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ANTIVIRALI Antivirali  Virus Parassiti intracellulari obbligati Possibile produzione di virioni sfruttando la cellula ospite per progenie Piccole dimensioni (0.02-0.4 µm) Costituiti da materiale genetico formato da un solo acido nucleico (RNA...

ANTIVIRALI Antivirali  Virus Parassiti intracellulari obbligati Possibile produzione di virioni sfruttando la cellula ospite per progenie Piccole dimensioni (0.02-0.4 µm) Costituiti da materiale genetico formato da un solo acido nucleico (RNA o DNA) Rivestimento di natura proteica Protezione del genoma virale Mediazione della penetrazione virale intracellulare NO ribosomi NO sistemi enzimatici per la produzione di energia Poche (anche due) proteine non strutturali per la replicazione virale Sfruttamento delle proteinecellulari Agenti infettivi responsabili di numerose patologie umane e animali Antivirali  Virus Antivirali  Virus Core Acido nucleico più ogni molecola che ne determina la stabilità Capside Struttura proteica che racchiude l’acido nucleico o il core Capsomero Unità proteica che, ripetuta, forma il capside icosaedrico (simmetria icosaedrica a forma sferica) Nucleocapside Acido nucleico più capside Envelope Involucro lipoproteico esterno (pericapside o peplos) Peplomeri Proiezioni superficiali che protrudono dall’envelope Virione Particella virale completa liberata al di fuori della cellula Antivirali  Replicazione virale Antivirali http://www.nimr.mrc.ac.uk/research/kate-bishop/  Virus DNA a doppio filamento: Replicazione nel nucleo - Trascrizione (polimerasi cellulare o virale) DNA a singolo filamento: Sintesi del filamento complementare (polimerasi cellulare). Replicazione acido nucleico virale. Trascrizione del genoma. Sintesi componenti virali RNA a doppio filamento: RNA segmentato – Trascrizione (polimerasi virale) in mRNA separati. mRNA: tradotto (proteine strutturali). Assemblaggio parziale (stampo per la sintesi di filamenti complementari) RNA a singolo filamento con polarità (+): RNA (stessa polarità dell’mRNA). Sintesi di un’unica poliproteina - processata in proteine virali strutturali. Polimerasi per formazione di RNA genomico Antivirali  Virus RNA a singolo filamento con polarità (+): RNA (stessa polarità dell’mRNA). Sintesi di un’unica poliproteina - processata in proteine virali strutturali. Polimerasi per formazione di RNA genomico RNA a singolo filamento con polarità (-): RNA (NO messaggero). Trascrizione in mRNA (polimerasi virale). RNA: stampo per trascrizione e replicazione (genoma segmentato) Retrovirus: trascrizione RNA virale in DNA virale (DNA-polimerasi RNA dipendente o trascrittasi inversa). DNA stampo per filamento complementare. DNA a doppio filamento integrato nel genoma virale (provirus). Segue poi la ritrascrizione del DNA virale integrato (polimerasi cellulare). Produzione di RNA genomico e di mRNA più piccoli, traduzione per poliproteine strutturali Antivirali  Antivirali Trattamento delle infezioni virali Trattamento effettuato agli inizi dell’infezione NO certezza di efficacia verso forme dormienti e/o non replicanti NO alternativa all’immunizzazione profilattica a lungo termine (vaccini) Antivirali, in associazione con trattamento sintomi, efficaci in un certo numero di infezioni, tra cui ­ Influenza – Orthomyxoviridae (influenza dell’uomo A e B) ­ Raffreddore comune – Picornaviridae (rhinovirus) ­ Infezioni erpetiche – Herpesviridae (herpes simplex, varicella- zoster, citomegalovirus, Epstein-Barr) ­ Epatiti – Picornaviridae (epatite A e C,) Hepadnaviridae: epatite B ­ AIDS – Retroviridae (HIV) Antivirali  Antivirali Inibizione processi replicativi specifici Blocco preferenziale della sintesi degli acidi nucleici virali Blocco preferenziale della sintesi di proteine virali In genere non attivi verso virus in FASE NON REPLICATIVA Scarsa selettività in taluni casi (effetti tossici) Problemi di resistenza (variazione strutturale del target) Antivirali  Orthomyxovirus (ssRNA-) Virus dell’influenza A (agente patogeno umano associato a epidemie e pandemie) Virus dell’influenza B (malattia nell’uomo, ma non grave come tipo A) Virus dell’influenza C (esclusivamente l’uomo) RNA a singolo filamento (-), in 8 segmenti (7 nell’influenza C) Ingresso nella cellula Virus inglobato per endocitosi “Conserved” proteins, such as M2 Antivirali Credit: C. Bickel/Science  Orthomyxovirus Ingresso nella cellula: facilitato dal legame di emoagglutinina (HA, glicoproteina della membrana lipidica virale) con mucoproteine della membrana cellulare contenenti l’acido N-acetilneuraminico (acido sialico) nella loro porzione terminale HO OH HO O COOH HN H3C OH O HO Neuraminidasi (NA): glicoproteina della membrana virale Scissione del legame tra particelle virali e membrana cellulare tramite l’acido sialico Antivirali  Orthomyxovirus From Foye Antivirali Nature Reviews Drug Discovery 6, 967-974  Inibitori della Neuraminidasi Idrolasi Sito attivo con la triade Glu-276 catalitica (Arg 118, 292, 371) Glu-277O O Arg-292 O O NH HO NH2 9 NH2 H2N H2O OH2 HO 8 H2N 7 OH HN NH32 O O H Arg-152 11 1 2 10 Arg-371 N O 5 N H H 4 NH2 O O O OH O NH2 O O Glu-227 H2N O O HN Asp-151 Glu-119 Arg-118 Antivirali  Inibitori della Neuraminidasi Antivirali  Inibitori della Neuraminidasi OH OH OH O CO2H O H N H OH Neu5Ac2en Ki(M) 4x10-6 IC50 5-10 µM Disidratazione Analogo dello stato di transizione dell’a. sialico Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi OH OH OH OH OH OH O CO2H O CO2H O H O H N N H H OH NH2 Neu5Ac2en 4-Amino-Neu5Ac2en Ki(M) 4x10-6 Ki(M) 4x10-8 IC50 5-10 µM OH HO OH O CO2 4-OH: sostituito con un’ammina AcHN N protonato H3N Forma ionica: legame con il sito attivo H2O O 4-Amino-Neu5Ac2en: selettivo e attivo in O vivo O O Asp-151 Glu-119 Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi OH OH OH OH OH OH O CO2H O CO2H O O H H Zanamivir N N Ki(M) 3x10-11 H H NH2 HN NH 4-Amino-Neu5Ac2en Ki(M) 4x10-8 NH2 OH HO OH Gruppo basico più ingombrante O CO2 AcHN Gruppo guanidinico in 4 NH O Maggior n di legami H e interazione H2O H2N NH2 O Asp-151 vdw Aumento di attività (100 volte) O O O O O NHR 1999 Glu-227 R Glu-119 Alta polarità, scarsa biodisponibilità Trp-178 Somministrazione per inalazione Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi OH OH OH OH Rtrans Rcis N OH OH O CO2H O CO2H O CO2H O O O H 6 H 5 N 4 N AcHN H H NH2 NH2 NH2 4-Amino-Neu5Ac2en 4-Epi-amino-Neu5Ac2en 6-Carboxamides Ki(M) 4x10-8 Ki(M) 3x10-7 Cambio di stereochimica del C-4 Rimozione del glicerolo Diminuzione di polarità Meno interazioni Introduzione di catena carbossamidica: mantenimento dell’attività Amidi terziarie con selettività per la forma A dell’enzima Rtrans: variable; Rcis: etile o n-propile Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi Dihydropyran Methylene Methylene HO OH oxygen HO OH isostere HO OH isostere O CO2H CO2H CO2H OH OH OH AcHN AcHN AcHN HO HO HO Neu5Ac2en Structure I Structure II IC50 850 nM IC50 20 nM Ossigeno dell’anello diidropiranico: nessun ruolo di binding Analogo carbociclico Diminuzione della polarità Struttura II: 40 volte più potente di I Conformazione dell’anello (importante per la potenza) Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi HO OH Me H CO2H O HO CO2H CO2H OH AcHN AcHN AcHN HO H2N NH2 Structure II Structure III Methyl ether IC50 20 nM IC50 6.3 µM IC50 3.7 µM Me Me Et H H H CO2H CO2H CO2H O O O AcHN AcHN AcHN NH2 NH2 NH2 Ethyl ether Propyl ether Butyl ether IC50 2.0 µM IC50 0.18 µM IC50 0.30 µM Alchil eteri: occupazione di una regione idrofobica Aumento di attività con aumento di interazioni idrofobiche Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi Asymmetric centre Me H H H CO2H CO2H CO2H O O O AcHN AcHN AcHN NH2 NH2 H2N Propyl ether Branched ether GS 4071 IC50 0.18 µM IC50 0.01 µM IC50 0.001 µM Ramificazione: aumento delle interazioni e dell’attività Attività migliore: catena pentil-3-ossi Interazione con la porzione legata dal glicerolo dell’a. sialico Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi H CO2H H O CO2CH2CH3 O AcHN H2N AcHN GS 4071 IC50 0.001 µM H2N Oseltamivir (Tamiflu®) Etil estere PROFARMACO 1999 (influenza A e B) Somministrazione orale Convertito in GS4071 (Farmaco) dalle esterasi del tratto gastrointestinale Antivirali Patrick  Inibitori della Neuraminidasi HO COOH Peramivir AcHN HN NH H 2N Derivato del ciclopentano Migliore adattamento in entrambe le porzioni idrofobiche del sito attivo Resistenza per mutazioni di emoagglutinina e neuraminidasi Attualmente indicati 12 trials clinici (5 completati, gli altri 7 interrotti o ritirati) Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) 1981: insolita comparsa di casi di polmonite da Pneumocystis carinii e di sarcoma di Kaposi, associati ad altre forme gravi di infezioni opportunistiche Deficit immunitario: caratteristica comune da cui il Sindrome da Immunodeficienza Acquisita, AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) 1983 – Montagnier, 1984 – Gallo: identificazione di virus (LAV e HTLV-III) Un solo virus, dal 1986 chiamato HIV (Human Immunodeficiency Virus) o virus dell'immunodeficienza umana Retrovirus Genoma trascritto in una copia di DNA (provirus) utilizzando il proprio RNA come stampo Trascrizione inversa, catalizzata dalla trascrittasi inversa (RT) contenuta nel virus Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Gag proteina del “core” p55, precursore delle proteine p17, p24, p7 e p6 Formazione del capside, rivestimento proteico (p24 per copertura RNA) Capside: protezione del genoma Pol enzimi proteasi, trascrittasi inversa e integrasi Env glicoproteina 160, precursore delle proteine del rivestimento gp120 e gp41 Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Proteine regolatrici: modulazione (positiva e negativa) dei processi di replicazione e maturazione del virus Interferenza sulle normali funzioni delle cellule infettate Tat Proteina tat: induttore (forse) della replicazione del virus Nef fattore negativo Rev fattore di controllo per tat e nef Atri geni “ausiliari” per la produzione di proteine di controllo Sequenze LTR (Long Terminal Repeat Sequence) - alle estremità del genoma: indispensabili per la trascrizione dei geni virali Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) HIV Antivirali http://www.niaid.nih.gov  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Gp120: glicoproteina virale di superficie Legame con il recettore specifico CD4 (superficie esterna delle cellule bersaglio) CD4: recettore di superficie su linfociti T Helper e altre cellule Ricognizione di peptidi estranei Simultanea presenza di uno o più recettori delle chemochine (CCR5, CXCR4) necessarie per il legame e la fusione con l’HIV Antivirali http://www.niaid.nih.gov  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Fusione della membrana virale Disassemblaggio delle proteine della matrice e del capside virali Rilascio del materiale genetico nella cellula Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Trascrizione dell’RNA virale in DNA Azione catalitica della trascrittasi inversa (RT) Generazione di un provirus Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) DNA virale: incorporato nei cromosomi della cellula ospite ad opera dell’integrasi Trascrizione del DNA provirale in RNA RNA polimerasi della cellula ospite Regolazione da un gene codificato dal virus HIV (Tat) Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Sintesi proteica Migrazione RNA genomico e proteine virali verso la parte interna della membrana citoplasmatica Aggregazione Assemblaggio della nuova particella virale Estrusione della nuova particella virale che presenta un rivestimento lipidico contenente le glicoproteine gp 120 e gp 41 Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Maturazione dei virioni Dipendente dall’azione di una proteasi aspartica codificata dal gene pol virale, responsabile della frammentazione dei precursori gag e gag-pol in proteine funzionali Antivirali  Retrovirus (RNA singolo filamento + con DNA intermediario) Strategia antivirale Blocco dell’adesione Inibizione della trascrittasi inversa Inibizione dell’integrasi Inibizione della proteasi Antivirali  Inibitori della proteasi gli 48' ile 50' N N ile 50 gli 48 H H N O N H H H O O H S4' S2' S1 S3 P4' O H P2' O P1 O H P3 O H H N N N N N N N N H O H P3' O H P1' O H P2 O P4 S3' S1' H O S2 S4 O H O O H H N gli 27' O gli 27 O N asp 29' asp 29 asp25' O- H O asp 25 sito catalitico Antivirali  HIV-PR S3 Protease cleavage Gln S2' S1 CONH2 Phe Ph Ph O Phe O O H H Viral polypeptide N N N Viral polypeptide N N N H H H O Asn O O Pro CONH2 Ile S1' S2 S3' Flap region I le-50 Ile-50' Gly-48 Gly-48 O Gly-48' Gly-48' H H O P3 H O P1 H O P2' H O P4' N N N N N N N P4 H O P2 H O P1' H O P3' H O Asp-29 Asp-29 Gly-27 Gly-27' Asp-29' Asp-29' Asp-25 Asp-25' Catalytic region Antivirali Patrick  HIV-PR Meccanismo di reazione Tetrahedral intermediate Ph Ph Ph Substrate + N N HN CO2H O O O H H O H H H H O O O O O O O O HO O O O Asp-25 Asp-25' Asp-25 Asp-25' Asp-25 Asp-25 ' Asp-25 and Asp-25’: cruciali per il meccanismo Coinvolgimento di una molecola d’acqua Antivirali Patrick  HIV-PR N N N H OH HO OH O Amide Tetrahedral intermediate Hydroxyethylamine transition-state isostere Inibitori: formazione di specifici legami idrogeno e interazioni idrofobiche con aa coinvolti nella stabilizzazione del dimero Alterazione della simmetria rotazionale C2 Destabilizzazione del dimero Inibitori di natura peptidica N (165)Leu Asn N H O Ile(169) Approccio mimetico transizione dallo stato O Inibitori competitivi per il substrato naturale (il precursore poliproteina) Inibitori di natura peptidica Classe di inibitori con diminuite caratteristiche peptidiche Antivirali  Inibitori della Proteasi O Ile(169) N (165)Leu Asn N (165)Leu Asn N N H H O Ile(169) OH O Substrato (frammento pol) Inibitore IDROSSIETILAMMINICO (IC50 = 6.5 µM) Differenti proprietà steriche ed elettroniche della catena laterale e dei sostituenti terminali Evidenza di una larga sacca idrofobica S3/P3 Necessità di configurazione "R" dell’OH nel raggruppamento idrossietilaminico Antivirali  Inibitori della Proteasi Lead compound Pol: polipeptide virale substrato della HIV proteasi Pentapeptide contenente il legame Phe-Pro Phe Leu Asn Phe Pro Ile Ile Leu O O H H H N H2N N N N CO2H H H H H O O CONH2 Pro Phe Asn Benzyloxycarbonyl (Z) Leu Ile protecting group O O O H H H H N N N N N N H H H H H O O OH O CONH2 Pro Asn NHtBu protecting group Hydroxyethylamine transition-state isostere Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Lead compound Phe Benzyloxycarbonyl (Z) Leu Ile protecting group O O O H H H H N N N N N N H H H H H O O OH O CONH2 Pro Asn NHtBu protecting group Hydroxyethylamine transition-state isostere Svantaggi Debole inibitore (IC50 750 nM) Alto peso molecolare Stabile alla reazione Forte carattere peptidico 5 residui: nei subsiti S3-S2’ Scarsa biodisponibilità Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Lead compound O O O H H H H N N N N N N H H H H H O O OH O CONH2 Svantaggi Debole inibitore (IC50 750 nM) Alto peso molecolare Stabile alla reazione Forte carattere peptidico 5 residui: nei subsiti S3-S2’ Scarsa biodisponibilità Antivirali Patrick  Saquinavir P1 t-Butylamide P2’ P3 O N O H H H H N N H N N H H H O OH O H O H P2 CONH2 H H O N N N N N N H O H H H H H O P1’ Decahydroisoquinoline O OH CONH2 Aumento di attività di 60 volte (IC50 0.4 nM) Stereochimica: R essentiale per l’isostere dello stato di transizione Saquinavir : primo inibitore della proteasi in clinica Antivirali Patrick  Saquinavir Studi mediante cristallografia raggi X 5 subsiti occupati (S3-S2’) S3’: inaccessibile Isostere dello stato di transizione, interazione con gli Asp catalitici Carbonili: HBA con la molecola d’acqua che interagisce con i flap S1 S3 HBA S2' O HBA N O H H H H N N H N N H H H O OH CONH2 H S2 S1' Asp-25 Asp-25' Antivirali Patrick  Saquinavir Saquinavir O CONH-t-Bu H N N N N H H O NH 2 OH Attivo nei confronti della HIV-PR O H Saquinavir mesilato Scarsa solubilità in acqua Assorbimento orale scarso Rapido metabolismo di “first pass” [Ritonavir: inibizione dell’enzima responsabile del metabolismo del saquinavir nel “first pass” (CytP450 CYP 3A4)] Resistenza: dovuta a mutazioni Glu48/Val e Leu90/Met Antivirali  Inibitori della Proteasi Merck: strategia di ibridazione molecolare Utilizzo di due porzioni provenienti da due derivati diversi Sfruttamento della simmetria del sito attivo Ph O O O N O H H H H N O N N N H H H N N OH OH H H H O OH L 685434 CONH2 IC50 0.3 nM H Saquinavir IC50 0.4 nM O NH O N N P’ del saquinavir: buona idrosolubilità H H HO OH P’ dell’L685434: no carattere peptidico H L 704486 L 704486: meno attivo ma potente IC50 7.6 nM Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Benzyloxycarbonyl O NH O NH O O N N N N H H H HO OH O N HO OH H L 704 486 O Piperazine IC50 7.6 nM L 732 747 IC50 0.5 nM S2 S2' Vantaggi rispetto alle decaidroisochinoline O NH S3 O N Facile funzionalizzazione dell’N4 N O N HO H OH Secondo atomo di azoto: migliore O solubilità in acqua e biodisponibilità S1 S1' orale Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Gruppo benzilico Aumento attività Diminuzione solubilità Benzyl group O NH O N N H N HO OH Structure IV IC50 0.3 nM Antivirali Patrick  Indinavir Indinavir IC50 0.56 nM Ki 0.34 nM EC95 0.10 µM S2' S2 S1 S3 P2 HBA S2' O O NH P2’ N HBA O S3 O H H H H N N H N N H H H N N O OH H CONH2 N N HO OH H P3 P1 P1’ S2 S1' S1 S1' Asp-25 Asp-25' Antivirali Patrick  Indinavir Inibitore potente e selettivo della PR virale IC50 = 0.56 nM Blocco della proliferazione dell'infezione virale in culture di linfociti umani a concentrazioni 50 nM Biodisponibilità orale: sino al 70% di quella ottenuta per ev Antivirali  Inibitori della Proteasi S1 S3 HBA S2' Gruppo benzilico (P1) e O N HBA O chinolinico (P3) vicini H H H H N N N N H Possibilità di estendere P1 H H H O CONH2 OH per occupare sia S1 and S3 H Eliminazione di P3 S2 S1' Minore MW Asp-25 Asp-25' Minore carattere peptidico S3 ca. 3.2A S1 S2' H Ph O N O H N N N H O OH S1' CONH2 LY 289 612 Benzamide IC50 1.5 nM S2 group Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Subsite 3 Subsite 3 Subsite 3 Subsite 3 Subsite 1 R3 Subsite 1 Subsite 1 R3 Subsite 1 Extended Extended residue residue R1 O O R1 O O H H HN HN OH N N N N OH N OH 'Pruning' NH NH NH OH 'Pruning' H H 2 H O R2 O O 2R R O O O R2 Subsite 2 Subsite 2 Subsite 2 Subsite 2 H Ph O N O H N N N LY 297 135 H IC50 1.1 nM O CONH2 OH ED50 23 nM H P3 eliminato Truncated S O N chain O Fenile rimpiazzato da gruppo S-naftilico H N Buona inibizione enzimatica N H Attività a livello cellulare scarsa O CONH2 OH Asparagina: da eliminare Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi AG 1204 Ki 24 nM H H S O N S O N O O H N HN N N H H O OH OH CONH2 Asparagina: rimpiazzata da una tetraidrochinolina Conformational AG 1232 blocker Diminuzione del carattere Ki 49 nM H peptidico Me O S O N H2N N Aniline H OH ring Antivirali Patrick  Nelfinavir S3 OH anzichè NH2 S1 S2' Aumento dell’inibizione enzimatica S O H N (10 volte) Me O Scarsa idrofilia HO N H OH AG 1254 S1' Nelfinavir S2 Ki 3 nM S3 S1 Val-32 S2' Ile-84 H S O N Me O H Semplificazione molecolare del HO N N saquinavir H H OH Migliore biodisponibilità orale Asp-30 H S2 Asp-25 Asp-25' S1' Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi De novo design of symmetrical lead compound II C2 C2 Ph RHN N C2 P1 P 1' HO OH CONHR' Ph Ph Ph HO OH N NHR RHN RHN RHN HO OH CONHR' HO OH HO OH Ph Reaction intermediate Ph OH NHR RHN OH Ph Target diol Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Inibitori C2-simmetrici O Progettazione sfruttando la configurazione HO OH H omodimera C2-simmetrica dell’enzima N N Inibitori C2-simmetrici Ridotto carattere peptidico Processo concettuale a tre stadi: definizione di un asse di simmetria C2 cancellazione della porzione C-terminale del substrato OH H H duplicazione della porzione N-terminale N N Antivirali  Ritonavir e Lopinavir Ph Ph Ph Ph H 2N NH2 Val Val N N OH H H OH Target alcohol (I) (II) IC50 > 10,000 nM IC50 590 nM Ile-50 Ile-50' O Wat-301 H H A74704 IC50 3 nM Ph P1 P1’ Ph O O Pattern di legame simmetrico ZHN N N NHZ Interazioni con Gly-27 e Gly-27’ H H OH non ottimali Me Me Me Me P2 P2’ Miglioramento aumentando la distanza tra gli NH? Gly-27 Asp-25Asp-25' Gly-27' Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Ph Ph P1 P1’ Val Val Ph Ph N N O O H H H H OH O N N O N N P3’ P3 H H Ph O OH O OH Me Me Me Me P2 P2’ NHR RHN OH Ph Target diol P1 Diol equivalent P2’ Ph O OH O H H O N N N N O P3 H H O OH O P2 P1’ Ph P3’ IC50 0.22 nM Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi A77003 Urea Ph P1 P2’ N Me O OH O Pyridine H H N N R N N N S N N H H Pyridine P3 O OH O Me Ph P2 P1’ Urea P3’ EC50 0.2 µM; Ki 140 pM Binding asimmetrico osservato nella struttura cristallografica R-OH: 2 legami H con gli aspartati catalitici S-OH: 1 solo legame H Rimozione di S-OH per evitare penalizzazioni energetiche da desolvatazione Ph P1 P2’ N Me O O A78791 N H N H N N N N N P3 H H O OH O Me P2 P1’ Ph P3’ Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi Pyridine A80987 Ph P1 N N Urethane O Urethane H H P2’ O N N O N H P3 O OH O P2 P1’ Ph Urea sostituita da uretano Valina: eliminata dalla porzione destra Molecola non più simmetrica, ma più piccola EC50 0.13 µM Piridine: suscettibile al metabolismo (N-oxidation) Ingombro sterico e sostutenti elettron attrattori per bloccare l’ossidazione Sostituzione dell’anello con altri eterocicli Antivirali Patrick  Inibitori della Proteasi 4-Thiazolyl Urea P1 Shifted OH Ph N S Me O OH H H P2’ N N N O N N P3 H A83962 O O P2 P1’ Ph Ph N N O H H O N N O N H O OH O Ph Antivirali Patrick  Ritonavir Ritonavir 5-Thiazolyl (P2’) P1 Ph Asp-30 S Me O OH N H H P2’ Val-82 N N N O N P3 N S H O O Ph P2 P1’ Anello tiazolico: bio-isostere della piridina (P2’) Attività aumentata (EC50 30 nM) Azoto tiazolico: Legami H con Asp-30 Farmaco resistenza se usato da solo Mutazione di Val-82 in Ala, Thr in Phe Rottura di interazione idrofobiche tra Val-82 e isopropile Antivirali Patrick  Lopinavir Conformational Aromatic restraint Ph P1 Me O OH P3 H P2’ HN N N N O Cyclic urea H O O Me P2 P1’ Ph Gruppo tiazolico P3 rimosso e sostituito con un'urea ciclica è interazioni di legame idrogeno migliorate con il sito secondario S2 Compensazione della perdita di interazioni di legame a causa della rimozione del gruppo tiazolico Nessuna interazione con Val-82 Attivo contro i ceppi resistenti al ritonavir Antivirali Patrick  Tipranavir O O O O 4 O OH OH Me Me Warfarin Phenprocoumon Ki 1 mM; ED50 100-300 mM Inibitore della proteasi da un lead compound NON PEPTIDICO High throughput screening di 5000 composti per identificare un lead compound Warfarina: debole attività antiproteasica Analoghi della Warfarina Fenprocumone: più attivo e migliore biodisponibilità Antivirali Patrick  Tipranavir Ile-50 Ile-50' Primo inibitore della proteasi con O O legame diretto ai flap P2 P1' No H2O 4 Occupazione dei sottositi S1’, S1 e S2 P1 OH Me Asp-25 Asp-25' H3C O O Ph O O 6 Ph O O Ph 6 6a 6a 3 3 3a 3a Me OH OH OH Me Me Me Antivirali Patrick  Tipranavir S3 H S2' N P2' SO2HN O O Ph N Me O O 6 P2 * P1' 3a P1 Me S2 OH * Me Me OH S1 Me S1' Structure I Structure II; Ki 1 nM; IC50 0.5 µM Ki 35 nM; ED50 3 µM Mixture of diastereomers Aumento attività Solfonamide: metabolicamente labile N Metabolizzata da glutatione S-transferase NC SO2HN O O Ph PNU 109112 Ki 7 pM; IC50 40 nM Me OH Me Antivirali  Tipranavir Enzyme N N Enzyme N N C SO2HN HN C SO2HN NC Enzyme R R + H2NR + SO2 N N NC SO2HN F3C SO2HN O O Ph O O Ph Me Me PNU 109112 OH Tipranavir OH Me Me Ki 7 pM; IC50 40 nM Ki 8 pM; IC50 30 mM. + 1.0... CF 3SO 2...75... CN NO2 SF5.... SO 2NH2 CH3SO2.50 CF 3. CH3CO CONH2 Miglioramento della stabilità metabolica OCF3.25 -2.0. -1.6. -1.2 -.8 -.4 CO2H.4 Cl.8 Br 1.2 I 1.6 2.0... F Legame al sito attivo occupando S1, S2, S3, -p. +p CH3CONH. OCH3 -.25 Me Et t-Butyl. OH S1’, S2’. NH2 -.50 NMe2 -.75 -1.0 - Antivirali Patrick  Tipranavir N F3C SO2HN O O Ph Me OH Me Tipranavir Potente e selettivo inibitore della HIV-1 PR III generazione della classe di composti a struttura pironica Associazione a ritonavir a basso dosaggio, con zidovudina o abacavir Legame alle proteine plasmatiche (99.9%) Antivirali  Hepadnavirus (DNA doppio filamento con RNA intermediario) Epatiti virali: infezioni del fegato causate da un gruppo di virus A oggi identificati: virus A, B, C, D, E e G dell’epatite Hepadnavirus: EPATITE B Epatiti B, C, D (probabilmente anche G): trasmesse per via ematica e sessuale Epatiti virali acute: infiammazione del fegato e necrosi epatocellulare Possibile immunizzazione attiva con vaccini specifici (epatite A e B) o passiva con immunoglobuline Antivirali  Interferoni Complessa famiglia di proteine, alcune glicosilate Sistema di difesa dell'organismo contro le infezioni e contro l'insorgenza di cloni cellulari neoplastici Nell'uomo tre classi di interferon: interferon alfa, leucocitario interferon beta, fibroblastico interferon gamma, prodotto dai T-linfociti Attività sulle cellule non ancora infettate, con modificazioni che le preparano a respingere l'attacco virale Antivirali  Interferoni Antivirali  Interferoni Interferone alfacon-1 (interferone consenso): 166 aa Sequenza: in ciascuna posizione l’aa più frequentemente presente in quella posizione, considerando le sequenze dei sottotipi a naturali Utilizzato nel trattamento dell’epatite cronica (HCV) Attività antivirale mediata dall’induzione delle proteine 2’-5’- oligoadenilato sintasi e chinasi R (PKR) 2’-5’-oligoadenilato sintasi: attivazione RNAsi con degradazione RNA virale PKR: inibizione sintesi proteica Recentemente dimostrata anche l’inibizione della traslazione dell’RNA con un meccanismo PKR indipendente Antivirali  Induttori degli interferoni Polinucleotidi a doppio filamento Statolone: Polisaccaride anionico da Penicillum stoloniferum Efficace nella produzione di interferone Doppio filamento di acido poliriboinosinico e poliribocitidilico Molecole di piccole dimensioni (tra cui propandiammine sostituite) Tilorone Efficace in modelli murini, meno nell’uomo Efficacia clinica non ancora perfettamente stabilita O O O 2,7-Bis[2- N (diethylamino)ethoxy]-9- N Tilorone fluorenone Antivirali  Hepadnavirus: Antivirali NH2 N N O HO Lamivudina O Analogo nucleosidico (citidina) S Fosforilazione intracellulare Blocco della replicazione mediante terminazione del DNA provirale nascente Biodisponibilità orale dell’80% 1,3-ossatiolano Antivirali  Hepadnavirus: Antivirali O NH OH N O O Telbivudina OH Analogo nucleosidico sintetico della timidina (enatiomero) Fosforilata da chinasi cellulari a trifosfato Inibizione della HBV DNA polimerasi competendo con il substrato naturale Incorporazione nel DNA virale con sua terminazione e conseguente inibizione della replicazione virale Inibitore sia della sintesi del primo filamento di DNA del HBV che del secondo Telbivudina 5'-trifosfato fino a [100 µM]: no inibizione della DNA polimerasi umana Antivirali  Hepadnavirus: Antivirali O N Ribavirina NH2 N N Proprietà antivirali verso un ampio numero HO di virus a DNA o RNA O Necessaria la fosforilazione a livello intracellulare OH OH Monofosfato interferenza con la sintesi della guanosina trifosfato e quindi con quella degli acidi nucleici Trifosfato Inibizione del “capping” dell’mRNA virale e azione sull’attività della transcrittasi Antivirali  Hepadnavirus: Antivirali CH3 H3C CH3 NH2 N N O O N N O O O P CH3 O O O CH3 Adefovir dipivoxil CH3 Profarmaco dell’adefovir [bis(pivaloilossimetil)-9-(2-fosfonilmetossietil)]adenina Nucleotide aciclico contenente fosforo Inibitore della transcrittasi inversa Antivirali  Hepacivirus: Epatite C RNA a singolo filamento con polarità (+) Antivirali  Hepacivirus: Epatite C a) adesione ed endocitosi; b) rilascio RNA; c) traduzione e processamento della poliproteina; d) replicazione dell’RNA; e) assemblaggio; f) maturazione e rilascio Antivirali  Hepacivirus: Epatite C NS4A-B à proteasi NS5A-B à replicazione Antivirali  Hepacivirus: Epatite C NS5B RNA polimerasi RNA dipendente (RdRp) Antivirali  Hepacivirus: Antivirali Antivirali  Hepacivirus: Antivirali Antivirali University, Redwood Building, Cardiff CF10 3NB, U.K. ces, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, U.K. Hepacivirus: for Medical Antivirali Research, Herestraat 49, 3000 Leuven, Belgium oach oside this ono- d an d-off and the istry rom ono- into This Antivirali J. Med. Chem. 2018, 61, 2211−2226  Hepacivirus: Antivirali Journal of Medicinal Chemistry Perspective Table 1. Stages of the Development of the ProTide Prodrug Technology arabinofuranosyladenine (AraA)39 monophosphate, which Antivirali Nevertheless, theJ. alkyl Med.andChem. haloalkyl2018, 61, masking phosphate 2211−2226 exerts antiviral activity, by simple dialkyl triesters (Stage 1, groups, especially for their application to AraA and AraC,  Hepacivirus: Antivirali Sofosbuvir O NH yladenine (AraA)39 monophosphate, which Nevertheless, the alkyl and haloalkyl phosphate masking activity, by simple dialkyl triesters (Stage 1, groups, especially for their application to AraA and AraC, hough these prodrugs led O to increased stability N indicated O that these masking groups showed good activity due ne/adenylate deaminases, they demonstrated a to better membrane-crossing ability, because the biological 36 O P O gical activity. Similar results were found when activity correlated with lipophilicity, rather than increased O 36,37,47 iple was applied to the anticancer NH agent 1-β- D- CHintracellular 3 levels of the phosphate species. Such 37,40 ylcytosine (AraC). However, when the conclusion shifted the thinking toward phosphate prodrugs to ate approach was used to mask the mono- a different strategy. up of the anti-HIV agent 3′-azidothymidine OH F Stage Two: Alkyloxy and Haloalkyloxy Phosphorami- O O 42 gnificant activity was observed in vitro. This dates. Subsequently, the design of nucleoside phosphate to several parameters, but the most likely prodrugs focused on alkyloxy and haloalkyl phosphoramidate the lack of activity was due to the high stability prodrugs (Stage 2, Table 1). The move toward phosphor- iesters, which hindered the eventual conversion amidate prodrugs was provoked by the findings that the HIV cally activeAntivirali 5′-O-triphosphate form of AZT. 43 protease can cleave an oligopeptide from the phosphate group 49  Hepacivirus: Antivirali Sofosbuvir Approvato nel gennaio 2013 dalle FDA PROFARMACO (GS-461203: 2'-deoxy-2'-α-fluoro-β-C-methyluridine- 5'-triphosphate) Inibitore selettivo di NS5B (RNA polimerasi virale) Chain terminator Antivirali  Sofosbuvir X X Antivirali  Chimica Farmaceutca 1 Hepacivirus: Antivirali O O P O O O O P O NH O O P O N O O O O O P O H3C O H O O H H P OH F O NH O O P O N O O O H H H H OH OH Antivirali