CM 4 Methods UE EcoMic M1 IBE.pdf

LES METHODES D’ANALYSES 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS L’évolution des connaissances suit celle de la technique 1 er symposium EM 1 er manuel 1er Journaux AEM ‘omic era’ 1st ISME 1957 1966 1970 1974-76 time 1980 1990 nowadays 1998 Echelle d’étude monoxen...

LES METHODES D’ANALYSES 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS L’évolution des connaissances suit celle de la technique 1 er symposium EM 1 er manuel 1er Journaux AEM ‘omic era’ 1st ISME 1957 1966 1970 1974-76 time 1980 1990 nowadays 1998 Echelle d’étude monoxenic cultures Populations cultivables Communautés totales Relation diversité génétique - fonction Développements méthodologiques Isolement sur milieux de culture Epifluorescence…….Electronique……Confocal…. Microscopie Bio Génomique informatique PCR Biologie moléculaire Metagénomique ADN environnemental Metatranscriptomique ARN environnemental Metaproteomique Protéines environnementales 11 février 2020 Fonctionnalité/structure Lerch fonctionnelle - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS bia omicro ia Verruc myd Chla 3 OP s ete s ete ia myd Chla yc tom yc tom nc a Pl c an Pl ia ter + ram CG an + Cy wG Lo ter obac Fibr Act ino bac teri Green a non su fur lfur Green su Cytophagales Thermu s/Deino coccus Spir oche tes s ale tog rmo The es ia ter + am Gr an C y + C wG Lo ter obac Fibr upA r eg o Marin lfur Green su Cytophagales WS Act 1 ino bac Green teri non su a fur OP5 OP9 lomus Dictyog ter obac therm o r p s Co ale um t og eri rmo act e b h T lfo es esu al od m fic r i e u Th Aq Thermu s/ Deinoco ccus Spir oche tes TM 6 WS 6 7 ria TM cte ba a so teri Fu bac teo Pro ria cte ba a so teri Fu bac teo Pro al ic uif Aq ac ob 10 OP ac ob OS-K Nitrospira Acidoba cterium OP8 Termite g roup1 S Fl yner ex ist gites ipe s Apport de la biologie moléculaire OP 11 Archaea Archaea 90% des espèces cultivées 1987 1998 Hugenholtz et al. (1998) J. Bacteriol. 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Et depuis 10 ans.. 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Qu’est que l’on veut évaluer ? Communautés Evaluer les fonctions : • fonctions, activités • globales, spécifiques • réelles, potentielles Fonctions 11 février 2020 Évaluer les populations • globales, spécifiques • taille, diversité Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Observation et Microscopie 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Dénombrements directs • Cultures en milieu solide ou liquide après ensemencement avec des suspensions dilutions de sol • Postulat : chaque germe donne une colonie • Problème : VNC < 1-0,1% ? 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Dénombrements au microscope • Étalement sur lame d’un échantillon de sol • Coloration et comptage au microscope (DAPI…) 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Mesure d’activité microbienne • Fonctions particulières • Minéralisation du C • Minéralisation de N • Mesures de minéralisation d’un substrat apporté (SIR) 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Mesures isotopiques du 13C Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14 (6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N) Isotope Radioactif Isotopes Stables La mesure du rapport 13C/12C permet de connaître la source de carbone utilisée 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Mesure du rapport • 13C/12C = 0.011225 • 13C/12C = 0.011071 • 13C/12C = 0.010918 13C/12C en IRMS R. Doucett • Les rapports sont exprimés en delta (d) : 13C/12C sample d13Csample = 11 février 2020 - 13C/12Cstandard x 1000 13C/12C standard Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS L’activité métabolique Biolog® Ecoplate 1. Inoculation des puits contenant 31 substrats carbonés différents avec une suspension de microorganismes pures ou en mélange 2. Incubation de microtitration à 30°C la plaque de 3. Lecture spectrophotométrique périodique à =595 nm pour suivre le développement de la couleur du fait de la réduction du sel de tétrazolium en sel de formazan (composé rouge) Schéma MP Charnay 11 février 2020 Lerch - IEES Paris 4. Estimation microbienne M1 STAEE parcours OMICS de la biodiversité Mesure du Carbone microbien Mesure du supplément de carbone ou d'azote minéralisé ou extractible dans un traitement fumigé Chloroforme (CHCl3) par rapport au traitement témoin (non fumigé) C-biomasse = Corg extrait(fum) - Corg extrait (non fum) Kc Kc = 0.48 (Zagal, 1993) 11 février 2020 Lerch - IEES Paris -> mg C biomasse /kg sol M1 STAEE parcours OMICS Les empreintes moléculaires 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS PLFA (PhosphoLipid Fatty acid Analysis) 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Mesure de biomarqueurs lipidiques • Analyse in situ : pas de mise en culture • Indicateurs quantitatifs de la biomasse • Informations sur la biodiversité • Informations la physiologie Bicouche lipidique d’une membrane cellulaire 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La biologie moléculaire • Mise en place de techniques d’études des acides nucléiques: la PCR dans les années 1980 • Développement des protocoles d’extraction d’acides nucléiques (ADN, ARN) à partir d’échantillons de sol 11 février 2020 Lerch - IEES Paris 1- dénaturation 2- Hybridation 3- Elongation M1 STAEE parcours OMICS PCR 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS qPCR Phase plateau Phase linéaire Phase exponentielle 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Les gènes d’étude de la diversité • gène codant ARNr 16S • Espace intergénique (ITS) Gènes très conservés Pas de transfert de gène horizontal Bases de données de plus en plus riches 16S 11 février 2020 ITS Lerch - IEES Paris 23S M1 STAEE parcours OMICS 5S DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La structure des communautés microbiennes: DGGE • DGGE – Gel d’électrophorèse en gradient de dénaturation • TGGE – Gel d’électrophorèse en gradient de température 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La structure des communautés microbiennes : DGGE Exemple: Impact des HAP sur la structure des communautés de Mycobacterium. • Extraction de l’ADN du sol • PCR avec amorces ciblant les Mycobacterium • DGGE Cheung et al, 2005 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La structure des communautés microbiennes : TRFLP • RFLP – Restriction fragment length polymorphism •T-RFLP – Terminal Restriction fragment length polymorphism 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La structure des communautés microbiennes: TRFLP Exemple: Impact de la diversité des plante sur la structure des communautés de mycchorizes • Extraction de l’ADN du sol • PCR avec amorces marquées avec fluorochromes et ciblant les mycchorizes • Restriction • Electrophorèse capillaire Jonhson et al, 2003 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La structure des communautés microbiennes RISA – Ribosomal Intergenic Spacer Analysis • Extraction ADN • PCR ciblant l’ITS (espace intergénique entre 16S et 23S) • Séparation sur gel Exemple: Impact des vers de terre sur la structure des communautés microbiennes Kersanté et al, 2006 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS La diversité des microorganismes • Clonage, séquençage, analyses phylogénétiques Plasmide (vecteur) Transformation dans bactérie compétente ADNr 16s (PCR) ligation Comparaison avec base de données, construction d’arbres phylogénétiques 11 février 2020 Lerch - IEES Paris Séquençage de l’insert Criblage Etalement sur un milieu de culture particulier M1 STAEE parcours OMICS L’abondance des microorganismes • PCR quantitative (qPCR): quantification d’un gène ciblé 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS L’activité des microorganismes ADN: présent dans bactéries actives, dormantes, mortes, extracellulaire ARN: uniquement synthétisé par les bactéries actives dans le sol, quantité liée à l’activité de la bactérie • RT-PCR • RT-qPCR ARN 11 février 2020 Transcription reverse ADN complémentaire Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS PCR / qPCR La fonction des microorganismes Mêmes techniques mais en ciblant un gène fonctionnel avec des amorces spécifiques au cours de la PCR: • qPCR / RT-qPCR • Séquençage Exemple: Expression des gènes de dégradation de l’atrazine chez Pseudomonas sp. ADP 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Identification in situ FISH – Fluorescent in situ hybridation Eickhorst and Tippkötter, 2008 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Un nouvel enjeu: relier diversité et fonction par approche SIP Stable-Isotope Probing: ADN, ARN, PLFA Substrat marqué isotope stable 13C – 15N Microorganisme s de l’écosystème 12C-ARN 12C-ARN 13C-ARN Ultracentrifugation 13C-ARN 13C-ARN 12C-ARN Extraction ADN ou ARN 13C-ARN Extraction PLFA 13C-ARN 12C-ARN 13C-ARN 12C-ARN PCR / RT-PCR Analyses phylogénétiques 11 février 2020 Lerch - IEES Paris Incorporation isotope stable dans système cellulaire M1 STAEE parcours OMICS Un nouvel enjeu: relier diversité et fonction Stable-Isotope Probing -ARN Exemple: Bactéries dégradant l’atrazine 13C dans des galeries de vers de terre αProteobacteria γ-Proteobacteria β-Proteobacteria 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS NGS 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Pas si vieux! 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Banque de clones : l’ancêtre 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Applications des NGS ARN ADN Génome entier ADN codant Genome de novo ADN immunoprécipité ADN méthylé ARN immunoprécipité ARN Non codant ARNm Mutations/SNP RNASeq ExomeSeq miARN Small RNASeq ClipSeq ChipSeq Séquençage de novo Reséquençage Séquençage d’ARN MeDIPSeq BisulfiteSeq Interactions ARN/protéines Interactions ADN/protéines Méthylation De l’ADN 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Pour quels questions? 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Metabarcoding 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS RNA seq 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Whole genome shotgun 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Microarray 11 février 2020 Lerch - IEES Paris M1 STAEE parcours OMICS Exemple de comparaison entre méthodes Caractérisation de communautés microbiennes d’un sol agricole soumis à différents types de fertilisation Site experimental de longue durée (1956) d’Ultuna (Uppsala, Suède) A B C F H J O L I Sol nu Sol cultivé Nitrate de calcium Paille Engrais vert Fumier Boues (STEP) Sciure de bois Tourbe Lerch, 2010 Thomas Lerch – M1 STA2E-IBE - UPEC Propriétés physico-chimiques des sols Soils treatments Code Total C Total N (mg g-1 soil) (mg g-1 soil) C/N pH Bare fallow A 9.8±0.4 g 1.06±0.04 h 9.2±0.1 f 6.1 ± 0.2 c Unfertilised B 11.1±0.2 f 1.18±0.02 g 9.4±0.2 e 6.2 ± 0.1 c Ca(NO3)2 C 14.0±0.6 e 1.45±0.04 f 9.6±0.1 d 6.7 ± 0.1 a Straw F 16,1±0,9 d 1,56±0,08 e 10,4±0,1 b 6,4±0,1 b Straw+ Ca(NO3)2 G 19,8±0,8 c 1,87±0,06 c 10,6±0,1 a 6,6±0,1 a Green manure H 16.9±0.3 d 1.73±0.03 d 9.8±0.1 d 6.1 ± 0.1 c Farmyard manure J 23.0±0.4 b 2.27±0.01 b 10.1±0.1c 6.5 ± 0.2 ab Sewage sludge O 28.6±0.9 a 3.08±0.09 a 9.3±0.03 ef 4.9 ± 0.1 d DGGE 25% 23% 11% PLFA TRFLP O J O F O G 65% 39% 31% G F B F H H J B J G H B 25% 22% Phylum Class 27% P<0.001 P<0.001 P<0.001 Order H J J H F J 59% 58% 56% G F O G F G B O B H O B Genus 27% 28% Family P<0.001 P<0.001 27% P<0.001 Species O H F J G F H 55% 51% 55% F B H O B J G O B P<0.001 P<0.001 P<0.001 G J Fingerprinting Soils treatments PLFA DGGE b Amplicon Sequençing T-RFLP 45±2 a Phylum Class Family Genus Species 201±3 676±28 b Ca(NO3)2 16±1 23±1 b 46±3 a 17±1 bc 40±1 bc 83±1 c 127±1 cd 206±3 709±10 ab Straw 17±2 26±2 a 44±3 a 16±1 c 38±2 c 84±1 bc 131±2 bc 207±7 713±27 ab Straw+ Ca(NO3)2 16±1 27±2 a 46±4 a 19±1 a 44±1 a 89±3 a 134±3 ab 209±6 755±56 a Green manure 16±1 19±1 c 48±2 a 18±1 ab 43±2 ab 81±3 c 124±4 d 194±13 619±29 c Farmyard manure 15±1 26±2 a 38±5 b 18±2 ab 44±3 a 89±3 a 137±2 a 214±6 738±20 a Sewage sludge 16±1 21±3 b b c 202±3 705±11 ab P value 0.66 0.021 0.062 0.002 0.011 17±2 0.029 44±3 0.015 0.025 Fingerprinting Soils treatments PLFA de DGGE T-RFLP Phylum 55±1 Ca(NO3)2 58±2 bcd 72±3 ab 59±5 c 38±3 a Straw 60±2 a 71±5 ab 63±1 abc Straw+ Ca(NO3)2 58±1 abc 77±4 60±2 129±2 0.006 Amplicon Sequençing Unfertilised a 85±4 abc 131±3 bc 21±2 a 85±4 abc 16±1 abc 43±3 Order ab Unfertilised 35±4 19±1 a bc 33±3 b Class 26±3 Order cd Family c Genus 14±2 Species b 10±1 c 23±2 18±2 31±1 a 26±1 22±2 b 16±1 b 17±4 b 32±1 b 24±1 cd 26±2 21±2 bc 16±1 b 13±3 c 68±2 ab 63±2 abc 28±3 b 22±2 d 24±2 22±2 b 16±2 b 18±3 ab 57±1 cde 66±3 b 68±3 a 30±2 b 22±2 d 23±3 21±2 b 16±2 b 10±1 c 60±2 ab 57±2 c 65±6 ab 32±4 b 27±1 bc 27±1 27±2 a 20±2 a 21±1 a Sewage sludge 54±1 e a ab b 13±1 c P value 0.002 Green manure Farmyard manure 67±2 b 0.009 55±2 d <0.001 41±4 <0.001 30±3 <0.001 bc 23±2 19±1 0.209 0.004 16±1 0.022 <0.001 Fingerprinting PLFA DGGE T-RFLP C 0.04 0.05* 0.06* N 0.43** 0.19*** 0.25*** pH 0.14* 0.11** 0.09** C/N 0.02 0.37*** 0.08** C*N 0.10* 0.04* 0.18*** C*pH 0.02 0.08** 0.05* N*pH 0.01 0.01 0.02 C*C/N 0.01 0.01 0.03 pH*C/N 0.01 0.01 0.01 C*N*pH 0.01 0.03 0.02* C*N*C/N 0.01 0.01 0.02 C*pH*C/N 0.01 0.00454 0.01 C*N*pH*C/N 0.01 0.01 0.02* Treatments 0.69*** 0.71*** 0.70*** Phylum 0.05 0.17** 0.19*** 0.06 0.18** 0.03 0.02 0.01 0.01 0.01 0.02 0.03 0.01 0.73*** Amplicon Sequençing Class Order Family Genus 0.14* 0.09* 0.09* 0.06* 0.02 0.18*** 0.17*** 0.18*** 0.06 0.12* 0.08* 0.08* 0.05 0.09* 0.07* 0.09** 0.11* 0.13** 0.12** 0.10** 0.08 0.05 0.06 0.11** 0.02 0.06 0.06 0.04 0.02 0.04 0.04 0.04 0.03 0.04 0.04 0.03 0.04 0.04 0.03 0.11* 0.05 0.02 0.02 0.02 0.01 0.01 0.01 0.02 0.01 0.01 0.02 0.02 0.63*** 0.61*** 0.62*** 0.65*** Species 0.08** 0.19*** 0.09** 0.07** 0.13*** 0.09** 0.03 0.03 0.03 0.02 0.03 0.02 0.02 0.77***