Biología Molecular (BIOQ 1043) 2023 - CLASE 1 PDF

BIOQ 1043 2023 Dr. Andrea Rivas Aravena [email protected] Unidad de aprendizaje 1 Estructura y propiedades de los ácidos nucleicos Analiza la composición química y las estructuras que adquieren los ácidos nucleicos en los seres vivos, de acuerdo a las funciones...

BIOQ 1043 2023 Dr. Andrea Rivas Aravena [email protected] Unidad de aprendizaje 1 Estructura y propiedades de los ácidos nucleicos Analiza la composición química y las estructuras que adquieren los ácidos nucleicos en los seres vivos, de acuerdo a las funciones que estos desempeñan.  MATERIAL GENÉTICO 1) ADN como material genético: Experimento Griffith, transformación de una sustancia desconocida 1928. 2) Avery, MacLeod, McCarty, 1944, ADN como agente de transformación. 3) Al Hershey and Martha Chase, 1952. Refuerza que ADN es el material genético.  MATERIAL GENÉTICO 1) ADN como material genético: Experimento Griffith, transformación de una sustancia desconocida 1928. 2) Avery, MacLeod, McCarty, 1944, ADN como agente de transformación. 3) Al Hershey and Martha Chase, 1952. Refuerza que ADN es el material genético.  En 1928, el bacteriólogo británico Frederick Griffith llevó a cabo una serie de experimentos utilizando ratones y la bacteria Streptococcus pneumoniae. Griffith no estaba tratando de identificar el material genético, sino más bien, estaba tratando de desarrollar una vacuna contra la neumonía. En sus experimentos, Griffith utilizó dos cepas de bacterias relacionadas, conocidas como R y S. Streptococcus pneumoniae: Cepa R y S Cepa R. Cuando se cultivaron en una placa de Petri, las bacterias R forman colonias, o grupos de bacterias relacionadas, con bordes bien definidos y una apariencia rugosa (en ingles Rough, de ahí la abreviatura "R"). Las bacterias R no eran virulentas, lo que significa que no causaban enfermedad cuando se inyectaban en un ratón. Cepa S. Las bacterias S forman colonias redondeadas y lisas (en ingles Smooth, de ahí la abreviatura "S"). La apariencia suave se debe a un recubrimiento de polisacárido producido por la bacteria. Esta capa protege a las cepa S del sistema inmunológico del ratón, haciéndolas virulentas (capaces de causar enfermedades). Los ratones inyectados con bacterias S vivas desarrollan neumonía y mueren. Experimento de F. Griffith Experimento de F. Griffith Experimento de F. Griffith Observación y Conclusiones experimento de F. Griffith Se observo en la sangre de los ratones presencia de la cepa S. Griffith concluyó que las bacterias de la cepa R deben haber adoptado lo que él llamó un "principio de transformación" de las bacterias S muertas por calor, lo que les permitió "transformarse" en bacterias de capa suave y volverse virulentas. El factor transformante tenia información para producir un carácter heredable en las cepas R. Material genético 1. ADN como material genético: Experimento de Griffith (1928), transformación de una sustancia desconocida. 2. Avery, MacLeod, McCarty (1944), ADN como agente de transformacion. 3. Al Hershey y Martha Chase (1952), refuerzan que el ADN es el material genético.  En 1944, tres investigadores canadienses y estadounidenses, Oswald Avery, Maclyn McCarty y Colin MacLeod, se propusieron identificar el "principio transformador" de Griffith. Para hacerlo, comenzaron con grandes cultivos de células S muertas por calor y, a través de una larga serie de pasos bioquímicos purificaron progresivamente el principio transformador. Ellos pudieron obtener pequeñas cantidades del principio transformador altamente purificado, que luego pudieron analizar mediante otras pruebas para determinar su identidad. Experimento de Avery, MacLeod, McCarty Conclusiones experimento de Avery, MacLeod, McCarty Todos estos resultados apuntaban al ADN como el probable principio transformador. Sin embargo, Avery fue cauteloso al interpretar sus resultados. Se dio cuenta de que todavía era posible que alguna sustancia contaminante presente en pequeñas cantidades, no ADN, fuera el principio transformador real. Debido a esta posibilidad, el debate sobre el papel del ADN continuó hasta 1952, cuando Alfred Hershey y Martha Chase utilizaron un enfoque diferente para identificar de manera concluyente al ADN como material genético.  MATERIAL GENÉTICO 1) ADN como material genético: Experimento Griffith, transformación de una sustancia desconocida 1928. 2) Avery, MacLeod, McCarty, 1944, ADN como agente de transformación. 3) Alfred Hershey and Martha Chase, 1952. Refuerza que ADN es el material genético. 1952 Experimento de Hershey y Chase Para establecer si el fago inyectó ADN o proteína en la bacteria, prepararon dos lotes diferentes de fagos marcados con un elemento radiactivo específico, que se incorporó a las macromoléculas (ADN y proteína) que componían el fago. Una muestra se produjo en presencia de 35S, un isótopo radiactivo del azufre. El azufre se encuentra en muchas proteínas y está ausente en el ADN, por lo que solo las proteínas del fago fueron marcadas radiactivamente por este tratamiento. La otra muestra se produjo en presencia de 32P, un isótopo radiactivo del fósforo. El fósforo se encuentra en el ADN y no en las proteínas, por lo que solo el ADN del fago (y no las proteínas del fago) se marcó radiactivamente con este tratamiento. Experimento de Hershey y Chase Conclusiones experimento de Hershey y Chase Sobre la base de este y otros experimentos similares, Hershey y Chase concluyeron que se inyectaba ADN, no proteína, en las células huésped, y por ende el ADN constituía el material genético del fago. Se refuerza y confirma la noción que el ADN y no las proteínas, es el material genético https://explorebiology.org/videos/dna-transformation-experiment https://explorebiology.org/videos/hershey-chase-experiment  Preguntas restantes El trabajo de los investigadores anteriores proporcionó una fuerte evidencia del ADN como material genético. Sin embargo, todavía no estaba claro cómo una molécula tan aparentemente simple podría codificar la información genética necesaria para construir un organismo complejo. Investigaciones adicionales de muchos científicos, incluidos Erwin Chargaff, Linus Pauling, James Watson, Francis Crick y Rosalind Franklin, llevaron al descubrimiento de la estructura del ADN, aclarando cómo el ADN puede codificar grandes cantidades de información.  Composición bases Erwin Chargaff (1951) Chargaff analizó el ADN de diferentes especies y analizó su composición de bases. A, T, C y G no se encontraban en cantidades iguales. La cantidad de bases variaba entre especies, pero no entre individuos de la misma especie. La cantidad de A siempre era igual a la cantidad de T y la cantidad de C siempre era igual a la cantidad de G. Estos descubrimientos, llamados reglas de Chargaff, resultaron cruciales para el modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN.  BIOQ 1043 BIOLOGÍA MOLECULAR UNIDAD 1: Clase 2 PROF. Andrea Rivas El dogma central de la Biología Es un concepto que ilustra los mecanismos de transmisión y expresión de la herencia genética tras el descubrimiento de la codificación de ésta en la doble hélice de ADN. Propone que existe una unidireccionalidad en la expresión de la información contenida en los genes de una célula, es decir, que el ADN es transcrito a ARN mensajero y que este es traducido a proteína, elemento que finalmente realiza la acción celular. El dogma central de la Biología El dogma central de la Biología  Función ácidos nucleicos AND Material genético – secuencia de nucleótidos que codifica para diferentes aminoácidos. ARN Involucrado en la transcripción/traducción del material genético (ADN). Ácidos nucleicos: ARN vs ADN Estructura nucleótidos Los ácidos nucleicos están compuestos por 4 nucleótidos. Por lo tanto la diversidad es dependiente de la secuencia nucleotidica. Todos los nucleótidos son 2 estructuras de anillos compuestas de: Azúcar de 5 carbonos: b-D-ribosa (ARN) b-D-deoxiribosa (ADN) Base: Púrica Pirimidinica Grupo fosfato: Un nucleótido sin grupo fosfato es un NUCLEÓSIDO Estructura nucleótidos - Azúcar HOCH2 OH Estructura genérica ribosa O Ribosa 5’ HOCH2 O OH OH 4’ 1’ 3’ 2’ HOCH2 OH O Deoxiribosa OH H Estructura nucleótidos – Bases Nitrogenadas - Púricas NH2 Adenina N N A N N N H 7 5 6 1 N 8 9 4 3 2 O N N N NH G Guanina N N NH2 H Estructura nucleótidos - Bases Nitrogenadas - Pirimidínicas O H3 C Timina NH T N O 3 4 5 N H 2 6 NH2 1 N N C Citosina N O H Estructura nucleótidos - Bases - Pirimidínicas O Timina es encontrada solo en el ADN. H3 C En el ARN la timina es reemplazada por uracilo. NH Uracilo y Timina son de estructuras similares. T N O H Uracilo O 3 4 N NH U 5 2 6 1 N N O H Estructura nucleótidos - Grupo fosfato Trifosfato O O O ej. ATP O P O P O P O CH2 No existe forma libre O O O  Estructura nucleótidos Base-azúcar-fosfato 4 3 5N 2 6 O 1 N 5’ O P O C O O 4’ 1’ 3’ 2’ OH Monofosfato gamma beta alfa  Función ácidos nucleicos ADN Material genético – secuencia de nucleótidos que codifica para diferentes aminoácidos. ARN Involucrado en la transcripción/traducción del material genético (ADN). AZÚCARES BASES NITROGENADAS ARN ADN https://www.youtube.com/watch?v=zo6QxDfO8Zo Monómeros Polímero 109 bases Formación del enlace fosfodiester Estructura acido nucleico Nucleótido Azúcar - fosfato “esqueleto” Estructura ácidos nucleicos Apareamiento de bases ARN (normalmente) existe como polímero de hebra simple. ADN existe como un polímero de doble hebra. ADN de doble hebra es creado por puentes de hidrogeno entre los nucleótidos. Los nucleótidos siempre interaccionan con un nucleótido complementario. Composición bases Erwin Chargaff (1951) Analizó la composición de las bases nitrogenadas del ADN en diferentes organismos, concluyendo que, la cantidad de purinas siempre se encontraban en proporciones iguales a las de las pirimidinas Reglas de Chargaff 1. La composición de bases del ADN varia de una especie a otra. 2. Las muestras de ADN aisladas a partir de tejidos diferentes de la misma especie tienen la misma composición de bases. 3. La composición de bases del ADN de una especie no varia con la edad del organismo, ni con el estado nutricional, ni con las variaciones ambientales. 4. La proporción de A = T y C = G 5. La suma de los residuos de purina es igual a la suma de los residuos de pirimidinas, es decir que A+G = C+T Difracción rayos X del ADN Rosalind Franklin y Maurice Wilkins (1952) Tomo fotografías del ADN mediante la técnica de difracción de rayos X donde la fotografía 51 demostró que la molécula de ADN tenia una estructura en forma de hélice. 1 Voluntario  Máximo 3 Diapositivas 5 minutos de presentación Experimento de Rossalin Franklin Qué es la difracción de rayos x Conclusiones 2 puntos control 1 Hélice mantenida por puentes de hidrógeno (proteínas) Linus Pauling (1901-1994) Estructura ácidos nucleicos Apareamiento de bases Bidireccionalidad COMPLEMENTARIEDAD  Considerando que 1) el ADN era una molécula grande, muy larga y delgada. 2) los datos de las bases proporcionados por Chargaff (A=T y C=G; purinas/pirimidinas=k para una misma especie). 3) los datos de la difracción de los rayos-x de Franklin y Wilkins (King's College de Londres). 4) los trabajos de Linus Pauling sobre proteínas (forma de hélice mantenida por puentes hidrógeno), quién sugirió para el ADN una estructura semejante. Watson y Crick proponen modelo doble hélice ADN, 1953 James Dewey Watson, biólogo estadounidense (1928- ) 96 años. Francis Crick, Biofísico, biólogo molecular británico (1916-2004) Premio nobel de Fisiología o Medicina 1962, junto a Wilkins.  Características doble hélice Modelo Watson y Crick: 1. Existen dos cadenas de polinucleótidos enrolladas alrededor de un eje común, formando una doble hélice. 2. Las dos cadenas del ADN son antiparalelas (es decir, transcurren en direcciones opuestas), pero cada una forma una hélice dextrógira. 3. Las bases ocupan el centro de la hélice y las cadenas de azúcares y fosfatos se sitúan en el exterior. Esto minimiza las repulsiones entre los grupos fosfato cargados. La superficie de la doble hélice contiene dos hendiduras de ancho desigual: los surcos mayor y menor. 4. Cada base interacciona por puentes de hidrógeno a una base de la hebra opuesta, para formar un par de bases plano. Cada residuo de adenina debe formar pareja con un residuo de timina y viceversa, y cada residuo de guanina debe aparearse con un residuo de citosina y viceversa. Estas interacciones por puentes de hidrógeno, conocidas como apareamiento de bases complementarias, da como resultado la asociación específica de las dos cadenas de la doble hélice. Distancia entre bases Aprox. 10 nt por vuelta: 3,4 nm  Estructura del ADN tipos de hélices Forma B es la mas estable en condiciones fisiológicas. Hay datos a favor de la presencia de Disoluciones relativamente zonas de ADN Z en procariotas y pobres en agua. surco mayor eucariotas. Estas regiones pueden más profundo y surco menor participar en la regulación de la expresión más superficial. de algunos genes o en la recombinación. Estructura del ADN tipos de hélices 2,8nm 2,8 nm 3,4 nm 4,5 nm 10 Inclinado Perpendicular Zig-Zag BIOQ 1043 BIOLOGÍA MOLECULAR UNIDAD 1: ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS CLASE 3: Topología, Superenrrollamiento, Topoisomerasas Andrea Rivas ¿Cuánto mide el ADN humano? Humano: 3,2 millones de bases – 2 metros. Célula: 10-30 𝞵m = 10-30 x 10-6 m Cómo meter dos metros de ADN en 0,01 milímetros? https://www.youtube.com/watch?v=4pc3aEqcHF8 Topología del ADN Estructura tridimensional del genoma ADN lineal Asociado a proteínas ADN se empaqueta en cromosomas Estructura del genoma - Cromatina La cromatina está formada por ADN y las proteínas que lo empaquetan. La doble hélice de ADN esta enrollada alrededor de un octámero de histonas. Alrededor de 146 pares de bases se envuelve a un único octámero de histonas (Nucleosoma). Los nucleosomas se empaquetan en fibras de 30 nm. La cromatina es una estructura dinámica que adapta su estado de compactación y empaquetamiento para optimizar procesos de replicación, transcripción y reparación del ADN. Estructura del genoma Tipos de Cromatina Heterocromatina Eucromatina Cromatina que permanece Cromatina que es menos altamente condensada durante la condensada durante la interfase interfase y NO ES activamente ES activamente transcrita. transcrita. Se vuelve altamente condensada durante la mitosis. Niveles de organización de la cromatina Niveles de organización de la cromatina Collar de perlas (nucleosoma, 11 nm) Fibras 30 nm Nucleosoma Estructura Nucleosoma Modificaciones Postraduccionales Histonas ADN linker – Histona H1  Solenoide o zigzag ADN linker – Histona H1 Entre cada nucleosoma hay aproximadamente 50 pb de ADN enlazador. La histona H1 se une al ADN enlazador contribuyendo en la compactación de los nucleosomas. Se ensamblan seis nucleosomas en un solenoide en asociación con histonas H1. Dos modelos de fibra Fibra 30 nm Eucromatina/Heterocromatina Que pasa en las bacterias? Las bacterias no poseen histonas. ADN circular El ADN bacteriano o el ADN mitocondrial, presentan una estructura terciaria, que consiste en que la fibra de 20 Å se retuerce sobre si misma formando una especie de superhélice. Esta disposición se denomina ADN superenrollado. Superenrollamiento Compactación DNA bacteriano Topoisomerasas Enzimas isomerasas Pueden cortar o formar enlaces fosfodiester ya sea en una de las hebras (topoisomerasa I) o en las dos (topoisomerasa II) que forman el ADN. Deshace el superenrollamiento negativo (I y II) o introduce superenrollamiento positivo (II girasa). Dado esto estas enzimas actuan en la topologia del ADN. De esta manera se permite el acceso a la cadena de ADN a todas las enzimas involucradas en la replicación. Mecanismo ADN Topoisomerasa I Actúa en una sola hebra Ruptura: unión 3’-fosfotirosil. Unión: 5’-hidroxil ataca grupo fosfato Mecanismo ADN Topoisomerasa I No requiere ATP Es monomérica  Mecanismo ADN Topoisomerasa II Requiere ATP Mecanismo ADN Topoisomerasa II Homodímero/ATP Ruptura transitoria de las dos hebras. Unión covalente 5’.fosfotirosil (ambos monomeros)  https://www.youtube.com/watch?v=T06lo8T8Pmw https://www.youtube.com/watch?v=wQ5oPL0PqYE Mecanismo ADN Topoisomerasa II Cada extremo pasa por un lado distinto de la helice intacta volviendo a sellar al otro lado.  Las toposisomerasas de tipo II pueden deshacer el superenrollamiento negativo o introducir superenrollamiento positivo (girasa) en procariontes. En eucariontes no pueden introducir superenrollamiento. Compactación del ADN en procariontes BIOLOGÍA MOLECULAR UNIDAD 1: ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS CLASE 4: Estructura ARN, Denaturación ADN, Andrea Rivas Aravena Denaturación de ácidos nucleicos DENATURACIÓN DE LA DOBLE HEBRA DE ADN Absorbancia de lez UV por ácidos nucleicos Determinación de la concentración de los ácidos nucleicos a 260 nm Absortividad molar media de ácidos nucleicos a longitud de onda de 260 nm: ADN bicatenario es de 0,020 (μg/ml)-1 cm-1, ADN monocatenario es de 0,027 (μg/ml)-1 cm-1, ARN monocatenario es de 0,025 (μg/ml)-1 cm-1 Así, una Absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/ml para el ADN bicatenario. Espectro de absorción del ADN Efecto hipercromico por denaturación del ADN Temperatura de melting Contenido de GC vs Tm Contenido de GC vs Tm Fuerza ionica El efecto de la fuerza iónica es unreflejo de otra característica fundamental de la hélice doble. Las columnas de sostén de las dos cadenas de DNA contienen grupos fosforilo que portan uma carga negativa. Estas cargas negativas de las cadenas enfrentadas están tan cerca que, si no se aíslan, tienden a causar que las cadenas se repelan entre sí, lo que facilita su separación. Con una fuerza iónica elevada, las cargas negativas están aisladas por cationes, lo que estabiliza la hélice. Por el contrario, con una fuerza iónica baja, las cargas negativas no aisladas toman la hélice menos estable.  pH Las bases nitrogenadas son bases débiles, pueden desprotonarse a un pH entre 9 y 10, por lo tanto a un pH intracelular no poseen una carga eléctrica significativa. Los grupos ceto (C=O) pueden tautomerizar a enol (C–OH), lo que les permite perder un protón y adquirir cierta acidez. La adenina, al no tener grupos ceto, es la más básica de todas. En cambio, el ácido úrico posee carácter ácido debido a sus tres grupos ceto. Denaturación/Renaturación Disminución de temperatura. Aumento concentración iónica. Neutralización pH. Otros factores vs Tm Hidrolisis alcalina del ARN Hidrólisis lenta mediada por los OH-de los enlaces fosfodiéster Tipos de ARN Estructura secundaria y terciaria del ARN Estructura secundaria y terciaria del ARN Horquillas: apareamientos por complementariedad. 5-10 nucleótidos o más. Pueden haber nucleótidos no apareados. Bucles: de >10 a cientos de bases. Algunas características Las doble hélices que se forman no tienen estructura similar al DNA-B por la presencia del 2'OH. Pueden haber apareamiento de bases no convencionales Por lo tanto hay más capacidad de ser autocomplementario Estructura secundaria y terciaria del ARN Estructura secundaria del ARN La estructura secundaria del ARN está compuesta principalmente por regiones de ARN de doble cadena originadas por plegamiento de la molécula lineal sobre si misma. Al combinarse regiones de simple y doble cadena, la energía acumulada en las bases apareadas incrementa la estabilidad de la molécula mientras que las bases libres la desestabilizan La estructura secundaria del ARN es la intermediaria entre la molécula lineal y la estructura tridimensional. Stem Loops (Hairpins) Al menos 3 bases libres para evitar el impedimento estérico con las bases que forman el tallo. Bulge Loops (Encorvado) Ocurre cuando las bases de un lado de la estructura no pueden aparearse. Interior loop Ocurren cuando a ambos lados de la estructura, quedan bases libres. Junctions (Multiloops) Dos o más regiones de doble cadena convergen para formar una estructura cerrada. Estructura terciaria Interacciones terciarias Kissing Hairpins Bases desapareadas de dos hairpin loops separados entre sí por pares de bases. Interacciones terciarias Pseudoknots Hairpin-Bulge Pseudoknots Estructura terciaria Ribozimas  CONDENSACIÓN/COMPACTACIÓN Superenrollamiento Empaquetamiento Histonas Topoisomerasas Proteínas no histonicas