Chapitre 1 Bioch App 2024 PDF

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Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. BIOCHIMIE APPLIQUEE: BIOMOLECULES D’ORIGINE ANIMALE Chapitre 1 : Produits sanguins 1.1. Le sang : Généralités  Les nutriments et l’oxygène diffusent dans le sang puis sont acheminées aux différentes cellules par ce dernier.  Le sang est mis en mouvement par le cœur.  Le corps en contient environ 5 L.  Le sang fait un tour complet de l’organisme en une minute. * Le sang total est un milieu biologique complexe composé d'une partie liquide jaune légèrement translucide, le plasma (60 %) et d'une partie solide en suspension (40 %) formée d'éléments figurés : les globules rouges (encore appelés hématies, ou érythrocytes), les globules blancs (ou leucocytes) et les plaquettes (ou thrombocytes). * Le plasma peut être séparé des autres constituants par simple centrifugation du sang traité par un anticoagulant. Le sérum est le surnageant obtenu à partir d'un sang laissé coaguler (30 à 45 min) puis centrifugé. 1.1.1. Composition du sang a/ Les globules rouges  Les globules rouges constituent 98% des éléments figurés.  Épaisseur 7 à 8 µm sur 2 µm.  Cellules anucléées.  Les globules rouges ont pour rôle de transporter l’oxygène.  Leur durée de vie est d’environ 120 jours.  Ils contiennent l’hémoglobine, molécule qui leur donne leur coloration rouge et qui se lie à l’O 2. b/ Les globules blancs  Cellules nucléées de 8 à 20 µm de diamètre.  Il en existe plusieurs catégories  Ils ont pour rôle de défendre l’organisme : destruction des microbes et des cellules mortes par phagocytose. 1 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. c/ Les plaquettes  Les plaquettes sont des fragments de cellules dépourvues de noyau.  Leur durée de vie et de 8 à 10 jours. Elles permettent la coagulation du sang : elles se rassemblent et forme une masse solide arrêtant le sang.  La coagulation est un mécanisme complexe impliquant d’autres molécules que les plaquettes. Exemple : Le facteur VIII, absent chez les hémophiles. d/ Le plasma  Le plasma sert à transporter les particules solides du sang.  Il contient de l’eau (90%), des nutriments, des déchets cellulaires, des hormones, des anticorps...  Il assure par conséquent le transport de ces substances.  De plus, il assure la fluidité du sang. 1.1.2. Fonctions du sang Au sein de l'organisme, le sang véhicule de nombreuses substances comme : l'oxygène (par les érythrocytes) ; des molécules d'origine alimentaire vers les cellules ; des produits de dégradation du métabolisme cellulaire vers les émonctoires ; des molécules jouant un rôle fondamental dans la défense de l'organisme contre les infections et agressions ; des molécules messagères permettant la communication entre organes différents par voie sanguine ; des globules blancs qui ont pour fonction de défendre l'organisme contre l'intrusion d’éléments étrangers. Le sang participe également au maintien de la température du corps à une valeur constante en assurant la distribution de la chaleur dans toutes ses parties. 1.1.3. Composition du plasma Le plasma sanguin est essentiellement constitué : 2 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O.  d'eau (environ 90 %) ; d'ions et de sels minéraux,des glucides, des acides gras, des glycérides, et d'autres lipides,des acides aminés et des protéines,des nucléotides ainsi que des vitamines et des hormones. Les protéines plasmatiques sont représentées essentiellement par trois fractions : L’albumine, les globulines, les facteurs de coagulation. a). Les facteurs de coagulation  Le facteur I, plus connu sous le nom de fibrinogène, est, quantitativement, le principal facteur de coagulation ; sa concentration dans le plasma humain est voisine de 2 à 3 g/L.  En se transformant en fibrine, il permet la coagulation du sang. Après formation du caillot, le plasma défibriné est appelé sérum.  Le fibrinogène est une glycoprotéine fibreuse synthétisée dans le foie, soluble en présence de sels et insoluble dans l'eau pure. Structure schématique du fibrinogène montrant sa nature dimérique avec trois chaines polypeptidiques Représentation schématique des réactions en cascade de la coagulation sanguine b). L’albumine  L'albumine sérique ou sérumalbumine est la plus abondante protéine soluble (35 à 45 g/L) du plasma sanguin et, à ce titre, elle est le principal responsable de la pression oncotique puisqu’elle assure à elle seule environ 80 % du pouvoir oncotique plasmatique. Cette propriété est due aussi à son fort pouvoir de rétention d'eau (15 à 20 mL d'eau/g d'albumine). 3 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O.  C’est une protéine monocaténaire très riche en ponts disulfures, son poids moléculaire est d'environ 67 000. Synthétisée par le foie, elle a une fonction biologique très importante ;c'est elle qui fixe et transporte, dans tout l'organisme un grand nombre de substances nécessaires à son bon fonctionnement.  La fixation aux ligands est en général solide mais non covalente. Ceci permet à la fixation d'être réversible.  Les substances transportées peuvent être : d'origine endogène : ions organiques ou inorganiques, bilirubine, acides gras libres (non estérifiés), hormones thyroïdiennes et stéroïdes, glucose. d'origine exogène : médicaments, vitamine C, iode. c). Les globulines  Les globulines sont séparées en différentes fractions selon leur mobilité électrophorétique. Elles sont principalement représentées par les gamma-globulines qui font partie des immunoglobulines (Ig)  Les immunoglobulines sont produites par les lymphocytes B. Elles sont divisées en 5 classes :IgG, IgA, IgM , IgE et IgD. Ce sont les IgG qui ont la concentration plasmatique la plus élevée (7-14 g/L) et qui peuvent traverser le plus facilement la barrière placentaire (transfert de la mère à l'enfant). 1.2. Le Prélèvement et la transfusion * Le prélèvement de sang doit suivre les étapes suivantes : Installation du donneur, vérification de son identité, choix des poches de prélèvement selon les prescriptions du médecin, préparation du site de phlébotomie, prélèvement des tubes échantillons, étiquetage des poches et des tubes échantillons, fermeture hermétique et irréversible des poches. * La transfusion consiste à administrer le sang ou l’un de ses composants (GR, PLT, plasma) provenant d’un ou de plusieurs sujets sains appelés « donneurs », à un ou plusieurs malades appelés « receveurs ». 1.3. Valorisation des produits sanguins On entend par produit sanguin tout constituant isolé du sang total tel que : globules rouges, concentré de plaquettes, plasma, albumine, facteurs de la coagulation, immunoglobines. * Les produits sanguins sont deux catégories : 4 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. 1/ Les produits sanguins labiles (PSL) : préparés par les établissements de transfusion sanguine. Les PSL obtenus à partir de don de sang total ou par aphérèse sont : CGR (concentré de globules rouges), plasma, plaquettes (CPS = Concentré Plaquettaire Standard) 2/ Les produits sanguins stables (PSS) : il s’agit de médicaments dérivés du sang (MDS).  Le fractionnement du plasma humain permet l'isolement, la purification et la concentration de certains constituants (protéines) pour les utiliser dans le domaine thérapeutique et clinique. On parle alors de « médicaments dérivés du sang ou MDS ».  Les protéines thérapeutiques permettent de traiter plus d'une centaine de maladies. Dans certaines pathologies, les médicaments dérivés du plasma sont irremplaçables car il n'existe pas d'alternative thérapeutique.  Dans le domaine médical, les médicaments dérivés du sang ou MDS sont utilisés : * L'albumine issue du fractionnement du plasma est utilisée en médecine d'urgence en cas d'hémorragie grave chez les grands brûlés, chez la femme enceinte en situation de pré-éclampsie, en présence d'une fuite protéique importante, en néonatalogie (hypoalbuminémie profonde chez le nouveau-né ou le nourrisson). * Les facteurs de coagulation : le facteur de Von Willebrand est utilisé chez les personnes atteintes de la maladie de Von Willebrand (maladie hémorragique héréditaire), pour prévenir et traiter les saignements spontanés ou consécutifs à une intervention chirurgicale. Le facteur IX est utilisé chez les hémophiles B et le facteur VIII est utilisé chez les hémophiles A. * Les immunoglobulines sont utilisées pour traiter les maladies infectieuses et les troubles immunitaires. Les déficits immunitaires peuvent être primitifs (DIP) ou consécutifs à une autre maladie (Déficits Immunitaires Secondaires). Les DIP regroupent une centaine de maladies différentes. Le traitement substitutif par immunoglobulines permet aux personnes souffrant de déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps ou de déficits immunitaires consécutifs à une autre maladie de mener une vie quasi-normale. Stratégie d'obtention des médicaments dérivés du sang 1.4. Stratégie d'obtention des médicaments dérivés du sang : le système de sécurisation biologique des médicaments dérivés du sang comporte les étapes majeures : 5 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. 1.4.1. Qualification des donneurs de plasma  Afin qu’un don de plasma soit utilisé en fractionnement, son donneur doit d’abord être qualifié.  Les donneurs sont rigoureusement sélectionnés dans les centres. Ils bénéficient d’un examen médical avant chaque don permettant de s’assurer qu’ils sont en capacité physique de donner. Lors de cet examen, un questionnaire permet de mettre à jour leurs antécédents médicaux et leur mode de vie afin d’identifier les comportements à risque. Les personnes ne répondant pas à ces critères rigoureux sont éliminées du don.  Le premier don doit être négatif pour tous les marqueurs viraux.  Le deuxième don doit être effectué dans un délai de 6 mois suivant le premier don.  Il doit également être négatif pour tous les marqueurs viraux * Si ces 3 conditions sont remplies, le donneur est alors classé en donneur qualifié : après une période de quarantaine, et si les marqueurs viraux sont négatifs, ses dons seront utilisés pour le fractionnement. * Si un donneur ne se présente pas pendant 6 mois, il perd son statut de donneur qualifié et doit recommencer le processus de qualification. Si un donneur ne répond plus aux critères de qualité ou de sécurité, il est exclu définitivement du don. 1.4.2. Qualification biologique du plasma * La qualification biologique concerne l’ensemble des étapes mises en place pour valider la qualité et la sécurité du plasma. * L’enjeu principal de cette étape est la détection des virus suivants : VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine), le parvovirus B19, et le VHA, le VHB, et le VHC (Virus de l’Hépatite A, B et C). Les contrôles sont principalement effectués selon 2 techniques : a/ La technique d’amplification des acides nucléiques (NAT), tel que la PCR (Polymerase Chain Reaction). Elle permet de détecter la présence du virus en décelant son matériel génétique : elle est donc plus sensible et souvent plus précoce que les tests sérologiques. b/ La sérologie : cette méthode permet de détecter les anticorps développés par l’organisme contre un virus spécifique. La séroconversion correspond au moment où les anticorps spécifiques d’un micro-organisme apparaissent dans le sérum après une infection ou une immunisation. Après la séroconversion, le test devient positif. * Plasma est soumis à des tests de détection virale, et n’entre en production que si les tests sérologiques et la recherche de génomes viraux sont négatifs. 1.4.3. Méthodes de fractionnement du plasma  Le plasma est obtenu à partir de dons de sang total ou par aphérèse.  Le fractionnement du plasma est le procédé qui permet d’isoler, de purifier et de concentrer les protéines thérapeutiques du plasma humain.  Les technologies actuelles s'appuient encore largement sur un procédé connu sous le nom de fractionnement de Cohn. La modification des conditions physico-chimiques (comme la température, la concentration en éthanol, la force ionique ou le pH) permet de rendre une protéine insoluble et de la faire précipiter. Le protocole de Cohn combine deux types de procédé : Précipitations séquentielles à l'éthanol dilué (10-40 %). Cette étape aboutit notamment à la séparation de l'albumine et des immunoglobulines. 6 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. Cryoprécipitation, qui consiste en la congélation du plasma à - 70 °C suivie d'une étape de décongélation à une température comprise entre 0 et 4 °C, ce qui permet d'isoler un cryoprécipité blanc utilisé pour la production des concentrés de facteurs VIII, XIII, Willebrand et de fibrinogène. Protocole général simplifié du fractionnement des protéines plasmatiques CP : complexe prothrombinique, AT : antithrombine, PC : protéine C, IgG : immunoglobulines Schéma général du fractionnement des protéines plasmatiques à l'éthanol selon Cohn 1.4.4. Elimination / inactivation virale * Au cours du fractionnement, des étapes contribuant à l’élimination et/ou inactivation des agents infectieux sont intégrés pour obtenir des médicaments sécurisés et efficaces. a/Nanofiltration / filtration virale : la filtration virale (ou nanofiltration) permet de retenir toutes les particules de taille supérieure au diamètre du filtre, notamment les virus. Le filtre de petit calibre (généralement entre 15 et 7 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. 40 nm) laisse passer les protéines thérapeutiques (de plus petite taille) et retient les virus, tel que le parvovirus B19, l’un des plus petits virus. * Le principal avantage de cette technique est d’être efficace contre les virus enveloppés ou non, sans dénaturer les protéines ni affecter la qualité du produit. b/ La pasteurisation : utilise la chaleur pour inactiver une large variété de virus, enveloppés ou non. Au cours de ce procédé, des stabilisants sont utilisés pour protéger les protéines et sont ensuite éliminés. c/ Traitement au thiocyanate de sodium : le traitement solvant/détergent inactive les virus enveloppés par destruction de l’enveloppe lipidique. Le détergent utilisé dissout les lipides et leurs dérivés ce qui détruit l’enveloppe virale, indispensable à la survie de la majorité des virus enveloppés. Ce procédé ne dénature donc pas les protéines thérapeutiques. d/ Traitement à pH acide : cette technique est particulièrement efficace sur les virus enveloppés : certains d’entre eux sont détruits spontanément lorsqu’ils sont exposés à un pH acide. Cette technique est utile lorsque la protéine thérapeutique est plus résistante que les virus aux pH acides. 1.4.5. Méthodes de purification des protéines thérapeutiques Techniques de chromatographie * La chromatographie d'immuno-affinité * La chromatographie d'exclusion stérique * La chromatographie d'échange d'ions Précipitation par Polyéthylènes glycols Ultrafiltration 1.4.6. Pharmacovigilance et traçabilité * Les produits finis sont alors conditionnés pour la distribution. L’assurance qualité vérifie chaque lot avant libération et mise sur le marché. Seuls ceux répondant à l’ensemble des critères seront libérés. 8 Master I Biochimie Appliquée Pr. Aouacheri O. * La pharmacovigilance a pour objectif de surveiller le risque d’effet indésirable (EI). Cette dernière comporte en particulier l’identification, l’évaluation et la prévention du risque. Le signalement peut être réalisé par tout professionnel de santé, le patient et les associations agréées de patients. * C’est l’ensemble des mesures prises pour retrouver rapidement à partir d’événement enregistré, l’historique, l’utilisation et la localisation d’un médicament à chaque étape depuis la collecte du sang, son fractionnement jusqu’à sa distribution et son administration au patient. Cela implique également de pouvoir faire le lien entre le donneur de plasma et le patient à qui un flacon a été administré, et inversement. * Tous les équipements qui sont utilisés pour la production de plusieurs lots sont nettoyés, désinfectés et/ou stérilisés de façon à éviter la contamination des productions suivantes par des protéines résiduelles ou d’éventuels agents pathogènes restant dans l’équipement. 1.5. Production des médicaments d'origine sanguine (MDS) recombinés Les différentes phases de production des protéines recombinées 1.5.1. Avantages et inconvénients des MDS recombinés  Leur disponibilité n'est pas limitée par l'approvisionnement en plasma humain, issu généralement des dons de sang, ce qui diminue le risque de pénurie et permet d’envisager une production industrielle régulière à moindre coût.  Absence de risques de contamination par des agents infectieux d'origine humaine tels que : VIH, les virus de l'hépatite et les parvovirus et donc de leur transmission.  Le produit final d'une très haute pureté conserve, toute son activité physiologique.  L’inconvénient principal réside dans le risque allergique dû à la présence d'anticorps murins utilisé pour la purification, et de traces de protéines de hamster et d'ADN dans le produit fini. 1.6. Médicaments dérivés du sang et leur utilisation en thérapeutique * L’avantage de la production de médicaments plasmatiques est leur plus haute pureté qui a joué un grand rôle dans l'amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des malades transfusés. Néanmoins, ces produits issus du sang ont été pendant longtemps responsables de contaminations virales car ils étaient obtenus à partir de mélanges de plasmas ; la présence d'un seul plasma infecté par un virus étant suffisante pour contaminer la totalité du mélange. * Des risques liés à la présence d’une quantité résiduelle d’anticorps monoclonaux (généralement murins) ayant servi de support pour les préparations obtenues par chromatographies d'immunoaffinité. Ces anticorps pourraient générer des réactions allergiques chez certains patients lors de l'injection répétée du produit. 9