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organización del citoesqueleto depende de la capacidad de las sistemas citoesqueléticos, en el capítulo siguiente se observa-- células para percibir señales –de factores solubles que bañan rá que los microfilamentos cooperan con los microtúbulos la célula, de célula...

organización del citoesqueleto depende de la capacidad de las sistemas citoesqueléticos, en el capítulo siguiente se observa-- células para percibir señales –de factores solubles que bañan rá que los microfilamentos cooperan con los microtúbulos la célula, de células adyacentes o de la matriz extracelular– e y los filamentos intermedios para el funcionamiento celular interpretarlas (fig. 17-3). Estas señales son detectadas por re- normal. ceptores de la superficie celular que activan vías de transduc- ción de señales, las cuales finalmente convergen en factores que regulan la organización citoesquelética. 17.1 Microfilamentos y estructuras La importancia del citoesqueleto para la función normal y la motilidad celular es evidente cuando un defecto de un de actina componente citoesquelético –o de la regulación citoesquelé-- tica– causa enfermedad. Por ejemplo, alrededor de 1 cada Los microfilamentos pueden ensamblarse en una amplia 500 personas tiene un defecto citoesquelético que afecta variedad de estructuras dentro de la célula (fig. 17-4a). Cada el aparato contráctil del corazón, lo que provoca diversas una de estas estructuras es crucial para determinadas funcio- miocardiopatías (enfermedades del músculo cardíaco). Se nes celulares. Por ejemplo, los microfilamentos pueden for- sabe que numerosos defectos de los componentes citoesque-- mar un haz compacto de filamentos que componen el centro léticos de los eritrocitos que sostienen la membrana plas-- de las microvellosidades digitiformes, pero también pueden mática de estas células provocan enfermedad. Las células hallarse en una red menos ordenada justo por debajo de la cancerosas metastásicas se separan de su tejido de origen y membrana plasmática, en una región de citoplasma conocida migran a nuevas localizaciones debido a la mala regulación como corteza celular, celular, donde proporcionan soporte y organi- del citoesqueleto. zación a las proteínas de membrana. En las células epiteliales, En este capítulo y el siguiente, se analizarán la estructura, la los microfilamentos forman una banda contráctil alrededor función y la regulación del citoesqueleto. Se estudiará cómo de la célula, el cinturón adherente, que confiere resistencia al dispone una célula su citoesqueleto para generar la forma y epitelio. En las células migratorias, se observa una red de mi- la polaridad celular a fin de proporcionar organización y mo- crofilamentos en la parte frontal de la célula en el borde con- tilidad a sus orgánulos, y ser el marco estructural de proce- ductor, o lamelipodio, a partir del cual pueden protruir haces sos como la natación y el arrastre de la célula. Se considerará de filamentos denominados filopodios. Muchas células tienen cómo las células ensamblan los tres sistemas de filamentos di- microfilamentos contráctiles conocidos como fibras de ten- ferentes y cómo regulan estas estructuras las vías de transduc- sión, que se unen al sustrato externo a medida que migran las ción de señales. En el capítulo 19, se analizará la regulación células (analizado en el capítulo 20). Células especializadas, del citoesqueleto durante el ciclo celular. En el capítulo 20 20,, se se como los macrófagos, utilizan microfilamentos contráctiles estudiará cómo participa el citoesqueleto en la organización para englobar e internalizar patógenos mediante fagocitosis. funcional de los tejidos. En este capítulo, el análisis se centra- Cursos breves, muy dinámicos, de ensamblado de filamentos rá en los microfilamentos y las estructuras basadas en actina. de actina pueden impulsar el movimiento de vesículas endo- Si bien inicialmente se considerarán por separado los tres cíticas desde la membrana plasmática. En una etapa tardía de la división celular en animales, después de que todos los orgánulos se han duplicado y segregado, se forma un anillo contráctil que se estrecha para generar dos células hijas en el Señales de factores solubles, otras células proceso denominado citocinesis. Por consiguiente, las células y la matriz extracelular utilizan filamentos de actina de muchas maneras: en papeles Membrana plasmática estructurales, como mecanismos contráctiles, aprovechando con receptores la polimerización y despolimerización de actina para realizar erio r trabajo, y para mover vesículas en el interior de una célula. A Ex t menudo, coexisten muchas disposiciones de microfilamentos s ol dentro de una sola célula, como se muestra en un filamento en Ci to migración (fig. 17-4b). Vías de transducción El componente básico de los microfilamentos es la act actina, ina, de señales una proteína que tiene la notable capacidad de ensamblarse de manera reversible en un filamento polarizado con extre-- mos funcionalmente distintos. Estos filamentos son moldea-- Citoesqueleto dos en diversas estructuras descritas en el párrafo previo por proteínas de unión a actina. El nombre mic microfi rofilamen to, que lamento, Organización y Forma, surgió de los filamentos muy delgados visualizados por mi-- movimiento movimiento y croscopia electrónica en preparados de cortes delgados de de orgánulos contracción celular células, hace referencia a la actina en su forma polarizada, con sus proteínas asociadas. En esta sección, se considerará FIGURA 17-3. Regulación de la función del citoesqueleto citoesqueleto por la proteína actina en sí misma y los filamentos en los que se señalización celular. Las células células utiliz utilizan an re recepto ptores res de de la supe super ficie ensambla. celular para percibir señales externas provenientes de la matriz ex- tracelular, de otras células o de factores solubles. Estas señales son transmitidas a través de la membrana plasmática y activan vías de La actina es antigua, abundante y está altamente señalización citosólicas específicas. Las señales –a menudo integradas conservada a partir de más de un receptor– conducen a la organización del citoes- queleto de manera que proporcione a las células su forma, y determi- La actina es una proteína intracelular abundante en las célu- ne la distribución y el movimiento de los orgánulos. En ausencia de las eucariontes. Por ejemplo, en las células musculares, la acti- señales externas, las células organizan, aun así, su estructura interna, na representa el 10% del peso de la proteína celular total; aun pero no de un modo polarizado. en células no musculares, la actina es el 1-5% de la proteína 17.1 Microfilamentos y estructuras de actina 755  (a) (b) Borde conductor Microvellosidades Corteza celular Cinturón adherente Filopodios Fibras de tensión Filopodios Lamelipodio/ Fibras de tensión borde conductor Fagocitosis Vesículas endocíticas Anillo contráctil en movimiento FIGURA 17-4. Ejemp Ejemplo loss de estruc estructuras turas basad basadas as en microfil microfilamentos. amentos. faloidina fluorescente, una sustancia que se une específicamente a la (a) En cada panel, los microfilamentos se representan en rojo. (b) Célula F-actina. Obsérvese cuántas organizaciones diferentes de microfilamen-- que se mueve hacia la parte superior de la página, teñida para actina con tos pueden existir en una célula. (P (Par arte te b: b: co con auto autoririzzaci ación ón de de J. Vi Victor Small). Small). celular. La concentración citosólica de actina en células no contráctiles; la corteza celular y el borde conductor de las musculares varía de 0,1 a 0,4 mM. En cambio, en estructuras células móviles están enriquecidos en b-actinas; y la g-actin actinaa como las microvellosidades, la concentración local de actina se localiza en fibras de tensión. puede alcanzar hasta 5 mM. Para comprender cuánta actina hay en las células, considere una célula hepática típica, que tiene 2 ´ 104 moléculas receptoras de insulina, pero alrededor Los monómeros de G-actina se ensamblan en de 5 ´ 108, o 500 millones, moléculas de actina. Como forman estructuras que se extienden por grandes partes del interior largos polímeros de F-actina helicoidales celular, las proteínas citoesqueléticas se encuentran entre las La actina existe como un monómero globular llamado proteínas más abundantes de una célula. G-actina y como un polímero filamentoso llamado F-actina, La actina es codificada por una familia de genes que da que es una cadena lineal de subunidades de actina. Cada mo- origen a algunas de las proteínas más conservadas dentro lécula de actina contiene un ion Mg2+ que forman un complejo de una especie y entre especies. Las secuencias proteicas de con ATP o ADP. De hecho, la actina es una ATPasa que hidro- las actinas de amebas y animales son idénticas en el 80% liza ATP a ADP y Pi. Más adelante, se analiza la importancia de sus posiciones aminoacídicas, pese a los aproximada-- de la interconversión entre las formas ATP y ADP de la actina. mente 500 millones de años de evolución. Los múltiples ge-- El análisis por cristalografía de rayos X revela que el monó- nes de actina hallados en los eucariontes modernos están mero de G-actina está separado en dos lóbulos por una hen- relacionados con un gen bacteriano, MreB MreB,, cuyo produ roducto cto didura profunda (fig. 17-5a). En la base de la hendidura, se forma filamentos que son importantes en la síntesis de la encuentra el pliegue de ATPasa, ATPasa, que es el sitio donde están pared celular bacteriana. Algunos eucariontes unicelulares, unidos el ATP y el Mg2+. El pliegue de ATPasa ATPasa tiene similitud como levaduras y amebas, tienen uno o dos genes de actina, estructural con la hendidura de unión a GTP de los interrup- mientras que los organismos multicelulares suelen contener tores moleculares GTPasa (véase fig. 15-7). El suelo de la hen- múltiples genes de actina. Por ejemplo, los seres humanos didura de la G-actina actúa como una bisagra que permite la tienen 6 genes de actina, mientras que Arabi dopsis tiene de Arabidopsis flexión de los lóbulos uno respecto del otro. Cuando se une 8 a 10, y el maíz, 21. Cada gen de actina funcional codifica ATP o ADP a la G-actina, el nucleótido afecta la conforma- una isoforma diferente de la proteína. En los vertebrados, ción de la molécula (de hecho, sin un nucleótido unido, la existen cuatro isoformas de actina en tipos específicos de G-actina se desnaturaliza con mucha rapidez). células musculares, y otras dos isoformas en las no mus-- La G-actina puede polimerizarse, en una reacción reversi- culares. Estas seis isoformas solo difieren en alrededor de ble, a F-actina. Los filamentos de F-actina que se forman in 25 de los 375 residuos de la proteína completa o muestran vitro son indistinguibles de los microfilamentos observados una identidad de alrededor del 93%. Tradicionalmente, las en las células, lo que indica que la F-actina es su componente isoformas de actina se han clasificado en tres grupos sobre principal. la base de su carga global: las a-actinas, las b-actinas y las Por los resultados de estudios de difracción de rayos X de -actinas g-a ctinas.. Las a-a -actinas ctinas se asocia asociann con dive diversas rsas estru estructuras cturas filamentos de actina y por la estructura de los monómeros 756 O 17 Organzacón y movment CAPÍTULO CAPÍTUL movmento o celular I: mcroflamentos mcroflamentos  (a) (b) (c) Extremo (–) Hendidura de unión a ATP * IV * II 36 nm * * * * * * Mg2+ * III I * 36 nm * * * * Extremo (+) FIGURA 17-5. Estruc Estructuras turas de la G -ac -actina tina monomérica y los filamen filamen- hacia el mismo extremo del filamento. El extremo de un filamento con tos de F-actina. (a) Estruc Estructu tura ra del monómero de actiactina na (m 5,5 ´ 5, (mide 5, 5,55´ una hendidura de unión expuesta es el extremo (–); el extremo opuesto 3,5 nm), que está dividido por una hendidura central en dos lóbulos de es el extremo (+). (c) En el microscopio electrónico, los filamentos de ac-- aproximadamente el mismo tamaño y cuatro subdominios numera-- tina teñidos negativamente se visualizan como hebras largas, flexibles dos de I a IV. El ATP (amarillo) se une a la parte inferior de la hendidura y retorcidas de subunidades arrosariadas. A raíz del giro, el filamento y entra en contacto con ambos lóbulos (la esfera verde representa Mg2+). aparece alternativamente más delgado (7 nm de diámetro) o más grue-- Los extremos N-terminal y C-terminal se encuentran en el subdominio I. so (9 nm de diámetro) (flechas). (Los microfilamentos observados en (b) Un filamento de actina aparece como dos hebras de subunidades. una célula por microscopia electrónica son filamentos de F-actina más Una unidad repetitiva consiste en 28 subunidades (14 en cada hebra, in-- cualquier proteína unida). (Par (Parte te a: a: datos datos de de C. E. E. Schut Schutt et al., 19 1993, Nat atu ure dicado por un * para una hebra) que cubren una distancia de 72 nm. La 365:8 :8110, PDB ID 2bt 2btff, co cortesí tesíaa de de M. M. Rozyck Roz ycki.i. Part Par te c: c: Rog Roger Craig, Craig, Universit Universityy hendidura de unión a ATP de cada subunidad de actina está orientada of Massachusetts, Medical School). de actina mostrada en la fi figu gura ra 17- 5a,, los 17-5a los cien científ tífic icos os han han de de- didura de unión a ATP de la subunidad de actina terminal terminado que las subunidades de un filamento de actina es-- entra en contacto con la subunidad vecina, mientras que en el tán dispuestas en una estructura helicoidal (fi fig. g. 17- 17-5b ). En 5b). extremo (–), la hendidura está expuesta a la solución circun- esta disposición, el filamento puede considerarse como dos dante (véase fig. 17-5b). hebras helicoidales enrolladas entre sí. Cada subunidad de la La hendidura de una subunidad de actina, y en consecuen- estructura entra en contacto con una subunidad por encima y cia la polaridad de un filamento, no es detectable sin la resolu- una por debajo de ella de su propia hebra, así como con dos ción atómica proporcionada por la cristalografía de rayos X. subunidades de la otra hebra. Las subunidades de una hebra Sin embargo, la polaridad de los filamentos de actina puede simple se enrollan alrededor de la parte posterior de la otra demostrarse mediante microscopia electrónica en experimen- hebra y se repiten después de 72 nm, o 14 subunidades de tos denominados de decoración, que aprovechan la capacidad actina. Como hay dos hebras, el filamento de actina parece de la proteína motora miosina (analizada en la sección 17.5)17.5) repetirse cada 36 nm (véase fi fig. g. 17- 17-5b 5b).). Cua Cuandndo o se obs obser erva va para unirse específicamente a filamentos de actina. En este F-actina por microscopia electrónica después de teñirla nega-- tipo de experimento, se mezcla un exceso de miosina S1, un tivamente con acetato de uranilo, aparece como una cuerda producto de la escisión proteolítica de la miosina que contiene retorcida cuyo diámetro varía de 7 a 9 nm (ffig 17-5cc). ig.. 17-5 el dominio de la cabeza de unión a actina (véase fig. 17-22), 17-22), con filamentos de actina en condiciones en las que tiene lugar la unión. La miosina se adhiere a los costados de un filamento La F-actina tiene polaridad estructural y funcional y se une con una ligera inclinación. Cuando todas las subu- Todas las subunidades de un filamento de actina están orien- nidades de actina están unidas a miosina, el filamento parece tadas de la misma manera. Una consecuencia de la orienta- como si estuviera decorado con puntas de flecha que apun- ción de estas subunidades es que el filamento, en su totalidad, tan, todas, hacia su extremo (–) (fig. 17-6). Por consiguien- muestra polaridad; es decir, un extremo del filamento difiere te, el extremo (–) suele denominarse el extremo puntiagudo del otro. Como se verá, un resultado de esta orientación de de un filamento de actina. El extremo (+) se conoce como el las subunidades es que se favorece un extremo, designado ex- extremo con púas. Dado que la miosina se une a filamentos tremo (+), para la adición de subunidades de actina, mien- de actina y no a microtúbulos ni filamentos intermedios, la tras que se favorece el otro extremo, designado extremo (–), decoración con puntas de flecha es un criterio que permite para la eliminación de subunidades. En el extremo (+), la hen- identificar definitivamente los filamentos de actina entre las 17.1 Microfilamentos y estructuras de actina 757  FIGURA EXPERIMENTAL 17-6. La decor decoración ación con con miosina S1 demuestra la identidad y polaridad de un filamento de actina. Lo Loss domini dominios os de de la cab cabeeza de de miosina S1 se unen a las subunidades de actina en una Extremo (Ϫ Ϫ) Extremo (+) orientación particular. Cuando se une a todas las subu- nidades de un filamento, S1 parece formar una espiral Extremo Extremo alrededor de este. Esta cubierta de cabezas de miosina puntiagudo con púas produce una serie de decoraciones con forma de punta de flecha (flechas). La polaridad de la decoración define un extremo puntiagudo (–) y un extremo con púas (+). (Roger Craig, University of Massachusetts, Medical School). otras fibras citoesqueléticas en las microfotografías electróni- La polimerización de la actina in vitro cas de células. se desarrolla en tres pasos La polimerización in vitro de monómeros de G-actina para formar filamentos de F-actina puede controlarse mediante CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 17.1 viscometría, sedimentación, espectroscopia de fluorescencia o microscopia de fluorescencia (véase capítulo 4). Cuando los Microfilamentos y estructuras de actina filamentos de actina alcanzan una longitud suficiente para en-- Los microfilamentos pueden ensamblarse en diversas marañarse, aumenta la viscosidad de la solución, que se mide estructuras, muchas de las cuales se asocian con la mem- como una disminución de su velocidad de flujo en un viscó-- brana plasmática (véase fig. 17-4a). metro. La base del análisis de sedimentación es la capacidad de la ultracentrifugación (100 000 g durante 30 minutos) para La actina, el componente básico de los microfilamen- sedimentar F-actina, pero no G-actina. El tercer análisis utiliza tos, es una proteína abundante en las células eucariontes G-actina marcada en forma covalente con un colorante fluores-- y está muy conservada entre las especies. cente; el espectro de fluorescencia del monómero de G-actina La actina puede ensamblarse reversiblemente en fila- marcado cambia cuando este se polimeriza en F-actina. Por mentos que consisten en dos hélices de subunidades de último, el crecimiento de los filamentos marcados con fluores-- actina. cencia puede visualizarse en tiempo real mediante microscopia de fluorescencia. Estos cuatro análisis son útiles para estudios Las subunidades de actina de un filamento están todas cinéticos de polimerización de actina y para caracterizar las orientadas en la misma dirección, con el sitio de unión a proteínas de unión a actina a fin de determinar cómo inciden en nucleótidos expuesto en el extremo (–) (véase fig. 7-5). la dinámica de la actina o cómo entrecruzan filamentos de esta. CUADRO 17-1 Resumen de las proteínas proteínas de unión 17.2 Dinámica de los filamentos a actina analizadas en este capítulo de actina Nombre Función primaria El citoesqueleto de actina es una estructura dinámica en Profilina Intercambio de nucleótidos de G-actina la que el ensamblado y el desensamblado de filamentos de actina, y su asociación en estructuras funcionales, están su- Cofilina Desensamblado de F-actina mamente regulados. En algunas estructuras citoesqueléticas, Timosina-bb4 Secuestro de monómeros de G-actina los microfilamentos son estables durante horas, mientras que, en otras, crecen o se encogen en segundos. Estos cambios de CapZ (extremo +) Unión a extremos de F-actina la organización de los filamentos de actina pueden generar y tropomodulina fuerzas que causan grandes cambios en la forma de una célula (extremo –) o impulsan movimiento de estructuras intracelulares. En esta Gelsolina Sección de F-actina sección, se considerará en primer lugar la capacidad intrínseca de la actina para polimerizarse y despolimerizarse, y después, Forminas, Arp2/3 Nucleación de actina se estudiará cómo son modulados estos procesos por proteí- Fimbrina, a-actinina, Entrecruzamiento de F-actina nas accesorias. Se verá cómo las proteínas de unión a actina filamina, espectrina realizan importantes contribuciones a la estabilidad y el des- ensamblado regulado de los filamentos. En secciones poste- Anquirina, banda 4.1, Unión a la membrana de F-actina riores, se tratarán los mecanismos que utilizan las células para proteínas ERM, distrofina ensamblar y organizar filamentos de actina, de qué manera Miosinas Motores moleculares basados en regulan las vías de señalización la localización del ensamblado F-actina dentro de una célula y cómo, junto con las miosinas, pueden impulsar procesos de motilidad. En el cuadro 17-1, se presen- Nebulina Regulación de la longitud de F-actina ta un resumen de las proteínas de unión a actina analizadas Tropomiosina ropomiosina Estabilización de F-actina en este capítulo. 758 O 17 Organzacón y movment CAPÍTULO CAPÍTUL movmento o celular I: mcroflamentos mcroflamentos  (a) Núcleo Núcleo Núcleo F-actina Extremo (–) F-actina Extremo (+) G-actina Nucleación Elongación Estado de equilibrio (b) (c) Estado de Estado de Nucleación Elongación Elongación equilibrio equilibrio Masa de filamentos Masa de filamentos Núcleos añadidos en t = 0 Tiempo Tiempo FIGURA 17-7. Las tr tres fas fasees de de la la po polim imeerización in in vi vitro de de en equilibrio con la G-actina monomérica. (b) El curso temporal de la G-actina. (a) En la fas fasee de de nuclea nucleació ción n inicial inicial,, los los monó monómmero eross de reacción de polimerización in vitro revela el período de retraso inicial ATP-G-actina (rojo) forman lentamente complejos estables de actina asociado con la nucleación, la fase de elongación y el estado de equi-- (púrpura). En la segunda fase, estos núcleos se elongan con rapidez librio. (c) Si al inicio de la reacción se agregan algunos fragmentos de por la adición de subunidades a ambos extremos del filamento. En la filamentos de actina estables, cortos, para que actúen como núcleos, tercera fase, los extremos de los filamentos de actina se encuentran la elongación ocurre de inmediato, sin período de retraso. Se ha estudiado de manera exhaustiva el mecanismo de 3. En la fase de estado de equilibrio, los monómeros de ensamblado de la actina. Notablemente, se puede purificar G-actina se intercambian con subunidades en los extremos G-actina a una alta concentración proteica sin que esta for-- de los filamentos, pero estos no presentan ningún cambio neto de me filamentos, siempre que se la mantenga en un amortigua-- la longitud total. dor con ATP y bajas concentraciones de cationes. La adición Las curvas cinéticas de la figura 17-7b 17-7b,, c ilustran la masa de de cationes (p. ej., hasta 100 mM de K+ y 2 mM de Mg2+) filamentos durante cada fase de la polimerización. Es posible a una solución de G-actina inducirá la polimerización a mostrar experimentalmente que el período de retraso se debe a filamentos de F-actina, y la cinética de la reacción dependerá la nucleación, porque este puede ser eliminado por la adición de la concentración inicial de G-actina. El proceso es reversi-- de un pequeño número de núcleos de F-actina –compuestos por ble: la F-actina se despolimeriza a G-actina cuando disminu-- ye la concentración iónica de la solución. La polimerización filamentos muy cortos– a una solución de G-actina (fig. 17-7c). ¿Cuánta G-actina se necesita para que tenga lugar la nuclea- de G-actina pura in vitro procede en tres fases secuenciales ción? Los científicos colocaron diversas concentraciones de (fi fig. g. 17-7a ): 17-7a): G-actina en condiciones de polimerización y observaron que, 1. La fase de nucleación se caracteriza por un período de por debajo de determinada concentración, los filamentos no retraso en el que las subunidades de G-actina se combinan en pueden ensamblarse (fig. 17-8). Por encima de esta concentra- un oligómero de dos o tres subunidades. Cuando el oligómero ción, comienzan a formarse filamentos; cuando se llega al es- alcanza tres subunidades de longitud, puede actuar como una tado de equilibrio, la incorporación de más subunidades libres semilla, o núcleo, para el siguiente paso. es equilibrada por la disociación de subunidades de los extre- 2. Durante la fase de elongación, el oligómero corto au- mos de los filamentos para producir una mezcla de filamentos menta rápidamente de longitud por la adición de monómeros y monómeros. La concentración mínima de monómeros con de actina a ambos de sus extremos. A medida que crecen los la que se forman filamentos se conoce como concentración filamentos de F-actina, disminuye la concentración de monó- Cc). Por debajo de la Cc, no se formarán filamentos; crítica (C meros de G-actina hasta que se alcanza el equilibrio entre los por encima de la Cc, sí se forman. En estado de equilibrio, extremos de los filamentos y los monómeros, y se llega a un la concentración de actina monomérica se mantiene en la Cc estado de equilibrio. (fig. 17-8). 17.2 Dinámica de los filamentos de actina 759  Por consiguiente, cuando la concentración de ATP-G-actina libre es alta, se añadirán subunidades a los extremos del filamento más rápidamente de lo que se perderán subunidades, de manera Filamento que el filamento crecerá. A medida que disminuye la concentra-- ción, se alcanzará un punto en el que la velocidad de adición Masa Monómero será equilibrada por la velocidad de pérdida, y no se observará crecimiento neto del filamento. Por el momento, considere solo el extremo (+). La concentración de G-actina libre a la que las velocidades de adición y de pérdida son iguales se denomina concon-- centración crítica para el extremo (+), Cc+. Se puede calcular Cc+ fijando la velocidad de ensamblado como igual a la velocidad de Cc Concentración total de actina desensamblado. Por consiguiente, con la concentración crítica, (monómero y filamentos) la velocidad de ensamblado es Cc+ multiplicada por la velocidad medida de adición de 12 mM–1 s–1 (Cc+ ´ 12 s ), mientras que la –1 FIGURA 17-8. De Determinación terminación de la concentración concentración crítica (C (Cc) de de velocidad de desensamblado es independiente de la concentra-- G-actina por encima de la cual se forman filamentos. Cuando se ción de actina libre, a saber, 1,4 s–1. Al igualar estas dos veloci veloci-- colocan diferentes concentraciones de actina en condiciones de polime- dades, se obtiene Cc+ = 1,4 s–1/12 mM–1 s–1, o 0,12 mM, para el rización y se permite que la reacción alcance el estado de equilibrio, la Cc extremo (+). Por encima de esta concentración de ATP-G-actina es la concentración a la cual comienzan a formarse filamentos de actina. libre, se añaden subunidades al extremo (+) y hay crecimiento Con concentraciones de monómeros por debajo de la Cc, no no tiene tiene lug lugar ar neto, mientras que, por debajo de ella, existe una pérdida neta de la polimerización. Con concentraciones de monómeros por encima de la subunidades, y se observa encogimiento. Cc, los los fila filame mentos ntos se se ensam ensambl blan an hast hasta que que se se alcan alcanzza el es estad adoo de eq equili uili-- Ahora, considérese el extremo (–). Como la velocidad de brio y la concentración de monómeros permanece en la Cc. adición es mucho más baja, 1,3 mM–1 s–1, pero la velocidad de disociación es aproximadamente la misma, 0,8 s–1, se espera Los filamentos de actina crecen más rápidamente que la Cc– en el extremo (–) sea más alta que la Cc+. De hecho, como recién se hizo para el extremo (+), es posible calcular en los extremos (+) que en los extremos (–) que la Cc– es de alrededor de 0,8 s–1/1,3 mM–1 s–1, o 0,6 mM. Ya se vio mediante los experimentos de decoración de En consecuencia, con menos de 0,6 mM de ATP-G-actina libre S1 que la F-actina tiene una polaridad estructural inherente –p. ej., 0,3 mM– el extremo (–) perderá subunidades. Adviér-Adviér- que se debe a la orientación uniforme de las subunidades en tase que con esta concentración el extremo (+) crecerá, porque el filamento (véanse figs. 17-5 y 17-6). Como se describió 0,3 mM supera la Cc+. Dado que las concentraciones críticas antes, la G-actina puede unirse a ATP o a ADP. Cuando se para los dos extremos son diferentes, en estado de equilibrio, la ensambla ATP-G-actina en un filamento, el ATP es hidroli- ATP-G-actina libre tendrá un valor intermedio entre Cc+ y Cc–, zado con rapidez a ADP-Pi-actina. Además, esto da origen a de manera que el extremo (+) crecerá, y el extremo (–) perderá dos extremos diferentes: el extremo (+) está compuesto por subunidades. Este fenómeno se conoce como recambio rota- rota- ATP-actina o ADP-Pi-actina, y luego, el Pi es liberado más len- torio (treadmilling treadmilling)) porque subunidades particulares, como las tamente, lo que genera un filamento compuesto, en su mayor ilustradas en azul en la figura 17-10b, parecen moverse a través parte, por ADP-Pi-actina y ADP-actina. Además, esto origina del filamento. dos extremos diferentes: el extremo (+) está compuesto por El recambio rotatorio de los filamentos de actina es impulsado ATP-actina o ADP-Pi-actina, mientras que el extremo (–) tiene por la hidrólisis de ATP. Cuando se une ATP-G-actina al extre-- ADP-G-Actina. Si se añade ATP-G-actina libre a este filamento mo (+) de un filamento, el ATP es hidrolizado a ADP y Pi. Como preexistente decorado por miosina, los dos extremos crecen a velocidades muy diferentes (fig. 17-9). De hecho, la velocidad de adición de ATP-G-actina es casi 10 veces más rápida en el extremo (+) que en el extremo (–). Los experimentos cinéticos han mostrado que la velocidad de adición es de alrededor de Extremo (–) Extremo (+) 12 mM–1 s–1 en el extremo (+) y de alrededor de 1,3 mM–1 s–1 en el extremo (–) (fig. 7-10a). Esto implica que, si se agrega 1 mM de ATP-G-actina ATP-G-actina libre a filamentos preformados, se añadi- rán, en promedio, 12 subunidades al extremo (+) por segundo, mientras que se añadirán solo 1,3 subunidades al extremo (–) por segundo. Obsérvese que la velocidad de adición (la ve- locidad de asociación) es una función de la concentración de ATP-G-actina libre. ¿Qué sucede con la velocidad de pérdida de subunidades de cada extremo? A diferencia de las velocida- des de adición, las de disociación de subunidades de G-actina de los dos extremos es bastante similar: alrededor de 1,4 s–1 del extremo (+) y de 0,8 s–1 del extremo (–). Como esta disociación es simplemente la velocidad a la que las subunidades abando- FIGURA EXPERIMENTAL 17-9. Los do dos ex extremos de de un un fi filament ntoo nan los extremos del filamento, no depende de la concentra- de actina decorado con miosina crecen a diferente velocidad. ción de ATP-G-actina libre. Cuando se decoran filamentos cortos de actina con cabezas de miosi- ¿Cómo repercuten estas velocidades de asociación y diso-- na S1 para revelar su orientación y luego se los emplea para nuclear la ciación en la dinámica de la actina? Como se mencionó an-- polimerización de la actina, los monómeros de G-actina se añaden de tes, la velocidad de asociación depende de la concentración de modo mucho más eficiente a los extremos (+) que a los extremos (–) ATP-G-actina libre, mientras que la velocidad de disociación, no. de los filamentos en nucleación. (Cor Corttesía de Tho Thomas mas Pollard) Pollard).. 760 O 17 Organzacón y movment CAPÍTULO CAPÍTUL movmento o celular I: mcroflamentos mcroflamentos  (a) Extremo (–) Extremo (+) ADP-actina ADP-Pi-actina ATP-actina Pi 1,3 µM−1 s−1 12 µM−1 s−1 0,8 s−1 1,4 s−1 = 0,60 µM C c− C +c = 0,12 µM (b) (–) (+) ADP-G-actina ATP-G-Actina se ADP-G-Actina >ATP P-G-actina FIGURA 17-10. Recambio rot rotaatorio (treadmil (treadmilling ling)) de actina. Las de la ac extremo (+), lo que da origen a una región corta del filamento que con-- subunidades de ATP-actina se añaden más rápidamente al extremo (+) tiene ATP-actina y a regiones que contienen ADP-Pi-a -acctina y AD ADP-ac P-actina tina que al extremo (–) de un filamento de actina, lo que determina una hacia el extremo (–). (b) En estado de equilibrio, las subunidades de concentración crítica más baja en el extremo (+) y recambio rotatorio en ATP-G-actina se añaden de manera preferencial al extremo (+), mientras estado de equilibrio. (a) La velocidad de adición de ATP-G-actina es mu-- que las subunidades de ADP-G-actina se desensamblan del extremo (–), cho más rápida en el extremo (+) que en el extremo (–), mientras que la lo que da origen al recambio rotatorio de subunidades. Como referen-- velocidad de disociación de la actina es similar en ambos extremos. Esta cia, dos subunidades de actina están coloreadas de azul, para destacar diferencia causa una concentración crítica más baja en el extremo (+). que a lo largo del tiempo las subunidades parecen moverse del extre-- En estado de equilibrio, la ATP-actina se añade preferencialmente al mo positivo al negativo dentro del filamento. el Pi es liberado con lentitud de las subunidades del filamento, el samblado del extremo (–). En cambio, el complejo profilina- filamento se organiza en tres regiones: una región corta de su-- ATP-actina puede unirse de manera eficiente al extremo (+). bunidades de ATP-actina en el extremo (+), ADP-Pi-actina en el Una vez que la nueva subunidad de actina está unida al fila- medio del filamento y, tras la liberación de Pi, subunidades de mento, la profilina se disocia. La actividad de la profilina no ADP-actina hacia el extremo (–) (fig. 17-10a). Durante la libera- aumenta la velocidad de recambio rotatorio, pero sí garanti- ción de Pi de las subunidades de un filamento, la actina presenta za un aporte constante de ATP-actina formada a partir de la un cambio conformacional que es responsable de las diferentes ADP-actina liberada. En consecuencia, esencialmente toda la velocidades de asociación y disociación en los dos extremos. G-actina libre de una célula está unida a ATP. Este análisis se basa en un aporte abundante de ATP-actina que, La profilina tiene otra propiedad importante: puede unirse como se verá, resulta ser el caso in vivo. Por consiguiente, la a proteínas con secuencias ricas en residuos prolina al mismo actina puede utilizar la energía generada por hidrólisis de ATP tiempo que está unida a actina. Se verá más adelante cómo para el recambio rotatorio, y los filamentos que presentan re-- esta propiedad puede aumentar la velocidad de ensamblado cambio rotatorio pueden realizar trabajo in vivo, como se verá de filamentos de actina. más adelante. La segunda de las proteínas de unión a actina es la cofilina, una pequeña proteína que se une específicamente a subuni- El recambio rotatorio de los filamentos de actina dades de ADP-actina dentro de la F-actina. Recuérdese de la figura 17-10a que estas son las subunidades halladas hacia es acelerado por la profilina y la cofilina el extremo (–) de la F-actina. La cofilina se une y forma un In vivo, el recambio rotatorio de la actina puede tener lu- puente entre dos monómeros de actina, e induce un pequeño gar a velocidades varias veces más altas que las observadas in cambio en el giro del filamento. Este pequeño giro desesta- vitro con actina pura en condiciones fisiológicas. ¿Por qué es biliza el filamento entre regiones con cofilina y sin esta, y lo más rápido el recambio rotatorio in vivo y cómo recarga la rompe en fragmentos cortos. Al romper el filamento de esta célula la ADP-actina que se disocia del extremo (–) a la ATP- manera, la cofilina genera muchos más extremos (–) libres y, actina que se añade al extremo (+)? Las respuestas involucran por consiguiente, aumenta mucho el desensamblado neto del dos proteínas de unión a actina. filamento (véase el ciclo de la cofilina en la fig. 17-11). Luego, La primera de estas proteínas es la profilina, una pequeña las subunidades de ADP-actina liberadas son recargadas por proteína que se une a G-actina del lado opuesto a la hendidu- la profilina y añadidas al extremo (+) como se describió antes. ra de unión a nucleótidos (véase el ciclo de la profilina en la Cuando se mezclan profilina y cofilina purificadas con ). Cuando la profilina se une a la ADP-actina, abre fig. 17-11). G-actina purificada en condiciones en las que se formarán la hendidura y aumenta mucho la pérdida de ADP. Como la filamentos, las velocidades de recambio rotatorio in vitro au- [ATP] de la célula es mucho mayor que la [ADP], el ATP se mentan más de diez veces en comparación con el recambio une con facilidad a la G-actina y forma un complejo profili- rotatorio en ausencia de estas dos proteínas de unión a actina. na-ATP-actina. Este complejo no puede unirse al extremo (–) Estos mayores niveles de recambio rotatorio in vitro son simi- porque la profilina bloquea los sitios de G-actina para el en- lares a los observados in vivo. 17.2 Dinámica de los filamentos de actina 761  Extremo (–) Extremo (+) en la forma despolimerizada. Asimismo, contienen aproxima-- Actina-ADP Actina-ADP-Pi Actina-ATP damente 500 mM de timosina-b timosina-b4, que secuestra gran parte de la actina libre. Sin embargo, como en cualquier interacción proteí-- na-proteína, la actina libre y la timosina-bb4 libre se encuentran en equilibrio dinámico con la actina-timosina b4. Cuando parte de la actina libre se incorpore a los filamentos de actina, enton-- 1 ces se disociará más actina-timosina b4, lo que mantendrá un Ciclo de suministro estable de subunidades de actina disponibles para la la profilina polimerización (véase el ciclo de la timosina b4 en la fig. 17-11). 17-11). Por consiguiente, la timosina b4 se comporta como un amorti-amorti- guador de actina despolimerizada, que determina la disponibili-- 2 dad de subunidades de ATP-actina según sea necesario. T Ciclo de la cofilina 3 Las proteínas taponadoras bloquean D Ciclo de la el ensamblado y desensamblado timosina-ββ4 en los extremos de los filamentos de actina T Las células regulan aún más el recambio rotatorio y la dinámi-- ca de los filamentos de actina mediante proteínas taponadoras D ATP (capping proteins) que se unen a los extremos de los filamentos. T Si esto no fuera así, los filamentos de actina continuarían crecien-- do y desensamblándose de una manera no controlada. Como ca-- D bría esperar, se han descubierto dos clases de proteínas: una que ADP se une al extremo (+), y una que se une al extremo (–) (fig. 17-12). Una proteína conocida como CapZ, formada por dos subu- D ADP-actina nidades estrechamente relacionadas, se une con muy alta afi-- T ATP-actina Profilina Cofilina Timosina β4 nidad (~~0,1 nM) al extremo (+) de un filamento de actina, lo que inhibe la adición o la pérdida de subunidades. La concen-- FIGURA 17-11. Regul Regulación ación del recambio recambio de filame ilamenntos median mediante te tración celular de CapZ suele ser suficiente para taponar con proteínas de unión a actina. Las proteínas de unión unión a actina actina regulan rapidez cualquier extremo (+) recién formado. De modo que la velocidad de ensamblado y desensamblado de los filamentos de ¿cómo pueden crecer los filamentos en sus extremos (+)? Por lo actina, así como la disponibilidad de G-actina para la polimerización. menos dos mecanismos regulan la actividad de CapZ. En pri-- En el ciclo de la profilina (paso 1), es esta se une une a la ADP- ADP-G G -a -acctin tinaa y cata cata- mer lugar, su actividad taponadora es inhibida por el fosfolípi-- liza el intercambio de ADP por ATP. El complejo profilina-ATP-G-actina do regulador fosfatidilinositol 4,5 bifosfato [PI(4,5)P2], hallado puede entregar actina al extremo (+) de un filamento, con disociación y en la membrana plasmática (véase capítulo 16). En segundo reciclado de la profilina. En el ciclo de la cofilina (paso 2), es esta se se une une dede lugar, estudios recientes han mostrado que ciertas proteínas re-- modo preferencial a regiones de filamentos que contienen ADP-actina, guladoras pueden unirse al extremo (+) y protegerlo de CapZ, lo que induce su fragmentación y, en consecuencia, aumenta la des- polimerización al formar más extremos de filamentos. En el ciclo de la mientras que, sin embargo, se permite el ensamblado allí. En timosina-b b4 (paso 3), la AT ATP- P-G G -ac actin tinaa form formad adaa en el el ciclo ciclo de de la prof profilin ilinaa consecuencia, las células han desarrollado un mecanismo ela-- se une a timosina-b b4, que que la se secu cues estr traa de de la po polim limer eriz izaci ación ón.. A me medidida da borado para bloquear el ensamblado de filamentos de actina que la concentración de G-actina libre disminuye por la polimerización, en su extremo (+), excepto cuando y donde este es necesario. la G-actina-timosina-b b4 se dis disocia para para formar formar G-a G-acctina libre, disponible disponible para la asociación con profilina y la polimerización ulterior. Extremo (–) Extremo (+) La timosina-β4 proporciona un reservorio C c– = 0,6 μM CapZ de actina para la polimerización Desde hace tiempo se sabe que las células suelen tener una reserva muy grande de G-actina que, a veces, representa hasta la mitad de actina de la célula. Como las concentraciones celulares de actina pueden ser hasta de 100-400 mM, esto implica que Extremo (–) Extremo (+) puede haber hasta 50-200 mM de actina despolimerizada en las células. Dado que la concentración crítica in vitro es de alre-- C c+ = 0,12 μM dedor de 0,2 mM, ¿por qué no se polimeriza toda esta actina? La respuesta es, por lo menos en parte, que hay proteínas que secuestran G-actina. Una de estas proteínas es la timosina- b4. timosina-b Tropomodulina Cuando la timosina-b b4 se une a ATP-actina, ATP-actina, inhibe la adición de FIGURA 17-12. Pro roteínas teínas taponador taponadoras filamentos. Las pro as de filamentos. pro-- la subunidad de actina a uno u otro extremo del filamento. Por teínas taponadoras (cacap pping prote ns)) blo proteiins bloqquea ueann el ens ensam ambl blad ado oy ejemplo, considérense las plaquetas sanguíneas humanas. Estos desensamblado en los extremos de los filamentos. La CapZ bloquea fragmentos celulares en forma de disco son muy abundantes el extremo (+), que es el lugar donde normalmente crecen los fila- y, cuando se activan durante la coagulación de la sangre, pre-- mentos, de manera que su función es limitar la dinámica de la actina sentan una ráfaga de ensamblado de actina. Las plaquetas son al extremo (–). La proteína taponadora tropomodulina bloquea los ricas en actina; se estima que tienen una concentración total de extremos (–), donde ocurre normalmente el desensamblado de los alrededor de 550 mM, de los cuales alrededor de 220 mM están filamentos; por consiguiente, su principal función es estabilizarlos. 762 O 17 Organzacón y movment CAPÍTULO CAPÍTUL movmento o celular I: mcroflamentos mcroflamentos  La tropomodulina es una de las proteínas reguladoras que in- hiben el ensamblado y desensamblado de filamentos mediante 17.3 Mecanismos de ensamblado la unión al extremo (–) de un filamento de actina. Esta proteína de los filamentos de actina predomina en células en las que es preciso estabilizar los filamen-- tos de actina durante períodos prolongados, como los filamentos El paso limitante de la velocidad de la polimerización de acti-- de actina cortos de la corteza del eritrocito y los filamentos de na es la formación de un núcleo de actina inicial a partir del cual actina del músculo. En estas dos células, la tropomodulina actúa pueda crecer el filamento (véase fig. 17-7a). En las células, este con la proteína de unión a actina tropomiosina para estabilizar paso se utiliza como un punto de control para determinar dónde los filamentos de actina. Más adelante en este mismo capítulo, se se ensamblan filamentos de actina y qué tipos de estructuras de analizarán con más detalle estas interacciones proteicas. actina se generan (véanse figs. 17-1 y 17-4). Dos clases impor- Además de la CapZ, otra clase de proteínas pueden taponar tantes de proteínas de nucleación de actina, la familia de pro- los extremos (+) de los filamentos de actina. Estas proteínas teínas formina y el el complejo Arp2/3, nuclean el ensamblado de también pueden seccionar los filamentos de actina. Un miembro actina bajo el control de vías de transducción de señales. Ade-- de esta familia, la gelsolina, es regulada por la concentración de más, nuclean el ensamblado de diferentes estructuras de actina: Ca2+ iónico. Al unirse al Ca2+, la gelsolina presenta un cambio las forminas inducen el ensamblado de filamentos de actina lar-- conformacional que le permite unirse al costado de un filamento gos, mientras que el complejo Arp2/3 genera redes de filamen-- de actina y, luego, insertarse entre las subunidades de la hélice, tos ramificados. Aquí, se analizará cada uno por separado y se lo que rompe el filamento. Después, permanece unida y tapona verá cómo la energía de la polimerización de actina puede im-- el extremo (+), lo que genera un nuevo extremo (–) que puede pulsar procesos móviles en una célula. Después, se considerarán desensamblarse. Como se analizará en la siguiente sección, las otros factores de nucleación de actina especializados. proteínas de entrecruzamiento de actina pueden establecer en-- laces entre filamentos de actina individuales para convertir una solución de F-actina en un gel. Si se añade gelsolina a un gel de Las forminas ensamblan filamentos no ramificados este tipo y la concentración de Ca2+ es elevada, la gelsolina sec sec-- Las forminas se encuentran en casi todas las células eucarion-- cionará los filamentos de actina y volverá a convertir el gel en tes como una familia diversa de proteínas; en los vertebrados, una solución líquida. Esta capacidad de convertir un gel en un existen siete clases diferentes. Si bien son distintos, todos los sol explica por qué la proteína fue llamada gelsolina. miembros de la familia forminas tienen dos dominios adyacen-- tes en común, los así llamados dominios FH1 y FH2 (formin-formin- homology domains 1 and 2 [dominios 1 y 2 de homología a CONCEPTOS CLAVE DE LA SECCIÓN 17.2 formina]). Dos dominios FH2 de dos monómeros de formina individuales se asocian para formar un complejo en forma de Dinámica de los filamentos de actina rosquilla (fig. 17-13a). Este complejo tiene la capacidad de nu- clear el ensamblado de actina al unir dos subunidades de actina El paso limitante de la velocidad del ensamblado de fi- fi- y mantenerlas de manera tal que el extremo (+) del filamento lamentos de actina es la formación de un oligómero de naciente esté orientado hacia los dominios FH2. Ahora, el fi-- actina corto (núcleo) que, después, puede ser elongado a lamento puede crecer en el extremo (+), mientras que el díme-- filamentos. ro de dominios FH2 permanece unido a él. ¿Cómo es posible La concentración crítica (C (Cc) es la concentración de esto? Como se mencionó antes, un filamento de actina puede G-actina por debajo de la cual no se formarán filamentos considerarse como dos hebras de subunidades entrelazadas. El de actina. dímero de FH2 puede unirse a las dos subunidades terminales. Cuando la concentración de G-actina supera la Cc, cre- cre- Luego, es probable que se balancee entre las dos subunidades cerá el extremo del filamento, mientras que cuando es más terminales y suelte una para permitir la adición de una nueva baja que la Cc, el filamento se encogerá (véase fig. 17-8). subunidad y, después, se una a la subunidad recién añadida y li-- La ATP-G-actina ATP-G-actina se añade mucho más rápidamente al bere espacio para la adición de otra subunidad a la otra hebra. extremo (+) que al extremo (–), lo que determina una con-- De esta manera, balanceándose entre las dos subunidades del centración crítica más baja en el extremo (+) que en el extremo, puede permanecer unida mientras simultáneamente extremo (–). permite el crecimiento en el extremo (+) (fig. 17-13a). El dominio FH1 adyacente al dominio FH2 también realiza En estado de equilibrio, las subunidades de actina una contribución importante al crecimiento de filamentos de presentan recambio rotatorio a través del filamento. Re-- actina (fig. 17-14). Este domino es rico en residuos prolina, cambio rotatorio significa que se añade ATP-actina en el que sirven como sitios para la unión de varias moléculas de extremo (+), el ATP es hidrolizado a ADP y Pi, el Pi se pier- profilina. Ya se analizó cómo la profilina puede intercam- de lentamente y la ADP-actina se disocia del extremo (–). biar el nucleótido ADP de la G-actina por ATP para generar La longitud y la velocidad de recambio de filamentos ATP-G-Actina. El dominio FH1 se comporta como un sitio de actina son reguladas por proteínas de unión a actina de aterrizaje para la profilina-ATP-actina. El dominio FH1 se especializadas (véase fig. 17-11). La profilina aumenta el comporta como un sitio de aterrizaje para la profilina-ATP- intercambio de ADP por ATP en la G-actina; la cofilina se G-actina a fin de aumentar la concentración local de estos une a regiones de ADP-F-actina para romper el filamento y complejos. Luego, se aporta la actina de estos complejos pro- generar nuevos extremos (–) a fin de aumentar la velocidad filina-actina al dominio FH2 para añadir actina al extremo (+) de desensamblado de la ADP-actina de los extremos (–) de del filamento, y se libera la profilina (fig. 17-14). los filamentos, y la timosina-b b4 se une a G-actina para crear Como la formina posibilita la rápida adición de subunida- una reserva G-actina para cuando sea necesaria. Las pro-- des de actina al extremo (+), se generan filamentos largos con teínas taponadoras se unen a los extremos de los filamen-- una formina en su extremo (+) (fig. 17-13b). Por consiguiente, tos, lo que bloquea el ensamblado y el desensamblado. las forminas no solo nuclean el ensamblado de actina, sino que permanecen unidas al extremo (+) y, junto con la profilina, 17.3 Mecanismos de ensamblado de los filamentos de actina 763