Biochemische Analytik Methoden & Entwicklung PDF

# BIOCHEMISCHE ANALYTIK ## METHODEN & DEREN ENTWICKLUNG - 1850 Proteinsequenzanalyse - 1866 Mendelsche Gesetze - 1873 Mikroskopie - 1890 Kristallisation - 1894 Schlüssel-Schloss-Modell - 1906 Chromatographie - 1907 Peptidsynthese - 1923 Ultrazentrifugation - 1926 Kristallisation von Urease - 1930...

# BIOCHEMISCHE ANALYTIK ## METHODEN & DEREN ENTWICKLUNG - 1850 Proteinsequenzanalyse - 1866 Mendelsche Gesetze - 1873 Mikroskopie - 1890 Kristallisation - 1894 Schlüssel-Schloss-Modell - 1906 Chromatographie - 1907 Peptidsynthese - 1923 Ultrazentrifugation - 1926 Kristallisation von Urease - 1930 Elektrophorese - 1935 Phasenkontrastmikroskopie - 1937 Rasterelektronenmikroskopie - 1937 Krebs-Cyclus - 1941 Verteilungschromatographie - 1946 Radioisotopenmarkierung - 1946 NMR-Spektoskopie - 1948 Aminosäureanalyse - 1950 Hybridisierung von Nucleinsäuren - 1953 DNA-Doppelhelix - 1953 Gaschromatographie - 1959 PAGE - 1959 Analytische UZ - 1960 Röntgenstrukturanalyse - 1961 Chemiosmot. Hypothese - 1963 Festphasen-Peptidsynthese - 1966 Isoelektrische Fokusierung - 1967 Automatische Proteinsequenzanalyse - 1972 Genkionierung - 1972 Restriktionsanalyse - 1974 HPLC von Proteinen - 1975 Monoklonale Antikörper - 1975 Southern-Blotting - 1976 DNA-Sequenzanalyse - 1975 2D-Elektrophorese - 1981 Ortsspezifische Mutagenese - 1981 Kapillarelektrophorese - 1982 Transgene Tiere - 1982 Rastertunnelmikroskopie - 1983 ansche Oligosynthese - 1985 - 1986 Ase-Kettenreaktion - 1986 Alonkretimikroskopie - 1987 & MALDI-MS ## Wichtigste methodische Entwicklungen ### Flussschema Bioanalytik **(Zahlen in Kreisen weisen auf Kapitel des Buches hin)** | | | | :---------------------- | :------------------------------------ | | **Zellen/Gewebe** | Isolierung und Reinigung (21) | | | Chromatographie (9, 10, 11, 22) | | | Elektrophorese (10, 11, 22) | | | Spektroskopie (7) | | **Proteine** | Proteinbestimmungen | | | enzymatische Aktivität (4) | | | chemische Modifikationen (6) | | | Spaltungen | | **Immunologie** | (5) | | | Aminosäurenanalyse (12) | | | Sequenzanalyse (13) | | | Massenspektrometrie (14) | | | synthetische Peptide (18) | | **Kohlenhydrate** | (19) | | **Lipide** | (20) | | **Nucleinsäuren** | Hybridisierung (23) | | | Restriktionsanalyse (22) | | | Amplifikation | | | Sequenzierung (25) | | | PCR (24) | | | Nucleotidsequenz | | | DNA-Modifikationen (26) | | **Funktionsanalytik** | Genkartierung | | | Proteomanalyse (29) | | | differenzielle Genaktivität (32) | | | Expressionsanalyse (33) | | | Protein-Protein-Wechselwirkungen (34, 35) | | | Protein-DNA-Wechselwirkungen (27) | | | Genfunktion | | | molekulare Cytogenetik (30) | | | physikalische und genetische (31) | | | gezielte Genmodifikation (36) | | | Antisense-Techniken (37) | | | Überexpression (38) | ### Vergleich der Phänotypen #### Vergleich der Organellen | | | | :---------- | :------------- | | **Proteine** | Expressionsmuster | | **Lipide** | Lipidmuster | | | Fettsäureverteilung | | **Kohlenhydrate** | | | **DNA** | Expressionsmuster | ## DAS PROTEOM – PROTEİN ANALYTIK ### TRENN METHODEN - **Zellen** - Zentrifugation - Pulsfeldgelelektrophorese - **Organellen** - DNA - Oligonucloetide - Nucleotide - Peptide - Proteine - Aminosäuren - **Membranen** - Affinität - SEC - HIC - IEC - RPC Chromotographie - CE 1D - 2D-Elektrophorese ### REINIGUNGS STRATEGIE #### Intrazellulare Proteine - Zelldisruption - Inclusion Bodies - Abtrennung von unlöslichem Material - Isolierung - Renaturierung - Extrazelluläre Proteine - Zelldisruption - Abtrennung von unlöslichem Material - Abtrennung von unlöslichem Material - Renaturierung #### Lipide - Proteasen - große Proteinmengen #### Renaturierungsprobleme - niedrige Ionenstärke - Chromatographische Verdünnt - geringe Proteinmengen #### Das Ziel der Reinigung bestimmt die Methoden Auswahl ### ERSTE REINIGUNGSCHATTE ES FALLUNG #### Die Hofmeister-Serie | Anionen | Cationen | | :---------- | :-------------- | | PO42- | NH4+ | | SO42- | K+ | | CH3COO- | Na+ | | CF31- | C(NH2)3+ | | | (Guanidin) | | | Br-* | | | NO2-* | | | CIO-* | | | Г-* | | | SCN-* | #### FALLUNG mit ORGANISCHEN LOSUNGSMITTELN - ELOH - Aceton #### FALLUNG MIT TCA (3-4% END KONZENTRATION) #### FALLUNG VON NUCLEIN SAUREN - POLYANIONED ! (POLYAMINE, PROTAMINE) ### DETERGENZIEN FÜR DIE PROTEIN REINIGUNG - **Die Pölle der** - Detergenz < CMC < CDetergenz #### Bildung von Detergenznicellen oberhalb der CMC und Einbau von Proteinen in die Micellen - In der Micelle sind die hydrophilen polaren Teile nach außen zur wässrigen Phase gerichtet und die hydrophoben Teile nach innen. - Membranproteine können sich in solche Micellen einlagern und als Detergenz-Proteinkomplex in Lösung gehalten werden. ### SOLUBILISIERUNG VON MEMBRAN PROTEINEN - **Problem der Entfernung bei weiteren Reinigungen Schritten** ## MATRIX PROBLEM ### PROTEASEN PROBLEM | Substanz | Konzentration | Inhibitor von | | :---------------------------- | :------------- | :-------------- | | Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) | 0,1-1 mM | Serinproteasen | | Aprotinin | 0,01-0,3 μM | Serinproteasen | | ε-Amino-n-capronsäure | 2-5 mM | Cysteinproteasen | | Antipain | 70 μM | Aspartatproteasen | | Leupeptin | 1 μM | Aspartatproteasen | | Pepstatin A | 1 μM | Aspartatproteasen | | Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | 0,5-1,5 mM | Metalloproteasen | ## AUF SCHLUSS - EINE AUSWAHL HILFE ### Biologische Ausgangsmaterialien und Aufschlussmethoden | Material | Aufschlussmethode | Bemerkungen | | :----------- | :------------------------------ | :------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- | | Bakterien | enzymatisch mit Lysozym | haben Peptidoglykan-Zellwand | | grampositiv | EDTA/Tris | macht Zellwand permeabel | | gramnegativ | French-Presse | mechanische Zerstörung der Zellwand | | Hefen | mechanisch mit Glaskugeln | für große Mengen wegen lokaler Überhitzung ungeeignet | | | Einfrieren-Auftauen | 24-28 h mit Toluol | | | Ultraschall | mehrfach, da ineffizient | | | Autolyse | gute Effizienz | | Pflanzen | French-Presse | Protease-Inhibitoren zufügen | | | mechanisch mit Glaskugeln | hoher Protease-Gehalt in Pflanzen | | | enzymatisch mit Zymolase | Polyvinylpyrrolidon | | | Messerhomogenisator | kalter Homogenisierungspuffer | | | + DTT | | | | + Phenoloxidase-Inaktivatoren | | | | + Protease-Inhibitoren | | | | Zermahlen in flüssigem Stickstoff | | |faserige Gewebe | Zermahlen, eventuell nach Trocknen | | | nicht-faserige Gewebe | Osmolyse mit hypotonischem Puffer | | | Höhere Eukaryonten | Pressen durch Sieb | | | Zellen, die in Suspensionskultur wachsen | Wiederholtes Pipettieren der Suspension | sehr empfindliche Zellen | | faserige Zellen | Zerkleinern | Protease-Inhibitoren zufügen | | Muskelgewebe | Kleinschneiden, Fleischwolf | schwierig aufzuschließen | ## PROTEİN BESTIMMUNG - EINE ÜBERSICHT ### Übersicht der verbreitetsten Färbemethoden zur Proteinbestimmung | Methode | ungefähr benötigtes Probevolumen (in mL) | Nachweisgrenze (µg Protein mL-1) | spektraler Absorptionskoeffizient* | | :------------- | :------------------------------------ | :------------------------------ | :--------------------------------- | | Biuret-Assay | 1 | 1-10 | 2,310-4 A550 | | Lowry-Assay | 1 | 0,1-1 | 1,7-10-2 A650 | | (modifiziert nach Hartree) | | | | | Bicinchoninsäure-Assay | 0,1 | 0,1-1 | 1,5-10-2 A562 | | Bradford-Assay | 0,1 | 0,05-0,5 | 4,0.10-2 A595 | * mit dem Standardprotein Rinderserumalbumin ### Übersicht der gängigsten spektroskopischen Proteinbestimmungsmethoden | Methode | Proteinbestandteil, auf den der Nachweis maßgeblich basiert | Nachweisgrenze (µg Protein mL-1) | Abhängigkeit von Protein-zusammensetzung | Stör-anfälligkeit | | :------------ | :---------------------------------------------------- | :------------------------------ | :-------------------------------------- | :--------------- | | Photometrisch: | | | | | | A280 | Tryptophan, Tyrosin | 20-3000 | stark | gering | | A205 | Peptidbindungen | 1-100 | wenig | hoch | | Fluorometrisch: | | | | | | Tryptophan (Tyrosin) | | 5-50 | stark | gering | ### Molare spektrale Absorptionskoeffizienten (s) bei 280 nm und Absorptionsmaxima von aromatischen Aminosäuren* | Aminosäure | $\epsilon$.10-3 (L mol-1 cm-1) | Absorptionsmaxima bei 280 nm in nm | | :---------- | :------------------------------ | :-------------------------------- | | Tryptophan | 5,559 | 219, 279 | | Tyrosin | 1,197 | 193, 222, 275 | | Phenylalanin | 0,0007 | 188, 206, 257 | * Angabe für wässrige Lösungen bei pH 7,1 ### Maximal zu verwendender Konzentrationsbereich von störenden, häufig in der Proteinchemie verwendeten Zusätzen bei der A205- und A280-Methode* | Zusatz | A205-Methode | A280-Methode | | :------------------------- | :------------- | :---------------- | | Ammoniumsulfat | 9% (w/v) | >50% (w/v) | | Brij 35 | 1% (v/v) | 1% (v/v) | | Dithiotreitol (DTT) | 0,1 mM | 3 mM | | Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | 0,2 mM | 30 mM | | Glycerin | 5% (v/v) | 40% (v/v) | | Harnstoff (Urea) | <0,1 M | >1 M | | KCI | 50 mM | 100 mM | | 2-Mercaptoethanol | < 10 mM | 10 mM | | NaCl | 0,6 M | > 1 M | | NaOH | 25 mM | > 1 M | | Phosphatpuffer | 50 mM | 1 M | | Saccharose | 0,5 M | 2 M | | SDS (Natriumdodecylsulfat) | 0,1% (w/v) | 0,1% (w/v) | | Trichloressigsäure (TCA) | <1% (w/v) | 10% (ww) | | TRIS-Puffer | 40 mM | 0,5 M | | Triton X-100 | <0,01% (v/v) | 0,02% (v/v) | * Aus: Stoscheck, C. M. Quantitation of Protein. Methods Enzymol. 182 (1990) 50-68. ## ZENTRIFUGATION ### Wie sedimentiert ein Partikel - **Zentrifugalkraft** - $G = w^2.r$ - $RCF = \frac{G}{g}$ - $g = 9,81 \frac{m}{s^2}$ - $w = \frac{2. \pi. U_{min}}{60}$ - $RCF = 1,11 \times 10^{-5}. (\frac{U}{min})^2. [r] = \frac{g}{g}$ - **Teilchen mit Dichte S_p, Radius M_p in Lösung S_l** - $F = \frac{4}{3}\pi r^3 (S_p-S_l) w^2.r$ - $f_0 = 6 \pi \eta r v_0$ - $F = f_0$ => $\frac{4}{3}\pi r^3 (S_p-S_l) w^2.r = 6 \pi \eta r v_0$ - $v_0 = \frac{2}{9} (\frac{S_p-S_l}{η}). w^2.r$ - $v_0$ abhängig von $(S_p-S_l)$, $w^2$, $r$, $\eta$, $r^2$ ### ELEKTROPHORESE IM ELEKTUSCHEN FELD - **Trennung** - $F_e = qE$ - $T_p = f_e v$ - $F_c = T_e$ => $qE = f_c v$ - $v = \frac{qE}{f_c}$ - $v = \frac{μ}{E}$ µ = Mobilität - **Für Kugeln: (Stokes' Gesetz)** - $v_0 = \frac{fe}{6\piηr}$ - $r$ = Teilchen Radius - η = Viskosität der Lösung ### GELE FÜR ELEKTROPHORESE #### Agarose - ungiftig - Porengrösse > 500 kDa #### Problem ELEKTROPHORESE mit AGAROSE - Elektrophorese #### POLY ACRYLAMID - Monomere - toxisch! - Porengröße < 800 kD - Stabilität ### ISOELEKTRISCHE FOKUSIERUNG - Trennung nach IEP - $R-COO^- + H^+$ $⇌$ $R-COOH$ - $R-NH_3^+ + OH^-$ $⇌$ $R-NH_2$ - $\Delta PI = D[\frac{d(pH)}{dx}] $ - $E = \frac{dU}{d(pH)} $ - D = Diffusionskoeffizient - E = Feldstärke - **pH-Gradienten** - 1) Trägersystem Polylyte - $CH_2-N(CH_2)_n-N-CH_2 -$ - $(CH_2)_x$ - $NR_2$ - $COOH $ - x = 2,3 - R = H-CH_3 - **Unterschiede in IEP's** - Puffer Kapazität an IEP hoch - niedrige Molekular - Leitfähigkeit ## 2D - ELEKTROPHORESE - TRENN LEISTUNG POTENZIERT SICH - 1) IEF - 1. Dimension - 2) SDS-PAGE - 2. Dimension - **Ablauf:** - Spannungs steigern bis 1500 volt - Probe soll in salzarmen Puffer vorliegen. - dauert meist über Nacht, IEF durchzuführen. - **Durch 2 Trenn Verfahren** - **IEF-Gel** - **SDS-Gel** ### Hochauflösende 2D-Elektrophorese mit Trägerampholyten 1. Vertikale IEF in Rundgelen 2. Entnahme des IEF-Gels zur Äquilibrierung mit SDS-Puffer 3. Transfer des IEF-Gels auf das vertikale SDS-Gradientengel 4. Fixierung des Rundgels mit heißer Agaroselösung. - Nach: Anderson N. G. und Anderson N. L. Anal. Biochem., 85 (1978) 331-340. ### Färbung: COOMASSIE BLAN ### ANSWERTUNG - SILBER-FARBUNG - 2000-6000 SPOTS! - **Proteom Analyse** - **Expressions Huster** ## 3D ELEKTROPHORESE - **ganze Proteome analysieren** - **1st Dimension: Isoelectric Focusing** - IPG 7-10 - pH 3 - pH 10 - **gel rod rebuffered in SDS buffer** - **2nd Dimension: SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis** - **Färbung: Coomasie** - **Silver: empfindlicher** ### High-resolution horizontal 2D electrophoresis of basic proteins from yeast cell lysate (Saccharomyces cerevisiae). - Immobilized pH-gradient in the first-dimension run (IPG-Dalt). - 2nd dimension is a horizontal SDS porosity gradient gel. - Silver staining according to Merill et al. (1981). - By kind permission of Professor A. Görg (1988b). ### uverschmieren wenn Proteine Modifikationen haben ## 2D ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN ### Hochauflösende 2D-Elektrophorese mit immobilisierten pH-Gradienten: Horizontale IEF im auf Folie polymerisierten IPG-Streifen. - Äquilibrieren des IPG-Streifens mit SDS-Puffer. - Transfer des IPG-Streifens auf ein horizontales oder vertikales SDS-Gel. - Nach: Görg A. et al., Electrophoresis, 9 (1988) 531-546. ### Hochauflösende 2D-Elektrophorese (IPG-Dalt) von Mäuseleberproteinen 1. Dimension: IPG 4-9; 2. Dimension SDS-Elektrophorese, Silberfärbung. - Die Protein-spots rechts vom Pfeil (pl >7,5) sind mit der Trägerampholyt-2D-Elektrophorese auf Grund der Kathodendrift nicht oder nur mit der NEPHGE darstellbar. - Aus: Görg A. Biochem. Soc. Trans., 21 (1993) 130-132. ## SILBER FARBUNG - **10-100 x emfindlicher als COOMASSIE-BLAU** - **AUFWENDIG** ### Silber staining | Step | Solution | V (mL) | min | | :------------- | :------------------------------------------------------------------ | :------ | :-- | | Fixing | 300 mL ethanol + 100 mL acetic acid + H2Odigst → 1 000 mL | 250 | >30 | | Incubation | 75 mL ethanol*) | 250 | 30 | | | + 17,00 g NaAc | | | | | + 1,25 mL glutaraldehyde (25% w/v) | | or | | | + 0.50 g Na2S2O3 × 5 H2O + H2Odigst → 250 mL | | overnight | | Washing | H2Odigst | 3 × 250 | 3 × 5 | | Silvering | 0.5 g AgNO3**) | 250 | 20 | | | + 50 µL formaldehyde (37% g/v) + H2Odigst → 250 mL | | | | Development | 7.5 g Na2CO3 + 30 µL formaldehyde (37% w/v) + H2Odigst → 300 mL | 1 × 100 | 1 | | | if pH >11,5, titrate to this value with NaHCO3 solution | | 3 to 7 | | Stopping | 2.5 g glycine + H2Odigst → 250 mL | 250 | 10 | | Washing | H2Odist | 3 × 250 | 3 × 5 | | Preserving | 25 mL glycerol (87% g/v) + H2Odigst → 250 mL | 250 | 30 | | Drying | air-drying (room temperature) | | | ***)** First dissolve NaAc in water, then add ethanol. Add the thiosulfate and glutaraldehyde just before use. ****) Dissolve AgNO3 in water, add the formaldehyde before use. ### BLAU TONEN (f. BECSERE LIVE WRITUT) - Beruner blan - **WASCHEN IN H2O BIDEST 2-3x** - **2 min TONEN:** - 140 µL #20 - + 20 mL 5% Fellz + - 10 mL 3% OxalSäure + - 20 mL 3,5% K-HEXACYANOFERRATE - **um gat zu vergleichen: dede Färbungen-, Fluorene fortshofle 2 + standard mit laufen --- hohe dymenische Bereich** ## 2-D- Elektrophorese mit Fluoreszenz Markern - **Die Proteine werden vor der Elektrophorese mit Fluorophoren kovalent gekoppelt:** - **Aminogruppe markieren** - problem Aminogrupnen beeinflusse IEP - **Durch die Verwendung des internen Standards und jeweils 2 Proben pro Gel ist die Vergleichbarkeit der Proteinexpression wesentlich verbessert:** - Standard: Mischung aus Kontrolle und Probe - Pooled internal standard - Label with Cy2 - Protein extract 1 - Label with Cy3 - Protein extract 2 - Label with Cy5 - Mix labelled extracts - 2-D separation - Image gel with Typhoon Variable Mode Imager - Image analysis and data quantitation with DeCyder Differential Analysis Software - mit Software aus verlem aber seh-temer - Gel A - Gel B ### Gel-to-gel variation or induced biological change? ## BLUE NATIVE GEL PAGE - **COMMASSIE BLUE** - liornfärben - wenn nicht mit SDS behandelbar - über nimmt die AUTRABE vou SDS als DETERGENZ - bevor Probe auf Gel andgetragen wird ### PULSED FIELD ELPRO - sriompeld anliegen - DNA fält in Ztch Zack durch gel - wlind nach curzer zeit ungeport - **Problem** - große Dova moleküle mit Gel auftremen - weil Dova kravel sich entwinder und zerzerren sung geht - zhikshan Aganore Langeln durch ### Field lines and separation results for two types of PFG electrophoresis - **left orthogonal doubly inhomogeneous fields and right homogeneous fields for hexagonally arranged point electrodes.** ## BLOTHING - WESTERN BLOTHING - **1) TRANSFER AUF MEMBRAN** - **FOR** - IMMUNO BLOTS - MS- ANALYSE - **(23 MALDI TOF)** - **ENZYMATISCHE HYDROLYSE** - **SEQUENZIERUNG** - **MEMBRAN AUSWAHL !** ### NC-MEMBRAN - hat eine große Innere Oberfläche ### PLDF-MEMBRAN - hat eine große Innere Oberfläche ### PP-MEMBRANEN - **Rasterelektronische Aufnahmen von Blotmembranen** - A: Immobilon P. - B: Westran. - C: Fluorotrans. - D: Selex 20. (10 μm entspricht 10 μm). ### Semidry-Blotting - Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere gelegt, die mit Puffer getränkt sind. ### Blotting-Tank für elektrophoretische Transfers der getrennten Proteine auf immobilisierende Membranen - Die mäanderförmig verlaufenden Elektrodendrähte sind an der vorderen und der hinteren Wand angebracht. - Das Gel und die Membran werden zwischen Filterpapiere, Schwämme und Gitter eingeklemnt. ### Blotmembran als Interface zwischen PAGE und anschließenden proteinanalytischen Verfahren ### Edman-Sequenzierung - Kapitel 13 ### Aminosäurenanalyse - Kapitel 12 ### Massenspektrometrie - Kapitel 14 ## Spezifische Oberflächen und Dicken von kommerziellen Blotmembranen - Die Membranen bestehen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polypropylen (PP) oder aus silikonisierten Glasfasern (SGF) - **Membran** - **Firma** - **Material** - **Oberfläche in m²** - **Dicke in µm** - **Trans-Blot** - Biorad - PVDF - 2900 - 140 - **Immobilon PSQ** - Millipore - PVDF - 1900 - 195 - **Fluorotrans** - Pall - PVDF - 1600 - 140 - **Selex 20** - Schleicher&Schüll - PP - 900 - 145 - **SM 17507** - Sartorius - PP - 880 - 150 - **SM 17506** - Sartorius - PP - 810 - 160 - **SM 17558** - Sartorius - PP - 610 - 100 - **Westran** - Schleicher&Schüll - PVDF - 570 - 150 - **Immobilon P** - Millipore - PVDF - 380 - 130 - **Glassybond** - Biometra - SGF - 130 - 315 ## Porengröße und Porenverteilung von Blotmembranen - **Membran** - **Porengröße in µm** - **minimale Porengröße in µm** - **mittlere Porengröße in µm** - **maximale Porengröße in µm** - **Volumen aller Poren in %** - **SM 17558** - 0,10 - 0,107 - 0,223 - 0,136 - 62,1 - **Immobilon PSQ** - 0,10 - 0,169 - 0,447 - 0,248 - 78,1 - **Selex 20** - 0,20 - 0,190 - 0,533 - 0,269 - 72,0 - **SM 17507** - 0,20 - 0,203 - 0,655 - 0,278 - 70,4 - **Trans-Blot** - 0,20 - 0,225 - 0,532 - 0,315 - 75,2 - **Fluorotrans** - 0,20 - 0,232 - 0,572 - 0,333 - 77,1 - **SM 17506** - 0,45 - 0,323 - 0,880 - 0,393 - 80,1 - **Immobilon P** - 0,45 - 0,517 - 1,136 - 0,692 - 68,4 - **Westran** - 0,45 - 0,571 - 1,361 - 0,779 - 62,7 - **Glassybond** - >> - 1,921 - 7,263 - 2,296 - 93,3 - Aus Eckerskorn Ch. et al., Electrophoresis 14, 831-838 (1993) ## PROTEIN MODIFIKATIONEN - **REAKTIVE GRUPPEN** - $NH_2$ Histidin, Lysin - COOH Säure AS - SH Cystein - S-C13 - AROMATISCHE A.S. (Phe, Trp, Tyr) - **$NH_2$** ### Acylierung von Proteinen mit Acetanhydrid oder N-Hydroxysuccinimidessigester - **Protein-NH_2** + - $CH_3-C-O-CH_3$ - $O=C-O-N$ - $CH_2-C-CH_3$ - **Protein-NH-C-CH_3 + CH_3COOH** - **Protein-NH_2** + - $H_3C-C-O-N$ - $CH_3-C-CH_3$ - **Protein-NH-C-CH_3** ### Aminidierung mit einem Imidoester - **Protein-NH_2** + - $NH_2$ - $R-O-C-NH$ - $CH_3$ - **Protein-NH-C- + R-OH** ### Reduktive Alkylierung - Aminogruppen reagieren mit Aldehyden zu Schiffschen Basen, die mit Borhydriden zu stabilen Alkylaminen reduziert werden können. - **Protein-NH_2** + - $R-C-H$ - $Protein-NH-CHOH-R$ - $Protein-N=CH-R$ - $Protein-NH-CH_2-R$ ### Aldiminbildung mit Pyridoxal-5'-phosphat und anschließ