on Crible néga9f 17 10/09/2023 Comment obtenir différents mutants qui concourent au même phénotype ? • Exemple : mutants différents auxotrophes pour une voie de biosynthèse d’un acide aminé ou d’un autre composé du métabolisme (comme la lysine vue précédemment). Biosynthèse de la lysine chez la levure S. cerevisiae Au moins 6 étapes du 2-oxoglutarate au produit final (L-lysine) catalysées par 8 gènes. Toutes les cellules mutées dans un de ces gènes auront le même phénotype [Lys-] Des mutants indépendants sont issus d’évènements mutationnels indépendants donc peuvent affecter: - Des gènes différents - Le même gène à différents endroits - Le même gène au même endroit (plus rare) 18 10/09/2023 Il faut obtenir une collec/on de mutants indépendants • Définition : mutants obtenus par des évènements mutationnels différents • Méthode d’isolement ? t0 Une culture liquide Evénement mutationnel initial tn Toutes les cellules issues de ce mutant ont la même mutation Après avoir fait un crible négatif (réplique sur velours) on obtient 12 clones mutants [Lys-] mais ce sont tous les mêmes ! 19 10/09/2023 3 cultures différentes : test de fluctuation de Luria-Delbrück Après avoir fait un crible négatif (réplique sur velours) 12 clones mutants [Lys-] 3 clones mutants [Lys-] 6 clones mutants [Lys-] A priori 3 évènements mutaAonnels différents donc le nombre et la nature des mutants de la seconde et de la troisième culture seront différents de ceux de la première culture Mutants indépendants: prélever une colonie par boite 20 10/09/2023 Conclusions Pour obtenir des mutants indépendants il faudrait en toute rigueur - multiplier les cultures - faire des dilutions, des étalements sur des milieux non sélectifs - des répliques puis - prélever une colonie par culture ! Si on veut obtenir 10 mutants [Lys-], il faudrait reproduire 10 fois l’expérience: Si la fréquence est de 1 mutant sur 106 cellules, à raison de 100 colonies par boîte, cela correspond pour chaque culture à étaler >> 104 boites de Petri !!! C’est très lourd à faire… Autre méthode ? Mutagenèse pour obtenir des mutants indépendants auxotrophes chez des microorganismes qui peuvent croitre sur boites (bactéries, S. cerevisiae…) Protocole 21 10/09/2023 Mutagenèse pour obtenir des mutants indépendants [Lys-] chez E.coli ou la levure L’exposition au UV augmente la fréquence d’obtention de mutants Etalement sur milieu minimum + Lysine et irradiation des boites juste après l’étalement UV croissance MM+ Lys MM+ Lys Les cellules ont été séparées physiquement avant d’être irradiées Mutagenèse pour obtenir des mutants indépendants [Lys-] chez E.coli ou la levure Crible négatif MM + Lys Réplique sur boite contenant un milieu sans Lysine MM [Lys+] [Lys-] 10 colonies sont capables de croitre sur MM+ Lys mais pas sur MM donc elles sont auxotrophes à la lysine. Comme les cellules ont été séparées avant l’irradiation, les mutants obtenus sont indépendants les uns des autres. On pourrait alors prélever les 10 colonies de cette boite il y a une très forte probabilité qu’ils soient mutés dans des gènes différents 22 10/09/2023 Dernière méthode Enrichissement Tuer les "parents" (c-à-d les cellules non mutantes) qui sont les seules capables de se diviser dans les conditions du test Enrichissement chez des bactéries sensibles à la pénicilline La pénicilline tue les bactéries en division. On a une population de cellules mélangées: sauvages [Lys+] et mutantes [Lys-] (par exemple : 1 mutant sur 106 cellules). On fait croitre les cellules dans un milieu sans lysine et avec pénicilline: -les cellules sauvages peuvent croitre mais 99% sont tuées par la pénicilline -les cellules mutantes ne peuvent pas se diviser donc ne sont pas tuées elles sont dans un état « statique » On fait croitre toutes les cellules restantes sur boites dans un milieu contenant de la lysine: toutes les cellules croissent mais on a enrichi la population en cellules [Lys-], qu'il faut repérer par réplique sur boite. On fait plusieurs enrichissements successifs. 23 10/09/2023 Applications TD4 24