Biología Molecular PDF

ínDiCe TEMA 1: CÉLULAS Y GENOMAS 1.1 CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS CÉLULAS (IMPORTANTE) 1.2 COMPONENTES QUÍMICOS DE LAS CÉLULAS AZÚCARES/ MONOSACÁRIDOS ÁCIDOS GRASOS NUCLEÓTIDOS AMINOÁCIDOS DIVERSIDAD GENÓMICA Y ÁRBOL DE LA VIDA TEMA 2: ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO 1. TEORÍA DE...

ínDiCe TEMA 1: CÉLULAS Y GENOMAS 1.1 CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS CÉLULAS (IMPORTANTE) 1.2 COMPONENTES QUÍMICOS DE LAS CÉLULAS AZÚCARES/ MONOSACÁRIDOS ÁCIDOS GRASOS NUCLEÓTIDOS AMINOÁCIDOS DIVERSIDAD GENÓMICA Y ÁRBOL DE LA VIDA TEMA 2: ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO 1. TEORÍA DE LA DOBLE HÉLICE DE WATSON, CRICK Y FRANKLIN (ADN B) 1.1 EVIDENCIAS 1.2 MODELOS ALTERNATIVOS 2. CROMOSOMAS DE VIRUS Y BACTERIAS 2.1 VIRUS 2.2 CROMOSOMA BACTERIANO 2.3 CROMOSOMAS DE ORGANISMOS EUCARIÓTICOS 3. IDENTIFICACIÓN DEL ADN COMO MATERIAL GENÉTICO 3.1 EXPERIMENTO DE GRIFFITH 3.2 EXPERIMENTO DE AVERY, MACLEOD Y MCARTY 4. TIPOS Y ESTRUCTURAS DEL ADN 4.1 ARN MENSAJERO 4.2 ARN TRANSFERENTE 4.3 ARN RIBOSÓMICO TEMA 3: REPLICACIÓN DEL ADN 1. SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA REPLICACIÓN 2. CARACTERÍSTICAS DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 1  TEMA 1: CÉLULAS Y GENOMAS Las células son las unidades básicas de la vida. Hay dos tipos de células, las procariotas y las eucariotas y poseen distintas formas y tamaños. 1.1 CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS CÉLULAS (IMPORTANTE) 1. Todas las células guardan su información genética en forma de ADN 2. Todas replican su material genético a través de una hebra molde de forma que el ADN de las células hijas es igual al de las madres 3. Todas las células transcriben parte de su material genético en forma de ARN 4. Todas las células usan proteínas como catalizadores (enzimas) 5. El fragmento de información genética que corresponde a una proteína se llama gen 6. Todas las células están rodeadas de una membrana (membrana plasmática) semipermeable, que permite el flujo de una serie de sustancias. 1.2 COMPONENTES QUÍMICOS DE LAS CÉLULAS En las células podemos encontrar una serie de nutrientes los cuales son imprescindibles para el correcto funcionamiento de la célula. Se dividen en dos grupos: Macronutrientes: H, Li Na, K, Mg, Ca, C, N, O, P, Cl Micronutrientes: Li, V, Cr, Mn, Mo, Fe, Co, Cu, Zn, B, Si, Se, I En las células hay cuatro tipos principales de molécula orgánicas pequeñas; azúcares (polisacáridos), ácidos grasos (lípidos), nucleótidos (ácidos nucleicos) y aminoácidos (proteínas) AZÚCARES/ MONOSACÁRIDOS Función: almacén de energía Fórmula general: (CH2O)n Los monosacáridos pueden unirse formando disacáridos (2)ej; sacarosa, oligosacáridos (2-20) y polisacáridos (+20), cuya función es el almacenamiento de energía, siendo el glucógeno en animales y el almidón en plantas ÁCIDOS GRASOS Función: almacenamiento de energía y componentes estructurales de las membranas celulares, formando las bicapas Lípidos: moléculas orgánicas insolubles en agua (hidrofóbicas) pero solubles en compuestos orgánicos (benceno). Fosfolípidos: componente principal de la membrana plasmática, están formados por una cadena carbonada, un grupo fosfato y un alcohol (glicerol). Poseen carácter anfipático 2 Los ácidos grasos pueden presentar insaturaciones (dobles enlace), la oposición que ocupa va señalada con el prefijo omega, si se empieza a contar por el final. Ej; omega 3 NUCLEÓTIDOS Son las subunidades del ADN y ARN Composición: Aldehído (ribosa - ARN, desoxirribosa - ADN), base nitrogenada (púricas/pirimidínicas) y un grupo fosfato AMINOÁCIDOS Son las subunidades de las proteínas y están formadas por un grupo amino (NH2) , un grupo carboxilo y una cadena lateral variable Los aminoácidos se encuentran unidos a partir de enlaces peptídicos Los componentes de las células son iguales/ muy parecidos en todas las células, tanto en procariotas como eucariotas. DIVERSIDAD GENÓMICA Y ÁRBOL DE LA VIDA Las comparaciones de ADN revelan relaciones entre los organismos vivos. El tamaño de los genes puede variar en las distintas especies, aunque aquellos con funciones más importantes no suelen variar mucho entre especies. Debido a las mutaciones o duplicaciones de genes existentes aparecen nuevos genes con funciones similares que contribuyen a la variabilidad y adaptación de los individuos. Los genes con funciones importantes son menos susceptibles a sufrir mutaciones pero sí duplicaciones. 3  TEMA 2: ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO El ADN está formado a partir de cadenas polinucleotídicas, nucleótidos unidos a través de enlaces fosfodiester La cadena polinucleotídica tiene 2 extremos; el 5´ donde se encuentra el grupo fosfato y el 3´donde se encuentra el grupo OH. Las cadenas de ADN pueden aparearse a partir de la unión de sus bases nitrogenadas, existiendo 2 uniones posibles; unión C-G (tres puentes de H) y las uniones A-T (2 puentes de H) 1. TEORÍA DE LA DOBLE HÉLICE DE WATSON, CRICK Y FRANKLIN (ADN B) 1.1 EVIDENCIAS Reglas de Chargaff: la regla de chargaff establece que siempre existe la misma cantidad de bases púricas que pirimidínicas. El número de timinas es igual al de adeninas y el de citosinas es igual al de guaninas Difracción de Rayos X: Hay dos cadenas polinucleotídicas enrolladas helicoidalmente La distancia entre las bases es de 3,4 A y se encuentran apiladas unas sobre otras orientadas de forma perpendicular al eje El diámetro es de 20 A y está enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 A hay una vuelta completa de la hélice. Características del modelo de la doble hélice: El ADN es una doble hélice enrollada helicoidalmente hacia la la derecha (dextrógiro) El diámetro de la doble hélice es de 20 A Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hélice y están apiladas unas sobre otras unas sobre otras a una distancia de 3,4 A. Cada 10 bases se produce una vuelta completa de la doble hélice Las hebras son antiparalelas (el extremo 5´se encuentra enfrentado al 3’) y se mantienen unidas por puentes de H Se crean dos surcos en la estructura del ADN de diferente amplitud implicados a la unión de proteínas 1.2 MODELOS ALTERNATIVOS El ADN B es el presente en disolución, tiene mayor interés biológico porque es el que presenta el ADN en interacción con proteínas nucleares. El DNA A es dextrógiro, tiene 11 pares de bases por giro y 23 Å de diámetro. Es más achatada que el B (2,9 Å) y se parece a la estructura de los híbridos DNA-RNA. El ADN Z es levógiro, tiene 12 pares de bases por giro y 18 Å de diámetro. Es más alargada (7,4 Å). Los azúcar-fosfato se disponen en “Zig-Zag”. Se observa en segmento con alternancia de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC). 4 2. CROMOSOMAS DE VIRUS Y BACTERIAS Los cromosomas están formados a partir de material genético condensado 2.1 VIRUS El material genético de los virus es muy variable, y puede estar formado por ADN o ARN en cadenas simples, dobles, lineales o circulares. 2.2 CROMOSOMA BACTERIANO ADN/ARN circular doblecatenario. El material genético se encuentra muy compactado de forma que cabe todo dentro de la bacteria. Ese proceso de compactación se lleva a cabo a través de una serie de pasos: 1. Formación de nucleótidos, los cuales a su vez forman una serie de asas llamadas loop. (empaquetamiento) 2. Los loop se compactan aún más mediante la torsión de las asas (superempaquetamiento) Además del cromosoma bacteriano podemos encontrar plásmidos, los cuales son ADN circular de pequeño tamaño, que no contiene genes esenciales para la bacteria pero sí genes que le pueden conferir alguna ventaja en ciertas condiciones. 2.3 CROMOSOMAS DE ORGANISMOS EUCARIÓTICOS Al igual que el cromosoma bacteriano el eucariótico también se encuentra compactado, esto se consigue a través de unas proteínas llamadas histonas, las cuales forman unos complejos llamados octámeros alrededor de los cuales se enrolla la cadena de ADN, formando el nucleosoma (fibra de 11nm) el cual se va compactando hasta llegar al cromosoma mitótico. IMPORTANTE 5 3. IDENTIFICACIÓN DEL ADN COMO MATERIAL GENÉTICO La identificación de ADN como material genético se dio gracias a la elaboración de dos experimentos: El experimento de Griffith y el de Avey, MacLeod y McArty 3.1 EXPERIMENTO DE GRIFFITH Este experimento consistió en la inyección de dos cepas de una bacteria, siendo una de ella no virulenta (la rugosa) y otra virulenta (la lisa) en ratones. En la primera parte del experimento se le inoculó a dos grupos de ratones la cepa rugosa y la lisa, aquellos en los que se inyectó la rugosa sobrevivieron mientras que los de la lisa murieron. En la segunda parte del experimento le inocularon a un tercer grupo de ratones la cepa lisa muerta por calor, y los ratones sobrevivieron. Por último se le inoculó a otro grupo de ratones la cepa rugosa y la lisa muerta por calor, llevando a la muerte de los ratones. 3.2 EXPERIMENTO DE AVERY, MACLEOD Y MCARTY En este experimento se le inoculó a distintos grupos de ratones una cepa virulenta de una bacteria. En el primero de ellos se le inyectó la cepa pero habiendo quitado los polisacáridos, produciendo la muerte de los ratones, en el segundo grupo se inoculó la misma cepa pero habiendo destruido los lípidos, produciendo igualmente la muerte de los ratones, lo mismo ocurrió con el ARN y las proteínas, sin embargo el grupo de ratones en los que se inoculó la misma cepa pero habiendo destruido el ADN sobrevivió. Este experimento demuestra que la información genética de una célula se encuentra en su ADN. 4. TIPOS Y ESTRUCTURAS DEL ADN 4.1 ARN MENSAJERO El ARNm es la copia de la información genética del ADN. Actúa como molde para el ribosoma en la síntesis proteica. Se encuentran en el citoplasma y tienen una vida media corta. Son de tamaño muy diverso (dependiendo de la proteína que codifican). Se une al ARNt por el codón. Se trata de una cadena lineal que forma estructuras mediante la complementariedad de bases. 4.2 ARN TRANSFERENTE El ARNt participa en la traducción uniéndose al ARNm por el anticodón y aportando el aminoácido correspondiente a la proteína que se forma. Tiene forma de trébol. 4.3 ARN RIBOSÓMICO El ARNr forma parte del ribosoma y constituye el 75% del ARN celular. Tienen estructuras complejas y flexibles que permite el ensamblaje de proteínas para dar lugar al ribosoma. Existen diferentes tipos según su masa molecular. El ARN en procariotas puede ser 5S, 23S y 16S, mientras que en eucariotas puede ser: 5S, 5.8S, 28S y 18S. 6  TEMA 3: REPLICACIÓN DEL ADN 1. SIGNIFICADO BIOLÓGICO DE LA REPLICACIÓN El material genético tiene que ser capaz de: Replicarse produciendo copias de sí mismo, de forma que así durante la división cada una de las copias va a cada una de las células hijas. Transmitirse de una célula en la división celular Expresar la información que contiene El significado biológico de la replicación es la de conservar la información genética para que, cuando una célula se divida, la dos nuevas células posean la esa misma información genética (perpetuación de la especie) 2. CARACTERÍSTICAS DE LA REPLICACIÓN DEL ADN La replicación del ADN es: Semiconservativa, forma que en las células hijas habrá una hebra original y otra de nueva síntesis. Esto se descubrió gracias al experimento de Meselson y Stahl, en el cual marcaron a un grupo de bacterias con N15 y después lo pusieron en un medio de cultivo de con N14, tras la primera división bacteriana observaron que el ADN de las células hijas estaba formado por una hebra original y otra de nueva síntesis. Tras una segunda división celular observaron que solo la mitad de las células hijas tenían una hebra original (marcada con N15), mientras que las otras estaban marcadas con N14. Descartando así las teorías de las replicaciones conservativas y dispersiva. Bidireccional. La doble cadena de ADN se separa dando lugar a la aparición de dos horquillas de replicación, haciendo que la replicación se de en ambos sentidos Semidiscontinua: para que se pueda dar la replicación del ADN se necesita una hebra molde, además de la presencia de un grupo OH en 3´para ir alargando la cadena. La dirección de síntesis del ADN es siempre 5´- 3´. De esta forma, vamos a tener una cadena conductora (sentido 5´- 3´), la cual solo necesitará un primer o cebador y una hebra retrasada (sentido 3´- 5´) la cual necesitará que se vayan colocando nuevos primers o cebadores a medida que se va abriendo la doble hélice 7 3. PROCESO DE REPLICACIÓN El proceso de replicación del ADN se da en tres pasos: Iniciación: se abre la cadena de forma estable Elongación: se alarga la cadena Terminación 3.1 INICIACIÓN El complejo de iniciación se encarga de detectar los puntos de origen de replicación. Posteriormente una proteína llamada helicasa se encarga de separar la doble hélice. Las proteínas SSB se encargan de mantener separadas las cadenas y por último las topoisomerasas son unas proteínas encargadas de eliminar las tensiones creadas al separarse las cadenas. 3.2 ELONGACIÓN Durante la elongación se va alargando la cadena, para ello existe una enzima llamada primasa la cual se encarga de ir colocando los nucleótidos en sentido 5´- 3´. Para iniciar la síntesis necesita un grupo OH libre en el extremo 3´. La polimerasa realiza otras funciones como: Actividad exonucleasa en sentido 3´-5´la cual se encarga de corregir los errores que se han podido producir durante la replicación. Actividad exonucleasa en sentido 5´- 3´la cual se utiliza en la eliminación de los cebadores o primers. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS 3.2 LA TERMINACIÓN La replicación termina con la maduración de los fragmentos de Okazaki, lo cual implica: La eliminación de los cebadores Rellenar los huecos dejados por los cebadores. (al eliminarse los cebadores se quedan grupos OH en 3´a partir de los cuales la primasa puede iniciar la síntesis de nucleótidos) Unión de los fragmentos resultantes gracias a una enzima llamada ADN ligasa 8 4. REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS Los telómeros son regiones situadas al final de los cromosomas lineales eucariotas y que están formados por ADN repetitivo no codificante. Están implicados en la estabilidad de los cromosomas. A medida que la célula se va dividiendo los telómeros se van acortando, ya que al estar situados al final de los cromosomas, al eliminarse los primers, no queda ningún OH en 3´ libre para que la primasa pueda rellenar los huecos. La telomerasa es un tipo de ADN polimerasa que es capaz de alargar los telómeros añadiendo fragmentos correspondientes a las secuencias repetidas que lo forman. Solo se mantienen activas hasta el final del periodo embrionario y en las células tumorales 5. RESUMEN DE LAS ENZIMAS IMPLICADAS EN LA REPLICACIÓN 6. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS 9  TEMA 4; REPARACIÓN DEL ADN 1. DAÑOS CAUSADOS AL ADN: MUTACIONES Una mutación es cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos del ADN. Durante la replicación del ADN se pueden producir una serie de errores que dan lugar a las mutaciones, aunque la tasa es baja 0,32 por mutación. Existen una serie de mecanismos para corregir estos errores, aunque no todos se corrigen y dan lugar a una acumulación de mutaciones que pueden producir enfermedades hereditarias o no o pueden no tener consecuencias. Las mutaciones son la base de la evolución. Existen distintos tipos de mutaciones: Según el tipo celular Según el tamaño de la mutación Según la región afectada Según el efecto en la proteína Según su origen. 1.1 SEGÚN EL TIPO CELULAR Este tipo de mutaciones pueden darse en las células germinales y en las somáticas 1.1.1 Células germinales Son las encargadas de formar gametos (óvulos y espermatozoides) Este tipo de mutaciones son las que dan lugar a las enfermedades genéticas heredables, las cuales afectan a todas las células del nuevo individuo. No son muy frecuentes. 1.1.2 Células somáticas Cualquier célula no germinal Son las mutaciones mayoritarias, las cuales pueden afectar a cualquier lugar de un organismo. Producen cambios no heredables y pueden aparecer en cualquier momento de nuestra vida. 1.2 SEGÚN EL TAMAÑO DE LA MUTACIÓN 1.2.1 Mutaciones pequeñas o puntuales Afectan a un número reducido de nucleótidos (normalmente entre 1 y 3). Son los tipos de mutaciones más comunes. Se pueden clasificar en: Sustituciones (de un nucleótido por otro) Inserciones (adiciones de nucleótidos) Deleciones (eliminaciones de nucleótidos) Inversiones (alteración en la posición de nucleótidos) Las sustituciones e inversiones generalmente afectan a uno o dos codones (excepciones cuando afecta a codones de inicio o stop) mientras que las deleciones e inserciones afectan al marco de lectura: efectos sobre multitud de codones produciendo efectos más graves 10 1.2.2 Mutaciones grandes o anomalías cromosómicas Afectan a grandes regiones del ADN y pueden ser intracromosómicas (en un mismo cromosoma) o intercromosímicas (entre distintos cromosomas). Se pueden clasificar en: Deleciones (eliminación de un fragmento del cromosoma) Duplicaciones (duplicación de un fragmento del cromosoma) Inversiones (inversión de un fragmento del cromosoma) Inserciones (inserción de un fragmento de otro cromosoma) Translocaciones (cambio de posición de un fragmento del cromosoma) 1.3 SEGÚN LA REGIÓN AFECTADA Mutaciones en regiones codificantes: pueden afectar a la secuencia de aminoácidos de una proteína. Son muy poco frecuentes en mamíferos. Exones. Mutaciones en regiones no codificantes: afecta a regiones intergénicas y a regiones génicas no codificantes como los intrones, promotores y el 3´UTR y el 5´UTR. Este tipo de mutaciones no afecta a las proteínas salvo algunas excepciones: Si afectan al procesamiento de los intrones Si afectan a los promotores, regiones reguladoras, 3´UTR y 5´ UTR. En estos casos no se altera la secuencia de aminoácidos de una proteína pero sí a su abundancia en la célula (expresión génica) 1.4 SEGÚN EL EFECTO EN LA PROTEÍNA Mutaciones silenciosas: En este caso a pesar de que se haya producido un cambio de nucleótido no se altera la secuencia de aminoácidos. Esto se debe a la degeneración del código genético, es decir el nuevo codón generado por mutación codifica el mismo aminoácido que el codón silvestre (el anterior). Suelen estar provocadas por sustituciones. Mutaciones de sentido alterado En este tipo de mutaciones se altera la secuencia de un único codón debido a la alteración de un aminoácido. Puede estar provocado por sustituciones o inversiones y suelen tener efectos leves o moderados (ej; anemia falciforme) Mutaciones sin sentido: Este tipo de mutaciones se produce por la terminación prematura de la proteína por la aparición de un codón stop (TAG, TAA, TGA) haciendo que se formen proteínas truncadas, lo que puede alterar severamente la funcionalidad de la proteína codificada. Pueden estar provocadas por inserciones, deleciones, sustituciones o inversiones 11 Mutaciones sin terminación En este caso se produce la supresión de un codón stop, generando proteínas de mayor tamaño que pueden tener alterada su funcionalidad. Pueden estar provocadas por inserciones, deleciones, sustituciones o inversiones. Mutaciones de cambio de fase de lectura: En este tipo de mutaciones se altera el marco abierto de lectura (por inserción o deleción de un aa) alterando completamente la secuencia de aminoácidos de la proteína. Producen modificaciones graves en las proteínas y a menudo anulan totalmente su actividad. 1.5 MUTACIONES SEGÚN EL ORIGEN 1.5.1 Errores durante la replicación La ADN polimerasa tiene una tasa de error de 1/100 millones de nucleótidos incorporados durante la replicación del ADN, los cuales pueden ser corregidos por ellas mismas siguiendo tres pasos: 1. La ADN polimerasa reconoce las distorsiones formadas por malos apareamientos en la cadena de ADN 2. Cuando reconoce tales distorsiones la ADN polimerasa se frena y se dirige al extremo 3´de la cadena hija hacia el sitio con actividad exonucleasa (eliminando nucleótidos) 3. Los últimos nucleótidos incorporados son retirados desde el extremo 3´. Una vez eliminado el error la replicación continúa y los nucleótidos son puestos de nuevo. 1.5.2 Inestabilidad de la molécula de ADN La molécula de ADN presenta cierta tasa de inestabilidad y de forma espontánea su estructura química se puede ver alterada. Existen 3 tipos de reacciones más importantes. 1. Pérdida de bases por inestabilidad del enlace N-glucosídico. Sobretodo en purinas (AyG): depurinización 2. Sustituciones por desaminación oxidativa de citocinas, lo que consiste en el cambio de un grupo amino (NH2) por un carbonilo (C=O), ocasionando apareamientos erróneos. 3. Tautomerización: cambio de la forma ceto (C=O) por enol (OH), y amino (NH2) por imino (NH), produciendo apareamientos incorrectos: T/G y C/A 12 1.5.3 Mutágenos endógenos Este tipo de mutaciones están producidas por subproductos del metabolismo celular cuando se produce tanta cantidad que las células encargadas de su eliminación no pueden eliminarlas (ej enzimas superóxido dimutasa, peroxidasa y catalasa). El caso más conocido son las generadas por las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS), generadas por metabolismo oxidativo (ej; anión superóxido, radical hidroxilo. peróxido de H). Las mutaciones se producen por la rotura de la hebra del ADN o bien por oxidación de bases nitrogenadas. 1.5.4 Mutágenos exógenos (agentes externos) Pueden ser físicos (ej: luz UV - dímeros de timina) o químicos (ej: agentes alquilantes - oroginando apareamientos incorrectos) 2. MECANISMOS DE REPARACIÓN DE MUTACIONES Las células cuentan con una serie de mecanismos de reparación de lesiones que se producen en el ADN, algunas de sus características principales son: Ubicuidad: están presentes en todas las células Redundancia: varios sistemas de reparación sirven para arreglar el mismo error, aunque hay algunos que son más específicos. Complejidad: algunos compuestos están compuestos por numerosos elementos, como en el caso de los mamíferos + de 130 proteínas involucradas Eficiencia: aunque estos mecanismos son eficientes nunca reparan el 100% de las lesiones. TIPOS DE MECANISMOS DE REPARACIÓN DE MUTACIONES REPARACIÓN DIRECTA Se tratan de mecanismos simples, en los que participan pocas enzimas (normalmente 1) No intervienen ADN polimerasas, nucleasas o ligasas No necesita cadena molde Mecanismos de reparación directa Está presente en plantas, hongos, bacterias y algunos animales, pero no en mamíferos. Fotorreactivación: sistema de reparación directa de los daños producidos por la luz UV la cual produce dímeros de pirimidinas ( dímeros de Timina). La enzima Fotoliasa reconoce los dímeros de Timina y se une a ellos deshaciendo el dímero de Timina. REPARACIÓN INDIRECTA Se tratan de mecanismos complejos en los que participan varias enzimas y complejos multienzimáticos Intervienen nucleasas, ligasas y ADN polimerasas Necesitan cadena molde 13 MECANISMOS DE REPARACIÓN INDIRECTA Por eliminación de bases Mecanismo de eliminación de bases anómalas en el ADN (ej, uracilo, 8-oxoguanina, metilguanina, etc). Importante en daños causados por ROS. La reparación consiste en: 1. Una ADN N-glicosidasa reconoce el nucleótido anómalo y retira la base nitrogenasa del nucleótido, rompiendo el enlace -glucisídico 2. Una AP endonucleasa reconoce los sitios sin bases nitrogenadas y corta la hebra por el lado 5´del sitio sin base nitrogenada generando un Nick (corte en una de las hebras A partir de este punto el proceso varía según los organismos. En E.coli una ADN polimerasa con actividad 5´-3-´exonucleasa elimina la zona dañada y al mismo tiempo la re-sintetiza usando la otra cadena como molde En eucariotas hay dos variantes 1. La ADN pol l β retira el nucleótido sin base y lo reemplaza con el correcto 2. La ADN pol δ o ε con actividad polimerasa 5´-3´ sintetiza a partir del extremo 3´ del nick un fragmento de cadena que levanta parte de la secuencia de la cadena dañada y por último una flap endonucleasa elimina las solapas. Finalmente, en todos los casos, una ADN ligasa une covalentemente la hebra de ADN que presenta el corte (nick) (restaura enlace fosfodiéster) 14 Reparación por eliminación de nucleótidos (NER) Se trata de un mecanismo de reparación de bases anómalas en el ADN, incluyendo dímeros de Timina. Es más versátil que el BER. La reparación consiste en: 1. Un complejo de proteínas recorre el ADN en doble cadena en busca de anomalías estructurales. Este complejo está formado por 3 subunidades UvrA (x2) y UvrB en E. coli y en mamíferos está formado por más de 16 subunidades. 2. Cuando el complejo encuentra una anomalía se separa y (en E. coli) se una una nueva proteína UvrC y las subunidades UvrA se separan. 3. UvrC tiene una actividad endonucleasa y corta la cadena dañada en las posiciones -8 (hacia la izquierda) y +5 (hacia la derecha) del sitio dañado. 4. A continuación se une la unidad UvrD que tiene actividad helicasa y elimina el segmento de ADN que contiene el daño, en este paso tanto la subunidad UvrC y l UvrB se separan del ADN 5. Por último una ADN polimerasa rellena el hueco usando la otra cadena como molde y una ADN ligasa restaura el enlace fosfodiéster. Reparación por eliminación de apareamientos erróneos Este mecanismo reconoce cualquier apareamiento que no sea A/T o G/C y funciona de forma parecida al NER. Para poder distinguir cual de las dos hebras es la correcta, este mecanismo localiza la hebra de ADN que presenta mayor grado de metilación, siendo esa la más antigua, y repara la hebra sin metilar (la más reciente). Se reconocen en sitios GATC. La reparación consiste en: 1. La MutS recorre el ADN en doble cadena en busca de apareamientos incorrectos 2. Una vez localizados se unen MutL y MutH y se fuerza la formación de un bucle en el ADN 3. MutH reconoce el grado de metilación del ADN en doble cadena y decide qué cadena será la correcta y cuál la incorrecta y cortará la cadena incorrecta (nick) 4. MutU (helicasa) separa el ADN y una exonucleasa (3´-5´) digiere la cadena (elimina los nucleótidos) hasta el mismatch (apareamiento incorrecto) y lo sobrepasa unos nucleótidos. 5. Por último una ADN polimerasa y una ADN ligasa rellenan el hueco y lo sellan respectivamente. 15  TEMA 5: TRANSCRIPCIÓN. SÍNTESIS DE ARN 1. DEFINICIÓN La transcripción consiste en la síntesis de ARN a partir de un fragmento de ADN llamado gen. El producto de un gen es una molécula de ARN transcrito, el cual puede ser usado para la síntesis de polipéptidos. La transcripción es parte esencial del dogma central de la biología molecular. LA ARN POLIMERASA La ARN polimerasa cataliza la síntesis de ARN, para ello: utiliza una cadena de ADN molde para sintetizar una cadena de ARN complementaria. Utiliza ribonucleótidos trifosfato como sustrato Sintetiza en sentido 5´-3´ Establece enlaces fosfodiéster 3´-5´entre los ribonucleótidos No necesita cebador Sigue la regla de complementariedad de bases A/U y C/G. La cadena codificante es aquella que es igual a la cadena de ARN recién sintetizada, mientras que la cadena molde o antisentido es aquella que se usa como molde. La ARN polimerasa tiene actividad correctora en sentido 3´-5´, debido a que es capaz de reconocer apareamientos incorrectos y eliminarlos. En este caso la ARN polimerasa comete un error por cada 10.000-100.000 nucleótidos incorporados, una tasa mayor que la ADN polimerasa. Esto no tiene mucha importancia debido a que el ARN es una molécula temporal, teniendo una vida media corta, no es heredable y salen muchas moléculas por gen. 2. TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS PROMOTORES Los promotores son las secuencias que se encuentran upstream del gen y regula cuándo y cuánto se expresa un gen. Posibilitan el inicio de la transcripción y señala el punto exacto en la que esta debe empezar. Son de tamaño variable, aunque presentan unas zonas muy conservadas e imprescindibles: elementos basales del promotor. En procariotas hay 2 elementos basales: Caja TATA, caja TATAAT, caja -10 (situada 10 nucleótidos upstream del promotor) o caja Pribnow Caja -35: posición aproximada de -35 nucleótidos upstream del nucleótido. Secuencia: TTGACA 16 POLIMERASA DE PROCARIOTAS La ARN polimerasa bacteriana está formada por 5 subunidades (2x, B, B´ y w) y necesita interaccionar con una proteína llamada factor sigma para reconocer los promotores, formando una holoenzima. Una vez iniciada la transcripción el factor sigma es liberado y no participa en las demás fases, durante la elongación el factor sigma es reemplazado por la proteína NusA FACTOR SIGMA Posibilita que la ARN polimerasa reconozca los promotores. Existen distintos factores sigma que modifican la afinidad de la ARN polimerasa por un promotor: Factor sigma 70: es considerado el estándar y se encuentra presente en la mayoría de promotores. Los factores 32, 54 y 28 reconocen genes que se inducen frente a diferentes condiciones ambientales. INICIACIÓN La ARN polimerasa (con el factor sigma) recorre el ADN, la unión entre el ADN y la holoenzima (ARN polimerasa + factor sigma) se llama complejo cerrado. Cuando el factor sigma reconoce los elementos -10 y -35 del promotor se une mucho más fuerte al ADN. En este punto ocurre la separación de la doble hebra de ADN justo en el punto de la caja TATAAT, debido a que es rica en A y T y por tanto es más fácil de separar (dos puentes de H), formándose el complejo abierto. La ARN polimerasa sintetiza un pequeño fragmento de ARN y se libera el factor sigma. La ARN polimerasa se va desplazando a lo largo del ADN sintetizando el ARN, formando la burbuja de replicación. ELONGACIÓN La burbuja de transcripción es de unos 17 nucleótidos. Conforme la ARN polimerasa se desplaza a lo largo del gen se van separando la doble cadena de ADN y cerrándose tras su paso. Dentro de esta burbuja se forma un híbrido de ADN y ARN de unos 8-11 nucleótidos, el cual es imprescindible para que la ARN polimerasa permanezca unida al ADN. 17 TERMINACIÓN En procariotas existen dos tipos de mecanismos para la terminación de la transcripción. la dependiente de rho y la independiente de rho. DEPENDIENTE DE RHO Upstream del terminador existe una secuencia de ADN llamada rut, cuando esa secuencia se transcribe a ARN, la proteína rho la reconoce y se une al ARN y lo recorre en sentido 5´-3´por detrás de la ARN polimerasa. Cuando la ARN polimerasa transcribe el terminador (rico en G y C) el ARN adopta una estructura secundaria en forma de bucle que interacciona con la ARN polimerasa y la frena. La proteína rho alcanza a la ARN polimerasa y llega hasta el híbrido de ARN-ADN de la burbuja de replicación y lo desestabiliza rompiendo los puentes de hidrógeno que los mantiene unido, (debido a su actividad helicasa), provocando la separación del ARN y ADN. INDEPENDIENTE DE RHO En este caso el terminador está compuesto por dos tipos de secuencias: Una región rica en G y C que provoca la formación de un bucle que se asocia con la ARN polimerasa y la frena Una región rica en A downstream, que cuando se transcribe resulta en una secuencia rica en U El bucle de la secuencia rica en GC provoca que la ARN polimerasa se frene justo cuando está transcribiendo la región rica en A, formando un híbrido ARN-ADN en la burbuja de replicación rico en A/U, cuya unión es muy débil (solo dos puentes de H entre bases complementarias) por lo que se separan espontáneamente y se libera la ARN polimerasa. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS En eucariotas hay 3 ARN polimerasas, mientras que en procariotas solo hay una: ARN polimerasa I: sintetiza ARN ribosómicos 80s ARN polimerasa ll: sintetiza ARN mensajero ARN polimerasa lll:sintetiza ARNt y ARN ribosómico 70s Los genes procariotas se suelen agrupar en operones bajo el mismo promotor y secuencias reguladoras, dando lugar a ARNm con más de un gen (policistrónico de un mismo ARNm se traducen varias proteínas), mientras que en los genes eucariotas dan lugar a ARNm monocistrónicos (por cada ARNm se traduce una sola proteína). EUCARIOTA 18 MADURACIÓN DEL ARN La estructura génica y la maduración de los ARN sintetizados es diferente en procariotas y eucariotas. La maduración del ARN en eucariotas consiste en eliminar los intrones (ARN no codificante) a través de una técnica llamada splicing o ayuste. Posteriormente en el extremo 5´se une una caperuza (metil-guanina) mediante enlace 5´-5´. Por último en el extremo 3´del ARN se une la cola poli A. 19  TEMA 6: TRADUCCIÓN 1. DESCRIPCIÓN La traducción es el proceso a partir por el cual se sintetizan las proteínas codificando una molécula de ARNm. Las proteínas son unidades funcionales de todas las céñulas y se encargan de las actividades metabólicas y regulan los procesos celulares, también son responsables de las características fenotípicas del individuo. En la traducción intervienen ARNm, ARNr y ARNt y es llevado a cabo por los ribosomas en el citosol. 2. EL CÓDIGO GENÉTICO El código genético presenta las siguientes características: Está organizado en tripletes llamados codones Es degenerado: hay muchas posibles combinaciones (64) para formar tripletes, pero solo hay 20 aa proteicos, por lo que hay varios tripletes que codifican el mismo aa. No hay solapamiento ni superposiciones; un codón empieza cuando acaba el otro. No hay separaciones entre codones. Es universal, eso quiere decir que un codón en procariotas codifica el mismo aa en eucariotas, excepto en el ARN mitocondrial. 3. EL ARNT El ARNt lleva a cabo dos funciones: 1. reconocer los codones del ARNM y portar al aa correspondiente. El ARNt presenta zonas de complementariedad intracatenaria, lo que le aporta su estructura secundaria en forma de trébol de tres hojas, en ella se observan las sig características: Brazo aceptor formado por los extremos 5´y 3´, aquí es donde se encuentra la secuencia CCA, cuyo extremo OH terminal sirve de lugar de unión con el aa Brazo T: es por donde el ARNt se une al ribosoma. Brazo D es donde se encuentra la aminoacil-ARNt sintetasa, encargada de añadir el aa correspondiente al extremo OH de la cadena CCA. Brazo largo: contiene una secuencia de tres bases llamada anticodón, la cual reconoce los codones del ARNm. La unión entre el codón y el anticodón es antiparalela, es decir, el extremo 5´se encuentra enfrentado al 3´y existe una complementariedad de bases. 20 Existen diferentes tipos de ARNt que pueden unirse a los 64 posibles codones del ARNm, cada uno de ellos aporta un aa diferente en su extremo 3´. Sin embargo no existen 64 tipos de ARNt diferentes, aquí es donde interviene la hipótesis del balanceo, la cual dice que un mismo ARNt puede reconocer varios codones, para ello, las dos primeras bases tienen que ser iguales y solo varía la 3 base del codón, estableciéndose las sig relaciones (las de la tabla) La estructura tridimensional del ARNt es importante para poder realizar su función correctamente (forma de L invertida) 4. RIBOSOMAS: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN Los ribosomas son complejos macromoleculares de proteínas y ARNr. Existen 52 proteínas diferentes en procariotas y 83 en eucariotas, y 3 tipos de ARNr en procariotas y 4 en eu. Los ribosomas cuentan con dos subunidades: una mayor (50S pro; 60S eu) y otra menor (30S pro y 40S eu). En eucariotas ambas subunidades son ensambladas en el núcleo y deben ser exportadas al citoplasma por separado. En los ribosomas se distinguen 3 cavidades que reciben los nombres de sitio E (de exit), sitio P (peptidilo) y sitio A (aminocilo). Los sitios P y A están formados por las dos subunidades, mientras que el sitio E es íntegro de la subunidad mayor. 5. AMINOACIL ARNT SINTETASA Es la enzima encargada de unir los aa a los ARNt al extremo 3´. Existen 20 tipos diferentes de aminoacil-ARNt sintetasa, una para cada aa 6. ETAPAS DE LA TRADUCCIÓN INICIACIÓN En esta etapa los factores IF1 y IF3 se unen a la subunidad menor del ribosoma impidiendo así que se ensamble con la subunidad mayor. La subunidad menor reconoce la secuencia de Shine-Dalgarno (situada upstream del codón iniciador), presente en el 5´UTR de los ARNm de procariotas y el codón AUG queda emplazado en el sitio P. El factor IF2 porta el ARNt iniciador que se coloca en el primer AUG tras la secuencia Shine-Dalgarno y porta una metionina especial, modificada por un grupo formilo. La unión del ARNt iniciador al codón promueve la hidrólisis del GTP unido al IF2, promoviendo así la liberación de todos los IFs, permitiendo que la subunidad mayor se acople con la menor, quedando el ARNm entre ambos. 21 ELONGACIÓN Un nuevo ARNt complementario al triplete contiguo del AUG se une al sitio A del ribosoma mediante la hidrólisis de GTP. Posteriormente se forma un enlace peptídico entre el grupo amino del aminoácido del sitio A y el grupo carboxilo del sitio P a partir de un proceso llamado transpeptidación. El ARNt del sitio P queda libre y el del sitio A pasa a tener dos aa, posteriormente el ribosoma se desplaza un codón (translocación), quedando el ARNt iniciador en el sitio E y se separa y el siguiente en el sitio P, quedando libre el sitio A , donde se une otro ARNt complementario a ese codón, y se vuelve a formar el enlace peptídico entre los dos aminoácidos anteriores y el del nuevo ARNt. Este proceso se va repitiendo contínuamente hasta que se termine de traducir el ARNm TERMINACIÓN Se desencadena cuando alguno de los codones de parada o STOP ocupa el sitio A. Los codones STOP (UAA, AUG,UGA) no son reconocidos por ningún ARNt, sino por los factores de terminación o de liberación (RF) En eucariotas hay un factor de liberación (RF1) mientras que en procariotas existen 2 (RF1 y RF2). En la terminación se rompe el enlace entre el ARNt y el polipéptido alojado en el sitio P, para ello es necesario la energía en forma de GTP. Un tercer factor, el RF3, participa en la disociación de los ribosomas. El polipéptido y el ARNt se liberan del ribosoma, y finalmente ambas subunidades del ribosoma se separan. Los poliribosomas o polisomas son un conjunto de ribosomas asociados a una misma molécula de ARNm; es decir, una molécula de ARNm es traducida a la vez por varios ribosomas. DIFERENCIAS ENTRE EUCARIOTAS Y PROCARIOTAS 1. Composición de los ribosomas, en eucariotas hay más tipos de proteínas y ARNr 2. Los ARNm son policistrónicos en procariotas y monocistrónicos en eucariotas. 3. Los ARNm son reconocidos en eucariotas por CAP y secuencias Kozak. En procariotas son secuencias Shine-Dalgarmo 4. Hay un mayor número de factores de iniciación en eucariotas. 5. La metionina inicial se encuentra modificada con un grupo formilo en procariotas. 6. Hay dos tipos de factores de liberación en procariotas y solo uno en procariotas. 7. La transcripción y traducción están acopladas en procariotas. 22 MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES Los principales mecanismos consisten en: 1. Plegamiento correcto del polipéptido hasta alcanzar su conformación biológica activa (estructura terciaria) 2. La maduración del polipéptido consiste en las modificaciones químicas de los aa y en la eliminación proteolítica de fragmentos del polipéptido. 3. La maduración de las proteínas finaliza con el transporte de las mismas a las distintas localizaciones subcelulares o extracelulares para el ejercicio de su función, a partir de un proceso llamado translocación, todo esto es posible gracias a los péptidos señal. PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS Las proteínas tienen que plegarse hasta alcanzar la estructura tridimensional que les permita llevar a cabo su función. Algunas proteínas se pliegan de forma espontánea y otras necesitan ser asistidas por otras proteínas llamadas chaperonas o carabinas. MODIFICACIONES QUÍMICAS Estas modificaciones son necesarias para que las proteínas lleven a cabo su función o bien llevan a cabo funciones reguladoras. Ej glicosilación (adición de azúcares), fosforilación (adición de un grupo fosfato), acetilación (adición de un grupo carbonilo), carboxilación (adición de un grupo carboxilo), ubiquitinación. PÉPTIDOS SEÑAL Todas las proteínas comienzan su síntesis en el citosol (excepto las de las mitocondrias y los cloroplastos), pero pueden realizar su función en diferentes orgánulos, para lo que es necesario un sistema de señalización y transporte de las proteínas a los diferentes orgánulos. 23  TEMA 7: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 1. CONCEPTOS BÁSICOS La regulación génica son todos los mecanismos que controlan la biosíntesis de proteínas, y es un proceso extremadamente complejo. La regulación de la expresión génica es la responsable del perfil de proteínas (el tipo y abundancia) presentes en un determinado momento en una célula. Esto va a condicionar: La interacción/ adaptación/respuesta de las células a las condiciones cambiantes de su entorno La diferenciación celular (especialización) en organismos pluricelulares. Hay hasta 5 niveles de regulación génica para controlar la cantidad de proteínas en la célula: Regulación pre-transcripcional; antes de la transcripción del ADN al ARN Regulación transcripcional: durante la transcripción Regulación postranscripcional: posterior a la transcripción Regulación traduccional Regulación postraduccional. 2. REGULACIÓN PRE-TRANSCRIPCIONAL Está determinada por la accesibilidad de la ARN polimerasa al ADN, hay dos factores principales: El grado de condensación del ADN determina cómo de accesible son los genes para la máquina transcriptora, a mayor grado de condensación peor es el acceso de la ARN polimerasa al ADN. Alteraciones químicas del ADN como las metilaciones de nucleótidos y la acetilación de las histonas. La metilación del ADN puede dificultar la unión del ARN polimerasa al ADN (dificulta la transcripción) y la acetilación de las histonas disminuye la compactación y favorece la transcripción. 3. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL Está determinada por la propia actividad de maquinaria transcriptora, hay varios elementos que están involucrados en la regulación transcripcional como: Factores ambientales: estado nutricional, estado fisiológico o de desarrollo o estrés biótico o abiótico del individuo. Elementos del ADN (elementos cis) Proteínas (elementos trans) del tipo factores de transcripción ELEMENTOS DEL ADN (CIS) En procariotas los genes se agrupan en operones bajo los mismos elementos reguladores, algunos ejemplos de elementos reguladores son: Promotor (lacP) Operón (lacO): secuencia que se encuentra downstream del promotor y que es reconocida por el gen regulador del operón. 24  Sitio CAP: secuencia que se encuentra upstream del promotor y es reconocida por una proteína reguladora que no es parte del operón. En eucariotas podemos encontrar diferentes elementos reguladores en el ADN: los elementos proximales (promotor) y los elementos distales (potenciadores, enhancers, represores. PROTEÍNAS REGULADORAS (TRANS) Son proteías que reconocen e interaccioan con los elementos cis (ADN) y facilitan y regulan la actividad transcriptora de un gen, como el factor sigma en procariotas o los factores de transcripción en eucariotas. Hay diferentes tipos de proteínas reguladoras pero todas tienen una estructura en común; dominios alfa-hélices y ricos en aminoácidos de carga positiva capaces de interaccionar con el surco mayor de la doble hélice del ADN. Estructuras típicas de unión al ADN: Hélice-giro-hélice Hélice-bucle-hélice Dedos de zinc Cremalleras de leucina 4. REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL Control existente entre la síntesis de ARNm y su traducción a proteína por los ribosomas. Es muy importante en eucariotas debido a la maduración del ARNm. La regulación postranscripcional se lleva a cabo mediante: Control de la vida media del ARN (el ARN se va desintegrando, si se desintegra antes de tiempo no se formarán el número adecuado de proteínas, o si tarda más en eliminarse se formará un exceso de proteínas) 25  Ayuste o splicing alternativo (de un mismo gen se pueden codificar varias proteínas con funciones similares, debido a que durante el splicing se pueden eliminar algunos exones, creando códigos nuevos Silenciamiento génico de ARNm por el ARNi 5. REGULACIÓN TRADUCCIONAL Determina cómo de eficaz es el proceso de la traducción. Por lo que puede haber puntos de control en cada uno de los pasos de la traducción: Regulación de la velocidad/frecuencia del inicio de la traducción Regulación de la velocidad de elongación de la traducción Regulación de la eficacia de terminación de la traducción 6. REGULACIÓN POSTRADUCCIONAL Está determinada por las modificaciones que sufren los polipéptidos (proteínas) desde que son sintetizados hasta que son activos (capaces de llevar a cabo su función) Los principales mecanismos consisten en: Plegamiento correcto del polipéptido: las proteínas deben adoptar estructuras tridimensionales adecuadas hasta alcanzar su conformación biológica activa (estructura terciaria y cuaternaria) Procesamiento o maduración del polipéptido ○ Modificaciones químicas de los aminoácidos ○ Eliminación proteolítica de fragmentos del polipéptido como los péptidos señal Proteínas alostéricas, las cuales se unen a algo (ligandos) Interacciones proteínas-proteínas Tráfico de proteínas entre el citosol y los orgánulos (péptidos señal o translocación) Control de su degradación hasta aminoácidos 26