Cours#5_TCF_2023_SB.pdf

18/10/2023 Génétique - Biologie Moléculaire 1 Cours #5 : Tests fonctionnels – TCF Fabrice CONFALONIERI Sébastien BLOYER Licence 2 2023-2024 1 Dans les cours précédents on a vu - Obtenir une collection de mutants indépendants (Cours n° 3) Et dans le cours n°4: - Comment faire un test de dominan...

18/10/2023 Génétique - Biologie Moléculaire 1 Cours #5 : Tests fonctionnels – TCF Fabrice CONFALONIERI Sébastien BLOYER Licence 2 2023-2024 1 Dans les cours précédents on a vu - Obtenir une collection de mutants indépendants (Cours n° 3) Et dans le cours n°4: - Comment faire un test de dominance récessivité (TDR) - Chercher pour un phénotype mutant donné si un ou plusieurs sites mutés étaient impliqués - Dans le cas où on analyse deux sites mutés différents (un site muté par phénotype), voir si ils sont indépendants ou liés génétiquement (et/ou physiquement) - Calculer la distance entre 2 sites muté s’ils sont liés génétiquement Et si deux sites mutés sont impliqués dans le même phénotype ? 2 1 18/10/2023 Biosynthèse de la lysine chez la levure S. cerevisiae Au moins 6 étapes du 2-oxoglutarate au produit final (L-lysine) catalysées par 8 gènes. Toutes les cellules mutées dans un de ces gènes auront le même phénotype [Lys-] Des mutants indépendants sont issus d’évènements mutationnels indépendants donc peuvent affecter: - Des gènes différents - Le même gène à différents endroits - Le même gène au même endroit (plus rare) 3 Voie de biosynthèse de la lysine Chaîne de biosynthèse de la lysine X Y Histidine Lysine Enzyme A Enzyme B Gène a Gène b Ces 2 gènes interviennent dans l’établissement du même phénotype 4 2 18/10/2023 Un seul phénotype, mais deux gènes impliqués Croisement des deux souches mutantes haploïdes avec la souche sauvage X Y X Lysine Enzyme B Enzyme A X X Enzyme A Y X Enzyme A 2 copies de chaque gène dans la cellule Y Lysine Enzyme B souche sauvage haploïde [Lys Mutant 1 haploïde [Lys-] Diploïde X X Lysine Enzyme B Y Enzyme A Lysine + ] Si le diploïde est [Lys+] L’allèle a1 est récessif sur l’allèle sauvage a+ Enzyme B 5 Un seul phénotype, mais deux gènes impliqués Si tous les diploïdes sont [Lys+] alors l’allèle a1 est récessif vis à vis de l’allèle a+ Les diploïdes entrent en méiose si on obtient une ségrégation 2:2 => un seul site muté Mutant1 [Lys-] X sauvage [Lys+] n a1 a+ a1 a+ 2n n [Lys+] méiose 2 cellules [Lys+] 2 cellules [Lys-] n 6 3 18/10/2023 Un seul phénotype, mais deux gènes impliqués Croisement des deux souches mutantes haploïdes avec la souche sauvage X Y Lysine Enzyme B Enzyme A X X Y Enzyme A X Enzyme B Mutant 2 haploïde [Lys-] Souche sauvage haploïde [Lys-] X Lysine Y Si le diploïde est [Lys+] Lysine Diploïde 2 copies de chaque gène dans la cellule Enzyme A X Enzyme B Y Enzyme A L’allèle b1 est récessif sur l’allèle sauvage b+ Lysine X Enzyme B 7 Un seul phénotype, mais deux gènes impliqués Si tous les diploïdes sont [Lys+] alors l’allèle b1 est récessif vis à vis de l’allèle b+ Les diploïdes entrent en méiose si on obtient une ségrégation 2:2 : un seul site muté Mutant1 [Lys-] X sauvage [Lys+] n b1 b+ b1 b+ 2n n [Lys+] méiose 2 cellules [Lys+] 2 cellules [Lys-] n Même raisonnement 8 4 18/10/2023 Conclusion Pour ces deux mutants indépendants [Lys-] : - TDR : Chaque allèle muté est récessif vis à vis de l’allèle sauvage - Ségrégation 2:2 : Pour chaque mutant, un seul site muté est impliqué Et si on croise ces deux mutants entre eux ? 9 Un seul phénotype, mais deux gènes impliqués Croisement de deux souches mutantes haploïdes X Y X Enzyme A Lysine Enzyme B X X Enzyme A X 2 copies de chaque gène dans la cellule Lysine X Enzyme B Mutant 2 haploïde [Lys-] Mutant 1 haploïde [Lys-] Diploïde Y Y X Enzyme B Y Enzyme A Si le diploïde est [Lys+] Enzyme A X Lysine Lysine Il y a complémentation fonctionnelle X Enzyme B 10 5 18/10/2023 Conclusion Test de complémentation fonctionnelle (TCF) - Si il y a complémentation fonctionnelle, comme chaque allèle muté est récessif vis à vis du sauvage, alors les deux sites mutés ne touche pas le même gène. Une seule copie (=allèle) sauvage de chaque gène est suffisante pour que la synthèse de la lysine puisse se faire - Et si il n’y a pas de complémentation fonctionnelle ? alors les deux souches sont mutées sur le même gène (a ou b) 11 Deux mutations indépendantes dans le même gène Croisement de deux souches mutantes haploïdes X Y X Enzyme A Lysine Enzyme B X X 2 copies de chaque gène dans la cellule mais ici les deux copies du gène a sont mutées X Enzyme A Lysine Enzyme B Mutant 2 haploïde [Lys-] Mutant 1 haploïde [Lys-] Diploïde Y X Y X Enzyme B Y X Enzyme A Si le diploïde est [Lys-] Enzyme A X Lysine Lysine Il y n’a pas de complémentation fonctionnelle Enzyme B 12 6 18/10/2023 Rappel : Vu au cours 4 ATG a1 STOP Gene A ATG STOP a2 Gene A Les deux copies du gène A étant mutées, le diploïde obtenu après fécondation sera incapable de synthétiser la Lysine. Par contre on ne sait pas s’ils sont mutés à la même position ou à des endroits différents ni la nature de la mutation (mutation ponctuelle, insertion, délétion…) 13 Conclusion Test de complémentation fonctionnelle (TCF) On peut alors croiser chaque mutant haploïde avec la souche sauvage haploïde, vérifiez que chaque allèle muté est récessif. Si l’allèle est dominant, on l’exclut du test. Puis on croise chaque mutant avec les autres afin de les classer par groupe de complémentation: - Si le diploïde est sauvage les deux mutants haploïdes appartiennent à deux groupes de complémentation différents - Si le diploïde est mutant les deux mutants haploïdes appartiennent au même groupe parce que muté dans le même gène 14 7 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Application à 10 mutants [Lys-] indépendants 15 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 m3 m4 m5 m6 - [Lys ] + + + - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m7 + + - m8 [Lys ] m9 + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] m10 On ne fait figurer que la moitié du tableau 16 8 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Croisements réciproques (m1 x m2 = m2 x m1) 17 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 - [Lys ] + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - [Lys ] + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] Contrôles positifs : On vérifie que les croisements entre mutants par eux-mêmes (de type sexuel différent !) donnent le phénotype mutant 18 9 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Il est nécessaire de réaliser en parallèle un test de dominance/récessivité (TDR), en croisant les mutants avec la souche sauvage (WT) 19 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 m3 m4 m5 m6 m7 - [Lys ] + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - m8 [Lys ] m9 + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] m10 Le mutant m6 est-il informatif ? 20 10 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Le mutant m6 est-il informatif Non, car le phénotype [Lys-] du mutant m6 est dominant par rapport au phénotype sauvage [Lys+] 21 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 - [Lys ] + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - [Lys ] m9 + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] m10 Le mutant m6 n’étant pas informatif, il est exclu du TCF 22 11 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Analyse ligne par ligne : Le mutant m1: • Complémente avec : m2, m4, m5, m7, m8, m10 ([Lys+]) Þ Le gène muté dans m1 est différent de ceux mutés dans m2, m4, m5, m7, m8, m10 (ou colonne par colonne) 23 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 - [Lys ] m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 Analyse ligne par ligne : (ou colonne par colonne) + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - [Lys ] + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] Le mutant m1: • Ne complémente pas avec : m3et m9 ([Lys-]) Þ Le gène muté dans m1 est le même gène muté dans m3 et dans m9 24 12 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Analyse ligne par ligne : (ou colonne par colonne) m1, m3 et m9 appartiennent au même groupe de complémentation Groupe de complémentation #1 m1 m3 m9 25 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 - [Lys ] m3 m4 m5 m6 m7 m8 + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - [Lys ] m9 (ou colonne par colonne) + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] m10 Analyse ligne par ligne : + Groupe de complémentation #2 Analysez la ligne du mutant m2 m2 26 13 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - 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m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Analyse ligne par ligne : (ou colonne par colonne) Groupe de complémentation #4 Analysez la ligne du mutant m5 m5 m9 m10 29 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + wt [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 - [Lys ] m3 m4 m5 m6 + + + - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m7 + - m8 [Lys ] m9 (ou colonne par colonne) + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] m10 Analyse ligne par ligne : + Etc … Conclusion(s) 30 15 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 wt [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 - m9 - [Lys-] m10 Conclusion(s) On observe 5 groupes de complémentation fonctionnelle: m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 31 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) On observe 5 groupes de complémentation fonctionnelle: Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 Pour le mutant m6 on ne sait pas le positionner : soit il forme un 6ème groupe soit il appartient à de ces groupes ? Impossible de conclure 32 16 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 33 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 am1 am3 am9 bm2 cm4 cm7 dm5 dm9 am10 em8 34 17 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 am1 am3 am9 bm2 cm4 cm7 dm5 dm9 am10 em8 am1, am3 et am9 sont 3 allèles du gène a 35 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à un gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 am1 am3 am9 am1, am3 et am9 sont issus de 3 évènements mutationnels indépendants Par exemple am1 am3 * * Gène a am9 * am1, am3 et am9 sont 3 allèles du gène a Il faut déterminer la séquence du gène a chez les mutants m1, m3 et m9 pour positionner ces mutations 36 18 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à un gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 On a vu précédemment qu’un seul site muté était présent chez le mutant m1 également dans le mutant m2 mais qui ne touche pas le même gène : si on croise m1 avec m2 quels seront les phénotypes et génotypes des spores obtenues après méiose ? 37 Croisement du mutant 1 avec le mutant 2 Mutant1 [Lys-] X Mutant2 [Lys-] n am1 b+ a+ bm2 n am1 b+ 2n ? a+ bm2 [Lys+] Il y a eu complémentation fonctionnelle On s’est arrêté à cette étape pour réaliser un TCF 38 19 18/10/2023 Après méiose…. am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] On obtient au maximum ¼ de cellules [Lys+] 39 am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] 1/4 1/4 1/4 1/4 ¼ [Lys+] + ¾ [Lys-] Si ces proportions sont obtenues alors les gènes a et b sont génétiquement indépendants et sont sur le même chromosome mais éloignés l’un de l’autre ou sont portés par deux chromosomes différents (voir cours #4) 40 20 18/10/2023 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. n am1 b+ x a+ bm2 n 2n am1 b+ a+ bm2 Plus les sites sont proches plus la probabilité d’avoir une méiose avec un CO entre les 2 sites est faible méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ P=P1+P2 a+ bm2 am1 bm2 R=R1+R2 a+ b + P>R 41 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] P>>R Moins d’¼ [Lys+] Les gènes a et b sont génétiquement liés P>R: les proportions dépendront de la distance entre a et b 42 21 18/10/2023 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] P>>R Comment calculer cette distance ? 43 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] A partir des [Lys+] ! =R2 R=R1+R2, sachant R1 = R2 44 22 18/10/2023 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 Exemple: sur 1000 spores 10 sont [Lys+] et 990 sont [Lys-] [Lys+] méiose n n n n am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + P1 P2 R1 R2 [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] ? ? ? 10 A partir des [Lys+] ! 45 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. n am1 b+ x a+ bm2 n Fécondation am1 b+ a+ bm2 Pour trouver des spores recombinées il faut qu’au moins un CO se produise entre les allèles a et b 2n méiose am1 b+ 1 CO am1 b+ a+ bm2 a+ bm2 am1 b+ am1 bm2 a+ b+ a+ bm2 am1b+ P1 am1bm2 R1 a+b+ R2 a+bm2 P2 2/4 recombinées: Autant de P1 que de P2 Autant de R1 que de R2 46 23 18/10/2023 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] 1000 spores : 10 sont [Lys+] et 990 sont [Lys-] ? =980 ? P>>R 10 =20 10 47 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am1 b+ 2n a+ bm2 méiose n n n n P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys+] 1000 spores : 10 sont [Lys+] et 990 sont [Lys-] [Lys-] 490 [Lys-] 490 10 [Lys-] [Lys+] 10 =980 P>>R =20 Théoriquement 48 24 18/10/2023 Si les deux sites mutés sont portés par le même chromosome et qu’ils sont proches alors….. am b+ 2n a+ b m 1000 spores : 10 sont [Lys+] et 990 sont [Lys -] [Lys+] méiose n n n n D= P1 P2 R1 R2 am1 b+ a+ bm2 am1 bm2 a+ b + [Lys-] 490 [Lys-] 490 10 [Lys-] [Lys+] 10 =980 P>>R =20 20 x 100 R = 0,02 x 100 = 2% = 2 cM (centiMorgan) x 100 = 1000 P+R Distance fiable car <10% 49 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Groupe #1 Groupe #2 Groupe #3 Groupe #4 Groupe #5 m1 m3 m9 m2 m4 m7 m5 m9 m10 m8 Le mutant m9 est muté dans deux gènes (a et d) Þ Pourquoi ? 50 25 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s): deux possibilités Double mutation chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Gène a Gène d Groupe #1 Groupe #4 m1 m3 m9 m5 m9 m10 am1 am3 am9 dm5 dm9 dm10 am1 am3 * * Gène a am9 * dm5 dm10 * * dm9 * Gène d 51 Croisement du mutant 9 avec la souche sauvage Mutant 9 [Lys-] X Sauvage [Lys+] n am9 dm9 a+ d + n am9 dm9 2n ? a+ d + [Lys+] TDR : Les deux allèles sont récessifs par rapport à l’allèle sauvage 52 26 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 WT [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m2 m3 m4 m5 - m6 [Lys ] m7 - [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] m8 m9 - - [Lys-] m10 L’allèle du mutant m9 est récessif par rapport à l’allèle sauvage 53 Après méiose…. am9? dm9 2n a+ d + [Lys+] méiose n n n n P1 P2 R1 R2 a+ d + am9 dm9 a+ dm9 am9 d+ [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] Quelles proportions des cellules [Lys+] et [Lys-] ? 54 27 18/10/2023 Après méiose…. am9? dm9 2n a+ d + [Lys+] méiose Si ¾ de [Lys-] et ¼ de [Lys+] n n n n P1 P2 R1 R2 a+ d + am9 dm9 a+ dm9 am9 d+ [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] 1/4 1/4 1/4 1/4 2500 spores P1 = P2 => P=50% 2500 spores 2500 spores R1 = R2 => R=50% 2500 spores P=R Alors les deux sites mutés sont indépendants génétiquement 55 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Double mutation chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Gène a am9 * Gène a Gène d Gène d dm9 * am9 dm9 Les gènes a et d peuvent être sur deux chromosomes différents ou sur le même chromosome mais dans ce cas ils seront éloignés l’un de l’autre 56 28 18/10/2023 Hypothèse n°2 am9? dm9 2n a+ d + [Lys+] méiose Si ¾ de [Lys-] et ¼ de [Lys+] n n P1 a+ d+ [Lys+] =50% P2 am9 dm9 [Lys-] =50% 5000 spores 5000 spores Ségrégation 2:2 => 1 seul site muté Hyopthèse : m9 porte une délétion touchant a et d ? 57 Si dans le mutant m9 la mutation est une délétion touchant les gènes a et d alors ces 2 gènes sont proches Gène a Gène d Groupe #1 Groupe #4 m1 m3 m9 m5 m9 m10 am1 am3 am9 dm9 am1 am3 * * Gène a dm5 dm10 * * dm5 dm9 dm10 Gène d 58 29 18/10/2023 Comment le démontrer ? Calculer la distance génétique entre 2 sites muté dans a et dans d 59 Exemple analyser le croisement am1 x dm5 S’ils sont liés et proche alors … Gène a Gène d Groupe #1 Groupe #4 m1 m3 m9 m5 m9 m10 am1 am3 am9 dm9 am1 am3 * * Gène a dm5 dm10 * * dm5 dm9 dm10 Gène d 60 30 18/10/2023 Analyse du croisement am1 x dm5 Mutant 1 [Lys-] X Mutant 5 [Lys-] n am1d+ a+ dm5 n am1 d+ 2n ? a+ dm5 [Lys+] TDR : Les deux allèles sont récessives par rapport à l’allèle sauvage 61 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) m1 m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 + + + + + - + + + WT [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] m1 [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] m2 m3 m4 m5 m6 m7 m8 m9 m10 - [Lys ] + + + - + + [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys+] [Lys+] - [Lys ] + + [Lys ] [Lys+] [Lys-] [Lys-] [Lys-] 62 31 18/10/2023 Après méiose…. am1? d+ 2n a+ dm5 [Lys+] méiose n n n n P2 P1 R1 R2 a+ dm5 am1 d+ a+ d + am1 d+ [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys-] P1 = P2 => P>>50% (P = 2 x P1) R1 = R2 => R<<50% (R = (P+R)-P) P >> R Alors les deux sites mutés sont liés génétiquement et sont très proches sur le même chromosome 63 Exemple am1? dm5 2n a+ d + [Lys+] méiose n n n n P2 P1 R1 R2 a+ dm5 am1 d+ a+ d + am1 d+ [Lys-] On observe : [Lys-] - 20 spores [Lys+] + [Lys ] - 9980 spores [Lys-] [Lys-] 64 32 18/10/2023 Exemple am1? dm5 2n a+ d + [Lys+] méiose n n n n P2 P1 R1 R2 a+ dm5 am1 d+ a+ d + am1 d+ [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys-] 20 spores 20 spores R1 = R2 R= R1+R2 R = 40 spores 65 Exemple am1? dm5 2n a+ d + [Lys+] méiose n n n n P2 P1 R1 R2 a+ dm5 am1 d+ a+ d + am1 d+ [Lys-] [Lys-] [Lys+] [Lys-] P= N-R P= 9960 20 spores 20 spores R1 = R2 R= R1+R2 R = 40 spores P>>R => les sites muté sont liés génétiquement 66 33 18/10/2023 P>>R Conclusion : les sites mutés a et d sont liés génétiquement Et après … ? 67 P>>R Conclusion : les sites mutés a et d sont liés génétiquement Calcul de la distance entre a et d: R d(a-d)= ______ X 100 P+R d(a-d)= 40 _________ 10000 X 100 = 0,4 % (ou UR) < à 10% donc : d(a-d)= 0,4 cM 68 34 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Délétion chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Gène a Gène d Groupe #1 Groupe #4 m1 m3 m9 m5 m9 m10 am1 am3 am9 d(a-d) = 0,4 cM am1 am3 * * dm5 dm10 * * Gène a dm5 dm9 dm10 Gène d Distance très courte => les gènes a et d sont très proches 69 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Délétion chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Gène a Gène d Groupe #1 Groupe #4 m1 m3 m9 m5 m9 m10 am1 am3 am9 d(a-d) = 0,4 cM am1 am3 * * Gène a dm5 dm10 * * dm5 dm9 dm10 Gène d m9 : 1 seul site muté ET les gènes a et d sont proches => m9 délétion touchant les 2 gènes Distance très courte => les gène a et D sont très proches 70 35 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Délétion chez le mutant m9 touchant à la fois a et d am1 am3 am9 d(a-d) = 0,4 cM am1 am3 * * dm5 dm10 * * Gène a dm5 dm9 dm10 Gène d d(a-d) = 0,4 cM am1 am3 * * Gène a dm5 dm10 * * Gène d Délétion dans m9 m9 : 1 seul site muté ET les gènes a et d sont proches => hypothèse m9 délétion touchant les 2 gènes 71 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Peut-on trancher entre ces deux hypothèses ? Double mutation chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Délétion chez le mutant m9 touchant à la fois a et d Dans le cas d’une double mutation touchant des gènes indépendants génétiquement : il y aura théoriquement 25% de cellules sauvages Si les gènes sont liés génétiquement c’est plus compliqué en particulier pour deux gènes contigus. Dans les cas intermédiaires, cela va dépendre du degré de liaison génétique entre les deux gènes et donc de la proportion des phénotypes sauvages et mutants observés. 72 36 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Conclusion(s) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Cette mutagenèse a permis d’identifier au moins 5 gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la lysine chez S. cerevisiae « Au moins », car on est pas certain d’avoir identifié l’ensemble des gènes impliqués lors de cette mutagenèse. Si on était parti de 50 mutants au départ on aurait pu en trouver d’autres ! 73 EN CONCLUSION Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Buts du TCF : • Savoir si 2 mutants pour le même caractères sont mutés dans le même gène ou dans des gènes différents • Connaître le nombre minimum de gènes impliqués Conditions du TCF : • Les phénotypes des allèles mutants doivent être récessifs par rapport au phénotype de la souche sauvage 74 37 18/10/2023 EN CONCLUSION Tests génétiques après mutagenèse Question: Les mutants pour un même caractère sont-ils mutés dans le même gène ou des gènes différents ? Pour y répondre, 2 tests génétiques: • Test de dominance-récessivité (Test D/R) • Test de complémentation fonctionnelle (TCF) 75 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Chaque groupe de complémentation correspond à 1 gène Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Par contre Cette méthode ne permet pas de déterminer l’ordre dans laquelle ils agissent dans la voie de biosynthèse, ni leur localisation dans le génome 76 38 18/10/2023 Test de complémentation fonctionnelle (TCF) Gène a Gène b Gène c Gène d Gène e Quelle méthode utiliser afin de savoir si les gènes sont proches ou éloignés sur le génome ? Croiser les mutants entre eux et analyser les produits des méiose. 77 Ce test est applicable à d’autres vies de biosynthèse par exemple l’adénine chez la levure Saccharomyces cerevisiae 78 39 18/10/2023 Applications TD#6 79 40