Biossensores - 03 de Outubro - Transdução (PDF)

Biossensores Elementos e técnicas de transdução ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Tipos de Transdutores Qual é o elemento transdutor (fisicamente) e a metodologia de Qual é o resultad...

Biossensores Elementos e técnicas de transdução ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Tipos de Transdutores Qual é o elemento transdutor (fisicamente) e a metodologia de Qual é o resultado da transdução. interacção do ERB Qual é a resposta final com a espécie de produzida pelo interesse (que o transdutor, que é transdutor “converte” numa mensurável e de resposta final). interesse analítico. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Tipos de transdutores TRANSDUÇÃO: conversão da “alteração” decorrente do processo de reconhecimento biológico numa quantidade mensurável; formato de utilidade analítica: RESPOSTA; Para o mesmo conjunto: ERB / analito e para a mesma alteração produzida podem ser utilizados diferentes transdutores (bioss acril, pot e cond ; Var mass e dens opti); Em termos gerais, o método de transdução dependerá sempre das espécies envolvidas no processo de reconhecimento biológico e…. em particular, da “alteração” resultante da interacção entre o analito e o ERB. Amperométricos Eletroquímicos Potenciométricos Calorimétricos Condutimétricos Óticos Piezoeléctricos ou acústicos ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores amperométricos  O TRANSDUTOR consiste num elemento eletricamente condutor (“um eléctrodo”);  “Fornece” valores de intensidade deelectroactive corrente eléctrica resultantes de uma reacção redox (à superfície do transdutor) de uma espécie electroactiva, envolvida no processo de reconhecimento molecular;  O ERB é imobilizado na superfície do transdutor; Current  TRANSDUÇÃO: conversão da transferência de carga (decorrente da reacção redox) numa resposta ou valor mensurável;  RESPOSTA: I = f (concentração espécie electroactiva): pode ser o analito de interesse, ou não…;  Aplicação de uma d.d.p.(E) constante entre um ET (eléctrodo de trabalho, WE - Transdutor) e um ER (eléctrodo de referência, RE) com medição da variação de intensidade de corrente e- eléctrica em função do tempo associada à reacção de oxidação ou redução de uma espécie electroactiva; Time  Conduz-nos sempre ao conhecimento da concentração da espécie de interesse; 1º - ligação do antigénio ao anticorpo (Ab) de captura;  Materiais de eléctrodo: platina, ouro, prata e derivados de carbono; 2º - ligação do Ab “marcado” e monitorização da evolução da I. Miniaturização, com desenvolvimento de I = f (C espécie electroactiva)  f (C antigénio) biosensores portáteis, com baixo custo associado…… Dispositivos implantáveis??? ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Primeiro biossensor: Amperométrico!!! (Clark e Lyons, 1962): Baseado no eléctrodo de O2 de Clark (1956) E constante Análise e avaliação de alguns parâmetros em amostras de sangue (ex. O2 dissolvido). Redução do O2 à superfície do eléctrodo de Pt Pt : O2 + 4H+ + 4e- → 2H2O (-0.60 V) Resposta: Variação da intensidade de corrente Enzima confinada entre eléctrica com o tempo… membranas poliméricas 1º Biossensor para medição de glucose no I = f (Conc. O2) sangue: transdução amperométrica I = f ([O2])  Conc. Glucose estequiometria ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores amperométricos I = f (C espécie electroactiva)  Espécie electroactiva ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Outras técnicas voltamétricas Resposta: pico de corrente = f (C). Varrimento de potencial ( Ecte) I Epa Ip a Emáx Varrimento linear + - : reduções (reacção catódica) E - + : oxidações (reacção anódica) Ef Ei  Ef Ip = f (Conc.) Ipc Epc E 80 I vs. Cv Ei Ef Ei 40 E Emáx I / A Voltametria 0 cíclica -40 -80 Ei  Ef -0.200 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 E / V vs. Ag/Ag/Cl ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores potenciométricos TRANSDUTOR: consiste num sensor (eléctrodo) “sensível” a espécies com carga (iões); Classe particular: eléctrodos seletivos de iões (ESI / ISE): H+, F-, CN-, Na+, Ca2+ , NH4+; O ERB é imobilizado na superfície do Eléctrodo Selectivo; TRANSDUÇÃO: conversão da variação da concentração de espécies com carga (iónicas) presentes na amostra, resultante da interacção entre o ERB e o analito, numa resposta final; RESPOSTA: um valor de diferença de potencial (E ou d.d.p) que é função da variação da concentração deste tipo de espécies; Mede-se a acumulação ou depleção de carga – AUSÊNCIA DE REACÇÃO redox (“ensaio de corrente nula”); K - termo constante;  2.303 RT  E K   log C  S - declive experimental da “equação de Nernst”;  nF  C - concentração do ião a que o transdutor “responde”; n - n.º de oxidação do ião. S = 59.16 mV/dec, 25 ºC Permite, por exemplo, avaliar a performance analítica do transdutor antes da sua utilização na montagem de um biossensor. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Aplicação: Determinação de penicilina em amostras clínicas (Biossensor potenciométrico) O que se mede? pH = - log [H+] ? [H+] penicilinase estequiometria Penicilina ácido penicilóico + H+ da reacção… Hidrólise [Penicilina] = ? ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Determinação de ureia em amostras de urina (Biossensor potenciométrico) ureia Urease A enzima urease é confinada numa 𝐂𝐎 𝐍𝐇𝟐 𝟐 (aq) + 2H O (l) 𝟐NH (aq) + CO (aq) membrana polimérica e colocada em 𝐍𝐇𝟒 𝐚𝐪 + 𝐇𝟐 𝐎 𝐥 𝐍𝐇𝟑 𝐚𝐪 + 𝐇 (𝐚𝐪) contacto directo com a superfície de um eléctrodo de pH; Trabalho desenvolvido no ISEL Eléctrodo selectivo a iões amónio Membrana polimérica com urease CO NH (aq) + 2H O (l) 𝟐𝐍𝐇𝟒 (aq) + CO (aq) Amostra contendo ureia estequiometria da reacção ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  E inicial Sensor de ADN com transdução potenciométrica E final Redistribuição de carga (iões) à superfície do transdutor, após o processo de hibridação, determinando uma variação da d.d.p. que constitui a evidência da ligação das CsADN alvo. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Exemplos de Biossensores Potenciométricos ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores condutimétricos TRANSDUTOR: Dispositivo condutimétrico que permite medir variações de condutividade da amostra; “Fornecem” valores de condutividade ou condutância, função da variação da concentração de espécies iónicas (espécies com carga) na amostra; TRANSDUÇÃO: conversão da variação da concentração de TODAS as espécies iónicas/com carga, resultante da interacção entre o ERB e o analito, numa resposta final; RESPOSTA: um valor de condutividade ou condutância (G); Transdutor Célula condutimétrica ou O ERB é imobilizado na “zona sensitiva” do transdutor; outro dispositivo condutimétrico “Zona sensitiva” para imobilização do ERB ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Célula condutimétrica 1 G Condutância (-1 = S) R Dispositivo interdigital ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Condutimétricos Original ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Condutimétricos ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores condutimétricos 1 G R d  R ρ A and the winner is….? ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensor Condutimétrico Determinação de acrilamida em amostras alimentares e água para consumo humano: Uma questão de Saúde Pública Mecanismo: Biossensor Enzimático G G Transdução condutimétrica: 0 2 4 6 ΔG = f ([NH4+; OH-]  f ([Acrilamida]) t (min) ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Condutimétricos Calibração do biossensor condutimétrico utilizando divsersas soluções de concentração conhecida de acrilamida: soluções padrão de acrilamida… 1M y = m x + b G (mS) 5×10-1 M 1×10-1 M G (mS) = m [acrilamida] (M) + G (ms) 5×10-2 M 1×10-2 M 160 5×10-3 M G (mS) E (mV) Gamostra 1×10-3 M 80 5×10-4 M Ginicial 0 2 4 6 0 t (min) -3,5 5 x 10 -4 -2,5 Camostra -1,5 -0,5 5 x 10 -10,5 Resposta da amostra Log [acrilamida] (M) ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores calorimétricos Medição do calor libertado ou consumido durante uma reacção bioquímica; “Fornecem” uma variação de temperatura do meio reaccional decorrente da variação de entalpia da reacção (energia sob a forma de calor); Utilizada em biosensores catalíticos  reacções biocatalisadas que conduzam a uma variação de entalpia; Obter informação relativa à concentração do substrato ou produto da reacção; Substrato Produto a i a) Amostra; d b) Reactor isolado; c) Permutador de calor; b g d) Caixa de alumínio; h e) Termístor de referência; f) Bioreactor; c f g) Termístor na saída; h) Medição do T. e ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores Óticos TRANSDUTOR: Elemento sensível à alteração do comportamento/propriedades de uma radiação eletromagnética. O processo de transdução produz como resposta*, um valor ou variação do valor de um determinado parâmetro associado à natureza, propriedades ou comportamento de um feixe de radiação (quando este “interage” com a biocamada onde ocorre - ou ocorreu – uma interação entre o ERB e o analito); Parâmetros tipicamente medidos: Intensidade de luz absorvida/emitida, ângulo de incidência de um feixe de luz, plano de polarização da luz, entre outros…….; A alteração do valor de um dos parâmetros referidos (e que resulta do processo de reconhecimento molecular que ocorre ao nível da biocamada) evidencia ou “sinaliza” a presença da espécie de interesse, podendo permitir adicionalmente a sua quantificação; A resposta analítica* “produzida” é f = (Cespécie opticamente ativa); ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores Óticos Aproximação mais comum - Medição da luz absorvida ou emitida: 1 - pelo analito (se este exibir propriedades óticas); 2 - por uma espécie que resulte da interacção entre o ERB e o analito, ou ainda, (se as condições anteriores não se verificarem) 3 - por um marcador ótico da reação, interveniente no processo de reconhecimento molecular; i.e, no mecanismo de “funcionamento” do biossensor. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores óticos DETEÇÃO DIRETA , , I0 It Exemplo: medição da intensidade de radiação absorvida DETEÇÃO INDIRETA It , , I0 (b) (a) Optical Label 𝑆𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝑓 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑚𝑎𝑟𝑐𝑎𝑑𝑜𝑟 ó𝑝𝑡𝑖𝑐𝑜 Medição da intensidade de radiação absorvida (a) ou = 𝑓 𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑒𝑠𝑝é𝑐𝑖𝑒 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑒𝑠𝑠𝑒 emitida (b) por uma espécie ótica conjugada com a cadeia alvo de DNA ou com o antigénio (analitos). Maior complexidade; (a) e (b) Tempo global de análise mais elevado; Custo envolvido mais elevado; ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores Óticos Alternativa ??? SPR Ressonância do Plasmão de Superfície (Surface Plasmon Ressonance); Utilização de um feixe de radiação eletromagnética para monitorização DIRETA de alterações nas propriedades físicas da biocamada (variação da densidade ótica, índice de refração DA BIOCAMADA), decorrentes da interação do ERB com o analito de interesse; Evidência da interação entre o analito e o ERB Não necessita de marcadores óticos da reacção !!! Geralmente associados a reconhecimentos moleculares por afinidade específica: Ab / Ag e ADNsonda / ADNalvo; ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores óticos Refração da luz: mudança de velocidade de propagação de uma radiação eletromagnética quando esta atravessa a interface de separação de dois meios diferentes. “Reflexão interna” ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  SPR (princípio de funcionamento) Radiação incidente Radiação reflectida mínimo de IR Biocamada Ouro, prata… - O valor de R (a posição do feixe incidente) depende de: Promover e manter o fenómeno de Excitação do -E (, ) → constante durante o ensaio ressonância: para o efeito, a radiação plasmão de incidente deve ter uma energia suficiente superfície a R - Densidade ótica à superfície do metal (, ) e deve incidir com um ângulo - Quando esta se altera: “compensação” no R adequado…. Quando acontece??? ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  SPR (princípio de funcionamento) Um plasmão de superfície pode ser entendido como uma onda electromagnética que se propaga ao longo da superfície de um metal; Os electrões livres de um metal podem ser considerados como uma solução destas partículas de elevada densidade (plasmão); A excitação do plasmão de superfície é baseada no efeito de reflexão interna total de um feixe de luz, quando este incide numa camada de metal localizada entre um sensor de vidro e um meio externo; Um feixe de luz monocromática polarizada é focado, por intermédio de um prisma, na parte inferior do filme metálico (ouro por ex.), num intervalo de valores de ângulo de incidência (θ) passíveis de provocar reflexão interna. A cada um dos ângulos de incidência corresponde um determinado ângulo de reflexão interna; A um determinado valor de ângulo de incidência do feixe de luz, a excitação do plasmão de superfície é promovida pela absorção de fotões da radiação pelos electrões do metal; ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  SPR (princípio de funcionamento) O efeito resultante (a ressonância do plasmão de superfície) conduz a um valor mínimo de intensidade da luz refletida (IR). O ângulo de incidência que promove a excitação do plasmão de superfície é designado por ângulo de ressonância (θR); O valor de θR, além de depender do comprimento de onda da radiação utilizada, é extremamente sensível a qualquer alteração das propriedades do meio adjacente à superfície metálica (ex. biocamada), em particular da densidade ótica ou índice de refração; Mantendo o comprimento de onda da radiação constante, a variação do valor de θR (e consequentemente do mínimo de intensidade observado) dependerá apenas da variação da densidade ótica ou índice de refração à superfície do filme metálico; Se este parâmetro sofrer alguma alteração, é efetuada uma compensação do ângulo de incidência de modo a que a excitação do plasmão de superfície continue a verificar-se. Quando acontece??? Ligação do analito ao biorecetor (alteração da densidade ótica…) A alteração de R é uma evidência da ligação do analito ao biorecetor ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Imunosensor ótico (baseado em SPR) A variação de R de modo a manter o fenómeno ótico (SPR), resulta da alteração da densidade ótica da biocamada que por sua vez decorre da ligação do antigénio ao anticorpo…. RESPOSTA: Variação do ângulo de ressonância R4 R máx. (Unidades de Ressonância) R3 em função do tempo …de R2 R = f (CAg ) reacção. 1 UR corresponde a uma alteração no R de 10−4 graus. Biocamada “saturada”  R máximo; Detecção direta (sem marcadores); Para a concentração exemplo são ocupados  60% dos Ab Monitorização em tempo real. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Imunosensor ótico (descrição da aplicação) O filme de ouro é recoberto com o elemento de reconhecimento biológico (anticorpos); A variação da densidade ótica dependerá da alteração de massa que possa ocorrer na superfície adjacente ao filme de ouro (biocamada) devido à ligação do antigénio; O ângulo de reflexão interna aumenta de 1 para 2, em resultado de um aumento no valor do ângulo de ressonância de θR1 (figura A) para θR2 (figura B); Esta variação surge em função da ligação do antigénio ao anticorpo imobilizado na superfície metálica, o que determina a alteração da massa e consequentemente da densidade ótica da biocamada (figura B); A figura C mostra o perfil de variação da intensidade de radiação reflectida internamente antes e após a ocorrência da interacção específica; A variação do sinal de ressonância (que corresponde à posição de θR) é expressa em unidades de ressonância (UR) em função do tempo. O gráfico resultante designa-se por sensograma (figura D); A alteração no valor de θR pode ser monitorizada em tempo real (através da representação do sensograma) utilizando um sistema em fluxo contínuo. A evolução do sensograma permite obter informação sobre a existência e a extensão da ligação do analito ao ERB imobilizado; O processo continua até ser atingido um equilíbrio onde a quantidade de analito que se liga ao ERB iguala a que sofre o processo inverso. Nesta fase não se observa variação adicional da massa e da densidade ótica da biocamada, pelo que o valor de θR se mantém constante; Este facto é traduzido pelo patamar do sensograma da figura D; O bioreceptor pode ser regenerado promovendo a dissociação do complexo anticorpo / antigénio. ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Biossensores piezoeléctricos (ou acústicos) “Fornecem” como resposta uma variação na frequência de vibração experimentada por um cristal piezoeléctrico decorrente de uma variação de massa na sua superfície, que resulta da ligação de um analito a um bioreceptor imobilizado; Frequência vibracional ou de oscilação ( f ) típica de cada cristal (massa, forma, espessura, ângulo de corte…); Variação de massa à superfície do cristal  variação na f ; Quartzo é o cristal mais utilizado; Deteção DIRETA da interação entre o analito e o biorecetor, sem recurso a marcadores de reação; ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Biossensores piezoeléctricos (ou acústicos) ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Biossensores piezoeléctricos (ou acústicos) ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Biossensor piezoeléctrico (princípio de funcionamento) A B f = f (Canlito) Microbalança de cristal de quartzo Sensor de massa ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Piezoeléctricos ou acústicos Transdutor: uma Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM); Resposta: variação na frequência de vibração experimentada por um cristal piezoeléctrico decorrente de uma variação de massa na sua superfície; Esta, por sua vez, resulta da ligação do analito a um bioreceptor imobilizado; Variação na frequência de vibração do cristal (f ): f (Conc. analito) Geralmente associados a interacções específicas: Ag/Ab e ADNsonda/ADNalvo  Deteção Directa (sem marcadores); variação de massa; Análises em Tempo Real !!! ISEL/ESTeSL – SI2425 36 MEB – Nanotecnologia e Biossensores Biossensor piezoeléctrico (princípio de funcionamento) https://www.youtube.com/watch?v=kzmBK9mONq8 ISEL/ESTeSL – SI2425 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Trabalho desenvolvido no ISEL ISEL/ESTeSL – SI2425 38 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Piezoeléctricos ou acústicos f1 f = f1 – f2 f(Concentração de antigénio) f2 10005600 f = f (CAntigene) Frequency (Hz) Ar Frequência inicial f1 10004600 f2 f3 f4 10003600 Ag1 (1:500) Ag2 (1:100) Ag3 (1:50) Ag4 (1:25) 10002600 0 20 40 60 80 100 time (min) ISEL/ESTeSL – SI2425 39 MEB – Nanotecnologia e Biossensores  Biossensores piezoeléctricos – descrição do princípio de funcionamento Microbalança de cristal de quartzo - QCM, Quartz Crystal Microbalance O dispositivo consiste num disco de cristal piezoeléctrico de quartzo com ambas as faces revestidas por um depósito de ouro (eléctrodos) “funcionalizado”; O cristal é ligado a um circuito oscilador aplica uma corrente eléctrica alternada entre os eléctrodos de ouro, promovendo uma oscilação no centro do cristal piezoeléctrico com uma frequência vibracional característica (frequência de ressonância natural do cristal); Directamente ligado ao circuito oscilador existe um contador de frequência (frequencímetro) responsável pela medição da frequência de oscilação do cristal; A figura A mostra um esquema de uma QCM com os restantes elementos que constituem o sistema sensor; A variação da frequência de oscilação do cristal de quartzo ao longo do tempo, em função do estabelecimento de uma bioreacção de interesse na superfície do eléctrodo e da consequente variação de massa, conduz à obtenção de um perfil semelhante ao representado na figura B; Esta alteração promove uma diminuição da frequência de oscilação do cristal à medida que o analito se vai ligando ao bioreceptor imobilizado na sua superfície, até que este se encontre totalmente “ocupado”; A resposta observada é relacionada com a concentração do analito em estudo; Considerando que a QCM é um sensor de massa, a adsorção não específica de moléculas presentes na amostra à superfície do dispositivo pode constituir uma interferência importante. 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