Médisup Sciences Biologie Cellulaire 2024-2025 PDF

# Médisup Sciences ## 2024-2025 ## Biologie Cellulaire ### Actualisation #### Fiche de cours **n°2** **Méthodes d'études des cellules et des tissus** **Techniques utilisées en biologie cellulaire** * Notion tombée 1 fois au concours * Notion tombée 2 fois au concours * Notion tombée 3 fois ou...

# Médisup Sciences ## 2024-2025 ## Biologie Cellulaire ### Actualisation #### Fiche de cours **n°2** **Méthodes d'études des cellules et des tissus** **Techniques utilisées en biologie cellulaire** * Notion tombée 1 fois au concours * Notion tombée 2 fois au concours * Notion tombée 3 fois ou plus au concours **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Microscopie: Description morphologique des structures ##### Résolution d'un microscope * Définition: Plus petite distance que l'on observe entre 2 points sans les confondre. Plus elle est petite et plus le microscope est puissant. * Formule: $Résolution D = (0,61 \lambda) / N \sin a$ * $\lambda$: longueur d'onde du faisceau utilisé * $N$: indice de réfraction * Air: N=1 * Huile: N=1,5 * $a$: demi-angle de diffusion du cône de lumière * Meilleur angle: 70 degrés pour la microscopie optique (MO) * DOEIL: 0,2 mm #### Microscopie: Description morphologique des structures ##### Différents échantillons | Milieu de culture | Boîtes de pétri: cellules adhérentes | --- | --- | | | Tubes: cellules non adhérentes | | Incubation à 37°C | | En asepsie | | Sous atmosphère humide en présence de 5% CO2 | Conditions de culture | Dans des milieux de culture spécifiques à chaque type cellulaire (solide ou liquide) contenant des facteurs de croissance. | 2 types de cellules | Cellules primaires: extraction à partir d'un organe et obtention d'une population polymorphe de cellules | | Cellules secondaires: repiquage avec une perte de différenciation. | Liquides biologiques | Sang | | Urine | | Moelle hématopoïétique | | Liquide céphalo-rachidien | | Epanchements de la plèvre, du péritoine, des articulations. | Liquides pathologiques | Lavage broncho-alvéolaire | Liquides d'exploration | Frottis vaginal | Brossage ou grattage | Obtention d'une unique couche de cellules entre lame et lamelle. | | Aussi à partir de suspensions cellulaires ou de tissus | | Exemple: ganglions | Biopsies entières | Ex vivo | Morceaux de biopsies | Résection = retrait chirurgical d'une partie d'organe. | | **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Microscopie: Description morphologique des structures ##### Imagerie cellulaire * Description morphologique: Réalisation de coupes et observation en microscopie optique ou électronique. * Etudes in situ des constituants d'une cellule: Localisation de sucres, lipides, enzymes, lysosomes, acides nucléiques.... * Exemples de méthodes utilisées: * Histochimie: réaction chimique * Histoenzymologie: réaction enzymatique * Immunohistologie: répartition de protéines d'une cellule avec des réactions antigène-anticorps. * Hybridation *in situ*: mise en évidence d'acides nucléiques * Autoradiographie: suivi dans le temps de macromolécules à l'intérieur d'une cellule avec des précurseurs radioactifs. * Analyse moléculaire *in situ*: #### Microscopie: Description morphologique des structures ##### Préparation des coupes * **Congélation dans de l'azote liquide (-196°C)** * En présence de cryoprotecteurs * Limiter la formation de cristaux de glace pouvant endommager la préparation * Rapidement par fixation par le froid après CONGELATION. * Puis insertion dans un cryostat * Enceinte réfrigérée (-20 à 30°C) composé d'un couteau >> ou microtome. * Coupes de 5-10 µm d'épaisseur. * Observation en microscopie optique après fixation et coloration * **Préparation plus longue avec FIXATION Chimique** * Utilisation d'agents chimiques afin de stabiliser les structures biologiques * Conservation plus longtemps les coupes * Coupes plus fines observables en microscopie électronique. * Fixation n'est pas toujours indispensable pour une observation au microscope photonique. * Exemple: observation de cellules vivantes. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures: PREPARATION DES COUPES #### Protocole de préparation avec fixation des échantillons en microscopie | | | | --- | --- | | Figer les structures biologiques | Pour observer des cellules proches de l'état naturel. | | Produits d'inclusion ne sont pas miscibles dans l'eau. | Remplacement de l'eau par des solvants organiques | paraffine = mo | Remplacement du solvant par le matériel d'inclusion | Refroidissement du matériel d'inclusion: bloc dur | Coupes | Coupe avec microtome pour la microscopie optique (MO) ou un ultra-microtome pour la microscopie électronique (MET) | | | | Fixation | | Déshydratation | | Inclusion | | Coupe | | Coloration | | Contraste | | MO | | MET | | MEB **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes optiques (MO) ou photonique ##### Microscope photonique classique * Principe: Source lumineuse à la base du microscope: photons * Un faisceau de photons traverse les lentilles de verres: * Lentilles de verre: condenseur, objectif et oculaire. * Grossissement de l'ordre de 400 fois. * Grossissement maximal est de 1000 fois * Appareil de capture d'image. * Schémas: * Image of a microscope with its parts labelled * Préparation: * Fixation avec: formaldehyde (= Formol), glutaraldéhyde * Déshydratation et inclusion en paraffine * Liquide entre 55-60°C et durcit entre 20-25°CO * Coupe (microtome) de 5 µm * Dépôt sur lame de verre (21mm x70mm), réhydratation * Coloration. * Eosine (violet/rose claire): cytoplasme * Hémalun (violet foncé): noyaux * Résultats/limites: * Pouvoir de résolution D= 0,2 µm. * Observation forme, aspect de la cellule, allure du noyau et certaines structures à l'intérieur de la cellule. * Ultrastructure ou structures infracellulaire peu observable. * Nécessité d'utiliser une préparation fine et d'augmenter les contrastes par une coloration. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes optiques (MO) ou photonique ##### Microscope à contraste de phase * Principe: * Basé sur la déviation des rayons lumineux: déphasage. * Observation d'interférences: microscope à interférence. * Faisceau traverse l'objet et les ondes lumineuses dévient en fonction de ce qu'elles rencontrent. * Si pas de déviation, l'intensité émise est plus importante: augmentation de la brillance * Si déviation: diminution de la brillance * Image en niveau de gris qui visualise tous les changements de milieu à l'intérieur de l'objet observé. * Préparation: * Aucune préparation. * Ni * Résultats/limites: * Observation d'organismes vivants, cellules ou organites en déplacement * Observation de phénomènes au cours de la division cellulaire. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes optiques (MO) ou photonique ##### Microscope à fluorescence * Principe: * MO équipé d'une lampe UV et de 2 filtre, un filtre d'excitation (λ1) pour choisir la longueur d'onde incidente et d'un filtre d'arrêt (λ2) pour sélectionner les radiations émises par l'objet. * Détecte la lumière émise par des molécules fluorescentes (λ2) après excitation à certaines longueurs d'onde. * 2 sources de lumière : * Lampe halogène * 1 Lampe à arc avec vapeur de mercure: permet l'excitation des fluorochromes et le marquage des molécules * Autres équipements: lentilles, filtres, un miroir dichroïque et un capteur de type CCD. * Préparation: * Image of a diagram showing the preparation steps * Marquage avec des anticorps couplés à des fluorochromes * Exemples de fluorochromes : * Fluorescéine: absorbe dans le bleu et émet dans le vert. * Rhodamine: absorbe dans le vert et émet dans le rouge. * Localisation de molécules marquées sur fond noir. * Pas de visualisation de l'aspect général de la cellule * λ1 < λ2 * Résultats/limites: * Ne permet pas une observation détaillée des structures. * Système de déconvolution pour éliminer le << flou >>> * Microscope volumineux. * Acquisition rapide des images **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes optiques (MO) ou photonique ##### Microscope confocal * Principe: * Découverte en 1988 * Microscope à fluorescence dont la lampe UV est remplacée par un faisceau laser. * Réalisation de coupes optiques réassociées par ordinateur: images 3D. * Coupe optique de l'ordre du µm à partir d'échantillon plus épais que ceux de la microscopie à fluorescence classique. * Préparation: * Marquage avec des anticorps couplés à des fluorochromes. * Présente l'avantage d'analyser des échantillons épais car on peut jouer sur la pénétration du faisceau qui peut aller en profondeur dans l'échantillon. * Localisation plus précise des molécules marquées par fluorescence: noyau, cytoplasme, à la membrane ou à surface de la cellule... * Pas possible avec un microscope à fluorescence classique. * Risultats/limites: * Analyse d'échantillons de 50 à 100 µm d'épaisseur. * Plusieurs sources de lumières : marquage de différentes structures. * Reconstitution d'images en 3D appelés Z série = << microtome optique >>> * Netteté plus précise qu'un MO à fluorescence classique: élimination des bruits de fond. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes électroniques (ME) ##### Microscope électronique à transmission (MET) * Principe: * Source lumineuse: électrons, plus pénétrant que les photons. * Échauffement d'1 filament de tungstène: émission d'électrons attirés par l'anode. * Electrons qui arrivent dans toutes les directions sont canalisés par un condenseur pour donner un unique faisceau d'électrons. * Faisceau d'électrons passe à travers des lentilles ou bobines électromagnétiques. * Vide extrêmement pousser dans la colonne: éviter la déviation des électrons. * Electrons viennent frapper sur un écran recouvert de molécules fluorescentes qui émettent des photons: image (jaune-vert ou blanc-noire) et capture d'image. * Image of a MET * Préparation: * Fixateurs chimiques: * Formaldéhyde ou formol * Glutaraldéhyde * Souvent 1 mélange des 2: augmente la qualité de fixation qui doit être plus importante que pour la MO * Tétraoxyde d'osmium: bon fixateur des lipides. * Déshydratation et inclusion en résine plastique de type époxy araldite (polymérise à 60°C). * Coupe ultramince avec un ultramicrotome au tranchant de diamant d'environ 50nm (< 0,1µm). * Dépôt sur une grille (diamètre de 2 mm) de cuivre ou platine. * Utilisation d'agents contrastants: métaux lourds. * Acétate d'uranyle (uranium). * Citrate de plomb. * Résultats/limites: * Pouvoir de résolution D = 0,1 nm à 2nm. * Grossissement de 30 000 à 100 000 fois. * Ultrastructure ou structures infracellulaires visibles. * Echantillon obligatoirement fixé et mort car vide poussé dans la colonne du microscope. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Microscopie: description morphologique des structures #### Microscopes électroniques (ME) ##### Microscope électronique à balayage (MEB) * Principe: * Faisceau d'électrons (système de bobines déflectrices) qui balaye la surface de l'échantillon recouvert par un métal qui réémet en réponse des électrons secondaires analysés par un détecteur à scintillation associé à un photomultiplicateur. * Image of a MEB * Préparation: * Fixation et déshydratation. * PAS DE COUPE * Métallisation: métaux (du carbone puis or ou platine) d'un échantillon entier. * Exemple: petits insectes. * Résultats/limites: * Observation de la SURFACE des échantillons: image en relief. * Informations sur la forme des cellules/tissus. * MAIS échantillon mort. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Etudes *in situ* de constituants biochimiques ##### Histochimie * Principe: Ajout de réactifs à la préparation afin de créer une réaction chimique permettant la coloration de la molécule d'intérêt. * Exemples: * Coloration PASO: Acide périodique-réactif de Schiff * Coloration des résidus glucidiques: rose-fuchsia. * Coloration Feulgen-Rossenbeck: * Coloration en bleu foncé-noir de l'ADN et donc du noyau. * Résultats: Détection au MO de la molécule d'intérêt dans une cellule ou un tissu. * Lipides, protéines, sucres, acides nucléiques. ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Etudes *in situ* de constituants biochimiques ##### Histo-enzymologie * Principe: Présence de l'enzyme recherchée décelée par son action sur un substrat fourni au cours de l'expérience. * Action de l'enzyme: révélée par une réaction colorée (produit coloré): visible en microscopie. * Exemples: * Peroxydase (enzyme) + H202 (catalyseur) + DAB (substrat incolore): précipité brun * Peroxydase: foie et polynucléaires neutrophiles et éosinophiles,, granulocytes. * Mise en évidence d'autres enzymes: * Phosphatases acides: les lysosomes * Activité tyrosine : les mélanocytes * Activité ATPasique: les cellules musculaires * Résultats: Localisation d'une enzyme en microscopie optique dans une cellule ou un tissu. * DAB (di-amino-benzidine): Donne un produit dense aux électrons observable au microscope électronique à transmission. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél: 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Etudes *in situ* de constituants biochimiques ##### Immuno-histologie * Principe: Révélation directe basée sur une réaction antigène-anticorps où l'anticorps (monoclonal ou polyclonal) est couplé * Un fluorochrome (a): détection au MO à fluorescence * À une enzyme (b): détection au MO d'un produit coloré (immuno-enzymologie) * À des billes d'or colloïdales (c) (de 1 à 20 nm de diamètre): détection au MET. * Révélation indirecte: si un marquage simple ne suffit pas (1er signal insuffisant) * Un anticorps primaire qui reconnait l'antigène. * Plusieurs anticorps secondaires (espèce animale différente de l'anticorps primaire) qui reconnaissent l'anticorps 1er permettant ainsi d'amplifier le signal. * Résultats: Détection au MO ou MET de protéines ou glycoprotéines dans une cellule/un tissu ou en surface de la cellule. * Peu adaptée à la détection des lipides. * Pas adaptée aux glucides qui sont peu ou pas antigéniques. * Technique réalisée soit à partir de tissus congelés ou une fixation et une inclusion en paraffine/époxy. * Valable aussi pour l'histochimie et l'histo-enzymologie. * Technique utilisée dépend de l'antigène, de sa quantité et de sa localisation. * Exemples: * Image of 3 different techniques * Fluorochrome * Enzyme * Billes d'or **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Etudes *in situ* de constituants biochimiques ##### Hybridation *in situ* * Principe: Hybridation de la séquence recherchée avec une sonde complémentaire d'acide nucléique simple brin marquée dans une cellule ou un tissu. * Hybridation ADN/ADN, ARN/ARN ou ADN/ARN. * Utilisation possible d'oligonucleotides: courtes séquences d'acides nucléiques. * Si hybridation avec de l'ADN : séparation au préalable des 2 brins par chauffage. * 2 types de sondes: * Sonde froide: * Marquage par la biotine-avidine, la digoxigénine ou un fluorochrome. * La plus utilisée car plus économe et facilité d'emploi. * Sonde chaude: * Marquage radioactif. * Utilisation d'isotopes. * Emulsion photographique * Exemples: * Recherche d'ARNm viraux. * Recherche de gènes codant pour une protéine spécifique. * Image of an example of Hybridation in situ * Résultats: Localisation d'une séquence nucléotidique (ADN ou ARN) sur une coupe de tissu. * Informations sur l'expression des gènes dans les tissus. * Couplage avec la technique d'immunohistochimie: mettre en évidence sur une même coupe l'ARNm et la protéine. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques morphologiques/imagerie cellulaire #### Etudes *in situ* de constituants biochimiques ##### Autoradiographie * Principe: Incubation d'un tissu avec une molécule radioactive: précurseur radioactif. * Pour suivre une protéine: marquage d'un acide aminé * Pour suivre un acide nucléique: marquage d'un nucléotide * Rinçage avec du milieu froid contenant un précurseur non radioactif. * Etalement et coupe sur lame. * Image of an example of Autoradiography * Exemples: * Echantillon plongé dans une émulsion photographique contenant des grains d'argent. * Quelques jours à quelques semaines. * Révélation à l'abri de * Observation de grains d'argent réduits: argent métallique sous la forme de points noirs. * Recherche de récepteurs aux neuromédiateurs : * Photo de microscopie électronique d'une jonction synaptique: * Résultats: * Détection d'une molécule radioactive dans les tissus. * Protéine * ADN * Observation en MO ou MET **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### Cytométrie en flux (FACS) * Principe: * FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter * Permet de faire défiler à grande vitesse des cellules marquées avec des anticorps fluorescents dans une chambre d'observation. * Différencier les cellules: celles qui sont marquées ou non marqués. * Compter les cellules. * Fonctionnement: * Utilisation d'anticorps marqués par fluorescence qui reconnait spécifiquement: * Soit un antigène intracellulaire. * Soit un antigène membranaire. * Cellules sont mises en suspension au centre d'une gaine liquide d'entrainement. * Système de micropipette fluidique. * Un laser excite le fluorochrome de la cellule qui réémet une lumière. * Un dispositif permet de reconnaitre les cellules fluorescentes, et de les trier par rapport aux cellules non fluorescentes par des collecteurs de cellules. * Image of a FACS * Résultats: * Quantification Get tri cellulaire de molécules à l'intérieur ou en surface de la cellule. * Exemples: * Typage des leucémies. * Numération de sous populations lymphocytaires. * Étude du cycle cellulaire: vérifier la présence de pics d'aneuploïdie dans des tumeurs. * Aneuploïdie: cellules humaines avec un nombre de chromosomes > à 2N. * Graphique: Quantité d'ADN est proportionnelle à la fluorescence. * Recherche du métabolisme cellulaire. * Formule automatique de lavage broncho-alvéolaire. * Ne permet pas de localiser des molécules dans un tissu. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### Fractionnement subcellulaire * Principe: * Séparation des différents constituants à l'intérieure d'une cellule en fonction de leurs vitesses de sédimentation par une succession de centrifugation pendant des temps déterminés et à des accélérations croissantes. * Plus la vitesse et les temps de centrifugation augmentent plus les constituants cellulaires sédimentent dans le culot. * Fonctionnement: * Dépôt d'un homogénat sur un gradient de concentration. * Force centrifuge: les composants cellulaires les plus lourds sédimentent au fond du tube. * 1ère centrifugation: 10 min à 1000 g (accélération de l'apesanteur) * Culot: noyaux et débris cellulaires. * Surnageant (SN): organites + membranes * 2ème centrifugation du SN: 20 min à 20 000g * Culot: mitochondries + peroxysomes + lysosomes * 3ème centrifugation : 60 min à 80000g * Culot: microsomes = fragments de réticulum endoplasmique reformé * SN: cytosol * Image of a diagram of fractionnement subcellulaire * Applications: * Etudes biochimiques des compartiments de la cellule. * Etude de la structure et des fonctions des membranes. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### Fabrication d'anticorps monoclonaux * Définition: * Produits par une même lignée de lymphocyte B activée reconnaissant le même épitope d'un antigène. * Immunisation de souris avec des antigènes avec des épitopes multiples. * Prélèvement de la rate: extraction des lymphocytes B. * Fusion avec des cellules myélomateuses issus de souris avec myélome (cancer). * Obtention de différents types de cellules fusionnées: * Récupération des hybrides: lymphocytes B + myélome. * Sélection des clones monoclonal recherché. * Amplification des clones produisant l'anticorps recherché * Technique d'hybridome: * Insertion intraperitonéale à des souris. * Récolte des anticorps dans le liquide d'ascite. * Ou production d'anticorps in vitro. * Image of a diagram of fabrication of monoclonal antibodies * Application: * En ELISA: utilisation d'anticorps monoclonaux permettant d'avoir une réaction spécifique. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) * Principe: * Conceptualisé par 2 suédois dans les années 70. * Test immuno-enzymatique: visualisation d'une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à un anticorps secondaire. * Technique facilement accessible aux biologistes. * Avantages: * Pas de matériel sophistiqué: un spectrophotomètre. * Utilisation d'anticorps monoclonaux: détection spécifique. * Utilisation d'anticorps secondaires: technique très sensible permettant la détection de quantités faibles en anticorps ou en antigènes. * Tester un grand nombre d'échantillons. * Inconvénients: * Limite de détection si très faible quantité d'anticorps ou d'antigènes. * Dépendant d'une réaction enzymatique dépend de paramètres comme la température, pH, éclairement... * Résultats: * Dosage d'un antigène ou d'un anticorps dans un échantillon biologique. * Quantification à l'aide d'une gamme étalon. * Coloration proportionnelle à la quantité d'Ag ou Ac recherchés. * Utiliser pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (ex HIV). * Image of an example of ELISA **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques : ELISA #### ELISA Indirect * But: Dosage d'un anticorps * Protocole: * Un antigène spécifique de l'anticorps recherché est adsorbé au fond des puits d'une microplaque. * L'échantillon à doser contenant l'anticorps recherché est déposé dans les puits: si l'anticorps recherché est présent il va se lier spécifiquement à l'antigène. * Un deuxième anticorps, couplé à une enzyme, capable de se lier à l'anticorps capturé est ajouté dans le puits. * Anticorps secondaires non fixés sont éliminés par rinçage. * L'anticorps secondaire est couplé à une enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. * La réaction est quantifiée par colorimétrie avec un spectrophotomètre. * L'intensité de la coloration dépend de la quantité de l'anticorps de départ. * Image of a diagram of ELISA Indirect #### ELISA Sandwich * But: Dosage d'un antigène * Protocole: * Un anticorps spécifique de l'antigène recherché est adsorbé au fond des puits d'une microplaque. * L'échantillon à doser est ensuite déposé dans les puits et si l'antigène recherché est présent il va se lier spécifiquement à l'anticorps. * Un deuxième anticorps, couplé à une enzyme, capable de se lier à l'antigène capturé est alors ajouté dans le puits. * Anticorps secondaires non fixés sont éliminés par rinçage. * L'anticorps secondaire est couplé à une enzyme catalysant la formation d'un produit coloré. La réaction peut ainsi être quantifiée par colorimétrie avec un spectrophotomètre. * L'intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d'antigène présent. * Image of a diagram of ELISA Sandwich **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### Chromatographie * Principe: Permet la séparation d'un mélange de molécules à travers une colonne constituée de deux phases: * Une mobile: liquide + mélange de molécules. * Une fixe: papier, gel, cellulose.... * Séparation des constituants du mélange sur une colonne remplie de billes poreuses formant un gel. * Molécules sont entraînées par le solvant à des vitesses différentes selon leur taille. * Image of a diagram of Chromatographic Separation and Elution * Chromatographie sur gel ou d'exclusion: * Fixation sur le support fixe d'un constituant ayant une affinité spécifique pour la molécule d'intérêt contenu dans la phase mobile. * Chromatographie d'affinité: * Exemple: couplage antigène-anticorps. * Anticorps accroché sur la colonne. * Passage d'un mélange protéique dans un tampon à pH 7. * Protéines non reconnues par l'anticorps sont récupérées à la sortie de la colonne. * Lavage: reste dans la colonne uniquement les antigènes reconnus par les anticorps. * Elution des protéines (= antigènes) à l'aide d'un tampon à pH 3 acide: coupure de la liaison entre l'anticorps et la protéine d'intérêt. * Image of a diagram of Chromatography d'affinité * Résultats: * Purification d'une molécule : séparation des molécules en fonction de leur affinité avec la phase fixe. * Chromatographie sur gel: séparation en fonction de leur taille. * Chromatographie d'affinité: séparation en fonction d'une affinité spécifique. * Chromatographie échangeuse d'ions: séparation en fonction de la charge. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Techniques non morphologiques (Techniques biochimiques) #### Electrophorese * Principe: Dénaturation des protéines. * Migration sur un gel de SDS-PAGE: gel de polyacrylamide. * Dénaturation des protéines par chauffage en présence d'un détergent, le SDS (sodium dodécyl sulfate) qui se fixe sur les protéines afin de les charger négativement. * Dénaturation: perte de la structure 3D. * Ajout possible d'un agent réducteur pour rompre les pont-disulfures. * Dépôt des protéines en haut d'un gel de polyacrylamide. * Fonctionnement: * Migration des protéines vers le pôle positif sous l'action d'un courant continu. * Migration selon leur poids moléculaire. * Présence d'un marqueur de poids moléculaire déposé dans un des puits. * Coloration au bleu de Coomassie pour visualiser les protéines présentes dans l'échantillon. * Ou transfert sur une feuille de nitrocellulose: technique de Western Blot. * Ajout d'un anticorps marqué, spécifique de l'antigène recherché. * Anticorps marqué permet de détecter l'antigène ou la protéine d'intérêt uniquement. * Schéma et Photos de gel: * Image of a gel electrophoresis * Résultats: Séparation des molécules (protéines ou acides nucléiques) en fonction de leur poids moléculaire: les plus petites migrent le plus vite. * Estimation du poids moléculaire grâce à un marqueur de poids moléculaire. * Indication sur la quantité de protéines: proportionnelle à la largeur des bandes colorées par le bleu de Coomassie. **Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 PARIS - Tél : 01 48 04 90 50** ### Autres Techniques de Biologie Cellulaire * **Radioactivité:** Détection et suivi du devenir d