Apuntes de Bioquímica y Microbiología Enología (2020/2021)

4º Biotecnología BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS Apuntes Ainhoa Riera Begué Curso 2020/2021 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué ÍNDICE TEMA 1 LA VINIFICACIÓN.............................................................................................................. 2 TEMA 2 COMPOSICIÓN DEL MOSTO Y DEL VINO........................................................................ 17 TEMA 3 SULFUROSO EN ENOLOGÍA............................................................................................ 22 TEMA 7 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA....................................................................................... 27 TEMA 10 FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA.................................................................................. 37 TEMA 12 BIOQUÍMICA DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DEL VINO......................................... 43 TEMA 13.1 BIOQUÍMICA COMPUESTOS AROMÁTICOS.............................................................. 47 TEMA 13.2 BIOQUÍMICA DE LOS COMPUESTOS AROMÁTICOS.................................................. 51 TEMA 15 ENZIMAS EN ENOLOGÍA............................................................................................... 55 TEMA 14 ANÁLISIS SENSORIAL Y AROMAS................................................................................. 60 TEMA 4 INTRODUCCIÓN A LAS FERMENTACIONES.................................................................... 65 TEMA 5 LEVADURAS: ASPECTOS BÁSICOS DE INTERÉS EN ENOLOGÍA....................................... 67 TEMA 6 LEVADURAS: ASPECTOS APLICADOS EN ENOLOGÍA...................................................... 77 TEMA 8 ALTERACIONES PRODUCIDAS POR LEVADURAS............................................................ 86 TEMA 9 LAS BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO.............................................................................. 91 TEMA 11 ALTERACIONES PRODUCIDAS POR BACTERIAS LÁCTICAS............................................ 97 TEMA 16.1 VINIFICACIONES ESPECIALES: LEVADURAS DE SEGUNDA FERMENTACIÓN........... 101 TEMA 16.2 VINOS CRIANZA....................................................................................................... 106 TEMA 17 BACTERIAS ACÉTICAS................................................................................................. 111 TEMA 18 HONGOS Y MOHOS FITOPATÓGENOS DE LA VID...................................................... 117 TEMA 19 BIOTECNOLOGÍA ENOLÓGICA.................................................................................... 123 TEMA 20 MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA APLICADA.................................................................. 128 1 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué TEMA 1 LA VINIFICACIÓN El vino es una transformación del mosto, es el producto obtenido de la fermentación del mosto de la uva. En la fermentación se produce alcohol, por tanto es una solución hidroalcohólica (vino sin alcohol no es vino). HISTORIA DEL VINO La producción y consumo de vino comenzó 6000 años A.C en la antigua Persia, aunque no se parecía al vino que tomamos hoy en día, por ejemplo los romanos tomaban el vino caliente mezclado con agua, aceite y especias. En el siglo XII en Europa coge importancia la viticultura y se extiende el consumo de vino gracias a las abadías, monasterios, etc. El vino más parecido al que conocemos ahora se empieza a hacer en Francia en el XVI-XVII, la uva se deja madurar más. En el siglo XIX una plaga americana llega a Europa, la filoxera, es un pulgón que hace que se seque la viña, esto hace que desaparezca todo el viñedo de Europa. Lo que llevo a un cambio radical de la viticultura, ya que ahora hay que poner un pie americano resistente a la plaga y ahí se inserta la variedad que se quiere cultivar. A las Canarias no llegó la filoxera, por eso ahí hay especies prefiloxéricas. La materia prima del vino no se puede cultivar en cualquier parte del mundo, este es el caso de los trópicos y los lugares fríos. Hay cinco países que cultivan la mitad de la vid de todo el mundo: España, Italia, Francia, China y Turquía. En el hemisferio norte los principales productores son los países mediterráneos y EEUU, mientras que en el hemisferio sur Australia es un gran productor, así como Sudáfrica, Chile y Argentina. CONTROL DE CALIDAD En España los niveles con los que se categoriza la calidad del vino es la siguiente: El vino de mesa es vino sin indicación geográfica, procede principalmente de la Mancha, a diferencia del vino de la tierra. Los vinos de pago son los de mejor calidad, y únicamente hay 17 en toda España. Para ser vino de pago la uva que sale de esa finca tiene que ser suficientemente diferente del vino que se elabora en las bodegas de alrededor. 2 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Los vinos con denominación de origen son unos 70 y cada vez hay más, por eso los más antiguos han querido diferenciarse de las nuevas que van proliferado, para ello aparece una nueva categoría: vinos con denominación de origen calificada, estos son Rioja y Priorat. COMPOSICIÓN DE LA UVA La uva hace referencia al racimo completo, el 95% son las bayas y el resto es el raspón. Lo primero que se hace es despalillar, es decir, eliminar el raspón de las bayas, ya que lo único que entra a la bodega es una papilla elaborada con los granos de uva. El 90% de las bayas es líquido (mosto) y el resto los hollejos. En la mayor parte de los casos el mosto es transparente, todo el color que tiene el vino procede de los hollejos, por tanto el 10% de los granos de uva es lo que aporta el color y el sabor del vino. Los taninos y los antocianos determinan el color y el sabor del vino, por eso es importante que el líquido esté en contacto con los hollejos en un proceso que se denomina maceración. Las pepitas no son favorables, se van al fondo del depósito y no se extrae nada de ellas, su principal componente son los lípidos. COMPOSICIÓN DEL MOSTO Y DEL VINO La principal diferencia en cuanto a composición entre el mosto y vino es el contenido en alcohol y en azúcar. El mosto tiene 200 g/L de azúcar mientras que el vino solo 1 g/L, esto es porque el azúcar es consumido por las levaduras para generar el alcohol, al cual no posee el mosto. El olor también es muy distinto entre las uvas y el vino, ya que las uvas no huelen a nada (excepto las uvas moscatel que sí que huelen como el vino moscatel). El vino adquiere el olor gracias a los compuestos generados por las levaduras, o también puede ser debido a que a veces lo compuestos que dan el olor al vino, en la uva están unidos a azúcares y por eso no huelen, pero en la fermentación se rompe la unión y dan el olor en el vino. La calidad intrínseca es lo que hay dentro de la botella, características medibles, mientras que la calidad extrínseca viene dada por el precio, la botella, etc. La primera es la que nos interesa, y viene marcada principalmente por la composición de las uvas, así como el proceso de 3 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué vinificación y envejecimiento del vino, aunque en menor medida. Esta composición viene fijada por otras muchas variables: VARIEDADES DE UVA Las uvas con las que se hace el vino son uvas de grano pequeño, ya que interesa una relación superficie/volumen de la baya grande. La uva puede clasificarse en función de uso, puede ser de mesa, de vinificación o de pasificación. Existen hasta 5000 variedades reconocidas y unas 150 son importantes para elaborar vino. Estas variedades están adaptadas al tipo de clima y de suelo, por lo que hay variedades que sólo se cultivan en una determinada región, estas se denominan variedades minoritarias. Existen variedades de uva blanca (moscatel, Chardonnay, Souvignon Blanc, Verdejo) y tinta (Garnacha, tempranillo, Merlot, Cabernet Sauvignon). Con las variedades de uvas tintas se puede hacer vino blanco ya que el mosto en sí siempre es transparente, por ejemplo la Pinot noir se usa para hacer el Champange. Los principales tipos de suelo son: arcillosos, arcilla caliza, arcilla ferruginosa, arenosas, arena caliza, caliza, húmedos/secos, pedregosos, altos/bajos, planos/con pendientes y muchísimas mezclas. El clima es el responsable de lo que se conoce como añadas que es la forma de identificar una serie de características climáticas en un periodo determinado y que condicionan la calidad de la uva. Por ejemplo, una añada muy húmeda puede favorecer la aparición de hongos. Hay dos tipos de conducción de los viñedos, uno dirigido en espaldera y otro dirigido en vaso. En la primera se puede introducir la vendimiadora mecánica y así no se hace manualmente. 4 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Una cepa de vid puede durar más de cien años, las más duraderas suelen estar en vaso. Con la poda Guyot en el invierno se da forma a la planta cortando el tronco por diferentes partes, esto también viene regulado en las denominaciones de origen. Dependiendo de cómo se poda se tendrán más o menos racimos, lo que determinará que el vino sea más o menos concentrado, ya que si una planta tiene que madurar muchos kilos estos estarán menos concentrados. Las plantas en espaldera normalmente dan más kilos de uva. LEVADURAS DOS TENDENCIAS Las levaduras pueden ser autóctonas, propias del viñedo y de la bodega, o pueden ser seleccionadas. En cuanto a la fermentación que llevan a cabo existen dos tendencias, por un lado hay levaduras que sólo fermentan y que no aportan nada más al vino, mientras que otras levaduras son seleccionadas para exaltar el aroma del vino o producir aromas secundarios. En las primeras levaduras la característica del vino serán más varietales. PROCESO DE MADURACIÓN Para llegar a cualquiera de esos dos vinos la uva tiene que estar madura. Esto es uno de los puntos que hoy en día se tiene más en cuenta, es decir, que la materia prima esté suficientemente madura. En la fruta, conforme va madurando, se acumulan determinadas sustancias (azúcar, potasio, aminoácidos que son la fuente de N de las levaduras, antocianos que son los compuestos del color, terpenos, norisoprenoides), descienden otras (ácidos: tatárico, málico y cítrico, metoxipirazinas, los taninos de las pepitas y carotenos) y se forman aductos (de glicosilación, polimerización y combinaciones: tanino-antociano, tanino-proteína). Proceso de maduración: los componentes de la uva dependen del estado de maduración de esta. - Cuando la uva madura toma el máximo de color, nivel de azúcar y pierde acidez, esto se nota porque los granos ya no están tan rígidos, cuando separas las bayas del raspón se desprenden fácilmente y dejan el pincel coloreado (parte del raspón que se encuentra en el interior de la baya). - Los granos se ponen translucidos y blandos, con un sabor suave, azucarado. - El mosto es viscoso y pegajoso al tacto. - Otra característica de la baya madura es que los taninos de la semilla han ido transformándose de manera que las semillas pasan de tener un color verde a uno negro. - Cuando tiene aromas varietales propios, como en la uva moscatel, van aumentando con la maduración. Los aromas típicos de la uvas moscatel son los terpenos, estos terpenos al ir trascurriendo los días de maduración, es decir, a lo largo del envero, van aumentando. La evolución de los aromas varietales no tiene por qué coincidir con la evolución de los azúcares y la acidez. Por eso una cosa es la madurez fisiológica de la planta, que se refiere principalmente a azúcares y ácidos, y otra cosa es la madurez tecnológica, es decir, las uvas con las condiciones adecuadas para el vino que se quiere en el mercado. La madurez fisiológica está marcada por el máximo de azúcar, este máximo de azúcar se correspondería con un vino con una madurez tecnológica con máximo de alcohol, y normalmente no se quieren unos vino con una graduación muy alta. En medio de esas dos encontramos la madurez óptima. 5 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué *Envero: tiempo que pasa mientras el racimo de uva va cogiendo el color. Seguimiento de la maduración: Lo primero que empieza a trabajar en la bodega es el laboratorio, ya que hay que ir muestreando la viña y medir los parámetros para saber cuál es el momento perfecto para vendimiar. Para ello se toman una serie de medidas: - Nivel de azúcar - Peso de 100 bayas: durante el envero el peso va aumentando, en el momento en el que el peso se estanca se considera que ya se ha conseguido la madurez fisiológica, incluso el peso puede disminuir debido a la pérdida de agua de las baya, esto se denomina sobremaduración. - La acidez. - Los polifenoles se miden en el caso de los vinos tintos. Es importante que el color que tengan las uvas sea fácilmente extraíble para que ese color esté en el vino. Por otro lado, se han diseñado varios índices para decidir cuál es el momento perfecto para vendimiar, entre ellos la relación azúcar/acidez. Dyostem está comercializado y sirve para medir estos índices; muestrean el campo, ponen las bayas ordenadas en una especie de bandeja, se hace una foto y percibe color y tamaño de las uvas, y con datos de azúcar y acidez te indica el momento idóneo para vendimiar teniendo en cuenta datos de años anteriores. También es importante el estado sanitario de la uva, a veces puede estar afectado por hongos. Hay distintas medias para el azúcar, equivalentes las unas con las otras:  Grados Brix: se mide mediante refractometría. Consiste en la diferencia de velocidad a la que viaja la luz en el aire o en un medio debido a la diferencia de densidad. Un grado Brix es aproximadamente 1-2% de azúcar en peso.  Grados Baumé (Be): también se mide mediante refractometría. El grado Be está calibrado con disoluciones de distinta concentración de NaCl, un 0°Be es igual a agua destilada, mientras que 10% de NaCl son 10°Be  Densidad g/L  Concentración de azúcar g/L  Alcohol probable: Cada 17 g/L de azúcar que transforman las levaduras equivale a un grado de alcohol en el vino. Tanto los grados Brix como Beaumé son escalas arbitrarias para medir densidades. A mayor densidad/Brix/Be más azúcar, lo que significa que el vino tendrá más grado alcohólico, mayor % v/v. En cuanto a la madurez del color se mide mediante espectrofotómetro. Los colores absorben en el visible por lo que se hace la suma de las absorbancias a 420, 520 y 620 nm. Los polifenoles totales del mosto se miden a 280 nm y a 750 nm (índice de Folin), y a 230 nm se mide la astringencia, esto último son compuestos que reaccionan con la saliva de nuestra boca y precipitan haciendo que los vinos sean astringentes. Hay una metodología, Cromoenos, desarrollada en Cariñena, que mide cómo se van a poder extraer los antocianos de la uva, que es una de las propiedades que determina la madurez de la uva. Si la uva está madura, los antocianos van a pasar con más o menos facilidad al vino. 6 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Factores que influyen en la formación de color y aromas:  Luz y sol.  Fertilidad de los terrenos.  Riego y disponibilidad de agua.  Variedad.  Cantidad de uva de la planta, rendimiento. Además hay que tener en cuenta que no siempre se quiere el mismo tipo de vino, y todos tienen distinto grado de alcohol y acidez. Tipos de vinos:  Vino joven: para consumirlo ese mismo año.  Vino base para espumosos: vino para hacer cava.  Vino para destilación y obtener alcohol.  Vino para envejecer.  Vinos especiales. El vino tinto tiene más alcohol que los espumosos, mientras que estos son más ácidos, por ello para los espumosos hay que vendimiar antes para que sean más ácidos y con menos alcohol. RECOGIDA DE LA UVA - Si la uva no está conducida en espaldera se vendimia a mano, esto es lo mejor para hacer vino de alta calidad, ya que no se rompen los granos, llega el racimo entero a la bodega… - Si la uva está conducida se usan máquinas, vendimiadoras. Como ventaja es que es más rápido y barato, y se puede vendimiar de noche que es cuando la temperatura es más baja por lo que los procesos de oxidación y enzimáticos tienen lugar de forma más lenta con lo que no se estropea tanto la uva. El problema es que se produce dilaceración de los granos. Es importante que el transporte sea rápido de la viña a la bodega, para evitar la oxidación del mosto. Para evitar esto los contenedores a veces tienen una atmosfera de nitrógeno. En cuanto a los materiales de recogida depende del vino que se va a producir después, por ejemplo el champagne tiene que ir en cajas de como máximo 50 kg y si se usa remolques deben tener un tamaño de máximo 80 cm, así se evita que se chafen las uvas y que pierda calidad. Cuando la vendimia llega a la bodega se hacen una serie de mediciones: se controla el peso, el grado alcohólico probable (azúcar), pH, acidez, color y estado sanitario. Para controlar esto último, es decir, ver si está podrida o no, se hace una cuantificación del ácido glucónico del mosto o del glicerol, con eso se mide el nivel de podredumbre de la uva. Lo que se busca siempre es una elaboración respetuosa, limitando el empleo de aditivos, seleccionando levaduras propias y protegiendo siempre microbiota autóctona de la viña. La viña hay que tratarla con el mayor respeto hacia al medio ambiente, se huye del uso de fitosanitarios. En las bodegas también es obligatorio la incorporación de depuradoras para que los efluentes de la bodega sean tratados, ya que las aguas residuales de una bodega son ricas en materia orgánica ácida. (El pH del vino tiene aproximadamente entre un pH de 3-4). 7 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Se buscan vinos íntegros con los menos tratamientos posibles, por eso a veces se pueden encontrar precipitados en el fondo de la botella. Las bodegas suelen construirse en diferentes alturas para evitar el uso de bombas al trasvasar el mosto/vino. De todas maneras esto depende de las denominaciones origen y las legislaciones. En la OIV (Organización Internacional de la Viña y el Vino) todo lo que no está estrictamente permitido no se puede añadir al vino, por ejemplo en Alemania como no tienen sol las uvas maduran poco, por lo que está permitido añadir azúcar para tener vinos con más alcohol, esto se denomina chaptalización. Sin embargo en EEUU se puede hacer todo excepto lo que está prohibido o atenta contra la salud. ELABORACIÓN DE VINO TINTO La mayor diferencia entre el tinto y el blanco/rosado es el color, debido a esto la principal diferencia en la elaboración es la fermentación. Para el tinto la fermentación tiene lugar con las partes sólidas, es fundamental el proceso de maceración, es decir, el contacto del mosto con las pieles. En la zona de recepción de la uva se hace una papilla con toda la baya (pieles y pepitas) y esto se fermenta, a lo largo de esa fermentación tiene lugar la maceración, que es la extracción de los compuestos del color al líquido. Sin embargo para un vino blanco o rosado, lo que es la fermentación tiene lugar sólo en el líquido, previamente se tendrán que haber quitado las pieles y las pepitas. Con lo cual en el blanco/rosado no hay maceración (en realidad en el rosado hay un poco de maceración previa a la fermentación). Las levaduras usan los componentes de la uva para llevar a cabo la fermentación, por lo que las características de la uva son esenciales para un buen vino. Para tener buenas características la uva: - Debe tener una buena maduración. - No haber sufrido estrés hídrico. - Haber tenido abundancia de sol. Diagrama de flujo vino tinto joven 1. Se parte siempre de uvas tintas, puede haber una selección de ellas. 2. Zona de recepción, donde se hace la papilla. 3. Esa papilla se somete a un sulfitado, que consiste en la adición de sulfuroso como conservante y antiséptico, para que sólo lleguen al depósito de vinificación las levaduras correspondientes. 4. Una vez en el depósito se produce la fermentación y maceración. A veces se aprovecha el CO2 de la fermentación para que la pasta esté en continuo movimiento. 5. Una vez terminada la fermentación se somete a otro sulfitado para que el vino se pueda almacenar, ya va a ser estable microbiológicamente. 6. Se le hará una serie de procesos para terminar el vino y al final se pasará a botella y a comercializar. 8 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué En la zona de recepción lo primero que encontramos es una despalilladora, que separa las bayas de los raspones, consiste en un tornillo sin fin con unos palos, y a la salida del tornillo sale el raspón (primer subproducto). Las bayas que salen del cilindro pasan a la estrujadora, que son unos rodillos que hacen una papilla con las bayas, se denomina pasta, que contiene la piel, las pepitas y el mosto. Esta pasta se lleva con una bomba de pistón hasta los depósitos donde fermenta. Hace años todos los depósitos eran de cemento, actualmente son de acero inoxidable (lo más industrial), sobre todo porque deja transmitir el calor lo que permite controlar la temperatura de fermentación. Se siguen usando depósitos de madera, que dependiendo del tamaño o la zona se llaman de una forma u otra: depósitos de 225L son las barricas, más grandes hasta 500L se llaman bocoy, y todavía más grande se llaman tino. Los depósitos de acero inoxidable tienen unas dobles paredes para hacer pasar por ahí agua fría o agua caliente, normalmente fría para que no suba la temperatura durante la fermentación. Esta posibilidad no está en los depósitos de cemento. Sea el depósito que sea, se puede hacer el seguimiento en la fermentación, proceso en el que las levaduras consumen el azúcar y producen etanol, CO2 y calor. El control de la fermentación se hace controlado la pérdida de peso a lo largo del tiempo. Esta pérdida de peso se debe al CO2 que se genera tras la fermentación y se va desprendiendo, por eso en plena fermentación es cuando se produce más pérdida de peso, ya que se desprende más CO2. 9 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué También se puede controlar la fermentación midiendo la velocidad de producción de CO2. Por otro lado la concentración de azúcar a lo largo de la fermentación va disminuyendo, por lo que para hacer un seguimiento habría que medir los grados Beaumé o Brix. Lo mismo con el alcohol y la densidad (g/L). (importante unidades) A continuación hay una gráfica en la que se muestra la evolución de la pérdida de peso en distintos tipos de fermentaciones: En la siguiente gráfica la línea azul es una fermentación a la que se ha añadido 120 mg de nitrógeno por L, la verde 260 y la amarilla 400. El nitrógeno es requerido por las levaduras para desarrollarse y fermentar, por lo que cuanto más alta es la cantidad de nitrógeno la fermentación es más rápida. Durante la fermentación se genera CO2, como consecuencia suben a la parte de arriba las pieles formando lo que se denomina “el sombrero”, abajo quedan todas las pepitas, y en medio todo el mosto. Pero para que el mosto extraiga el color de las pieles tiene que estar en contacto con ellas, por lo que hay que mover, romper y sumergir el sombrero. Para ello hay varios procedimientos: - Se abre el depósito por abajo, sale parte del mosto y se introduce por arriba, esto se denomina el remontado. - El bazuqueo consiste en sumergir/romper el sombrero de forma mecánica. - Hay sistemas que usan el CO2 de la fermentación para que este en continuo movimiento. - Pulsair: meter aire a presión. El tiempo de maceración depende del tipo de vino que se quiera hacer: 10 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué - Vino crianza: la maceración es larga. Si se quiere mantener durante mucho tiempo a veces lo que se hace es que una vez terminada la fermentación se sigue la maceración. - Vino joven: maceración corta para no extraer muchos aromas. Existe una maceración para vinos jóvenes que es muy concreta, denominada maceración carbónica. Son vino típicos de La Rioja Alta y se tienen que consumir muy pronto. Los granos llegan al depósito sin estrujar y la fermentación comienza en esas bayas enteras, como se va produciendo CO2 al final ese grano explota y se rompe. Esto hace que estos vinos sean característicos, huelen como al yogurt de frutas del bosque. Son vinos muy suaves. La maceración es corta. Una vez terminada la maceración hay que separar el vino de los hollejos, este paso se denomina “descube”, consiste en abrir el depósito para que salga el vino y dentro quedan las pieles. Lo que ha quedado en el depósito, pieles mojadas en vino, se llevan a una prensa para sacar el vino que queda, y se obtiene lo que se denomina vino de prensa, y un segundo subproducto que son las pieles secas que se llevan a las alcoholeras para obtener alcohol. El vino de prensa es muy bueno, ya que es el que ha estado más tiempo en contacto con las pieles, pero si se insiste mucho en el prensado se ven irisaciones procedentes de las pepitas (el aceite). Si la uva es buena, y no se abusa del prensado, el vino de prensa se mezcla con el de lágrima. El vino que sale del descube es un poco ácido porque le falta la segunda fermentación, la fermentación maloláctica, que es llevada a cabo por bacterias lácticas (la primera la hace las levaduras, Saccharomyces). Esta fermentación es fija en los vinos tintos, siempre la hacen, mientras que en los rosados y blancos normalmente no se hace. Consiste en que el ácido málico, que es un diácido, se convierte en ácido L-láctico, un monoácido, esto hace que disminuya la acidez. En la fermentación maloláctica sobre todo se pierde acidez y además el vino pasa a ser más estable biológicamente. Los vinos con málico no son estables microbiológicamente y con el tiempo las bacterias propias del vino lo transformarán en láctico, produciendo CO2 y desestabilizando el vino. El ácido málico en la uva suele estar entre 2-10 g/L y cuando el vino a terminado la fermentación maloláctica la concentración es menor a 0´5 g/L. Esta fermentación se produce cuando se tienen las condiciones favorables: - Medio no muy ácido, si el pH es menor a 3´5 las bacterias no actúan bien. - El alcohol no debe tener más del 15% v/v sino las bacterias no hacen la fermentación. - El ácido sulfuroso (antiséptico) tiene que ser bajo. - Temperatura mínima entre 18 y 20°C Un vino con una concentración superior a 0´5 g/L de málico es un vino inestable. En la fermentación maloláctica la liberación de CO2 es más baja que en la primera fermentación. Hace tiempo se decía que en primavera el vino vuelve a “hervir”, esto es porque en el invierno el vino terminaba la fermentación alcohólica, y aunque había bacterias, como hacía mucho frio no podían hacer la maloláctica, en primavera al subir la temperatura el vino volvía a “hervir”, es decir, hacía la fermentación maloláctica. 11 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Actualmente se usa mucho el biocontrol de la fermentación, por ejemplo está de moda la utilización de quitosano, es un biopolímero, producido por un hongo, cargado positivamente. Como los microorganismos al pH del vino están cargados negativamente se pueden controlar añadiendo quitosano, esto es de cara a microorganismos perjudiciales como las levaduras Brettanomyces que producen olores anómalos, y también para controlar bacterias, por eso si hacemos vino tinto no se puede añadir una cantidad alta de quitosano porque si no, no habría fermentación maloláctica. Otra opción de controlar el nivel de bacterias sería añadiendo lisozima. La coinoculación consiste en que a la vez que se siembran las levaduras para la fermentación alcohólica se pueden sembrar las bacterias lácticas, lo que da la posibilidad de que se produzca la maloláctica y alcohólica la vez. Los vinos se pueden hacer con levaduras y bacterias autóctonas, comerciales o combinándolo. Antes de meter el vino en la botella hay que estabilizarlo, clarificarlo, meterlo en barrica, etc. ELABORACIÓN DE VINO BLANCO En este caso la fermentación tiene lugar sin las pieles, solo el mosto. Hay dos tipos de vino blanco:  Tecnológico/fermentativo: llega la uva blanca a la bodega se hace presión en una prensa, se saca el mosto y ese se lleva a un depósito para que fermente. Normalmente la fermentación se produce con levaduras seleccionadas, ya que en los vino blancos es más importante los aromas que en los tintos. Son aromas fermentativos, es decir, productos derivados de la fermentación de levaduras  Varietales: son más complejos. Para que un vino blanco tenga las características de la variedad se tienen que usar las pieles, ya que es donde están los precursores de los aromas, que son moléculas que no huelen. - Precursores glicosídicos (aroma-glucosa). - Cisteínicos (aroma-cisteína). - Glutatiónicos (aroma-glutation). Los aromas tienen que ser volátiles, tienen que llegar a la nariz, por eso los precursores no huelen ya que son moléculas demasiado grandes. Estos precursores están en la piel, por ello para que estas moléculas lleguen al mosto, y en él unas enzimas rompan las uniones de los precursores para que se liberen los aromas, tiene que haber algo de maceración. La uva blanca se hace una papilla con las pieles, pepitas y mosto, esa papilla va a un depósito donde macera unas horas, una vez que ha macerado se saca el mosto, sin pieles y sin pepitas, y se lleva a fermentar. En esas horas se ha conseguido que los precursores de aromas en la piel pasen al mosto. Como aroma encontramos el hexanoato de etilo o acetato de etilo, ósea son compuestos químicos, todo lo que lleve etilo huele a plátano La diferencia entre estos dos tipos de vinos blancos es que los varietales además de los aromas derivados de la fermentación también tendrá aromas procedentes de la propia uva, mientras que los tecnológicos solo tendrán aromas fermentativos. 12 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Tras la obtención del mosto, ya sea macerado o no, hay que sulfitarlos, siempre antes de la fermentación hay que sulfitar para hacer la selección de levaduras e introducir antioxidante. En todos los vinos blancos antes de fermentar hay que limpiar el mosto, esto se denomina desfangado: limpiar el mosto de tierra, pepitas, levaduras, etc. dejar un mosto menos turbio. La fermentación es igual que en los tintos, el mismo perfil siguiendo azúcar/densidad/CO2, pero una vez que ha acabado la alcohólica no hay fermentación maloláctica. Una vez que se tenga el vino hecho se sulfita. Finalmente hay que clarificar y estabilizar para embotellar. Diagrama de flujo de producción de vino blanco: Desfangado: el objetivo es obtener un mosto menos turbio, para ello se retiran coloides, proteínas, pepitas, tierra… Los tipos de desfangado se pueden clasificar en dos grupos:  Lo que no interesa baja al fondo mediante decantación o dejando el mosto estático. Se hace a bajas temperaturas para que no haya nada de actividad, con una cantidad alta de sulfuroso para que no fermente. Todas las impurezas quedan en el fondo.  Añadir unos coadyuvantes para hacer acumulaciones de todo lo que no interesa e introducir gas para que vaya a la superficie de manera que se forma arriba una espuma que se retira, es decir, flotación. Todas las impurezas quedan en la superficie. También se puede desfangar añadiendo enzimas proteolíticas que corten las moléculas que haya en el mosto. También se puede hacer una filtración. El objetivo es tener un mosto lo más limpio posible, solo con aquello que requieran las levaduras. Factores que afectan al aroma de fermentación:  Tipo de levadura: los aromas dependen sobre todo de esto.  Condiciones de fermentación: - Temperatura: los blancos normalmente fermentan a temperaturas más bajas que los vinos tintos, 15-18°C frente a 25°C. A temperaturas bajas se retienen mejor los compuestos aromáticos. - Aireación. - Composición del mosto. - pH. 13 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Depósitos de fermentación: es importante refrigerar tanto en blancos como en tintos, de hecho en blancos más para que no pierda tantos aromas. En el caso de los blancos como no hay maceración el depósito es solo un contenedor, no hay que hacer nada con el sombrero porque no hay. Clarificación y estabilización El vino blanco y el vino tinto de las botellas son vinos transparentes y brillantes, es decir, son vinos clarificados y estabilizados. La clarificación consiste en eliminar los materiales en suspensión, y la estabilización consiste en poner el vino en determinadas condiciones para que a lo largo de los años no aparezcan precipitados en las botellas. Hay tres moléculas/sustancias que hacen que un vino no sea estable:  El color: antocianos y taninos, que son polifenoles, pueden precipitar porque se puede condensar. Los monómeros de estas moléculas tienen siempre tres anillos aromáticos, pero estas moléculas se enlazan unas con otras, de manera que terminan siendo polímeros muy complejos con un peso molecular muy alto, por lo que pueden precipitar.  Las proteínas, procedentes de la uva o producidas por las levaduras, también pueden precipitar. Estas proteínas pueden ser inestables y hacer que el vino sea turbio.  Tartratos: el ácido mayoritario del vino es el tartárico. Si en el fondo de la botella se ven cristales eso son tartratos, es una sal. Para estabilizar el vino, lo que se hacía hasta ahora era eliminar las proteínas y los tartratos mediante métodos físicos como la filtración, haciendo las proteínas más grandes para que precipiten, centrifugación, etc. o mediante la adición de colas. Pero cada vez más lo que se usa es la química de los coloides, que consiste en adicionar al vino carboximetilcelulosa, poliaspartato o manoproteínas, que lo que hacen es evitar que precipiten. La carboximetilcelulosa (CMC) se pone alrededor de los cristales de tartrato y evita que se formen cristales más grandes y precipiten. Las manoproteínas y el poliaspartato evitan que precipite el color. Antes de existir estos coloides lo que se usaba mucho, y se sigue usando, son las colas, sustancias que son capaces de flocular y sedimentar partículas en suspensión.  Colas inorgánicas: - La bentonita: tiene carga negativa, mientras que las proteínas al pH del vino tienen carga positiva, por lo que al juntarse sedimentan. - Gel de sílice. - Ferrocianuro.  Colas orgánicas: - Proteínas animales como la clara de huevo, de manera que las proteínas se van al fondo unidas con la ovoalbúmina. También se usa la cola de pescado o la gelatina de cerdo. Estas proteínas animales tienen un inconveniente, ya que personas con dietas vegetarianas, veganas y con alergias no pueden consumirlos. - Proteínas vegetales como la patata o el guisante, como alternativa a las animales. 14 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué - Los taninos también se pueden usar ya que están cargados negativamente. Para eliminar los cristales tartáricos lo que se ha hace es enfriar mucho el vino, a -5 o -6°C. A esta temperatura no se congela el vino (Tª congelación = (grado alcohólico/2)-1), pero precipitan todos los tartratos. Es una forma cara, ya que se necesita mucha energía para enfriar tantos litros de vino. Por eso la otra opción es el uso de los coloides que hemos comentado, ya que impiden que se forme hidrogeno tartrato de potasio (KTH) y tartrato de calcio (CaT). Después de estos procesos hay una filtración gruesa para quitar toda la ovoalbúmina, bentonita, etc. y luego hay una filtración de membrana para que no pase ninguna levadura o bacteria a la botella. LÍNEA DE EMBOTELLADO CRIANZA EN BARRICA Sobre todo en el vino tinto, una vez hecho, en lugar de conservarlo en depósito lo que se suele hacer es pasarlo a contenedores de madera, barricas. Lo que se busca es que la madera ceda al vino componentes y que a través de las duelas de la barrica entre oxígeno, ya que en depósitos de acero inoxidable o cemento no entra. El oxígeno es importante para las reacciones que tienen lugar entre los compuestos del color, ya que además de ser componentes del color también son responsables de la astringencia. Los compuestos de color son polifenoles, la condensación de estos se hace con ayuda del oxígeno, lo cual es necesario para que disminuya la astringencia. Dentro de una barrica hay compuestos que aumentan y otros que disminuyen por eso hay una diferencia en cuanto al olor de un vino joven y un vino criado. Por ejemplo, los esteres van disminuyendo, lo que hace que los vinos criados huelan menos a fruta. En las barricas a veces suele tener lugar una alteración del vino debido a las levaduras Brettanomyces que se meten en los poros de la madera. Estas levaduras son capaces de crecer a alto grado alcohólico, con pH ácido, a temperatura baja, en escasez de nutrientes, etc. Estas levaduras atacan el ácido cumárico y ferúlico. Lo que hacen es generar etilfenoles: 4etilfenol y 15 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué 4etilguayacol, estos compuestos huelen mal. Con cantidades muy pequeñas de esos compuestos, en ppm, se pueden llegar a oler. 16 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué TEMA 2 COMPOSICIÓN DEL MOSTO Y DEL VINO Las principales diferencia entre el mosto y el vino es el contenido de azúcares, de alcoholes, el color, sobre todo en el caso del tinto, y aromas, la uva no huele como el vino. Dentro de estas diferencia lo que es el color y el aroma no se considera composición mayoritaria del vino/mosto. AZÚCARES Los azúcares forman parte de la composición. En el mosto se miden mediante aerometría o refractometría, y se expresan en forma de densidad (g/L). La densidad del vino se encuentra entre 993-998 g/L, cuanta menos densidad mayor grado alcohólico, o un vino con una densidad de 993 también deberse a que tiene mucha agua. En el vino encontramos, si hablamos de monómeros, tanto hexosas como pentosas, en cuanto a dímeros la sacarosa y la galactosa (125g/L). En un mosto estándar su mayor cantidad de azúcares está en forma de glucosa y fructosa. Durante la fermentación los azúcares que se consumen son las hexosas, por lo que los vinos tendrá menos de 1 g/L de glucosa y fructosa, mientras que las pentosas no se fermentan, la cantidad es la misma en mostos que en vinos. Los azúcares igual que los fenoles se oxidan, son compuestos reductores, y lo son tanto las hexosas fermentables como las pentosas no fermentables. Para determinar la cantidad de azúcar que tiene un vino se puede indicar como cantidad de glucosa + fructosa o cantidad de azúcares reductores. En este último caso se da información tanto de hexosas como pentosas. Para medir los azúcares reductores se usa el método Rebelein, que consiste en la reducción de Cu2+, el exceso de Cu2+ oxida el I- que pasa a I2 en medio ácido y finalmente se hace una valoración con tiosulfato con almidón como indicador (Vtiosulfato blanco- Vtiosulfato vino=g/L azúcares reductores). En cambio, para determina la glucosa y fructosa se usa el método enzimático en el que se determina NADPH por espectrofotómetro, es un método más rápido pero aquí hay que incrementar a este dato en las pentosas para dar los azúcares reductores, suele ser algo más de un g/L. 17 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Un vino es tanto más estable cuanto menos azúcares reductores tiene. A valores muy altos de azúcar puede haber enturbiamiento, es decir, que si hay alguna levadura en el vino podrá producirse una fermentación. ÁCIDOS ORGÁNICOS En cuanto a los ácido orgánicos, hay una diferencia grande entre lo que es el vino y el mosto.  En el mosto los ácidos mayoritarios son tartárico, málico, cítrico y ascórbico (en este orden).  En el vino como mayoritario también está el tartárico, málico y cítrico, pero hay muchos más ácidos, que están en proporción baja con respecto a los otros, pero estos no proceden del mosto si no de la fermentación alcohólica o maloláctica. El ácido láctico también está como mayoritario en el vino que procede de la fermentación ML, la mayoría en forma de L- láctico, aunque se puede tener algo de D-láctico en proporción baja. Si aparece D-láctico indica que hay alguna alteración y probablemente también se tendrá acético en cantidades altas. Otros ácidos orgánicos que se producen a niveles altos en fermentación son el succínico, acético y pirúvico, sólo están en el vino. En el laboratorio lo que se determina es la acidez total, con esto se determina la suma de todos los ácidos, tanto la de la acidez fija (málico, tartárico, cítrico y succínico) como la acidez volátil (acético, láctico, propiónico), incluso del sulfuroso que se introduce en el vino. La acidez total condiciona: o El sabor y en el aroma, sobre todo porque está relacionada con el pH que determina la disociación de los ácidos. o En la adición de sulfuroso: La forma de H2SO3 es la forma más eficaz en el vino: la forma antiséptica, antioxidante… El sulfuroso es un diácido y tiene un pK1 de 2 y un pk2 de 7, por tanto si tenemos un vino con un pH a 4 va a haber muy poco en forma de H2SO3, es por eso que el pH de un vino (determinado por los ácidos totales) va a marcar cuanto sulfuroso hay que añadir. o En la estabilidad microbiológica del vino, pH más ácidos más estables. Así como en la estabilidad de tartratos y proteica (cambia la solubilidad de las proteínas con el pH) y del color, esto es porque las moléculas del color, los antocianos, dependiendo de si están en cationes flavilo o no tienen un color u otro:  pH ácido  catión  morado.  pH básico  no catión  incoloro/amarillo 18 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Para medir la acidez total se hace una valoración con NaOH sirviéndonos de pHmetro (método oficial) o indicadores (método aproximado). Hay que tener en cuenta que el CO2 y el SO2 interfieren en las determinaciones de la acidez total. Otra cosa importante en la determinación de la acidez total es que el resultado se da en g/L de ácido tartárico, pero hay zonas donde la acidez total se da en g/L de ácido sulfúrico, que no es que el vino tenga sulfúrico, pero a la hora de pasar los moles que hemos gastado de NaOH para llevar el vino a pH 7 se pasa a masa de ácido sulfúrico usando su masa molar. Por eso es muy importante fijarnos en las unidades. Es importante que el electrodo del pHmetro esté midiendo bien y siempre tener las disoluciones de calibrado al lado y comprobar que el electrodo esté midiendo bien. El color del vino puede precipitar en los electrodos y se estropean, de hecho hay electrodos especiales para vinos/bebidas con color. La acidez total, por debajo de 4 vinos sosos/enfermos, entre 4-6 adecuados. Determinación del ácido málico: Es otro de los ácidos mayoritarios del vino. Es importante controlarlo en la bodega ya que es el sustrato de la fermentación maloláctica. Se puede controlar con un test enzimático midiendo la producción de NADH, o se puede hacer mediante cromatografía de papel. En esta última se coloca una gota de vino en el papel, siendo el eluyente ácido acético, etanol y un colorante, sube y se pueden ver tres manchas: la primera del tartárico, la segunda del málico y la tercera del láctico/succínico. En un vino que ha hecho la fermentación ML no se ve la mancha intermedia pero sí la de arriba y en la que no la ha hecho al revés. 19 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué La acidez volátil está formada por los ácidos más pequeños, los que se destilan. Es uno de los análisis más importantes en bodega ya que nos indica si está habiendo alguna desviación en la fermentación, ya que se determina el acético, el cual indica si hay una desviación microbiana, se ha realizado una mala vinificación o conservación defectuosa.  Rango vino joven 0,2-0,4 g/L de ácido acético.  Rango vino de guarda 0,4-0,6 g/L de ácido acético Un vino de 10 grados lo máximo que puede tener es 0´5 gramos/L de ácido acético, cuanta menos acidez volátil mejor. Cuanto más fermenta una levadura más ácido acético, por eso va asociado al grado alcohólico. El ácido acético tiene dos orígenes:  Microbiológico: bacterias acéticas, en fermentación con levaduras Saccharomyces o no Saccharomyces, en crianza o por altas concentraciones de azúcar.  Químico: Si el vino está en contacto con oxígeno este reacciona con el acetaldehído que es un componente mayoritario y da ácido acético, esto es lo que se denomina vino picado. LOS MINERALES Es otro componente mayoritario, no hay diferencia en cuanto a los minerales en el mosto y en el vino. El potasio y el calcio son los responsables del pH del vino y de la estabilidad tartárica ya que son los que se unen a los tartratos, de hecho una forma de disminuir el pH es retirando todo el potasio, ya que así no hay precipitación de tartrato, hay más tartárico y disminuye el pH. En cuanto a los oligoelementos son importantes el hierro y cobre, y también hay elementos traza. Antes las tuberías eran de hierro y cobre, pero ahora son de acero inoxidable, por eso los niveles de hierro y cobre antes eran más altos, ahora son bajos pero aun así son suficientes para considerarlos como catalizadores de oxidaciones. El vino sale mejor si se añade un secuestrador de metales para eliminar el contenido de hierro y cobre en el mosto, ya que son catalizadores de la oxidación. VITAMINAS Una de las más importantes es la tiamina o B1, es requerida por las levaduras para la fermentación, muchos complejos nutricionales que se añaden a las levaduras llevan tiamina. Con contenidos apropiados de tiaminas las levaduras producen menos compuestos carbonílicos, que hacen que el sulfuroso sea menos eficaz. 20 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué MATERIA NITROGENDA Estamos hablando de muchos compuestos, desde nitrógeno total que es lo más parecido al FAN (nitrógeno amoniacal y aminoácidos), hasta aminas biógenas. Estas aminas biógenas, que pueden estar en el mosto o en el vino, proceden de los aminoácidos de forma exclusiva: a partir de la lisina se forma la cadaverina, de la histidina la histamina, etc. Su concentración está regulada. Todo este material nitrogenado procede de las proteínas de la uva, el contenido en estas proteínas va a ser mayor o más bajo dependiendo de los tratamientos que se le haya dado a la uva (despalillado, vendimia a máquina, contacto con hollejos), al mosto (desfangado con bentonita) y al vino. La solubilidad de las proteínas depende del pH, la temperatura, el grado alcohólico y la fuerza iónica. De esta materia nitrogenada nos fijamos sobre todo en el nitrógeno fácilmente asimilable (aminoácidos y amonio), el nivel mínimo de FAN son 140 mg/L. Importancia de los aminoácidos en enología: - Nutrientes para el desarrollo de levaduras. - Influencia en la velocidad de fermentación, y de que ocurra de manera adecuada. - Precursores de alcoholes, aldehídos, ésteres, ácidos cetónicos y aminas biógenas. - Caracterización de las distintas variedades. Los aminoácidos a través del mecanismo de Erlich (desaminación + descarboxilación) van a derivar en alcoholes. También estos aminoácidos van a ser los responsables de los aldehídos de strecker que son responsables de aromas en el vino. 21 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué TEMA 3 SULFUROSO EN ENOLOGÍA Su uso se remonta al tiempo de los romanos. Hay muchos ejemplos de utilización de azufre, por ejemplo en las plantas para que no proliferen los hongos. Los griegos lavaban la ropa de los enfermos con azufre para esterilizarla. El siglo pasado cuando se vinificaba se añadía yeso (sulfato de calcio), ya que en la fermentación se reduce a sulfuroso. Desde comienzos del siglo pasado se conoce que este compuesto se presenta en el vino en variadas formas cada una con acciones diferentes. Las acciones que tiene son:  Antiséptico: actúa sobre mohos, levaduras y bacterias. La levadura Saccharomyces sí que crece con niveles de sulfuroso altos, sin embargo las no Saccharomyces no, lo que supone un efecto selectivo de las levaduras que intervienen en la fermentación. Dependiendo de la cantidad de sulfuro la acción antimicrobiana también es selectiva.  Acción antioxidante: impide la oxidación química. Cuando el oxígeno se disuelve en el vino intervienen el hierro y el cobre para llevar a cabo reacciones de fenton, formando radicales hidroxilo. El sulfuroso lo que hace es reaccionar con el agua oxigenada que se forma de la a partir del oxígeno, transformándola en agua, evitando así la formación de radicales hidroxilo, evitando la reacción de fenton. Por eso tiene acción antioxidante.  Acción antioxidásica, inhibiendo la acción enzimática de oxidasas. La uva podrida tiene mucha lacasa o polifenol oxidasa, su actividad es inhibida por el sulfuroso.  Es capaz de que se extraigan más los polifenoles cuando estamos macerando con las pieles de las uvas tintas. Tiene también efectos perjudiciales:  Hay gente alérgica o que admite niveles muy bajos de sulfuroso. El sulfuroso destruye la tiamina (B1) que es necesaria para digerir los carbohidratos. En las etiquetas siempre se pone el grado alcohólico y si contiene o no sulfitos, esto está muy controlado en todas las legislaciones, normalmente no se permiten más de 100-150 mg/ml.  Al ser antiséptico, para poder hacer la fermentación maloláctica y que funcionen las bacterias lácticas, los niveles de sulfuroso deben ser bajo.  El sulfuroso huele, se forman compuestos sulfurosos que llegan a la nariz y tienen un olor picante, por lo que puede ser responsable de olores no agradables. Hay dosis máximas recomendables por encima de las cuales no se puede consumir. ESTADOS DEL ANHÍDRO SULFUROSO EN EL VINO El SO2 incorporado a la vendimia o el vino, permanece en diversas formas de las que dependen sus propiedades enológicas. 22 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Se acostumbra a considerar que este compuesto se encuentra en el vino en estado libre y en estado combinado con otras moléculas del vino. SO2libre + SO2combinado = SO2total. Hay una metodología determinar el libre y otra para hacer el total, en esta última se rompen las combinaciones con NaOH y así se mide el total. En la bodega se puede adicionar el sulfuroso en varias formas:  Solución sulfurosa: anhidro sulfuroso disuelto en agua.  Combustión de azufre: si se quema el azufre elemental se genera sulfuroso.  Disolviendo una sal: A partir del metabisulfito potásico. DIFERENTES FORMAS QUÍMICAS Y SUS PROPIEDADES También hay que tener en cuenta que el sulfuroso tiene dos pK, uno a 2 y otro a 7, a pH muy acido estará principalmente en forma de H2SO3, a pH muy básico SO32-, y a pH intermedios HSO3, por lo que el sulfuroso puede estar en tres formas químicas, independientemente de que esté libre o combinado. El vino tiene un pH entre 2-4, por lo que la forma predominante será hidrogenosulfito/bisulfito (HSO3-). La especie que se va a combinar y va a formar parte del sulfuroso combinado va a ser sobre todo el bisulfito, y concreto lo hará con el acetaldehído. Formas moleculares: H2SO3 y SO2 H2SO3 es lo mismo que SO2+H2O, es la forma molecular. Esta forma hidratada es muy escasa en el vino, es la única especie que es antimicrobiana. Esta forma está libre por lo que llega a nuestra nariz, por lo que cuando decimos que olemos a sulfuroso la forma que llega es esta. Cuando se produce perdida de sulfuroso lo que disminuye es la concentración de H2SO3. Ion bisulfito HSO3- Esta es la forma antioxidante. Es la forma mayoritaria en el vino, y también es la forma que se combina con otras moléculas del vino, sobre todo con el acetaldehído, aunque también lo hace con cetoácidos, glucosa, quinonas y antocianinas. Esta forma no tiene ningún valor antiséptico. Ion sulfito SO32- Es de la que menos hay en el vino, y tiene muy poca actividad antioxidante, tiene poca importancia. SULFUROSO Y pH Las formas químicas en las que podemos encontrar el sulfuros depende del pH del medio, por lo que el sulfuroso y el pH van totalmente unidos. A pH del vino la mayor parte del anhídrido sulfuroso se presenta monodisociado en forma de ion bisulfito. La mayor parte está combinado y es inactivo respecto de la mayoría de sus propiedades. 23 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué El nivel de sulfuroso que hay que poner el vino depende del pH de este, si tenemos un vino de pH 3 y otro de 4, en este último tendremos que poner más cantidad de sulfuroso, para poder tener la cantidad suficiente de SO2 y H2SO3, que son las formas antisépticamente activas. Para que el vino este lo más protegido posible debemos tener niveles de sulfuroso molecular alto. Las combinaciones con acetaldehído son muy estables, por lo que cuando se forman ya se pierde ese sulfuroso y por tanto sus propiedades, pero hay otras combinaciones menos estables (con antocianos, azúcares y ácidos) que sí se pueden romper. LA FRACCIÓN LIBRE DE SO2 Está formada por sulfuroso, bisulfito y sulfito, está en equilibrio con las formas combinadas. El nivel que tenemos como sulfuroso libre va a depender de la concentración total que tengamos del sulfuroso, del pH, de la temperatura y condiciones de oxidorreducción. Estas formas libres son las que presentan las mayores actividades que se buscan del agente, además también son las responsables de los defectos sensoriales. ANHIDRIDO SULFUROSO COMBINADO El sulfuroso es un compuesto nucleófilo por lo que se combina con cualquier molécula electrófila del vino: todos los compuestos carbonílicos, las quinonas… Entre los compuestos carbonílicos estrella está el acetaldehído. El origen de estos compuestos electrófilos es: - Compuestos presentes en uvas sanas. - Compuestos presentes en uvas alteradas: las uvas que tienen botritis traen ácido glucónico que se combina con el sulfuroso y lo inactiva. - Compuestos generados por las levaduras en la fermentación (acetaldehído, pirúvico…). Dependiendo del tipo de vino, la proporción de sulfuroso combinado será una u otra, sobre todo depende de la cantidad de acetaldehído. El SO2 combinado con el acetaldehído lo hace de forma permanente, la unión de sulfuroso con acetaldehído tiene lugar en horas y es irreversible. Lo mismo ocurre con el ácido pirúvico en elevadas concentraciones. Por lo que este SO2 es considerado un lastre. Sin embargo, las otras combinaciones, por ejemplo con los antocianos, son reversibles, es considerado SO2 de depósito. Estas combinaciones pueden disociarse liberando SO2, reponiendo así en parte el anhídrido sulfuroso perdido por oxidación o volatilización. Si a un vino se le añade una alta concentración de sulfuroso pierde el color, esto es porque los aductos antociano- sulfuroso son incoloros. En el momento que ese vino pierde el sulfuroso el equilibrio se desplaza 24 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué hacia la izquierda, volvemos a tener el sulfuroso libre y se libera el antociano de manera que el vino vuelve a tener color. Combinación con acetaldehído El producto que se produce entre el sulfuroso y el acetaldehído es el 1-hidroxietilsulfonato. Si adicionamos acetaldehído a un vino, aproximadamente el 99% de ese acetaldehído va a estar combinado, y esta combinación es prácticamente irreversible, por ello altas concentraciones de acetaldehído dejan bajas concentraciones de SO2 activo. Una de las propiedades que se selecciona en las levaduras es que produzcan cantidades bajas de acetaldehído, además la levadura es capaz, a partir de bisulfato del mosto, de generar sulfuroso. Combinación con azúcares - La combinación más estable es con la arabinosa. - Con la glucosa se combina de manera más débil. - Con la fructosa es extremadamente reducida. La combinación está muy afectada por la temperatura, siendo mayor a bajas temperaturas. La combinación es claramente más lenta que con acetaldehído. Combinación con ácidos cetónicos Estos proceden de la fermentación alcohólica, por ejemplo el ácido pirúvico o el cetoglutarático. Estos son electrófilos y se combinan con el sulfuroso. Tienen cierta importancia en los vinos provenientes de fermentaciones a temperaturas elevadas, mostos de pH elevados y aireados. Si se adiciona tiamina disminuye la formación de ácidos cetónicos. Reacciones de equilibrio: Toda adición de SO2 a un vino produce la combinación de una fracción de la dosis. A la inversa todo descenso del SO2 por oxidación genera una liberación de una fracción de las formas combinadas débiles (SO2 depósito). ACCIÓN ANTISÉPTICA DEL SO2 Está sobre todo centrada en el sulfuroso molecular, es como 500 veces más activo en cuanto a acción antiséptica, que las otras formas químicas, por tanto es muy importante conocer el pH del vino para saber cuánto sulfuroso en forma molecular tenemos en el vino. Para determinados organismos se conoce cuál es la cantidad necesaria para evitar su crecimiento. El cálculo de sulfuroso molecular en un vino se hace con la constante de equilibrio y conociendo la cantidad del SO2 y el pH. FUENTES DE SULFUROSO EN EL VINO A lo largo de la vida de un vino estándar se va añadiendo sulfuroso: 25 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué - Nada más entrar el mosto en la bodega. - Cuando acaba la fermentación también, aunque se añade poco para que funcione la ML - Cuando acaba la ML se vuelve a añadir para conservarlo. - Antes de embotellarlo. - Si se está haciendo un vino crianza cada vez que se trasiegan las barricas hay que controlar el nivel de sulfuroso. Por tanto los vinos cuanto más viejos, más sulfuroso van a tener. Además de estas adiciones existe una formación del sulfuroso por las levaduras, las levaduras de forma natural reducen los sulfatos a sulfuroso. Por eso en cualquier fermentación va a haber sulfuroso (10-20mg/L), aunque no se haya añadido. Por eso es imposible hacer un vino que no contenga nada de sulfuroso. Evolución del SO2 en el vino El sulfuroso es un elemento muy complicado ya que tiene muchos estados de oxidación, participa en compuestos con propiedades acido-base y propiedades redox. En la vida del vino la concentración de SO2 desciende debido a varios fenómenos. Los sulfatos que vienen de la viña se reducen a sulfuroso e incluso pueden llegar a formar sulfhídrico a lo largo de la fermentación. A lo largo de la crianza, el sulfuroso se oxida a sulfato. Además parte se pierde por evaporación del SO2 gaseoso. Por todo esto hay que ir añadiendo sulfuroso al vino. 26 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué TEMA 7 FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA LEVADURAS: aspectos fisiológicos de interés Son microorganismos eucariotas unicelulares pertenecientes mayormente a la división Ascomycota de los hongos (reino Fungi). Son quimioorganoheterótrofos, su fuente de carbono y energía principal son los azúcares (glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa). Son mayormente anaerobios facultativos, en presencia de oxígeno hacen la respiración aerobia, pero en condiciones anaerobias obtienen energía mediante fermentación. Sin embargo, el oxígeno es esencial en algunas rutas metabólicas. Su distribución en la naturaleza y su manipulación en el laboratorio es similar a las bacterias. Son organismos ampliamente utilizados en la industria alimentaria (pan, cerveza, vino) y biotecnológica (enzimas, proteínas eucariotas). Metabolismo facultativo Efecto pasteur: En presencia de oxígeno las levaduras con metabolismo facultativo desarrollarán preferentemente la respiración aerobia como vía de obtención de energía, oxidando completamente la glucosa hasta CO2 y H2O, mientras que la fermentación alcohólica y producción de etanol serán mínimas. Dado que la respiración aerobia es un proceso más eficiente desde el punto de vista energético, el paso de un metabolismo fermentativo a un metabolismo respiratorio conlleva a una disminución en el consumo de glucosa. Es decir, en condiciones aerobias se produce mayor cantidad de biomasa con menor consumo de glucosa. Efecto Crabtree: en presencia de altas concentraciones de glucosa externa, algunas levaduras realizan la fermentación alcohólica en presencia de oxígeno, en lugar de la respiración aerobia. produce etanol en lugar de biomasa Aun en condiciones aerobias, si la concentración de sustrato supera los 9 g/L en estas levaduras ocurrirá la fermentación en vez de la respiración aerobia. Los altos niveles de glucosa estimulan la glucólisis y la formación de ATP por fosforilación a nivel de sustrato. Este hecho reduce la necesidad de obtención de energía a través del ciclo TCA y la fosforilación oxidativa conllevando a una represión de la síntesis y actividad de las enzimas respiratorias, por lo que el piruvato que se acumula se metaboliza preferentemente a etanol. En presencia de altas concentraciones de sustrato el Efecto Pasteur no inhibe el efecto Crabtree. 27 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué RESPIRACIÓN AEROBIA Es la oxidación completa de la glucosa, a partir de los 6 átomos de carbono se forman 6 moléculas de CO2, como resultado neto da 38 moléculas de ATP. Se divide en tres fases: - Glucolisis (citoplasma): no requiere presencia de oxígeno, ocurre siempre. - Ciclo de Krebs (matriz mitocondrial): se inhibe en ausencia de O2. - Cadena transportadora de electrones y fosforilación oxidativa (membrana interna de la mitocondria). La glucólisis es el paso común con la fermentación. Por cada molécula de glucosa se obtienen dos moléculas de piruvato, dos ATP y dos NADH. En la glucólisis se consume NAD+ que hay que regenerar, se hace en la respiración aerobia o en la fermentación. El ciclo de Krebs es un proceso aerobio que ocurre en la matriz mitocondrial (excepto en procariotas que ocurre en el citoplasma). El piruvato de la glucolisis entra a la mitocondria y entra en el ciclo, como consecuencia por cada molécula de glucosa se obtienen 6NADH, 2FADH2, 2GTP (que dará lugar a ATP), 2CO2. El ciclo TCA, al igual que la glucolisis tampoco aporta mucho ATP. La mayor cantidad de moléculas ATP se forman en la última fase de la respiración aerobia: la cadena transportadora de electrones y fosforilación oxidativa. La mayor cantidad de energía procedente de la glucosa proviene del poder reductor que se forma en las fases previas, de los electrones aceptados por NAD y el FAD. El NADH (10 moléculas) y el FADH2 (2 moléculas) transferirán sus electrones al oxígeno molecular a través de una cadena transportadora de electrones ubicada en la membrana mitocondrial interna. El transporte de electrones generará un gradiente de protones que permitirá la fosforilación oxidativa del ADP por la ATP sintasa, generando ATP. Las 10 moléculas de NADH y las 2 moléculas de FADH2 generarán un total de 34 moléculas de ATP (de las 38 totales de la respiración aerobia). OBTENCIÓN DE ENERGÍA EN ANAEROBIOSIS En ausencia de oxígeno se pueden producir dos procesos esenciales:  Respiración anaerobia: ocurre sólo en algunas bacterias y archeas. Los electrones provenientes de los enlaces de la molécula combustible pasan a una cadena transportadora donde el aceptor final no es oxígeno molecular (sulfato, nitrato, azufre, etc.).  Fermentación: Tras la glucólisis (única vía de síntesis de ATP durante la fermentación), el piruvato no continúa hacia el ciclo de Krebs y no funciona la cadena transportadora de electrones debido a la ausencia de oxígeno. Para regenerar el NAD+ consumido durante la glucólisis, el piruvato puede aceptar directamente los electrones del NADH (fermentación láctica) o descarboxilarse a acetaldehído y ser este último quien reciba los electrones del NADH (fermentación alcohólica). En la alcohólica únicamente se regenera el NAD+, no se obtiene energía, de hecho el etanol, que es el producto de este proceso, llega a ser tóxico para las levaduras. 28 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Fermentación láctica: la enzima lactato deshidrogenasa transforma el piruvato en lactato, regenerándose los 2 NAD+ consumidos en la glucólisis. Por ello, a partir de cada molécula de glucosa, se producen 2 moléculas de lactato y 2 de ATP. Fermentación alcohólica: se llega a piruvato a través de la glucólisis. Este piruvato se transforma en acetaldehído por acción de una piruvato descarboxilasa que libera CO2. El acetaldehído, posteriormente, es transformado en etanol por acción de una alcohol deshidrogenasa, regenerándose el NAD+ consumido en la glucólisis. En este caso, por cada molécula de glucosa, se obtienen 2 moléculas de etanol, 2 de ATP y 2 de CO2. las fermentaciones tienen como unico objetivo la regeneración del NAD+ consumido en la glucólisis, pues no generan energía. Las moléculas resultantes de las fermentaciones, además, no son útiles para las levaduras, y de hecho algunas como el etanol resultan tóxicas. LEVADURAS DE INTERÉS ENOLÓGICO Teniendo en cuenta que no todas las levaduras presentan la misma capacidad para fermentar la glucosa y la misma resistencia a etanol, para el proceso de vinificación necesitamos levaduras con mayor capacidad de fermentación y mayor resistencia. No todas las levaduras presentes de forma natural en el mosto serán deseables en el proceso de fermentación y producción del vino. Saccharomyces cerevisiae: tiene las dos cualidades deseadas, un elevado poder fermentativo y una alta resistencia al etanol. Si conducimos bien la fermentación S. cerevisiae produce pocos efectos secundarios adversos que aporten características organolépticas poco deseables al mosto/vino frente a otras levaduras fermentativas. A pesar de ser la más importante, la cantidad que hay de manera natural en la uva es muy poca, por ello se incorporan durante el tratamiento mecánico de la uva. Las fermentaciones pueden ser impulsadas con la inoculación de cepas comerciales puras seleccionadas por el enólogo o la adición de pies de cuba (pequeña fermentación previa a la vendimia, con frutos seleccionados, que garantiza un inóculo de levaduras naturales con mejores prestaciones fermentativas). Saccharomyces bayanus: resisten a concentraciones aún mayores de etanol (18% v/v), esto es interesante para vinos con grados muy elevados de alcohol (vendimias ricas en azúcares) o reiniciar fermentaciones paralizadas. No Saccharomyces: son las que más abundan en la uva. Son endémicas o nativas (superficies de las uvas), bajo poder fermentativo y baja resistencia al alcohol. En muchos casos estas especies tienen características organolépticas típicas de la zona o aporta metabolitos deseables (glicerina o ácido láctico), pero en la mayoría de las veces hacen lo contrario. 29 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Entre estas levaduras no Saccharomyces encontramos Schizosaccharomyces, que desarrollan una ruta interesante, la fermentación maloalcohólica. Es una forma de reducir la acidez del mosto, gracias a la enzima acido málico descarboxilasa es capaz de llevar el málico a piruvato y a partir de este la fermentación alcohólica. Es decir, la fermentación maloalcohólica es la capacidad de alguna levadura de emplear el ácido málico para producir etanol gracias a la presencia de la málico descarboxilasa. Reducen el málico hasta el 75-100%, por eso sirve para reducir la acidez. Esto es interesante en vendimias muy ácidas, procedentes de zonas frías donde las uvas apenas tienen azúcares. ESPECIES DE LEVADURAS NO DESEABLES Algunas especies de levaduras endémicas (la mayorías de las no Saccharomyces: Pichia, Brettanomyces) no son deseables en la fermentación alcohólica debido a la alta producción de metabolitos secundarios que disminuye la calidad del vino, en especial del ácido acético, que es un ácido volátil por lo que huele. También acetaldehído, acetato de etilo y etilfenoles. Solución: sulfitado o fermentación supercuatro (mezclar mosto y vino para tener un grado de alcohol inicial del 4%) ACCIÓN SECUENCIAL DURANTE LA FERMENTACIÓN Si cuando llega el mosto a la bodega, no lo esterilizamos y añadimos las levaduras, se va a producir de manera natural una acción secuencial de distintos organismos durante la fermentación. Cuando el grado alcohólico es bajo las levaduras endémicas proliferan en el mosto y producen metabolitos no deseables, a medida que aumenta el grado alcohólico comienza a prevalecer S. cerevisiae y domina todo el proceso de fermentación, si ya pasamos el 11% de alcohol necesitaremos levaduras más resistentes a etanol. Durante todo este proceso no sólo se produce la transformación de piruvato a etanol, sino que también se dan transformaciones bioquímicas colaterales a partir del piruvato que aportan 30 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué características, como aroma o sabor, al vino. Estos compuesto secundarios pueden aportar características organolépticas deseables o no. FERMENTACIÓN GLICEROPIRÚVICA (Pregunta de examen) El componente mayoritario en el vino, después del etanol, es el glicerol, aparece con una concentración de 5-11 g/L, este se forma a través de la ruta gliceropirúvica. En la glucólisis se producen gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetona, que se isomeriza mayoritariamente a gliceraldehído-3-fosfato (parte de la izquierda). Sin embargo, una parte de la dihidroxiacetona se reduce a glicerol-3-fosfato recuperando NAD+. Tras esto, el glicerol-3- fosfato se transforma en glicerol (parte de la derecha). glicerol aporta suavidad y textura al vino, mejora el volumen de este y aporta un ligero dulzor (aunque no es aromático porque no es volátil) Por tanto, la recuperación del NAD+ se hace sin necesidad de llevar a cabo la fermentación alcohólica, y el glicerol no se sigue transformando. A este proceso se le denomina fermentación gliceropirúvica, y a ella se destina aproximadamente el 8% de la glucosa consumida. El glicerol, como hemos dicho, es el segundo componente mayoritario del vino y le aporta características muy interesantes, dándole untuosidad y plenitud en la boca. Es, de hecho, un indicador de calidad, y está prohibido añadirlo, de modo que tiene que haber sido producido necesariamente en esta fermentación gliceropirúvica. La producción de glicerol por parte de las levaduras tiene como objetivo la protección frente a elevadas presiones osmóticas, es una respuesta adaptativa. De modo que ante alta presión osmótica la levadura favorece la vía gliceropirúvica para concentrar glicerol en el interior e igualar las osmolaridades interna y externa. Cuando la presión osmótica extracelular disminuye, el glicerol difunde al exterior celular. Esto se da principalmente en los primeros momentos de la fermentación, en los que el mosto tiene una gran concentración de azúcares y por tanto la presión extracelular es alta. PRODUCTOS SECUNDARIOS DE LA VINIFICACIÓN Uno de los subproductos más importantes es el ácido acético, este es perjudicial ya que da olor y sabor a vinagre. No solo se produce por bacterias acéticas que contaminan el vino, si no por algunas cepas de levaduras debido a que no se conduce bien la fermentación alcohólica o se usan levaduras no adecuadas, como consecuencia se produce ácido acético alto. En la formación 31 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué de acético influyen distintos factores: la levadura, deficiencias nutricionales, inhibidores, temperatura y pH. Es un ácido volátil, fácilmente captado por el olfato por eso huele. En todo proceso de fermentación siempre se produce una pequeña cantidad pero siempre hay que intentar que esté por debajo de un umbral determinado. Hay otros ácidos volátiles como el fórmico, propiónico y butírico, que también se producen pero en menor cantidad por lo que no son tan relevantes. En general, el aumento de la acidez volátil es indeseable ya que se asocia con descriptores aromáticos intensos. Por otra parte, en la vinificación, se producen otros ácidos procedentes de la fruta, ácidos orgánicos como el tartárico y málico, o de la fermentación, como el láctico y succínico, que no son volátiles y por tanto no huele, pero sí que resultan interesantes al mantener las cualidades del vino, como el color. La acumulación de estos ácidos es interesante en vendimias de zonas cálidas, pobres en acidez natural. Junto a ellos encontramos otros productos del metabolismo de la levadura, que no se limita a fermentar únicamente los carbohidratos, sino que también tiene un metabolismo de ácidos grasos, aminoácidos y compuestos azufrados a partir del que se generan los precursores aromáticos que van a poder aportar características positivas o negativas a los vinos. El nivel de síntesis dependerá de la capa de levadura y condiciones de fermentación. FACTORES QUE AFECTAN LA FERMENTACIÓN El desarrollo de la fermentación alcohólica dependerá de tres factores fundamentales, y como consecuencia repercutirá en la calidad del vino resultante.  La microbiota: conjunto de microorganismos presentes en la fermentación. Determina la cantidad de alcohol producida, productos secundarios, etc.  Composición nutricional y tratamientos del mosto. El desfangado o sulfitado influyen en la concentración de nutrientes y microorganismos en el mosto.  Condiciones operativas como la temperatura, régimen de aireación, acidez, etc. Todas estas condiciones hay que controlarlas para que la fermentación llegue a buen puerto. Composición nutricional del mosto A lo largo de la fermentación alcohólica la composición del mosto/vino va variando, y es importante ir midiéndolos para saber cuándo está el vino listo. En cuanto al azúcar, al principio encontramos una concentración elevada, que va disminuyendo conforme las levaduras lo fermentan. De forma paralela a la disminución de azúcares se da un crecimiento exponencial de levaduras, que terminan llegando a fase estacionaria. Como consecuencia de la fermentación de azúcares va aumentando la concentración de etanol, y esto junto con la disminución de azúcares es lo que ralentiza el crecimiento de las levaduras. Si estudiamos la curva de crecimiento de las levaduras vemos una primera etapa de crecimiento que se prolonga hasta que los nutrientes comienzan a escasear y el etanol alcanza una concentración tóxica. Finalmente, las levaduras entran en una etapa de muerte como consecuencia de la alta concentración de etanol alcanzada y falta de nutrientes. 32 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué Los azúcares fermentables presentes en el mosto, especialmente glucosa y fructosa, constituyen la principal fuente de carbono y energía para las levaduras responsables de la fermentación alcohólica. La concentración de azúcares del mosto determinará su velocidad de fermentación y el grado de alcohol producido. Lo habitual es que la concentración en el mosto sea de 170-220 g/L, lo que da una gradación entre el 10% y el 13% en V. Por encima de 220 gramos la fermentación se ralentiza por un aumento de la presión osmótica, y por encima de 600 la fermentación se para (aunque a 360 g se producen los vinos dulces). Si la concentración es muy baja se produce una ralentización por falta de nutrientes. En algunas regiones vinícolas, debido a sus características climáticas y situaciones meteorológicas puntuales, algunas vendimias no alcanzan el grado de madurez y concentración de azúcares adecuado para generar un vino de calidad. En estos países (Alemania o Suiza) está permitido la chaptalización, que consiste en la adición de azúcar de caña, y por tanto el aumento del grado alcohólico, independientemente de la uva. En España esto está prohibido, de hecho se considera que el vino es el producto que se obtiene directamente de la fermentación de la uva fresca o del mosto de la uva, si se obtuviese del azúcar de caña sería fraudulento. En cambio en países nórdicos, donde la uva no tiene la concentración de azúcares suficientes, sí está permitida la chaptalización. En cambio, en España sí que hay una vía permitida para aumentar el grado alcohólico en vendimias de menor calidad. Consiste en adicionar al mosto otros más concentrados. Para obtener estos mostos concentrados, lo que se hace es evaporarlo al vacío a bajas temperaturas o mediante osmosis inversa. Esta corrección debe realizarse antes de la fermentación. Otro de los factores a tener en cuenta son los compuestos nitrogenados, como amonio, aminoácidos y péptidos/proteínas. De forma natural el mosto es rico en estos, y suele ser suficiente para que la levadura crezca de manera natural. Una concentración adecuada en nitrógeno se encuentra entre 0,06-2,4 g/L, es decir, una concentración muy pequeña en relación al azúcar, por tanto el nitrógeno condicionará el crecimiento de la vendimia y la fermentación alcohólica. En este caso, a diferencia de la chaptalización, sí está permitida la regulación y corrección de los niveles de nitrógeno. Las levaduras asimilan en primer lugar el amonio libre mediante difusión facilitada, de hecho mientras haya amonio libre se inhibe el transporte de aminoácidos, una vez que se consume se introducen los aminoácidos y pequeños péptidos por permeasas, transporte activo. 33 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué La asimilación de nitrógeno supone la generación de un gradiente de protones en el interior celular, que luego tiene que ser descargado al exterior mediante una ATPasa. Cabe destacar que al aumentar la concentración etanol disminuye la permeabilidad de la membrana y por tanto se ve afectada la actividad ATPasa, esta es una de las razones por las que es tóxico el etanol para las levaduras. Como se ha dicho, los compuestos nitrogenados se pueden ajustar. Si el FAN es menor a 150 mg/L y el amonio a 25 mg/L se considera que la fuente de nitrógeno es insuficiente y se tiene que adicionar en forma de sales de amonio. En cambio, un exceso de sales de amonio puede inducir la formación excesiva de sustancias tóxicas, como el carbamato de etilo y aminas biógenas. La adición del nitrógeno se debe hacer al final de la fase de multiplicación, esperamos que pase la fase exponencial, para así influir de forma más eficaz en el aumento de la población de levaduras y evitar paradas de fermentación. A la vez hay que airear el mosto que favorecer el transporte y consumo de nutrientes. Además del azúcar y el nitrógeno, hay otros componentes, que aunque están en cantidades pequeñas son imprescindibles y promueven el crecimiento de las levaduras y la fermentación, aumentan la permeabilidad de las membranas, mitigan el efecto de las sustancias inhibitorias del crecimiento, etc. Algunos de estos componentes son las vitaminas, acido pirúvico, esteroles y ácidos grasos, entre otros. Tratamiento del mosto El mosto, para elaborar el vino, es sometido a tratamientos que pueden afectar a su composición nutricional y la presencia microorganismos, siendo uno de ellos el desfangado. Esto proceso se realiza antes de la fermentación en el mosto con el fin de eliminar partículas en suspensión, y se lleva sobre todo en blancos y rosados ya que estos no requieren el contacto con los hollejos durante la fermentación, por eso este proceso no se lleva a cabo en los tintos. El desfangado puede realizarse mediante distintos métodos: estáticos, dinámicos o mixtos. Trae consigo aspectos positivos como disminución de levaduras indeseables, bacterias acéticas o colores más pálidos y estables. Sin embargo, si no se hace de manera adecuada, el desfangado puede producir el empobrecimiento de levaduras y nutrientes, y como consecuencia una fermentación más lenta o incluso incompleta, por ello si esto ocurre es necesario corregirlo. Si lo que se produce es un empobrecimiento de levaduras lo que se hace es sembrar levaduras a partir de pies de cuba o adicionar levaduras secas tras hidratarlas. En el caso de una disminución de nutrientes, lo primero es determinar el déficit concreto y el nivel, y luego se realiza una corrección de los mismos. Otra operación que se lleva a cabo es el sulfitado, si se hace de forma excesiva favorece efectos indeseables como la neutralización del aroma y sabor del vino, formación de compuestos 34 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué indeseables de azufre (sulfhídrico), inhibición de la fermentación maloláctica al impedir el crecimiento de las bacterias lácticas e incluso ligera toxicidad (hay unos límites legales). Condiciones operativas durante la fermentación Además de la capacidad nutricional del mosto, algunos factores fisicoquímicos influirán significativamente en el crecimiento de las levaduras, en la cinética y rendimiento de la fermentación alcohólica, así como en la calidad del vino obtenido. Entre estos factores encontramos el pH, la temperatura, la presión y la aireación. Debido a que la fermentación es un proceso exotérmico, es importante controlar la temperatura y vigilar que no suba demasiado. Para controlar la temperatura hay serpentines rodeando el depósito que permiten enfriar el mosto en la fermentación. Además existen dos temperaturas óptimas, una de crecimiento de levaduras y otra de producción del vino en la que se producen metabolitos interesantes, y no coinciden necesariamente una con otra. A la hora de seleccionar la temperatura a la que se desarrolle la fermentación, se prioriza esta temperatura a la que se producen metabolitos interesantes frente a la de crecimiento óptimo de las levaduras. No se puede conducir la fermentación alcohólica a la temperatura optima a la que crecen las levaduras, por lo que hay que estresar un poco las levaduras para obtener un vino de mejor calidad. S. cerevisiae, por ejemplo, tiene una temperatura óptima de crecimiento de entre 30 y 35°C, a la cual se prioriza la fermentación gliceropirúvica frente a la alcohólica. Por tanto, si fermentásemos a esta temperatura, predominaría el glicerol sobre el etanol y no podríamos elaborar adecuadamente el vino. Fermentando a una temperatura de entre 15 y 30°C se logra producir más etanol, así como otros metabolitos secundarios deseados como ácidos grasos y ésteres aromáticos. Por encima de los 25°C se favorece la extracción de los polifenoles de los hollejos, por eso a esa temperatura se obtienen los tintos, en cambio los blancos se producen a temperaturas más bajas. Si la temperatura aumenta desde los 19 hasta los 30°C, la síntesis de ergosterol, fundamental en la composición de la membrana celular, disminuye en más de la mitad. Finalmente, cabe destacar que cambios bruscos en la temperatura de más de 5°C pueden provocar una parada de la fermentación por el estrés térmico generado. Otro de los factores a controlar es el régimen de aireación. Aunque las levaduras sean capaces de fermentar en ausencia de oxígeno, no son organismos anaerobios estrictos, sino que requieren de O2 para determinadas rutas metabólicas. Por tanto, aunque la fermentación es un proceso anaerobio desde un punto de vista bioquímico, el oxígeno se requiere para el adecuado crecimiento celular. Es esencial para la síntesis de ácidos grasos insaturados y esteroles de membrana, como el ergosterol, responsables de la fluidez y permeabilidad de las membranas celulares: a mayor cantidad esteroles más solubilidad y permeabilidad de la membrana, favoreciendo el transporte. Pero la aireación no sólo es necesaria para esa biosíntesis, sino también para paliar el efecto toxico del etanol sobre la ATPasa. Al disminuir la funcionalidad de la ATPasa, esta deja de expulsar protones, de modo que el medio interno de la levadura se acidifica y esta termina muriendo. Al final de la fase exponencial, ya hay cierto nivel de etanol que afecta a la permeabilidad de la membrana, por eso en esta etapa es importante airear facilitando así la 35 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué llegada de oxígeno, y por tanto la síntesis de ergosterol que aumenta la permeabilidad de la membrana. De este modo, la oxigenación de las levaduras aumenta la permeabilidad y fluidez de las membranas al sintetizarse ergosterol y ácidos grasos insaturados, y por otra parte se favorece el funcionamiento de la ATPasa, lo que en conjunto facilita la captación de N del medio. En ausencia total de oxígeno las levaduras sustituyen los ácidos grasos insaturados por saturados aumentando la rigidez de membrana y dificultado el intercambio de sustancias con el medio ambiente. Finalmente, cabe destacar que el O2 es fundamental para otras rutas de biosíntesis, como la del grupo hemo y de las pirimidinas. Se recomienda, al menos, una fase de aireación al terminar la fase exponencial de crecimiento de las levaduras, así como cuando se adicionan las sales de amonio para facilitar la captación del N. Pregunta de examen: ¿por qué las levaduras a pesar de tener un metabolismo fermentativo necesitan oxigeno? 36 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué TEMA 10 FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA ACIDEZ DEL VINO La sensación de acidez no sólo está influenciada por el valor de pH, sino además por las especies de ácidos presentes y la concentración individual de cada una de ellas. Por tanto, para un mismo pH dos vinos pueden ser completamente distintos debido a que las especies de ácidos y sus concentraciones pueden variar, repercutiendo positiva o negativamente en las características organolépticas, la calidad y la estabilidad del vino. Ácidos del vino:  Ácidos provenientes de la uva, mayormente tartárico y málico. También hay cítrico y otros ácidos orgánicos.  Una vez terminada la fermentación alcohólica, y durante la maloláctica, se va a añadir al vino ácidos provenientes del metabolismo microbiano (de levaduras y bacterias), tanto no volátiles (láctico y succínico) como volátiles (acético, etc.).  Ácidos de la madera de las barricas, por ejemplo el 4-hidroxibutírico. La acides total se mide en g/L de ácido tartárico, que en un vino de calidad está entre 4,5 y 7 g/L de tartárico. A la acidez total contribuye una fracción beneficiosa que es la acidez fija, y una usualmente perjudicial que hay que reducir al máximo que es la acidez volátil. La acidez fija está formada por ácidos no volátiles que no pueden ser separados del vino por destilación, proceden de la uva y de las fermentaciones, favorecen la estabilidad biológica y química. Mientras que la acidez volátil aporta aromas indeseables, en caso de que estén por encima de un valor umbral. Entre los ácidos volátiles encontramos el acético, propiónico (grasa), fórmico y butírico (queso). El ácido tartárico es específico y característico de la uva, casi no existe en la naturaleza. Contribuye a la acidez total, y confiere sensación de astringencia o sequedad. Es poco metabolizable. El ácido málico es también abundante en la uva, confiere un sabor herbáceo y agresivo, similar a una manzana verde, no muy apetecible para muchos consumidores. En menor cantidad está el ácido cítrico, es metabolizable pero más lento que el málico y puede ser fuente de ácido acético. Da sensación de frescura con un toque amargo y aromas frutales. No es necesario eliminarlo. El pH de mosto ronda entre 2,4 y 4,2. La pulpa es ligeramente más ácida que los hollejos, lo cual determina que el pH de los vinos blancos sea ligeramente menor que en los tintos. Con la maduración, los ácidos contenidos en las uvas disminuyen y el pH aumenta. Las vendimias de climas cálidos suelen producir bajos niveles de ácidos y altos valores de pH, ocurre lo contrario en climas fríos. En dependencia de esto se hace la corrección de la acidez, que según el método el momento de aplicación será antes o después. Corrección de la acidez de mostos y vinos La corrección de la acidez (acidificación o desacidificación) de los mostos y vinos está autorizada hasta límites legales específicos según el método de corrección aplicado. Cada método de 37 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué corrección tendrá un momento de aplicación adecuado (antes o después de la fermentación alcohólica, antes del embotellado, etc.) para garantizar una mayor calidad del vino. Si tenemos una vendimia procedente de climas cálidos o con un exceso de maduración, la cantidad de ácidos en las uvas será baja y puede ser que sea necesario acidificar, adicionando tartárico o cítrico. Pero lo más frecuente es que nos encontremos con una maduración insuficiente o vendimias procedentes de climas fríos que hacen que el mosto tenga una nivel de ácidos ligeramente elevado, por tanto será necesario desacidificar. La desacidificación puede hacerse por métodos químicos (adición de potasio o calcio que forma sales neutras con el tartrato) o biológicos (fermentación maloalcohólica o maloláctica). Los ácidos tartárico y málico contribuyen a aproximadamente el 90% de la acidez del mosto, siendo el tartárico el más representativo. El problema es que el tartárico no es altamente metabolizado por microorganismos, pero a medida que aumenta la concentración de etanol comienzan a formarse cristales de este ácido debido a una disminución de la solubilidad. Estas sales de calcio y potasio que se forman no afectan a la calidad ni a las propiedades organolépticas. Esta precipitación tartárica se produce espontáneamente al bajar la temperatura del vino (estabilización por frío). El málico sí es metabolizable por lo que se podría reducir la acidez mediante su metabolización, en concreto mediante la fermentación maloalcohólica y la maloláctica. Semejanzas y diferencias entre la maloláctica y maloalcohólica: los dos procesos tienen como consecuencia la desacidificación del vino, reducen la acidez y ambas rutas parten del málico. Pero la maloalcohólica es llevada a cabo por levaduras y la maloláctica por bacterias, además los productos son diferentes, en la primera se produce etanol y en la segunda láctico. Por cualquiera de las dos vía se reduce el ácido málico, aumentando ligeramente el pH y cambiando las cualidades organoléptica, se produce un cambio de sabor se pasa de uno similar a una manzana verde a unos sabores ligeramente lácticos. Aunque Schizosaccharomyces puede llegar a metabolizar hasta el 100% del málico es una levadura que tiene fermentación lenta y puede dar aromas y sabores desagradables. Por tanto, en la mayoría de las bodegas se hace la fermentación maloláctica para desacidificar y así se evitan estos efectos adversos. Otra opción es inmovilizarlas en alginato y retirarlas una vez metabolizado el ácido málico. FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Las bacterias lácticas presentan un metabolismo fermentativo llevando a cabo la fermentación maloláctica. El piruvato obtenido de la glucólisis es transformado a lactato por la LDH, en este proceso se regeneran los NAD+ gastados en la glucólisis. Por tanto en esta fermentación se obtiene lactato a partir de azúcares. 38 BIOQUÍMICA Y MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICAS | Ainhoa Riera Begué La acción de las bacterias lácticas se produce tras la fermentación alcohólica, por lo que los niveles de glucosa serán mínimos. Si no es así se producirá un picado láctico debido a la excesiva formación de lactato. Las bacterias lácticas se dividen en dos tipos en función de su metabolismo:  Homofermentativo: fermenta las hexosas vía glucólisis, solo produce lactato.  Heterofermentativo: consume hexosas y pentosas mediante la vía de las pentosas fosfato. Se obtiene lactato, pero también CO2, etanol y acetato, por lo que hay que tener cuidado con estas bacterias porque puede incrementar la producción de acetato y dar un olor/sabor avinagrado. Las pentosas por sí solas no son capaces de producir ese picado láctico ya que están en pequeña cantidad, pero sí que es necesario limitar al máximo la presencia de hexosas residuales. En mostos y vinos se podrán aislar tanto especies lácticas homofermentativas como heterofermentativas. Oenococcus oeni, a pesar de ser heterofermentativa, es la principal bacteria para llevar a cabo la fermentación maloláctica. Las bacterias lácticas utilizan el ácido málico del mosto para la generación de ATP. El málico se internaliza al citoplasma, y pasa a láctico, se consumen protones del interior celular y este consumo y disminución genera un gradientes de protones externo que luego es descargado por una ATP sintasa y así generar ATP. Gracias a la enzima maloláctica se pasa de málico a láctico, disminuyendo la acidez, ya que se pasa de un ácido dicarboxílico a uno monocarboxílico, es un ácido más débil. Además del málico, el cítrico también puede ser metabolizable por las bacterias lácticas, este metabolismo es mucho más lento que el del málico. Con la degradación de cítrico se genera acético y diacetilo. Esta degradación es la causa principal del incremento de la acidez volátil, por tanto el metabolismo del cítrico hay que evitarlo. Lo bueno es que al ser un metabolismo muy lento se puede parar justo después del consumo del málico. Algunas de las bacterias presentes en el mosto, Lactobacillus, son capaces de metabolizar el tartárico que dará lugar a acético, por tanto también hay que evitarlo. Pero esta degradación se da tras consumir el málico y el cítrico, por lo que es fácil de evitar. Esta degradación baja la acidez volátil y la total, y confiere un olor a col cocida. Si no se conduce bien la fermentación maloláctica también puede producirse un efecto negativo, algunas bacterias lácticas pueden degradar el glicerol y producen subproductos q

Apuntes de Bioquímica y Microbiología Enología (2020/2021)

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