Ayudantía Clase 23: Biología Molecular de Células Madre - PDF

Ayudantía Clase 23: BIOLOGÍA MOLECULAR DE CÉLULAS TRONCALES Fabián Rivera Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile Desarrollo Embrionario El oocito fertilizado generará el embrión, comienzan a ocurrir procesos de división cel...

Ayudantía Clase 23: BIOLOGÍA MOLECULAR DE CÉLULAS TRONCALES Fabián Rivera Curso de Biología Molecular 2024 Facultad de Ciencias, Universidad de Chile Desarrollo Embrionario El oocito fertilizado generará el embrión, comienzan a ocurrir procesos de división celular. Cuando alcanza el estado de 8 células (blastómeros) ocurre la compactación, donde se pierden los bordes de las células. Luego de esto, en estadio de mórula (16-32 células) comienzan a polarizarse las células, algunas quedan hacia dentro y otras al exterior. Oocito fecundado y células de las primeras divisiones (hasta mórula) tienen la capacidad de generar un organismo completo. Por lo tanto, estas células son TOTIPOTENTES. Desarrollo Embrionario Células van a “diferenciarse” en aquellas que quedarán hacia el exterior y el interior. Determinando las que formarán el trofoectodermo y la masa celular interna (MCI). Células del MCI pueden originan las 3 capas germinales embrionarias (ecto-, meso- y endodermo), dejan de ser totipotentes a ser PLURIPOTENTES, porque ya no pueden generar anexos embrionario (trofoectodermo). La cavidad blastocélica se forma por secreción de fluidos desde el trofoectodermo, importante para el movimiento de células.  Extra En el estado mórula, antes de la de cavitación, las células que quedarán al exterior e interior presentan regulaciones diferenciales de genes importantes para permitir capacidad de células de generar organismo completo (o los anexos embrionarios) Durante la compactación la expresión de proteínas de adhesión es indispensable. Dentro del MCI se diferencian dos poblaciones estocásticamente, que se diferencian por la expresión de diferentes factores transcripcionales. Desarrollo Embrionario Las células del MCI tienen la capacidad de formar todos los linajes celulares que conformarán al embrión (las 3 capas germinales). A medida que se van diferenciando para formar los distintos tejidos embrionarios pierden su capacidad de diferenciarse en otros linajes, adquirieron la capacidad entonces de diferenciarse a un sólo linaje (MULTIPOTENTES). Entonces estas células indiferenciadas que tienen la capacidad de proliferar para generar un organismo completo y diferenciarse en distintos tipos Células troncales: células no celulares son las CÉLULAS diferenciadas que pueden generar TRONCALES. células hijas que se van a diferenciar. Potencial de Diferenciación Durante el desarrollo las células se van diferenciarse a distintos tipos celulares y por lo tanto a estructuras/funciones diferentes, perdiendo en el proceso la capacidad de originar otros tipos de células. De esta manera a medida que el organismo se desarrolla las células pierden esta capacidad proliferativa que posee oocito recién fertilizado y adquieren un fenotipo cada vez más diferenciado.  Características Células Troncales Generan los diferentes linajes germinales y a partir de ellos todas las células y tejidos que componen organismos. Son capaces de autorrenovarse y diferenciarse a tipos celulares especializados. División Simétrica Al comienzo del desarrollo embrionario las células troncales se someten a una división celular simétrica y da lugar a dos células idénticas que tienen el mismo potencial de diferenciación. División Asimétrica Células se dividen de forma asimétrica, por distribución asimétrica de los componentes celulares, que llevan a que la célula comprometida tenga un perfil transcripcional (y epigenético) diferente al de la célula troncal (cuyo perfil le permite seguir teniendo esta capacidad de autorrenovación y seguir generando células hijas).  Potencial de Diferenciación División Asimétrica Esta célula tiene características diferentes y se denomina célula progenitora. Esta sigue teniendo la capacidad devidirse (un número finito de veces) pero va a seguir el camino de la diferenciación. La célula está comprometida hacia un destino celular, este camino es “irreversible”. Por esto, el pool de células troncales disminuye durante el desarrollo, ya que comienzan a formarse células diferenciadas. Se habla de que el pool de células troncales alcanza una cantidad crítica que lleva a la formación de células progenitoras. Potencial de Diferenciación Estos cambios en la capacidad autorrenovativa y de diferenciación de las células troncales, está dada por cambios nivel transcripcional. Métodos de Tranfección Pregunta: ¿Cómo las células en el contexto del desarrollo embrionario “saben” que deben diferenciarse?  Potencial de Diferenciación Estos cambios en la capacidad autorrenovativa y de diferenciación de las células troncales, está dada por cambios nivel transcripcional. Durante el desarrollo embrionario, las células se encuentran en un CONTEXTO muy específico, lo solemos llamar microambiente, a las propiedades fisicas/mecánicas, A medida que las células se dividen, sufren cambios químicas y biologicas en en la interacción entre ellas, en gradientes las que se encuentran las químicos (como O2) y fuerzas mecánicas. Esto se células. censa por las células y lleva a cambios celulares que se traducen en cambios en la expresión de genes (y por lo tanto en la estructura de la cromatina), cambios que llevan a las células a modificar sus funciones (diferenciarse).  Potencial de Diferenciación Los cambios a nivel transcripcional se suelen dar por la acción de factores transcripcionales maestros. Los cuales son capaces de inducir un programa genético característico de la “troncalidad” de la célula. Por ejemplo, Oct-4 es un factor de transcripción maestro de pluripotencia. Este regula la expresión de otros genes de pluripotencia como Sox2, Klf4 y Nanog. Muchos de los factores transcripcionales maestros, permiten el reclutamiento de factores remodeladores de la estructura de la cromatina. Por lo que cambios en el perfil transcripcional se debe en gran parte por cambios a nivel epigenético. Y no solo cambios en las histonas, sino tambien metilaciones en el DNA (muy importante). Extra  Potencial de Diferenciación Los cambios en el perfil epigenético de las células suelen llevar a cambios transcripcionales, que gatillan cambios en la capacidad de diferenciación de las células troncales.  Métodos de Tranfección Pregunta: ¿Qué metodologías podemos usar para ver cambios a nivel epigenético’  Potencial de Diferenciación TECNICAS: Los cambios en el perfil RNA-seq permite ver transcripción epigenético de las células Chip-seq permite ver cambios a nivel suelen llevar a cambios de modificación histonas (cambios transcripcionales, que gatillan perfil epigenético). cambios en la capacidad de Chip-seq contra metilaciones o bien diferenciación de las células secuencación por PacBio. troncales. Células Madre Embrionarias (ES) Se originan a partir de la masa celular interna (MCI) del blastocisto en un estadío previo a la implantación en la pared uterina. Son pluripotentes (dan origen a 3 capas germinales embrionarias). Características definitorias: Son clonogénicas: una sola célula madre embrionaria puede originar una colonia de células genéticamente idénticas, o clones, que tienen las mismas propiedades que la célula original. Expresan factores de transcripción maestros (genes de la pluripotencia) como son Oct-4, Nanog, sox2 que activan o inhiben genes diana y mantienen las células madre embrionarias en un estado de proliferación, no de diferenciación. Pueden inducirse para continuar proliferando o diferenciarse.  Células Madre Embrionarias (ES) Preparación ES Inicialmente las células del MCI se crecían sobre una monocapa de fibroblastos irradiados de ratón. Estas células proporcionan los factores tróficos que permiten el crecimiento de las células. Luego se identificó que LIF (factor inhibidor de leucemia) es uno de los factores producidos por los fibroblastos y mantiene la proliferación de las células. Permitiendo así suplir el uso de monocapa y suero para el cultivo de las ES.  Células Madre Embrionarias (ES) Cómo conocer si células son efectivamente pluripotentes 1. Formación de Quimeras: Inyectar células en blastocisto y transferir la combinación a una hembra pseudopreñada. Esto sirve para demostrar que la célula es pluripotente al poder aportar a la formación de un organismo completo. 2. Formación de teratomas: Inyectar las células madre en ratones genéticamente idénticos o inmunodeficientes. Teratoma refiere a tumor derivado de línea germinales en vez de sacar un espermios u oocitos. Células Madre Embrionarias (ES) Cómo conocer si células son efectivamente pluripotentes 3. Formación de cuerpos embrionarios: Permitir a las celulas madre diferenciarse espontaneamente o dirigir su diferenciación a lo largo de las vías específicas.  Células Madre Somática Son células indiferenciadas (no especializadas) que se encuentran en un tejido diferenciado (especializado) Pueden renovarse a sí mismas y convertirse en células especializadas Son multipotentes  Células Madre Somática Células Troncales de la Médula Ósea En la misma medula osea hay estroma con células troncales mesenquimáticas que apoyanna las células troncales sanguíneas o hematopoieticas.  Células Madre Somática Células Troncales Células Troncales Mesenquimales Hematopoiéticas El tejido conectivo (o estroma) rodea los organos y contiene este tipo de células que se encuentran durante toda la Son células que se renuevan y generan vida adulta. progenitores (linaje sanguineo o inmune) que luego generan progenitories multipotentes que se diferencian a un solo tipo celular (Linfocito B, T, NK, eritrocito, etc). Células Madre Somática El cordón umbilical al igual que la medula ósea posee células troncales mesenquimaticas y hematopoieticas. Aunque están en el mismo espacio “físico”, estas células poseen propiedades diferentes entre sí.  Células Madre Somática Células Troncales Neurales Precursores del sistema nervioso, progenitores generan glia o neuronas. Estas células desaparecen casi completamente y quedan solo restos en el hipotalamo.  Células Madre Somática Células Troncales Neurales En el contexto del desarrollo del cerebro y el organismo en general, el crecimiento y diferenciación de las células no ocurre de manera aislada, sino que involucra una serie del procesos en donde las células deben interaccionar entre ellas y el ambiente que conforman y las rodean. Células Troncales Pluripotentes Inducidas (IPS) Las marcas epigenéticas ayudan a permitir la expresión de subconjuntos específicos de genes en cada tipo celular durante la diferenciación y el desarrollo. Las células diferenciadas se vuelven más restringidas en su potencial: La metilación del ADN es establecida por las metiltransferasas de novo, DNMT3a y DNMT3b en mamíferos. La metilación del ADN diferencia las células madre embrionarias totipotentes de las células madre adultas multipotentes. Reversión a la pluripotencialidad IPS (Reprogramación nuclear) Célula Célula troncal Todas las células de un organismo tienen un mismo somática genoma por lo tanto todas tienen el mismo potencial de pluripotencialidad. Introdujo vectores virales los TF maestros de la pluripotencia y transfectó células somáticas (fibroblastos) logrando la expresion de estos en varios pasos de selección hasta conseguir un perfil pluripotente. En la clonación, el núcleo somático transferido al ovocito enucleado es reprogramado por el entorno del óvulo, lo que altera su perfil de expresión La IPS comparten las génica. Esta reprogramación permite que el núcleo mismas propiedades adquiera un nuevo perfil de diferenciación, recuperando la capacidad de dirigir el desarrollo que las células de todos los tipos celulares necesarios para embrionarias. formar un organismo completo. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka. CELL August 2006 Células Troncales Pluripotentes Inducidas (IPS) El concepto de diferenciación estable más que terminal. Características en común entre la reprogramación nuclear y el desarrollo: Vemos como la célula reprogramada vuelve a “rejuvenecer” Transdiferenciación: La reprogramación celular permite la transdiferenciación y desdiferenciación mediante factores inductivos. La desdiferenciación con factores Yamanaka (4F) promueve rejuvenecimiento epigenético, mientras que la transdiferenciación no revierte marcas epigenéticas. La reprogramación a células madre pluripotentes inducidas (iPSC) puede causar teratomas, limitando su uso. La modulación temporal de 4F puede inducir rejuvenecimiento epigenético sin cambiar completamente la identidad celular. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka. CELL August 2006  Células pluripotentes Pregunta: Considerando que las células cancerígenas comparten características con las células pluripotentes ¿Cómo se relaciona con la reprogramación nuclear? Extra: células troncales y cáncer (Por si les es de interés a para encontrar algún tema para su tesilla. SOLTYSOVA, A., et al. Cancer stem cells. Neoplasma, 2005, vol. 52, no 6, p. 435.