Biologie Cellulaire - Cours PDF

I. Généralités sur la cellule Objectifs du cours: être capable de: - Définir une cellule eucaryote et procaryote - De faire le schéma d’une cellule (animale ou végétale), d’un virus et d’une bactérie. - De décrire au moins deux des techniques d’étude de la cellule - De définir les...

I. Généralités sur la cellule Objectifs du cours: être capable de: - Définir une cellule eucaryote et procaryote - De faire le schéma d’une cellule (animale ou végétale), d’un virus et d’une bactérie. - De décrire au moins deux des techniques d’étude de la cellule - De définir les structures microscopiques et leurs fonctions cellulaires 1. Caractères fondamentaux Les cellules de tous les êtres vivants, qu´elles se présentent en structure organisée autonome ou en unité intégrée dans un ensemble communautaire, ont en commun certains caractères fondamentaux. 1.1. Nombre Mis à part les unicellulaires et les formes qui ont un nombre de cellules constant et spécifique (ex: Rotifères : Epiphaneosenta: 959 noyaux cellulaires : Némathelminthes), le nombre de cellules est fonction de la taille du corps. Ce nombre croît jusqu´à la maturité de l´organisme. Toutes les cellules ne se multiplient pas à la même vitesse. Chez l ´homme, toutes les cellules nerveuses sont formées à la naissance, elles sont irremplaçables. Les cellules sanguines et celles des téguments ont une vie courte : Elles sont produites et remplacées de façon continue jusqu'à la mort de l'individu (chaque jour 2 x 10 11 cellules sanguines sont formées chez l'homme). On estime que le corps humain contient 100.000 à 1 million de millards de cellules et que chaque seconde près de de 50 millions de cellules meurent, cependant qu'un même nombre de cellules sont formées. 1.2 Forme Très variable, cela tient à la diversité des fonctions: - arrondies: (cellules sanguines) en milieu liquide par suite de la tension superficielle: exception: spermatozoïde, - polyédriques dans un groupement de cellules parce qu'elles s'écrasent mutuellement. Certaines cellules peuvent changer leur forme par des modifications de leur surface pseudopodes grâce auxquelles elles peuvent se deplacer ou se nourrir, ex: amibes, leucocytes. cellules à ________ 1 forme étoilée, cas particuliers des cellules nerveuses et certaines cellules du tissu conjonctif 1.3 Taille Les cellules animales ont un diamètre qui varie en moyenne entre 7 et 20µ, celui des virus et bactéries entre 100 à 1000 Å. Les ovules de batraciens et des oiseaux : 1mm à 7cm (autruche) 2. Structure microscopique et fonctions cellulaires La vie de la cellule se déroule suivant un cycle (cycle cellulaire) à deux phases : l´interphase et la mitose. L’interphase correspond à la période fonctionnelle d'intenses activités biochimiques. La mitose représente la phase de division cellulaire. Pendant l'interphase on distingue dans une cellule: une membrane, un cytoplasme contenant des organites et un noyau. - Définition de la cellule La cellule est un volume de cytoplasme entouré par une membrane cytoplasmique (doublée elle-même, chez les végétaux (d'une paroi) Elle renferme un noyau et différentes structures exception : bactéries cyanophycées sans noyau individualisé, algues et champignons à cellules polyénergides) et se présente isolée ou associée à d'autres cellules. Les cellules ayant un noyau différencié, limité pas une enveloppe nucléaire sont dites eucaryotes, celles n'ayant pas de noyau bien différencié sont dites procaryotes. 2.1 Cellule eucaryote. (Voir Planche 1) La cellule animale diffère de la cellule végétale par: - La présence du centrosome (lequel existe seulement chez les végétaux inférieurs: thallophytes (algues et champignons) et bryophytes (mousses) et ptéridophytes (fougères) - l'absence de plastes(présent chez chlamydomonas et euglènes) - l'absence d'une membrane cellulosique - la présence de vacuoles moins volumineuses - présence d'enclaves de glycogène ________ 2 2.2 Cellules procaryotes a) Les bactéries (voir Planche 2) Ce sont des organismes unicellulaires caractérisés par une structure simple (1µ ) observable au Microscope ordinaire, appareil de Golgi, lysosomes et mitochondires sont absents. Présence de nombreux ribosomes et d'un mésosome (digitations de la membrane plasmique à fonction mitochondriale) sur lequel se fixe le nucléoide (chromosome bactérien) Malgré cette organisation simplifiée, la bactérie présente les activités fondamentales du vivant. (Dualité, noyau-cytoplasme) b) Les virus (voir Planche 2). Ils ne présentent pas d´aspect cellulaire: matériel génétique enveloppé dans une capside observable seulement au microscope électronique. Un virus isolé ne présente aucune manifestation de vie. Les virus peuvent néanmoins présenter certaines fonctions vitales lorsqu´ils parasitent une cellule hôte. Il existe des virus à ADN et des virus à ARN. ________ 3 2.3. Principales structures et fonctions cellulaires. Structure Fonction Noyau : chromatine (interphase) Chromosome div.cellulaire. centre de contrôle de la croisance et de la reproduction cellulaire support de l´ information héréditaire pendant l’interphase règle le fonctionnement Cre Marque une discontinuité mais autorise des échanges entre le cytoplasme et le noyau. Cytoplasme Membrane cytoplasmique Règle les échanges entre la cellule et le milieu extérieur. Perméabilité passiv eou active ou selective Sépare deux phases cellulaires, surface membranaire active intracytoplasmique, réseau de transport et de stokage. Ribosomes Granulations du reticulum rugueux. Siège dessynthèses protéïques. Appareil de golgi, dictyosome Stockage, maturation et conditionnement dessubstances élaborées par la cellule. Lysosomes, Péroxysomes Vésicules contenant les enzymes digestivesdigestives de la cellule. Mitonchondries Organites membranaires, centrales énergétiquesde la cellule. Hyaloplasme Substance fondamentale du cytoplasme. Supportdes organes cellulaires. Tous les éléments du métabolisme cellulaire y transitent Microtubules, microfilaments. 3 Méthodes d'étude de la cellule 3.1 Méthodes morphologiques: 3.1.1. Microscopie photonique Source lumineuse visible: lumière naturelle ou électrique (radiations électromagnétiques lumineuses) Longueur d'onde entre 0,4 (violet) et 0,8 (rouge) Pouvoir séparateur 0,4 ou mieux 0,2 - Grossissement courant 1000 fois, 2500 pour les appareils les plus ________ 4  perfectionnés fonctionnant au uv. La microscopie photonique permet d'étudier la cellule vivante traitée ou non par un colorant vital (rouge, neutre, vert jaune iode..). L'observation se fait directement entre lame et lamelle. On peut pratiquer au cours de l'observation une microdissection à l'aide de micromanipulateurs ou encore filmer les phénomènes qui se déroulent sous le microscope (microcinématographie de la mitose des mouvements de cyclose ou encore des contractions de vacuoles) La Microdissection renseigne sur la consistance cellulaire et permet l'ablation de territoire cellulaire et des griffes de noyaux. La microscopie photonique permet également l'étude de la cellule tuée et colorée. La préparation du matériel se fait en deux phases : - Fixation : C'est le procédé par lequel on tue la cellule tout en gardant sa structure intacte. Elle consiste à l'immersion pendant un certain temps d'un petit fragment d'organe dans le fixateur. On distingue des fixateurs physiques (chaleur froid) et des fixateurs chimiques (Alcool, Bichromate de K; Sels D'argent, Ac. osmique.) - INCLUSION Après la fixation le fragment d'organe déshydraté est inclus dans de la paraffine liquide. Après solidification de la paraffine par abaissement de la température, on obtient un bloc d'inclusion que l'on découpe en coupes minces à l'aide d'un microtome (épaisseur 1 à 7). Ces coupes sont collées sur une lame de verre, déparaffinées, réhydratées, colorées puis récouvertes de baume du Canada. On les recouvre ensuite d'une lamelle et on les observe au microscope. 3.1.2 MICOSCOPIE ELECTRONIQUE (De Broglie, 1931). - Source : électrons: Particules à charges négatives de longueur plus petite que celle des radiations lumineuses. Flux d´électrons émis par la cathode: radiations électroniques. - Pouvoir séparateur 0,4A. - DDP entre cathode anode. 100.000V. - Vitesse des électrons. 164.000 Km/s - Grossissement. De 100.000 à 600.000. - Hauteur. 2m. Poids. 500kg. - Consommation 2500W La microscopie électronique ne permet pas l´étude de cellule vivante car les objets examinés doivent être placés sous vide très élevé ________ 5 (10-5 d’Hg) nécessaire au déplacement des électrons. Les préparations (fixation et inclusion) sont faites suivant les mêmes étapes qu´en microscopie photonique. Les fixateurs utilisés sont: tetroxyde d´osmium, (O5O4), le formaldéhyde, H-CHO glutaraldehyde CHO(CH2)3-CHO, le permanganate de potassuim (KMnO4). Après la fixation, l´inclusion se fait dans une résine (épon, araldite, vestopal) ou un plastique (métacrylate de butyle ou de méthyle) Puis les blocs sont coupés à l´ultramicrotome (0,03) et recueillies à la surface d´une solution acétonique. Les meilleures coupes de couleur jaune claire (0,03) sont placées sur un tamis de bronze ou de cuivre que l´on dépose sur un porte-objet. Ce dernier est inséré dans la colonne du M.E. Comme contrastant, on utilise des sels de plomb, d´uranuim ou de tungstène, la structure apparaît en nombre sur un fond clair (électron-dense) les observations en microscopie électronique peuvent être améliorées par des techniques particulières comme: -Ombrage métallique On fait vaporiser sous vide sur les éléments à étudier (Cellule entière, constituants cellulaires, bactérie ou virus), un métal lourd (or), de la silice ou du carbone. Un effet d´ombrage se crée en raison du relief des objets (étude du relief et des dimensions des objets) -Coloration négative (Hall 1955) L´objet étudié (en réalité non coloré) est entouré d´un dépôt électron- dense de sel de l´acide phosphotungstique. Cette suspension est déposée sur une grille recouverte d´un film de collodion (solution de nitrocellulose dans un mélange d´alcool et d´ether pour la photographie) En séchant, le phosphotungstate de Na crée un écran entre les structures qui seules laissent passer les electrons. On obtient des images en négatif. Cette propriété est utilisée pour visualiser les structures qui ne sont pas suffisamment denses. - Cryodécapage (Steere 1957) L´objet étudié est congélé rapidement, puis fracturé sous vide par une lame refroidie. La surface de fracture suit les reliefs membranaires. L ´opération se poursuit par la technique de l´ombrage métallique pour l ´étude des réliefs. ________ 6 3.2. Méthodes cytochimiques, biochimiques et cytophysiques 3.2.1. Coloration et méthodes cytochimiques Divers colorants sont utilisés pour obtenir des indications sur les substances entrant dans la composition des strucures colorants acides se fixent sur les structures basiques. Colorants basiques ont une affinité pour les structures à caractère acide. Les colorants d´oxydo-réduction mettent en évidence les régions oxydantes ou réductrices de la cellule, leur couleur varie selon qu´ils sont réduits ou oxydés. 3.2.2. Autoradiographie On met à la disposition de la cellule, des précurseurs radio- Actifs (3H, 14C, 131-125I, 32P, 35S) qui seront métabolisés. Elle permet de localiser les structures sur lesquelles sont incorporés les précurseurs radioactifs(sites de synthèse) et de suivre par exemple le déroulement d ´un processus métabolique ou les dépla-cements dans la cellule d´un composé marqué.Isotopes lourds ou stables 15N 2H, 18O. 3.2.3. Fractionnement Séparation des divers constituants cellulaires. a)centrifugation simple Broyage ménagé des cellules qui ensuite maintenues dans une solution isotonique: on obtient ainsi un homogénat. Toutes les opérations se font à basse température (0oC) pour empêcher d´éventuelles réactions biochimiques au sein du mélange. L´homogenat est centrifugé une première fois à faible vitesse (700g) pendant un temps très court (10mn) Le culot contenant les particules lourdes (noyaux) est séparé du surnageant contenant les particules légères. Le surnageant subit une nouvelle centrifugation (séparation culot-surnageant) et ainsi de suite. b) centrifugation de zone et centrifugation à équilibre de densité (isopycnique). Cest un procédé de fractionement suivant un gradient de densité (gradient de saccharose, de C5Cl, eau lourde O2O). Après centrifugation les particules se répartissent dans les zones du gradient dont la densité correspond à leur densité propre. 3.2.4. Chromatographie - sur colonne - sur papier. - sur colonne…etc. ________ 7 3.2.5. Electrophorèse C´est la séparation des protéines suivant leurs charges électriques et/ou leur poids moléculaire. Les protéines sont des poly-électrolytes amphotères. Les radicaux NH2 et COOH proximaux n´entrent pas en ligne de compte car, à l'exception de ceux des acides aminées terminaux, ils sont engagés dans des liaisons peptidiques (SO-NH). N´interviennent que les groupements distaux des AA polaires acides (GLU, ASP) et basiques (LYS, ARG, HIS). - Dans un milieu basique les protéines se comportent comme un anion (charge négative), elles migrent vers l´anode chargée positivement. COO- Carboxyle-->H+ en devenant anion libère proton R - CH NH2 (faible dissociation) - En milieu acide, elles se comportent comme un cation (Charge positive), elles migrent vers la cathode chargée négativement. COOH (faible dissociation) R - CH NH3 amine capte H+ en devenant cation - Point isoélectrique : les deux dissociations sont égales, on obtient un ion mixte qui ne migre pas. Il existe plusieurs types d´électrophorèse: - Electrophorèse sur papier - Electrophorèse sur gel. 3.3. Méthodes physiologiques et expérimentales. 3.3.1. Dosages immunologiques. a) Dosage radio-immunologique RIA * Dosage d´anticorps - L’antigène en solution saline incubé dans une plaque de microtitration est absorbé en partie sur la surface plastique l ´antigène libre est éliminé par lavage. ________ 8  - La plaque est ensuite bloquée par un excès de protéine étrangère pour prévenir toute fixation non spécifique. - L´anticorps à doser est ajouté et se fixe à l´antigène - Les protéines libres sont éliminées par lavage - L´anticorps est détecté par un ligand radiomarqué. Le ligand libre est éliminé par lavage et la radioactivité de la plaque est comptée dans un compteur gamma ou un compteur à scintillation liquide () Fixation spécifique 20 à 100 fois supérieure au bruit de fond. Par une réaction inverse, on peut détecter la présence ou l´absence de l ´antigène en utilisant un anticorps spécifique. Ex : détection des sporozoites dans les moustiques à partir d ´anticorps anti P. falciparum. b) Dosage immuno-enzymatique: ELISA La plaque d´ELISA est préparée comme le RIA jusqu´à l´étape 4. le ligand est une molécule couplée à une enzyme telle que la péroxy-dase Il se fixe à l´anticorps à doser et après lavage est révélé par l´addition d ´un substrat incolore activé par la portion enzymatique du ligand pour donner un produit coloré. La quantité d´anticorps est déterminée à partir de la Densité optique induite/ apparition du produit coloré. Il faut toujours prendre soin de disposer de témions positifs et négatifs. 3.3.2 Production d’anticorps monoclonaux: (biotechnologie, 1975) - Animaux (souris ou rats) immunisés avec l'antigène. - Les lymphocytes spléniques sont préparés et fusionnés avec les cellules d'une lignée de myélome (tumeur de lymphocytes B) par addition de polyethylène glycol (PEG) qui induit la fusion membranaire. Seulement une petite portion des cellules fusionne avec succès (5%). - Le mélange est ensuite mis en culture dans un milieu contenant HAT (Hypoxanthine Aminopterine Thymidine) C'est un milieu de sélection pour empêcher la croissance des cellules de myélome après la fusion avec les lymphocytes. Les cellules spléniques peuvent pousser en milieu HAT mais les cellules de myélome ont un défaut métabolique (manque d'Hypoxanthine Phosphoriboxyl Transférase HPRT et ne peuvent utiliser le shunt de sorte qu'elles meurent en milieu HAT. - La culture dèveloppée en milieu HAT, contient les cellules spléniques, les cellules du myélome et les hybrides (hybridrome) ________ 9  Les premières meurent naturellement après une à deux semaines (milieu de culture pauvre), les secondes sont tuées par le HAT, mais les hybrides survivent car ils ont l'immortalité des cellules du myélome et le shunt métabolique des cellules spléniques. Certaines auront également la capacité de produire des anticorps comme les cellules spléniques. Tous les puits contenant des cellules se multipliant sont testés pour la production d'anticorps souhaité (par RIA ou par ELISA) et s'ils sont positifs, la culture est clonée c’est à dire réparti dans des plaques de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits (centrifugation dilution ou support semisolide, transfert pipette PASTEUR) Cela done un clone cellulaire provenant d'une seule souche qui est à la fois immortelle et productrice d'anti-corps (monoclonal) 3.3.3 Génie Génétique C'est la formation de nouvelles combinaisons dans le matériel génétique, par insertion de molécules d'acides nucléiques (isolées du reste de l'organisme) par un système vectoriel quelconque permettant l'incorporation dans un hôte capable d=assurer sa propaga-tion continue. Il comprend 5 étapes principales: - L’isolement d'une séquence d'acide nucléique, idéalement un gène, (enzyme de restriction) - L'insertion de ce gène dans un vecteur (plasmide ou phage), - L'incorporation de ce vecteur dans un hôte (généralement E. coli), mais plus récemment les cellules eucaryotes et même de mammifères) Transfection. - L'hôte ainsi transformé peut assurer la propation du vecteur à chaque cycle de réplication, et par conséquent, de la séquence génétique qui y est insérée. Dans la mésure ou une telle séquence est conservée après chaque cycle de réplication, on aboutit à la formation d'un clone (puisque par ce type de transmission se propage dans une lignée tout un ensemble de cellules qui sont génétiquement identique d'une génération à la suivante). Initialement présente sous la forme d'un seul gène (ou plus exactement d'un petit nombre de copie), la séquence insérée va ainsi être propagée à un grand nombre d'exemplaires: on dit qu'elle est amplifiée. Dans certains cas il sera possible de faire traduire (s'exprimer) la sequence génétique insérée et amplifiée qui sera donc fonctionnelle en dehors de l'organisme dont elle est initialement issue. ________ 10  Les ensembles géniques insérés dans les clones constituent des banques génomiques ou banques d'ADNC (librairies) Application: productions d'antigènes d'agents pathogènes pouvant être utilisées dans la production de vaccins. Emploi de sonde d'ADN pour le diagnostic du paludisme - Prelèvement de sang sur sujet parasité - Lyse des cellules sur plaque de microtitrage - Transferer l'échantillon sur filtre de nitrocellulose à l'aide d'un appareil de microtransfert (Technique de buvardage ou blotting) - Incuber pendant 10minutes dans NaOH, puis 10 minutes dans du tampon à température ambiante - Chauffer à l'étuve á 50?C pendant une heure - Ajouter la sonde d'ADN marquée (32P) pendant au moins quatre heures à 42oC, afin de l'hybrider avec l'ADN cible Laver puis Couvrir avec une plaque d'autoradiographie - Développer pendant 6 heures en chambre noire. ________ 11 II. LE RÊVETEMENT CELLULAIRE DES EUCARYOTES Objectifs du cours: être capable de: - Décrire la composition et la structure des cellules eucaryotes et procaryotes - Décrire la Composition biochimique et organisation moléculaire de la membrane plasmique - Décrire la structure et rôle de la paroi bactérienne des cellules procaryotes - Réproduire les schémas. 1. Cellules eucaryotes. Le revêtement cellulaire délimite le milieu intracellulaire et le sépare du milieu extracellulaire. Il comprend : - la membrane plasmique : en rapport avec le milieu intracellulaire. - le cell-coat (manteau cellulaire) en relation avec le milieu extérieur 15 Ao. - le cytosquelette sous-membranaire. 1.1. Structure de la membrane plasmique a) Structure trilaminaire. A partir de coupes minces 0.03 (fixation dans KMnO4 et inclusion dans une résine) observées au M.E à transmission, on observe deux feuillets denses osmiophiles de 20 Ao chacun, séparés par un feuillet clair osmiophobe de 35 Ao: structure trilaminaire. L'épaisseur des feuillets peut varier suivant les types cellulaires et les membranes. b) Structure particulaire Après cryodécapage (cassure après fixation par congélation dans l ´Azote liquide -196 0c), on observe en M.E à balayage deux couches : exoplasmique et protoplasmique. Ces couches contiennent des particules intramembranaire (creux et bases complémentaires dont le nombre, la taille et la distribution sont ________ 12 variables (ex: 3000 par m2 et de 40 à 100 Ao de diamêtre, ce qui correspond à une structure particuliaire. Les particules intramembranaires correspondent aux protéines globulaires. c) Notion de membrane unité. Ces structures se retrouvent également au niveau de toutes les membranes intracytoplasmiques: - réticulum endoplasmique, Appareil de Golgi, enveloppe nucléaire, lysosomes, péroxysomes et vésicules de transition. - membranes mitochondriales. On définit ainsi la membrane plasmique de membrane unitaire ou membrane de base(Roberston 1959) d) Cell-coat(manteau cellulaire) Un feuillet supplémentaire peut être visible sur la face ex-terne de la membrane plasmique: c'est le cell-coat (Gassec, 1963) appelé aussi manteau cellulaire, glycocalyx ou glycolemme. e) Le cytosquelette sous-membranaire. La face interne de la membrane (face hyaloplasmique) est tapissée de microtubules et de microfilaments formant le cytosquelette sous membranaire. 1.2. Composition biochimique et organisation moléculaire de la membrane plasmique 1.2.1. Composition biochimique La membrane plasmique contient en moyenne 40% de lipides et 60% de protéines. a) Les lipides: Ce sont des lipides amphiphiles possédant un pôle hydrophile et pôle hydrophobe. Ils sont composés de 55% de phospholipides, 25% de ________ 13 cholestérol, 18% de glycolipides et 2% d Acides gras hydrophobes. b) Les protéines: Il s´agit de polypectides dont le P.M. varie de 20.000 à 240.000 (Surtout des glycoprotéines). Elles sont composées de protéines de structure, de protéines enzymatiques (enzyme de la glycolyse), de protéines contractiles (actine, myosine, spectrine), d´ATPases, de protéines Kinase, Adenyl cyclases, de perméases. Une protéine majeure de la membrane est la glycophorine glyco-protéine riche en acides sialiques. 1.2.2. Modèle en mosaique lipides-protéines (Singer et Nicolson 1966- 1971). La membrane plasmique est constituée d'une bicouche de phospholipides dont les pôles hydrophobes sont disposés face à face et les pôles hydrophiles retournés l´un envers l´autre vers le cytoplasme, tous les deux sont recouverts de molécules de protéines périphériques hydrosolubles (protéines extrinsèques internes et externes). Les protéines intégrées (p.intrinsèques) possèdent un pôle hydrophile en contact avec la phase aqueuse extracellulaire ou le hyaloplasme et une partie interne hydrophobe plongée dans la bicouche lipidique. Ces protéines amphiphiles de structure globulaire constituent près de 50%- 70% des protéines membranaires. Elles possèdent des sites spécifiques qui leur permettent de fixer des hormones, des médiateurs chimiques ou des substrats transportés activement, enzymes, médicaments, virus, toxines, cellules ou des informations extracellulaires. Les régions polysacharides des glycoprotéines et des glycolipides baignent dans le milieu extracellulaire et forment le revêtement fibreux du manteau (structure asymétrique de la membrane) D'après ce modèle la membrane plasmique possède une fluidité ________ 14 capable de varier localement et qui s´explique par les interactions entre les différents composants chimiques: - Agencement des phospholipides : il varie suivant la quantité d´eau, formation d’une couche monomoléculaire avec peu d'eau, formation de micelles avec moins de 50% d'eau et d'une bicouche avec plus de 50% d ´eau. - Interaction lipides-lipides : La fluidité augmente avec le dégré d ´insaturation des lipides. Les phospholipides saturés sont peu fluides, les non saturés double liaison) sont plus fluides. - Les interactions entre phospholipides et cholesterol font varier la fluidité. On obtient ainsi une mosaique lipidique qui constitue la matrice des membranes biologiques. - Interactions protéines-lipides : Les protéines extrinsèques hydrophiles : (fibronectine) sont situées à la périphérie des phospholipides, alors que les protéines intrinsèques (hydrophobes) se lient aux chaines d'acide gras des phospholipides par des liaisons hydrophobes. Les protéines intrinsèques sont enchassées dans la matrice lipidique. Les protéines extrinsèques diffèrent en fonction de leur localisation. La fibronectine sesur la face externe alors que l'alpha-actinine la spectrine, l'ankirine se situent sur la face interne. - Interaction protéines-protéines : Les protéines membranaires sont mobiles dans la matrice lipidique Il y a déplacement transversal ou fusion des protéines responsables des fonctions enzymatiques et de transport. Les protéines globulaires les unes des autres par leur groupement carboxyl COO-. L'abaissement du Ph modifie les charges négatives des protéines et il y a formation d'agrégats. L'abaissement de la température empêche la mobilité des protéines. ________ 15  Le contrôle de la mobilité sous l'action du milieu se fait par l'intermédiaire des microfilaments et des microtubules. On distingue des mouvements de diffusion latérale et des mouvements de bascule ( flip-flop ) CONCLUSION La membrane plasmique ne présente donc pas une structure uniforme en toutes circonstances mais des états successifs d'organisation correspondant à des conditions d'activité différente. 2. Cellules procaryotes 2.1. Structure Epaisse d’environ 10nm, la membrane plasmique à une structure moléculaire comparable à celle des cellules eucaryotes. Cependant, il ne semble pas qu’elle soit recouverte par un cell coat. 2.2. Fonctions Comme chez les eucaryotes, elle joue un rôle dans la perméabilité sélective grâce des perméases qui commandent les entrées dans la cellule. Elle intervient aussi dans le contrôle des sorties, c’est à dire dans l’excrétion des enzymes, de toxines…etc. Mais son rôle diffère de celui de la membrane plasmique des cellules eucaryotes car elle est le siège de nombreuses enzymes : en particulier elle contient des enzymes du métabolisme respiratoire (des cytochromes, des enzymes, des enzymes du cycle de Krebs) La membrane plasmique des bactéries a donc les mêmes fonctions que les crêtes mitochondriales. Elle contrôle la division bactérienne : lorsque la bactérie se divise, on constate que, tandis que s’effectue la duplication du chromosome, le mésosome sur lequel il est attaché augmente de volume, se divise. Les deux mésosome se séparent, entraînant chacun vers une extrémité de la bactérie, le chromosome auquel il adhère. 2.3. La paroi - Définition La paroi est une structure de protection physico-chimique et un exosquelette (squelette externe). Elle protège la cellule en maintenant la pression osmotique intrabactérienne à un niveau élevé, très supérieur à celui du milieu externe, et elle confère sa forme à la bactérie. - La coloration de Gram et la structure de la paroi La coloration de Gram (coloration par le violet de gentiane et la fushine, ________ 16 après mordançage par le lugol, suivie d’un lavage à l’alcool) distingue empiriquement deux grands groupes de bactéries dites Gram+ qui retient le colorant, et le Gram-. La positivité ou la négativité de la réaction de Gram dépend de la structure de la paroi. On admet que la perméabilité de la paroi des bactéries gram- est beaucoup plus grande que celle des bactéries gram+ de telle sorte que l’alcool entraînerait aisément les colorants fixés. Une seconde hypothèse soulève le problème de la formation d’un complexe entre la substance qui constitue la paroi, le violet de gentiane et le lugol. - Structure en microscopie électronique La paroi des bactéries gram+ est une couche unique, homogène, de 15 à 30 nm d’épaisseur. Elle est formée d’une molécule énorme d’un peptidoglycane, la muéine (encore appelée glycopeptide ou mucocomplexe). Cette molécule géante entoure à la manière d’un filet, la totalité de la bactérie. Elle repose directement sur la membrane plasmique de la bactérie. Cette molécule de muréine est solidement maintenue à la membrane plasmique par des polysaccharides anioniques et des acides teïchoïdes ancrés dans la membrane sous jacente et qui établissent avec le glycopeptide des liaisons covalentes. - La paroi de la bactérie de Gram- Elle est plus complexe, hétérogène, de 8 à 12 nm d’épaisseur. La muréine repose en une couche mince sur la membrane plasmique bactérienne. En dehors de cette couche, des protéines s’organisent en hexagone, tandis que la partie périphérique de la paroi à la structure d’une membrane plasmique. 2.4. Rôle de la paroi bactérienne En plus du rôle protecteur et le soutien (exosquelette), la paroi bactérienne est le support des antigènes somatiques La capsule bactérienne Certaines bactéries possèdent, en dehors de la paroi, une capsule d’épaisseur variable, généralement faite de polysaccharides. Les bactéries pathogènes capsulées sont moins sensibles à la phagocytose. Cette capsule permet à la bactérie de résister plus ou moins complètement à la phagocytose. D’autres part, ses polysaccharides ont des activités antigéniques. ________ 17 III. FONCTION DE LA MEMBRANE PLASMIQUE Objectifs du cours : être capable de : - décrire les différents types de transport cellulaire - décrire les différenciations de la membrane plasmique et d’adhésivité La membrane plasmique joue un rôle important dans les échanges entre le hyaloplasme et le milieu extracellulaire. Ces échanges assurent la pénétration ou l'expulsion de substances la reception d'informations d'origine extracellulaire et leur transmission au milieu intracellulaire. Pour assurer ces fonctions, différents mécanismes sont utilisés: - Transport perméatif: direct passif ou actif de diverses substances à travers la membrane plasmique (ions et autres petites molécules et autres substances de faibles poids moléculaires) - Transport cytotique par ingestion (endocytose) et expulsion (exocytose) de diverses substances (grosses molécules) sous emballage membranaire. - Spécialisation de la surface cellulaire : développement de différenciations morphologiques de membrane - Transfert d'informations de cellule à cellule par l'intermédiaire de membrane de cellules spécialisées. 1. Transports perméatifs Il s'agit de passage transmembranaire n'impliquant pas de modification morpologique de la membrane visible en M.O., On distingue: - les transports passifs - les transports facilités - les transports actifs 1.1. Transports passifs a) Perméabilité à l'eau: osmose Passage d'eau du milieu le moins concentré vers le milieu le plus concentrésous l'effet de la pression osmotique du milieu de part et d'autre dela membrane. b) Perméabilité aux solutés: Diffusion simple. C'est le passage de substances dissoutes du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré. Cette perméabilité passive est sélective et dépend de la taille des molécules (volume critique), du coéfficient de partition (rapport de solubilité dans lipide/solubilité dans l’eau), du gradient de concentration de la charge électrique (# de potentiel) ou encore de la structure chimique. ________ 18 Applications thérapeutiques: les liposomes Ce sont des microsphères de 500 Ao de diamétre obténu par ultrasons sur un milieu aqueux renfermant des phospholipides avec acides gras et cholestérol. Ils sont constitués d'une double couche lipidique et on peut y inclure des des principes actifs (enzymes, anticoagulant, des médicaments...) Ils traversent facilement la phase lipidique de la membrane et libèrent leur conténu dans la cellule. 1.2. Transports facilités Diffusion facilitée: C'est un mécanisme permettant à certaines substances (Sucres, acides aminés, ions) de diffuser plus rapidement que lors d'une diffusion simple La diffusion facilitée se fait grâce à l'intervention de transporteurs enzymatiques (perméases) qui se lient à la substance transpotée (ligants) et facilitent son passage. Ces transporteurs sont généralement spécifiques de différents types de de substances. Ce mode de transport ne nécessite pas d'apport énergétique et se fait sous l'influence de l'agitation thermique. Ex. Stockage et et libération de glucose dans la cellule hépatique. Pénétration du glucose dans les hématies. b) Les ionophores: Ce sont des composes qui augmentent la permeabilité de la membrane à certains ions par la formation d'un canal transmembranaire (gramicidine) ou suivant un système de navette (valiomycine) k+ ex: antibiotiques transporteurs ou ionophores synthétisés par certains micro-organismes 1.1. Transports actifs Il se fait grâce à un apport d'énergie contre les gradients normaux de diffusion ex: pompe ionique, pompe à glucose, pompe à acides animés. - Transport actif des ions: mécanisme de la pompe Na-k Des molécules de protéines intégrées (glycoprotéine) jouent le rôle de perméase et d'ATpase. La pompe Na-k est un tétramère protéique transmembranaire de PM: 270.000 d, appelé ATpase Na+ k+ dépendante, activée en présence Mg sous sa forme phosphorylée, elle se lie par un site spécifique à Na+ dont elle assure le transport de l'intérieur de la cellule vers l'extérieur (transport actif en présence de Mg++ de 3Na+) Elle est déphosphorylée en présence de K+ Sous sa nouvelle forme, elle se lie à 2k+ qu'elle transporte de l'extérieur vers l'intérieur (diffusion facilitée). La libération de K+ régénère la fonction ATpasique de la molécule. Le transporteur se recharge en énergie et le cycle peut recommencer. ________ 19 - Rôle du transport actif La pompe à Na+k+ (Sortie de 3Na+ pour entrée de 2k+) est responsable de la création d'une différence de potentiel appelée aussi potentiel de membrane ou potentiel de repos ( -70mv). De facon générale le transport actif sert à la régula-tion PH, des taux d'ions, de glucose, d'A. gras et d’Acides aminés dans la cellule. 2. LES TRANSPORTS CYTOTIQUES. On distingue: - endocytose pénétration des substances. - exocytose: expulsion de substances a) Endocytose C’est un phénomène lié à la pénétration de particules solides ou liquides dans le cytoplasme par invagination sous l'effet de la contraction de microfilaments sous membrane Il comprend: - phagocytose: capture et destruction de particules solides de Diamètre inf. a 1u chez les amibes et les macrophages (histiocytes et leucocytes) - Pinocytose: capture et destruction de gouttelettes du milieu extracellulaire (macromolécule). La macroginocytose: 0,1 à 0,2u : invagination tubiliforme profonde ou rabattement de lame ectocytoplasmique observable au microscope optique micropinocytose 300 à 500 à invagination en tubules qui forment des microvacuoles par étranglement observable au M.E. L'endocytose se produit dans toutes les cellules. b) Exocytose C’est un mouvement inverse de l'endocytose. La migration des vésicules vers membrane plasmique s'effectue grace à des courants cytoplasmiques crées par la contraction des microfilaments du cytosquelette et dont la direction est imposée par des microtubules ce mécanisme est ATP et ca++ dépendant. Les vésicules s'ouvrent sur l'extérieur et libèrent leur contenu par fusion membranaire (hybridation somatique). Les produits transportés peuvent être endogènes (grains et secrétion) comme mucus, enzyme et hormones ou exogènes introduits après endocytose ________ 20 2. Les mouvements de la membrane a) mouvement de bouillonnement. Ce sont des saillies hémisphériques en forme de bulles remplies de cytoplasme. Ces mouvements en relation avec la pression osmotique intracellulaire sont caractéristiques de cellules en mauvais état. b) Les mouvements de locomotion. - Membranes ondulantes : ce sont des expansions cytoplasmisques planiformes fines qui sont animées de mouvement d'ondulation assurant à la cellule un déplacement dans un milieu liquide. Les mouvements d'ondulation dépendent du réseau sous membranaire de fibres contractiles - Les pseudopodes : ce sont des prolongements émis par une cellule qui adhèrent au substrat et qui lui permettent de se mouvoir. Ils ont une morphologie variable lamellaire digitiforme (mots dus aux microfilaments) 4. Les échanges d'information Les échanges d'information de cellule à cellule se font par : - Transmission hormonale - Transmission synaptique - Par voie nerveuse (synapses chimiques ou électriques) - Par l'intermédiaire des fonctions communicantes (gap) unissant deux cellules non nerveuses. 4.1. transmission hormonale Les hormones sont apportées aux cellules par le sang puis par les liquides intercellulaires. Toutes les cellules ne reagissent pas à une hormone donnée. Ex : mécanisme d'action d'hormones agissant par l'AMP cyclique (Adénosine 3'5'monophosphate cyclique) - Phase intramembranaire Le recepteur hormonale possède un site spécifique situé en regard du milieu extracellulaire et sur lequel se fixe l'hormone Le complexe hormone- récepteur diffuse dans la bicouche lipidique et se combine par l'intermédiaire d'un transducteur aux enzymes membranaires (Adényl- cyclase) qui sont ainsi activées. Mécanisme d'action d'hormones agissant par l'AMP cyclique - Enzymes actives sous forme phosphorylée ou déphosphorylée (enzymes des métabolismes glucidiques et lipidiques) : important mécanisme de régulation. -Transducteur: probablement de nature lipidique ________ 21 - Phase cytoplasmique Le site catalitique de l'Adényl-cyclase situé en regard du hyaloplasme transforme alors l'APT en AMPC qui déclenche différentes reactions au sein du hyaloplasme en reponse à la stimula-tion hormonale (concentration de 10-8 à 10-12 M) par activation d'enzymes suite àune levée d'inhibition de la protéine kinase (phosphorylation). L'activité de l'AMPC est controlée par une phospho-diesterase qui transforme l'AMPC en produit inactif, le 5' AMP après hydrolyse de la liaison 3'. Pour un même second message, la réponse varie pour différentes cellules en raison de leur différence en équipement enzymatique: - cellules hépatiques..... glycogénolyse - cellules adipocytes..... lipolyse - cellules surrénales......stéroidogenèse La fixation de l'hormone peut certains cas provoquer une inhibition de la cyclose (ex: Insuline, mélanotonine et protaglandine). La plupart des hormones agissent par l'intermediaire de l'AMPc a l'exception de l'insuline et de la Gh-somatotropine qui agissent par GMPc.Certaines hormones: derives du cholesterol (testostérone, progestérone oestradiol...) et hormone thyroidienne T3 pénètre dans la cellule. 4.2. Transmission synaptique La transmission des informations de cellule a cellule se fait par : - Synapses electriques : transmission continue de l'IN au niveau des lacunes des gap junctions (fibres musculaires lisses : Transmission ultra rapide du potentiel d'action). - Synapses chimiques : intervention de neuromédiateurs chimiques excitateurs ou inhibiteurs contenus dans les vésicules membranaires des boutons synaptiques de l'arborisation terminale de l'axone. +Les fibres cholinergiques produisent de l'acétylcholine ou du carbachol. +Les fibres adrenergiques produisent de l'adrénaline et de la noradrénaline. Ex: Libération de l'acetylcholine par une terminaison présynaptique. L'arrivée de l'influx nerveux dans la terminaison nerveuse déclenche (par augmentation de la perméabilité au Ca2+) la décharge par exocytose du contenu des vésicules synaptiques. Libérées dans la fente synaptyque, les molécules d'acétylcholine se lient à des récepteurs de l'acétylcholine, récepteurs qui sont des protéines intégrées à la membrane postsynaptique (1) Cette liaison de l'acetylcholine avec le recepteur change la conformation du recepteur (2) qui forme un canal transmembranaire à ________ 22 travers lequel entrent les ions Na+ et sortent les ions K+(Phénomène de diffusion) : Il ya création d'un potentiel post synaptique excitateur. L'existence du canal n'est que transitoire (3), puis l'acétylcholine se détache du recepteur (4)qui reprend sa conformation initiale. Dans la fente synaptyque l'acetylcholinester hydrolyse les molécules d'acétylcholine en choline et acétate. L'action des neurotransmetteurs est fonction des propriétés de la membrane postsynaptique (teneur ionique, perméases), le même médiateur pouvant entrainer tantot une augmentation de la perméabilité aux chlorures (synapses inhibitrices) tantot une augmentation de la permeabilité au Na+ et une dépolariation (Synapse excitatrice). 5. Biogénèse de la membrane plasmique La M.P. est en perpétuel renouvellement. Les éléments du système membranaire intracellulaire et la membrane plasmique sont liés de façon dynamique par des échanges réciproques : - Les lipides amphiphiles sont synthétisés au niveau des membranes du REL. - Les protéines périphériques de la face interne sont synthétisées par des polysomes libres dans le hyaloplasme. - Les protéines périphériques de la face externe et les protéines intégrées sont synthétisées par les polysomes attachés aux membranes du REG. Ces 2 dernières catégories de protéines et les glycolipides sont apportés à la M.P. par un "écoulement" continu des membranes provenant du RE et de l'Ap. de G par l'intermédiaire de la formation de vésicules de transition qui fusionnent par exocytose avec la membrane plasmique (composés subissant la glycosylation). Les protéines périphériques externes et les protéines intégrées sont dégradées au niveau de la surface cellulaire, alors que les protéines périphé-riques internes sont réutilisées plusieurs fois avant d'être dégradées dans le hyaloplasme (H.F.lodish et B. Small, 1975). La vitesse de renouvellement des constituants de la membrane s'exprime en demi-vie : Polypeptides 2-13jours, Lipides : 3-5 jours. 6. Spécialisation de la surface cellulaire La spécialisation est une différenciation structurale ou une transformation morphologique qui confère à la cellule une fonction particulière. La spécialisa-tion intéresse principalement la membrane plasmique qui revêt le pôle basal des cellules. 6.1. Spécialisation de la membrane apicale : microvillon Ce sont des expansions cytoplasmiques cylindriques (0,8u de haut et 0,1u de diamètre) limitées par la membrane apicale et intervenante surtout dans l’augmentation des surfaces d'absortion (1500 fois, visibles au M. E) Elles sont soutenues par des éléments du cytosquelette hyaloplasmique, ________ 23 des microfila-ments d'alpha-actinine et de myosine sont insérés à leur extrémité. Le feuillet externe de la membrane possède un cell coat très développé qui contient des hydrolases attachées à la membrane renfermant de l'ATP et est le site de nombreux transporteurs. Les microvillosités sont groupées à la surface des cellules épithéliales en formations dénommées : - Plateau strié: zone de striation perpendiculaire à la surface cellulaire qui recouvre les entérocytes (intestin grêle). - Bordures en brosse: des tubes contournés proximaux du rein microvillosité de grande longueur. - Stérocils: longues expansions cytoplasmiques s'agglutinant en touffes à la surface. Ces voies excrétrices de l'appareil génital male guident l'évacuation du produit de secrétion) 6.2. Différenciations de la membrane basale : invaginal La partie basale de la cellule épitheliale particulièrement riche en mitochondries est divisée en une série de compartiments parallèles. Ex : cellules des tubes contournés distaux du rein : échange contre le gradient de concentration (transport actif) 6.3. Différenciation de la membrane plasmique et adhésivité Les cellules d'un organe sont séparées les unes des autres par des espaces intercellulaires interrompus parfois par des zones de jonction : complexes jonctionnels ou couplages, tight, gap, desmosomes, a) Espaces intercellulaires Les cellules juxtaposées faisant partie d'un même tissu sont séparées par un espace de 50 à 200A. L'espace intercellulaire contenant la lymphe interstitielle riche en mucopolysaccharides (fibronectine, élastine, collagène) La lymphe intervient dans le transport des éléments nutritifs, des produits de sécrétion et des déchets et joue le rôle de ciment assurant la cohésion de l'ensemble. La présence d'ions ca++ et MG++ est indispensable à la cohésion. b) Les interdigitations Les membranes des cellules contigues sont généralement rectilignes, mais par places, elles suivent un contour sinueux et s'engrènent l'une dans l'autre : interdigitation augmentation de la cohésion, de la surface d'échange et reserve cellulaire pour l'expansion de la cavité delimitée. Ex : épithelium rénal, col de l'utérus, vagin et muscle cardiaque (trait scalariforme). c) Les tights jonctions (jonctions serrées) ou encore zonula occludens. Ce sont des régions spécialisées de la membrane ou les feuillets externes établissent un contact si étroit qu'ils obturent complètement l’espace ________ 24 intercellulaire et empèche le passage de toute substance. Elle forme une barrière au passage de l’eau et à la diffusion des molécules. Les échanges se font donc obligatoirement à travers les cellules et non par les espaces intercellulaires. Ce type de jonction unit les cellules endothéliales, les entérocytes, les cellules hépatiques qui bordent un canalicule biliaire. d) Gap jonctions ou jonctions communicantes, jonctions lacunaires ou encore zona adhaerens. Ce sont des zones régions spécialisées des membranes de 2 cellules adjacentes qui se caractérisent essentiellement par un rapprochement de 2 membranes (entérocytes) L’espace intercellulaire est d’environ 20Ao. Les gaps junctions permettent des échanges directs entre cellules voisines d’ions et de molécules, parfois aussi par l’intermédiaire de connexions réalisées entre les membranes (pont ou septate like junction: Espace de 15 à 20 nm). Mise en évidence de la jonction lacunaire par utilisation de Nitrate de lanthane. e) Desmosomes ou Macula adhaerens. Ce sont les systèmes les plus complexes et les plus différenciées d'attache intercellulaire. Les desmosomes présentent un espace intercellulaire plus large (240-500Ao) rempli d’un matériel (fibres et particules du cell coat) qui diffuse fortement, les électrons après fixation osmique des tissus. Les membranes plasmiques voisi-nes rectilignes, parallèles et recouvertes sur leurs faces intracellulaires d’un matériel dense ou plaque (keratohyaline) vers laquelle convergent des faisceaux de tonofilaments : scleroprotéine, cytokératine P.M. 50 à 60 Kd. Les desmosomes existent dans tous les épitheliums endothelium des vaisceaux sanguins et mésothelium de l’abdomen et du thorax, avec des dégrés divers de différentiation (desmosomes maculaires, ovalaires, desmosomes zonulaires, jonctions continue (esp. 15-20nm), et les hémi- desmosomes ou desmosomes mono-cellulaires qui assurent l'adhérence de l' épithelium à la lame basale. f) Les complexes de jonctions. Un complexe de jonction comprend 3 types de jonctions intercellulaires. Ex : Epithelium intestinal. - Tight jonction: elle entoure la partie apicale de chaque cellule, - Un gap lui fait suite : l’espace intercellulaire à 20nm de large et il est occupé par un matériel peu dense homogène : Il ceinture également la cellule. L’ensemble Tight-gap jonction forme le cadre cellulaire visible en microscopie optique. - Le desmosome maculaire occupe la partie la plus profonde du complexe de jonction. Ces complexes joinctionnels s'observent dans l'épithelium intestinal ________ 25 ________ 26 IV. Le nucléole Objectifs du cours : être capable de : - décrire le nucléole en microscopie optique et electronique - décrire la biochimie et le rôle du nucléole Le nucleóle est un organite responsable de la synthèse des acides ribonucléiques des ribosomes, présent dans le noyau au cours des phases G1, S, G2 et disparaissant pendant la mitose. 1. Structure du nucléole a) En microscopie optique. Ce sont de petites sphères de 1 à 2  de Ø très refringentes de position variable et dont le nombre est généralement fixe pour un type cellulaire donné. Le nucléole comprend : - La chromatine périnucléolaire (ou chromatine associée) le calcium durcit cette zone de chromatine. - Le corps nucléolaire : Partie du nucléole entourée par la chromatine périnucléaire, constituée d´une substance filamenteuse : Le nucléolonéma enroulé irrégulièrement au sein d´une substance amorphe ou pars amorpha. b) En microscopie electronique. Les nucléoles ne présentent pas de membrane limitante et offrent un aspect spongieux, où le nucléolonéma apparait en un réseau de filament avec des granules nombreux arrondis de 150Ao (ribosomes nucléolaires) associés à des fibrilles de 400 Ao - Les fibrilles ont une longueur variable de 20 à 40nm sur 4 à 8nm de diamêtre. Leur densité est égale à celle des fibres de chromatine. ________ 27 Nucléole réticulé en microscopie électronique - Les granules. Ils sont de 15nm de diamêtre avec les mêmes affinités tinctoriales et même polymorphisme que les ribosomes. - La pars amorpha. Elle est formée par le nucléoplasme contenant des protéines nucléolaires. - Les centres fibrillaires. Il s´agit de zones contenant le rDNA (ADN ribosomal) ou fractions de l´organisateur nucléolaire responsables de la transcription en rRNA (ARN ribosomal) Classification des nucléoles. On distingue : - Des nucléoles réticulés - Des nucléoles compacts - Des nucléoles annulaires 2. Biochimie du nucléole a) Le DNA nucléaire: se présente soit - sous une forme condensée: zones chromatiniennes périnucléolaires. - sous une forme dispersée. Il n´existe pas de différences significatives entre la quantité des bases puriques et pyrimidiques du DNA nucléolaire et celle du DNA nucléaire. La réplication du DNA nucléolaire s´effectue au cours de la phase S du cycle cellulaire. La réplication du DNA périnucléolaire est plus précoce et plus rapide que celle du DNA intra-nucléolaire. b) Les RNA nucléolaires. Il existe dans le nucléole divers types d´ARN classés selon leur coefficient de sédimentation exprimé en unité SVEDBERG. Dans les nucléoles des cellules hépatiques on trouve les ARN suivants : ARN 45S, 35S, 28S, 8 à 16S, 4à 7S. L´ARN 18S a été isolé du nucléoplasme. Ces différents ARN correspondent à des étapes de maturation. c) Les protéines. ________ 28  Le nucléole contient des protéines acides et des histones (rôle de protection contre Rnases ou association en sous unités aux ARN) d) Les enzymes nucléaires. Elles interviennent dans les réactions de synthèse ou de maturation du RNA. Le nucléole contient une ARN polymérase-DNA dépendante qui catalyse la synthèse de l´ARN et une NAD pyrophosphorylase (ou NAD synthétase) à rôle mal connu. Des enzymes jouent un rôle dans la mutation de l'ARN - la convertase transforme ARN 45S en rRNA 32S et 28S - les méthylases fixation d'un groupement CH3 sur ARN (méthylation) - Ribonucléase: Scission des liaisons phosphodiester des ARN. - La polyriboadénylique synthétase acide catalyse dans le nucléole la synthèse de l´acide polyriboadénylique qui est un polymère de l´Adénosine diphosphate ribose. 3. Rôle du nucléole a) Transcription de l´ARN ribosomal. Expérience de physiologie sur crapeaud africain (Xenopus laevis), qui possède 2 nucléoles, mais il existe une souche avec un nucléole. La présence d’un seul nucléole est un phénomène héréditaire. Si l’on croise deux crapauds dont les cellules ne possèdent qu’un seul nucléole, les tétards obtenus constitueront une population dont 25 % possèdent des noyaux à 2 nucléoles, 50 % des noyaux à 1 nucléole et 25 % des noyaux à 0 nucléole. Crapauds 1N x 1N ------25% 2N + 50% 1N +25% à 0N. Si on place les trois types de tétards dans les mileux contenant des précurseurs marqués de l'ARN, les tétards à 1 à 2 nucléoles synthétisent les ARNm, ARNt et les ARNr par contre les tetards sans nucléoles synthétisent uniquement ARNm et ARNt.Le nucléole est indispensable à la synthèse de l'ARNr. Les zones fibrillaires du nucléole sont le site de synthèse de l'ARN ribosomale. - Maturation du rRNA Le rADN est responsable de la synthèse du rRNA 45S (rDNA parie de l’ADN d'un chromosome localisée dans l'organisateur nucléolaire et située dans les centres fibrillaires). Le rRNA 45S forme à la suite d'un processus de maturation une molécule de RNA 28S, toutes les deux méthylées et incorporées à des protéines ribosomales. Ces particules de RNA ribosomales (40S pour le RNA 18S et 65S pour le RNA 28S) passent dans le cytoplasme par les pores nucléaires pour former en s'associant avec les ________ 29 ARN 5S, les ribosomes (80S). La Régulation de la transcription du rRNA dépend de la quantité de ribosomes présents dans le cytoplasme. b. Nucléole et ARNm La présence d´un nucléole fonctionnel est nécessaire pour que l ´ARNm passe du noyau dans le cytoplasme. L´inactivation du nucléole par traitement par un microfaisceau de lumière UV inhibe le passage de l ´ARNm dans le cytoplasme. c. Rôle du nucléole dans la préparation de la mitose. Les nucléoles sont indispensables à un déroulement normal de la mitose. En En effet, des altérations importantes des nucléoles provoquent le blocage des cellules à la phase G2, phase qui prècede la mitose (phase M). L´irradiation par un microfaisceau d´UV du nucléole inhibe la division cellulaire. De même si la synthèse protéique est bloquée par l´actichrome ou la cyclohéximide juste avant la disparition du nucléole, au cours de la prophase, la mitose se déroule mais les noyaux ne peuvent se reformer. 4. Variations morphologiques du nucléole Le nucléole subit des variations morphologiques dont certaines sont physiologiques (augmentation de volume) et d´autres pathologiques (inactivation nucléolaire, ségrégation nucléolaire, hypertrophie nucléolaire). ________ 30 V. Le noyau interphasique Objectifs du cours : être capable de : - Décrire la structure et le rôle de l'enveloppe nucléaire - Décrire l’ hétérochromatine et l’euchromatine. - Décrire la constitution biochimique des fibres de chromatine 1. Constituants structuraux du noyau interphasique - Caractères généraux a) Structure. Le noyau est limité par une enveloppe nucléaire formée de deux membranes séparées par un espace périnucléaire. Il comprend en microscopie optique : - un nucléoplasme peu colorable - des amas d´une substance fortement chromophile, la chromatine (chaque amas appelé caryosome ou chromocentre) - des filaments qui unissent les amas des corps sphériques,les nucléoles b) Constance. Le noyau existe dans toutes les cellules eucaryotes à l´exception des érythro-cytes des vertébrés supérieurs et des fibres du cristallin. Les procaryotes possèdent cependant des équivalents (granulations chromatiques des Protozoaires, nucléoïdes des bactéries, ADN viral) c) Forme. La forme nucléaire est liée à l´activité de la cellule: - Sphérique dans les cellules épithéliales cubiques ou polyédriques - allongé dans les cellules fusiformes (cellules musculaires lisses - discoïdes dans les cellules pavimenteuses (épiderme) - lobulé dans les granulocytes ________ 31  - de forme très irrégulière dans les mégacaryocytes (cellule de la lignée thrombocyte : Plaquettes sanguines.) d.) Dimension. Le volume nucléaire varie d'un type cellulaire à un autre, mais remarquable-ment fixe pour le type cellulaire. e) Nombre. Les cellules ne possèdent habituellement qu'un seul noyau. Cependant dans le foie où les cellules polyploides et en particulier tétraploides sont relativement fréquentes, il n'est pas exceptionnel d'observer des hepatocytes à 2 noyaux. Les masses protoplasmiques plurinucléées sont dénommées plasmodes ou syncytium, en fonction de leur mode de formation: - Les plasmodes resultent de la multiplication nucléaire sans cytodiérèse; - Les syncytiums naissent de la fusion de plusieurs cellules en une masse commune (Les ostéoblastes proviennent de la fusion de plusieurs ostéoblastes) f) Position. Elle est variable, mais caractéristique de chaque type cellulaire. Le noyau est central, mais peut être périphérique ou basal. 2. L'enveloppe nucléaire a.) Structure. En M.E. l'enveloppe nucléaire est formée de 2 feuillets membranaires à structure trilaminaire de 75 Ao chacun. Ces 2 feuillets sont séparés par un espace de 200 à 500Ao Qui est l'espace périnucléaire. La membrane nucléaire externe peut montrer des relations de continuité avec le R.E. alors que la membrane nucléaire interne est associée à une couche superficielle du nucléoplaste appelée la Lamina qui est une couche protéique fibrillaire épaisse de 150 a 500 Ao. Elle est formée de fibres d'actine et de tubuline. L’enveloppe nucléaire est perforée par de nombreux pores de diamêtre variant entre 500 et 700 Ao. La surface totale occupée par les pores varie entre 5 et 30 %. Au niveau des pores les feuillets membranaires externes et internes se rapprochent et forment un diaphragme constitué de petites particules serrées les unes contre les autres. Le diaphragme est un court cylindre capable de contraction ou d'expension. Le diaphragme est appelé Annulus. Il fait sailli vers l'extérieur. Le matériel annulaire est constitué de huit particules sphériques de 200 Ao de diamêtre. Un canal central de 250 Ao occupe le centre du pore. Les fibres de chromatine et les éléments de la lamina sont accolés aux particules de l'annulus du coté nucléaire. ________ 32 b) Rôle de l'enveloppe nucléaire. Permet d'assurer et de controler les échanges entre le noyau et le cytoplasme. Les échanges se font: - Des cavités du RE à l'espace périnucléaire - Par l'intermédiaire des pores: Passage selectif des particules de 25 à 85 Ao de diamêtre. - la voie transmembranaire: les substances comme les ions, les petites molécules (PM < 500d) passent directement à travers l'enveloppe nucléaire. La membrane nucléaire intervient dans la génèse des membranes annélées et dans certains cas dans la formation de l'appareil de Golgi. 3. Le Nucléoplasme Il s'agit d'un gel protéique dont la composition est voisine de celle du hyaloplasme. IL contient des enzymes tels que les phosphatases alcalines qui sont sources d'énergie, d’ADN polymérase, d'ARN en plus des cations Na+, Ca+, mg++. 4. La chromatine a. Structure de la chromatine et des espaces interchromatiniens - Structure en M.O. Les noyaux fixés et traités par un colorant basique revèlent l'existence de masse colorable : la chromatine (ou hétérochromatine) représentant 80%. Les espaces moins colorés entre les masses sont les espaces interchromatiniens qui contiennent l'euchromatine qui représente 20%. L'aspect de la chromatine ne varie pas d'un type cellulaire à un autre. On observe des mottes de taille variable, des granulations plus ou moins fines et un réseau à maille fine ou épaisse. ________ 33 Ces masses peuvent etre dispersées dans le nucléoplasme ou accolés à la membrane ou encore au nucléole, dans les noyaux des cellules somatiques femelles. Une masse de chromatine de 1 en forme de lentille biconvexe se collent soit contre le nucléole soit contre l'enveloppe nucléaire, c'est la chromatine sexuelle ou corpuscule de Barr. - Structure en M.E: les fibres chromatiniennes. La chromatine est constituée par des fibres spiralées très serrées les une contre les autres et qui représentent les fibres de chromatines qui sont les constituants essentiels du noyau. Elles représentent la chromatine pendant l'interphase. Elles ont une longueur variable avec un diametre de 10 à 25nm. On rencontre les fibres de chromatines aussi bien dans les amas de chromatine que dans les espaces inter chromatiniens qui correspondent aux zones claires. L'euchromatine ou chromatines dispersées est formée par des fibres de 35 à 100 Ao qu'on appele des fibres A (Forme décondensée déspiralisées de chromatine) L'hétérochromatine ou encore chromatine dense (zone sombre) présente des fibres épaisses de 200 à 250Ao de diamêtre qui sont les fibres B et qui représente la forme condensée. ________ 34  Structure en M.E. des fibres chromatiniennes Les fibres s'attachent sur l'enveloppe nucléaire au niveau des annulus. Les fibres de chromatines présentent sous l'aspect d'un collier de perles formées d'une succession de particules sphériques de 100A o de diamêtre appelées les nucléosomes. A proximité des fibres de chromatine, on observe que les espaces interchromatiniens sont formés: - de fibres périchromatiques (30-50Ao) ARNm - des granules périchromatiques (ARN 400 à 450A o) - de corps spiralés (ARN 400 à 600Ao) - des granules interchromatiques (ARNm transitoire 200 à 250A o) - Organisation moléculaire des fibres de chromatine: les nuléosomes (Fig) Les nucléosomes sont constituées par un ensemble de 8 molécules d'histones H2B, H2A, H3, H4 entourés d'un segment d'ADN comportant 140 paires de base complémentaire (bp). L'ensemble forme le coeur nucléosomique. Deux coeurs successifs sont reliés par un lien internucléosomique qui est une portion de l'ADN d’une longueur de 40 paires de base. Les fibres de type A : les fibres d’euchromatine correspondent à un chapelet de nucléosome enroulée en Hélice. La liaison entre 2 nucléosomes est assurée par une molécule d'histone H1 qui assure la cohésion de la chaine. Les fibres de type B : correspondent à la surspiralisation des fibres de type A en super hélice. Chaque tour de spire comporte une dizaine de nucléosomes. Ce superenroulement est lui aussi stabilisé par les histones H1. - Hétérochromatine et Euchromatine. ________ 35 L’hétérochromatine se présente sous 2 formes: * hétérochromatine constitutive : C'est une structure repétitive qui occupe une région constituée de chromosomes condensés et qui est généralement inactivé. ** Hétérochromatine facultative : les gènes de l´hétérochromatine facultative sont réprimés (inactivés) : Cette inactivation complète d´un segment chromosomique ne s´accompagne pas d'une altération de la structure génique. Les séquences de gènes réprimés diffèrent d’un type cellulaire à un autre. Ce ne sont donc pas les mêmes gènes qui s ´expriment d´un type cellulaire à un autre C´est un mécanisme qui provoque la différentiation cellulaire. Elle est le plus souvent gonosomique (chromosome sexuel : lentille biconvexe de 1 de diamètre) - L´euchromatine. Dans les zones dites interchromatiniennes de la microscopie optique, les fibres chromatiniennes ont la forme des filaments nucléosomiques. Elles sont actives génétiquement. Cette euchromatine formée d´ADN non répétitif est le lieu de transcription de l ´ARN messager (ARNm) et de l´ARN de transfert (ARNt) 4.2 Constitution biochimique des fibres de chromatine : structure de l'ADN. Elles sont constituées par un acide nucléique: l'acide désoxyribonucléique (ADN) et des protéines (histones, protamines et protéínes acides) l'ensemble formant un complexe nucléoprotéique (ADN + histone) difficile à dissocier. a. Définition: L'ADN est une macromolécule parfois très longue, polymères de nucléotides, constitués de deux chaines hélicoïdales antiparallèles, indispensable à la vie cellulaire puisqu'elle contient les informations (transmises de génération en génération) nécessaires à la synthèse des protéines structurales et enzymatiques. ________ 36 b) Les mononucléotides de l'ADN. Ces monomères contienent en quantité équimoléculaire, du phosphate, un pentose, le 2 désoxy-D-ribose et une base azotée à noyau cyclique. Ainsi,un nucléotide de l'ADN est formé par l'union d'un nucléoside (le 2 désoxy-Base) 2- désoxyribose-Base et d’un phosphate. Il répond à la formule générale : ________ 37 - Les bases azotées à noyau cyclique. Les bases azotées de l'ADN (mais aussi de l’ARN) dérivent de corps aromatiques hétérocycliques, la pyrimidine et la purine. Les bases pyrimidiques au nombre de trois, sont: la cytosine,la thymine et l'uracile.Seules la cytosine et la thymine entrent dans la constitution de l'ADN.Elles sont désignées par les lettres C et T. Les bases puriques sont l'adénine, désignée par la lettre A et la guanine, désignée par la lettre G. Les désoxyribonucleotides sont les seuls éléments de base de la molécule d'ADN: leur association en constitue le squelette. c) Structure primaire de l’ADN. Le brin D'ADN ou molécule monocaténaire: c'est un polymère linéaire de mononucléotides.Les quatre désoxyribonucléotides s'unissent les uns aux autres par des liaisons entre le phosphate et le désoxyribose de chacun des deux nucléotides voisins. Cette liaison phosphate réunit le carbone 3 d'un désoxyribose au carbone 5´ d'un désoxyribose adjacent: c'est une liaison 3- 5phosphodiester une base pyrique ou pyrimédique se fixe latéralement sur le carbone 1 de chaque désoxyribose. Le nombre désoxyribonucléotides peut atteindre 104 à 105 pour un brin - La molécule d'ADN. Elle comprend deux brins unis l'un à l'autre par l'intermédiaire de liaisons hydrogénes associant les bases puriques et pyrimidiques de chacune des deux chaînes. L'appariement entre les bases est exclusif; ce fait est la conséquence de la forme des molécules : il faut qu'elle soit complémentaire (complementarité stérique) pour qu'il y ait association (AT et GC). Ainsi, la molécule d'ADN à la forme d'une échelle dont les montants sont faits par la succession ________ 38 3'sucre 5'PO4 3'sucre 5'PO4 3'sucre 5' et les barreaux par l'union sucre Base Base sucre. d. Structure tertiaire de la molécule d'ADN La molécule d'ADN est formée de deux de brins hélicoïdaux anti parallèles, enroulés autour d'un axe commun : c'est une double hélice. Le pas de cette double hélice, d'une longueur de 3,4nm ; contient dix paires de désoxyribonucléotides distantes de 0,34 nm. Son diamètre extérieur est de 2nm. Sa longueur est fonction de la cellule à laquelle elle appartient. Le DNA d'une bactérie Escherichia coli à 1 mm de long et contient 4 x 106 paires de désoxyribonucléotides tandis que celui d'une cellule humaine haploïde (comme le spermatozoïde) en renferme 109 et aurait une longueur totale de 1m si le DNA des 23 chromosomes était placé ________ 39 bout à bout. Le terme d'antiparallèles s'explique de la manière suivante, le squelette du premier brin à la séquence: - phosphate (PO4) - carbone 3' du désoxyribose - carbone 5' du désoxyribose - phosphate, etc.. Soit PO4 3'5'PO4 3'5'PO4, tandis que l'autre brin a une séquence opposée à celle du premier, soit : PO4 5'3'PO4 5'3'PO4. ________ 40 VI. Cycle cellulaire (Interphase et mitose) Objectifs du cours : être capable de : - décrire les différentes étapes du cycle cellulaire - décrire la réplication de l’ADN dans les cellules procaryotes et eucaryotes - décrire le mécanisme de la transcription de l’ADN Les cellules passent par des alternances de mitoses et de phase intermitotique appelée interphase. Le cycle cellulaire est l'ensemble des modifications qu'une cellule subit entre sa formation par division de la cellule mère et le moment où cette cellule a fini de se diviser en deux cellules filles. 1. L'interphase. La plus grande partie du cycle cellulaire est occupée par l'interphase, période comprise entre la fin d'une division et le début de la suivante ; le noyau est alors mécaniquement inactif. L’interphase se décompose en une phase G1, une phase S et une phase G2. 1.1. Phase G1 La phase G1 succède immédiatement à une mitose. Sa durée est variable en fonction de la nature de la cellule étudiée (en général 5 à 10h chez les mammifères.Il n'y a pas de synthèse d'ADN au cours de cette phase période de présynthèse ou de préduplication (2n chromosomes). La phase G1 est la phase de croissance cytoplasmique. Elle est caractérisée par la synthèse des protéines. ________ 41 1.2. Phase S La durée de cette phase est relativement constante (6 à 8h). Elle est caractérisée par la réplication de la totalité de l'ADN nucléaire: la quantité d'ADN double au cours de cette phase (4n). a. Réplication de l'ADN dans les cellules procaryotes - La réplication est semi-conservatrice, chaque chromosome aurait un brin parental et un brin nouvellement synthetisé (voir schéma). Mise en évidence par expérience de MESELSON et STAHL. - La réplication est également orientée (expérience de CAVIN). La synthèse débute en un point particulier ou point d'initiation qui contient un gène initiateur (action par protéine). La zone de séparation des brins parentaux porte le nom d'œil de réplication. - La réplication est bidirectionnelle, elle s'effectue dans les deux directions à partir du point d'initiation : fourche de réplication des régions actives. La déspiralisation des spires d'ADN se fait grâce à l'hélicase (10000 spires/30mn). La progression de l'œil de réplication grace à un organe ou topo-isomérase. b.Réplication de l'ADN dans les cellules eucaryotes. La réplication dans les cellules eucaryotes est également semi- conservative, orientée et bidirectionnelle. Sa durée est de l’ordre de 400 mn et elle se fait en plusieurs sites: unités de réplications ou réplicons, qui se reproduisent pour leur propre compte. Leur longueur serait comprise, chez les eucaryotes, entre 40 et 400 åm. Le réplicon possède un système régulation autonome formé par le gène initiateur de la réplication et le point d'initiation de la réplication. ________ 42 c.Enzymes intervenant dans la réplication. Les ADN polymérases interviennent dans la sépration des deux brins l'un de l'autre et dans la réplication. Production in vitro à partir d'amorce et de précurseurs (20 fois plus) Application PCR. L'ADN polyméraseIII assure la réplication en se déplaçant de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5' c’ est à dire dans un seul sens (polarité de réplication). La synthèse se fait séparement sur chaque brin: d'abord sur le brin 1 (brin avancé ) dans le sens 3'- 5' sur une courte distance, puis sur le brin 2 (brin retardé) dans le sens 3'- 5' (puisque brins antiparalèlles); le brin retardé formant une boucle. La molécule d'ADN polymérase lit les molécules d'ADN dans le sens 3'- 5' et synthétise une molécule 5'- 3' antiparalèlle au brin précédent. Polymérisation réaction entre 3'OH d'un brin en croissance et un nucléoside 5'Triphosphate (dNTP 4) Une primase (ARN polymérase) se fixe sur le brin parental et élabore un fragment d'ARN (100 bases paires) qui amorce la duplication de l'ADN en jouant le rôle de matrice. Une ligase: la molécule initiale d'ARN l'amorce est détruite par une endonucléase. Les yeux de réplication confluent et la molécule d'ADN est repliquée dans sa totalité. - ADN polymérase I (Arthur Kornberg 1957): séparation des deux brins Réplication. - ADN polymérase II - ADN polymérase III 2 sous-unités catalytiques responsables du déplacement. Réplication. - ADN ligase : assure la liaison 5'P - 3'OH - ARN polymérase (primase). Synthèse du brin avancé et du brin retardé par l'ADN polymérase III (dimère) selon le modèle de Kornberg 1988. La réplication est discontinue pour le brin retardé. Mécanisme proposé pour la synthèse simultanée des deux brins d'ADN. En résumé, lors de la réplication interviennent: - hélicase et une protéine Single Standard DNA Binding SSB: protéine déstabiliasnt l´hélicase: qui permettent le déroulement de la double hélice. - gyrase qui introduit des supertours négatifs. - primase qui permet la synthèse d'amorces d'ARN. - DNA polyméraseIII qui poursuit la synthèse de l'ADN sur l'amorce. - DNA polymérase I qui hydrolyse les amorces et les remplace par de l'ADN. -ligase qui relie les fragments d'ADN (fragments 5' d'Okasaki): liaison 5'P - 3'OH. - désoxynucléosides Triphosphates (4) + Mg2+. 1.3. Phase G2 Plus courte d'une durée de 4 à 5 heures, elle débute dès que la réplication du DNA est achevée.Lea synthèses de RNA persistent tandis que la quantité de DNA est double de celle observée au cours de la phase G1. ________ 43 1.4. Transcription de l'ADN Elle s'effectue pendant toutes les phases de l'interphase. La transcription du DNA corespond à la synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'un seul brin d'ADN. 1.4.1 Structure des acides ribonucléiques L'ARN est un polynucléotide toujours monocaténaire. Les constituants de base des nucléotides sont les mêmes que ceux du DNA, à l'exception : - du pentose qui est le ribose, - d'une base pyrimidique, l'uracile, qui remplace la thymine toujours absente de l'ARN. - Structure primaire de l'ARN : la disposition des nucléotides de la chaine de l'ARN est la même que celle de l'ADN. - Unité de transcription : Le brin d'ADN transcrit déterminé par le sens de déplacement de l'ARN polymérase. La synthèse ayant lieu dans le sens 5'- 3' - Si l'ARN polymérase se déplace de gauche à droite synthétisant 5' - 3' c'est le brin 3'-5' qui sera copié c.à.d le brin supérieur. - Par contre si elle se déplace de droite à gauche synthétisant 3'-5',c´est le brin inférieur qui sera copié. N.B. L´ARNm est complémentaire et antiparallèle au brin trancrit (anti sens) d'où il est égal au 2ème brin ADN "sens" non transcrit en polarité et en séquence de base exception faite pour l’uracile. La transcription est suivie de la traduction des ARNm. 1.4.2 Mécanisme de la transcription C'est une enzyme, l'ARN polymérase-dépendante, qui assure la formation d'une molécule d'ARN par association des nucléotides dans un ordre prédéterminé par la molécule d’ADN La transcription s'effectue en quatre étapes - La reconnaissance du promoteur, - le début de synthèse à partir du site d'initiation, - la copie du gène, - la fin de synthèse. a) Reconnaissance du promoteur. Le promoteur est une séquence spéciale de nucléotides localisés sur l'ADN au début du gène. L'ARN polymérase se fixe sur le promoteur grâce au polypeptide sigma. b) Début de synthèse: Le side d'initiation ou site de depart de la transcription. Le début de la synthèse de l'ARN se fait à partir d'un site physiquement different du promoteur : C'est le site d'initiation. Dès que l'ARN polymérase est fixé sur ce site, le polypeptide se détache ; La polymérase assure seule la lecture et la synthèse. * Il existe : ________ 44 ARN polymérase I ou A : nucléaire pour biosynthèse des ARNr 28S et 18S ARN polymérase II ou B : chromatinienne - ARNm + Sn AR ARN polymérase III ou C : chromatinienne, pour petits RNA, 5S et 4S (ARNt) Sn AR c) Copie du gène: L'ARN polymérase "lit" un brin de la molécule d'ARN en se déplaçant dans le sens 3'-5'. La molécule d'ARN est polarisée (comme l'ADN). La transcription de l'ADN en ARN nécessite la sélection des ribonucléotides complémentaires appropriés (les précurseurs ATP, GTP, CTP, UTP) et la formation de liaisons phosphodiester entre les ribonucléotides voisins au fur et à mesure que la molécule d'ARN se déplace le long du brin. d) Fin de la synthèse. La synthèse s'achève en certains sites de la molécule d'ARN ("signaux" de fin de lecture) L'arrêt de la synthèse ne peut se faire qu'en présence d'une protéine d'un PM de 50.000d, le facteur p(rho). A la fin de la lecture, la molécule d'ARN se détache de la molécule d'ADN ainsi que l'ARN polymérase-DNA dépendante. Virus à ARN ARN (+)->chaine complémentaire appelée (-) synthetisée par RNA replicase en utilisant (+) comme matrice. La chaine (-) en son tour sert de matrice pour la synthèse d'un grand nombre de chaines (+) qui servant de messagers vont permettre la formation des protéines virales. En 1970 TEMIN et BALTIMORE ont mis en évidence la transcriptase reverse DNA polymérase. ARN dépendante qui permet la synthèse d'ADNc sur une matrice d'ARN. - Hybride DNA-RNA. - Destruction du RNA matrice - ADN polymerase synthétise la 2em chaine ADN - Double chaine ADN-ADN. 1.4.3 Les produits de la transcription de l'ADN La transcription de l'ADN aboutit À la formation de l'ARNm qui est une "copie" du gène, mais aussi de l'ARNr et de l'ARNt et de Sn ARN qui sont indispensables à la traduction de l'ARNm, mais qui ne peuvent eux-mêmes être traduits. L'ARNm récemment synthetisé apparait dans le noyau sous la forme de fibrilles périchromatiques. 1.4.4 Régulation du contrôle de la transcription Les cellules règlent leur synthèse en fonction de leurs besoins et des variations du milieu ambiant. Cette adaptation nécessite un contrôle de l'activité des gènes, qui s'effectue soit par modification de l'aptitude de l'ARN polymerase à reconnaître le promoteur, soit par action sur un site voisin du promoteur dénommé. ________ 45 VII. LE CYTOPLASME Objectifs du cours : être capable de : - Décrire les rôles et activités physiologiques du hyaloplasme et des organites du morpholasme. - Réproduire les schémas Définition: C'est l'ensemble formé par le hyaloplasme (substance cellulaire proprement dite) et les organites (morphoplasme) qui y baignent. 1. Le hyaloplasme: cytosol a) Caractères généraux C'est un gel colloidal, homogène en microscopie optique, mais hétérogène en microscopie electronique. Il comprend une matrice fondamentale, des structures granulaires (paraplasme, cristaux protéiques, enclaves de glycogène, gouttelettes lipidiques, ribosomes) et fibreuses (microtubes et microfilaments). Le Ph du cytoplasme est voisin de 6,8. Il est constitué de 85% d'eau, de protéines solubles (enzymes)ou insolubles (protéines de structure), du glycogène, des lipides, des ARN solubles (ARNm et ARNt),des sucres, des acides aminés, acides gras, sels minéraux et des nucléotides. Sa consistance est variable, soit visqueuse (gel) soit liquide (sol), différente d'un point a un autre de la cellule et elle est capable de changer rapidement en un même point dela cellule (phénomène de thyxotropie : polymérisation et dépolymérisation des filaments et des microtubes). b) Rôles et activités physiologiques. Le hyaloplasme représente la phase continue du cytoplasme dans laquelle les organites trouvent les substances nécessaires à leur métabolisme et où ils rejettent leurs déchets. Le hyaloplasme est le carrefour des voies métaboliques, c'est le lieu où s'effectuent les principales réactions biochimiques de la cellule (glycolyse, production d'ATP, voie des pentoses, NADPH, synthèse, du glycogène, synthèse protéinée de l'A.palmitique de nucléotides, AA et hexoses. 2. Le réticulum endoplasmique a. Morphologie et structure Il a été décrit par PORTER en 1945 grâce à la microscopie électronique. Il est présent dans toutes les cellules animales et végétales. Il est formé d'un ensemble de cavités limitées chacune par une membrane de 75 Ao et ________ 46 de même structure que la membrane cytoplasmique. Les cavités du RE sont de formes variables, généralement aplaties de 250 à 500  et communiquant entre elles par des connections temporaires comme celles qui constituent les vacuoles de la cellule végétale sont parfois très dilatées, d'autres forment des tubes ou des vésicules. Le RE est généralement très polymorphe (système dynamique) à l'intérieur de la cellule à l'exception de la région qui marque la frontière entre le hyaloplasme et le nucléoplasme. En effet le RE entoure complètement le noyau et forme la membrane nucléaire. Contre les membranes du RE on observe tres fréquemment des granules de 150Ao de diamètre : ce sont les ribosomes. On distingue selon qu'il existe ou non les ribosomes contre les membranes : un REG ou ergatoplasme (basophile) et un RE lisse. Tout ce système de cavités s'étend dans le hyatoplasme depuis la membrane nucléaire jusqu'à la membrane cytoplasmique avec lesquelles les parois du réticulum sont en continuité. b) Rôle. - stockage de substances dans la cellule : ces substances peuvent provenir soit du milieu extracellulaire (pinocytose et phagocytose) soit être synthétisées par la cellule. - Transport de substances : Que les substances proviennent du milieu extracellulaire ou de l'activité élaboratrice de la cellule, elles sont transportées d'un point à un autre de la cellule à travers les canalicules du RE. EX. Le transit des gouttelettes lipidiques à travers les cellules de l'épithélium intestinal. Le RE represente un compartiment cellulaire où peuvent être isolées du hyaloplasme les substances les plus variées. Le REL synthèse des composés lipidiques et le REG synthèse des composés protéiques. ________ 47 3. L'appareil de golgi IL a été mis en évidence par Golgi en 1898. Il existe dans toutes les cellules animales et végétales. a.) Structure et morphologie (microscopie électronique) voir schéma. L'Appareil de Golgi comprend deux niveaux d'organisation : La citerne ou saccule et le dictyosome. - La citerne : C'est l'unité de base du dictyosome. Elle a la forme d'un compartiment aplati, limité par des membranes lisses de 60 à 75 Ao d'épaisseur. Ce compartiment se prolonge à la péri-phérie par des tubules de 300 à 500 Ao de diamètre disposés en un réseau complexe pouvant s'étendre à plusieurs microns du bord du saccule. - Le dictyosome: C'est un système lamellaire formé par l'empile-ment de plusieurs citernes ou saccules. Le nombre de saccules par dictyosome est variable, en moyenne 5 à 8 mais peut atteindre 30. Un espace d'une épaisseur de 100 à 150 Ao sépare les differentes citernes les unes des ________ 48 autres (substance contenant des fibrilles orientées). Chaque dictyosome possède deux faces entre lesquelles se placent les citernes empilées: - Une face de formation (ou face proximale), en rapport avec l'enveloppe nucléaire ou le réticulum endoplasmique. - Une face de maturatin (face distale), en rapport avec les vésicules ou vacuoles de sécrétion (de 200 Ao de diamètre) à membrane plus épaisse 100 Ao. Les vésicules proviennent d'un bourgeonnement suivi d'une frag- mentation des bords des saccules. L'imprégnation par AgNO3 ou l'acide osmique montre que les saccules de la face formation sont chromophiles alors que les saccules de la face de maturation très dilatés sont chromophobes. Le nombre de dictyosomes est variable d'une cellule à l'autre 20. b) Rôle. L'appareil de golgi intervient: - dans le transfert et la concentration des protéines destinées à être excrétées, ex : cellules sereuses pancréatiques exocrines : protéines synthétisées dans le REG, gagnent les dictyosomes puis les grains de secrétion (grains de zymogène) - dans la formation de nouvelles membranes: La membrane nucléaire et membranes du RE à l'origine des membranes golgiennes. Les membranes golgiennes subissant des transformations morphologiques et bio-chimiques très importantes. Ces nouvelles membranes limitent les graines de sécretion, et lors de l'exocytose, elles s'incorporent à la membrane plasmique, compensant ainsi la perte de segments de membrane due à l'endocytose. - dans la synthèse des glycolipides et des glycoprotéines (Glycosylation et sulfatation) Remarque: Les cavités des saccules communiquent avec celles du RE, ainsi s'explique le passage des protéines des cavités du RE à celles de l'Appareil de Golgi où elles se concentrent. ________ 49 4. Les lysosomes Ce sont des organites découverts par De Duve 1951. Ils apparaissent sous forme de petites vésicules limitées par une membrane simple de 75Ao imperméables au contenu du lysosome (hydrolases) acides. - lysosomes primaires - lysosomes secondaires a) Lysosomes primaires Ce sont des organites cellulaires constants (sauf hématies) contenant des hydrolases qui ne sont pas encore intervenues dans le pro-cessus de catabolisme. Ils sont sous formes de corps denses, arrondis ou ovalaires. Leur diamètre vari entre 0,3 et 1,5 . Ils sont entourés par une membrane qui assure la latence enzymatique. Leur quantité varie en fonction de l'activité de la cellule dont ils dépendent. Ils sont très abondants dans les macrophages: les histiocytes, les ________ 50 granulocytes acidophiles et neutrophiles (cellules de défense de l'organisme). Les nombreuses enzymes (= 40) de ces lysosomes sont capables d'hydrolyser les acides nucléiques, les protéines, les glucides et les lipides, Optimum d'activité à Ph 5. Ex: Phophatase acide, lipase, glycosidase, protéase, RNases, DNases (desoxy-ribonucléase). La synthèse des enzymes lysosomales est realisée par les ribosomes du REG. Les enzymes gagnent ensuite l'appareil de golgi à travers les canalicules du RE. La membrane lysosomale se forme ensuite par bourgeonnement de la citerne de la face de maturation de l'appareil de golgi. Le rôle essentiel des lysosomes primaires est de contenir les hydrolases, d'en assurer le transport intracytoplasmique vers les phagosomes, de deverser leurs produits enzymatiques, soit dans les vaccuoles intracellulaires soit dans le milieu extracellulaire. b) Lysosomes secondaires. Ce sont les lysosomes intervenant dans les phénomènes de digestion cellulaire. On distingue:(schéma) - Vaccuoles hétérophagiques ou hétérophagolysosomes ou hétérolyso- some. Elle resulte de la fusion d'un lysosome primaire avec les hetérophagosomes. Elles interviennent: * dans la nutrition par digestion intracellulaire * dans la défense de la cellule: (bactérie, substoxique) * dans l'invasion des régions peu pénétrables (par lyse) - Vacuoles autophagique ou cytolysosome ou autolysosomes résultent de la fusion de lysosomes pimaires avec les autophagosomes. Elles interviennent: * dans la nutrition cellulaire au cours des conditions défavorables (jeunes, anoxie) * dans l'autodestruction des cellules mortes. *dans la régulation de la sécrétion ou crinophagie: lyse des grains de sécrétion. c) Corps résiduels. Ce sont des vacuoles provenant d'un hétérolysosome ou d'un autolysosome, danslesquelles persistent des résiduts non digérés par les enzymes lysosomales (pigments biliaires, myéline, férritine ou substance étrangère) ________ 51 b) Maladies lysosomales. - Par destruction de la membrane lysosomale * Pneumoconioses: inhalation de poussière de charbon, de silice, d'étain, de zinc: atteinte pulmonaire. * Streptococcies Les streptocoques possèdent la particularité de détruire la membrane lysosomale, ce qui entraine la mort de la cellule par libération des enzymes. la cellule morte libère à son tour les agents pathogènes dans l'organisme. *Goutte->arthrite. Phagocytose de cristaux d'Aurique (métabolisme des purines.) - Par modification génétique de la structure et de la propriété des membranes lysosomales. Maladie de chadiak-Streinbrink-higash. - formation de lysosomes géants par fusion des membranes (2 à 5 dediamètre) Splénomégalie, hépatomégalie, photophobie par surchargedes lysosomes thesaurismose. Elle peut être génétique ou acquise: absence ou mutation de cer-tains gènes -> pas de lyse de certaines molécules -> accumulation et grossissement anormal du lysosome (maladie de pompe:mort) Maladie de taysachs accumulation de glycolipides (gangliosides par manque de N-acthylhexosaminidase: ________ 52 détériorations motrices et mentales. 5. Peroxymoses 5.1. Morphologie et structure a) Peroxymoses. (Microbody) Ce sont des corpuscules de 0.5 de diamètre formés d'éléments constants (membrane et matrice) et inconstants (nucléiodes et plaque marginale). - La membrane à une structure tripartite semblable à celle de la membrane plasmique: 60 à 80 Ao. Elle est en continuité avec le REG par l'intermédiaire d'expansions tubulaires souvent sinueuses. - La matrice est homogène ou finalement granulaire. - Le nucléoide occupe le centre du peroxysome. Il est formé d'ADN diffus. Il a une structure multitubulaire. Il est absent chez les primates. - La plaque marginale. Elle a une structure plate, épaisse, linéaire disposée à la periphérie du peroxysome (8.5nm, plus épais que la membrane du peroxysome). Existe chez de nombreux primates (Foie et reins). b) Microperoxysomes. Ils ont un diamêtre est compris entre 0.15 et 0.25. La membrane a l'épaisseur du REL avec laquelle elle est en continuité. La matrice est finement granulaire ou hétérogène, ne contient jamais de nucléiode ni de plaque marginale. Les microperoxysomes se forment à partir du REL, alors que les peroxysomes proviennent du REG. 5.