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Librerie di composti per lo screening Legacy libraries ! Sono formate da composti che sono stati sintetizzati nel passato allo scopo di ottimizzare composti nell’ambito di progetti di chimica farmaceutica, e conservati per progetti futuri ! Esempi ! Identificazione di inibitori della proteasi di HIV...

Librerie di composti per lo screening Legacy libraries ! Sono formate da composti che sono stati sintetizzati nel passato allo scopo di ottimizzare composti nell’ambito di progetti di chimica farmaceutica, e conservati per progetti futuri ! Esempi ! Identificazione di inibitori della proteasi di HIV: molte companies avevano sviluppati inibitori delle proteasi disegnati come inibitori dell’enzima umano renina. In seguito alla scoperta e caratterizzazione della proteasi di HIV i composti precedentemente sviluppati vennero utilizzati per identificare rapidamente inibitori di tale enzima (focused library) ! Inibitore benzodiazepinico dell’enzima Tat: i ricercatori della Roche testarono la vasta libreria di benzodiazepine in loro possesso per cercare nuovi inibitori della transattivazione della proteina Tat, una proteina regolatoria richiesta per la replicazione dell’HIV ! Nevirapina: inizialmente preparato dai ricercatori della Boehringer Ingelheim come bloccante dei recettori muscarinici ma risultato inattivo, venne incluso in una legacy library e risultò attivo come inibitore allosterico dell’enzima trascrittasi inversa di HIV Topiramato: originariamente preparato come intermedio sintetico. Fu scoperta la sua attività anticonvulsivante in uno screening fenotipico ! Fonti di hit e leads nel processo di scoperta dei farmaci ! ! Le fonti tradizionali di hit e lead includono metaboliti di piante e prodotti microbici come ligandi naturali per enzimi e recettori che si trovano nel nostro organismo ! Lovastatin, paclitaxel, sirolimus ! Nel recente passato è stato osservato che il 33% dei nuovi farmaci approvati in terapia sono stati prodotti naturali ! Del rimanente 66% sono farmaci sintetici, ma circa per una metà può essere rintracciata l’ispirazione da prodotti naturali: atorvastatina, exbepilone quale analogo dell’epotilone Altre fonti includono composti bioattivi riportati nella letteratura scientifica, derivanti da osservazioni cliniche che descrivono attività inaspettate in composti bioattivi Composti derivati da piante sono stati i punti di partenza per lo sviluppo di molti farmaci ! Approvazione di un prodotto naturale ! Approvazione di un suo derivato meno tossico o più potente ! Efedrina: prodotto naturale dalla pianta Ephedra sinica ! Amfetamina, metamfetamina e metilfenidato: queste ultime due usate ancora oggi per i disordini da deficit di attenzione e iperattività Bioassays ! Screening of crude plant extracts typically is a slow process involving ! heating in an organic solvent ! fractionation by liquid-liquid extraction into increasingly polar solvents ! Purification of each subfraction by multiple chromatographic steps ultimately provides pure compounds. ! Bioassays, most often phenotypic assays, are done at each level of purification to identify the active fractions. ! Once pure compounds are obtained, it may take considerable effort to elucidate novel structures. ! Crude extracts often contain 10-100 compounds Microbi e animali superiori ! In addition to plants, microbes are an important source of pharmacologically active compounds ! Penicillin G ! Cephalosporin P ! Epothilones In many of the historical examples described, the natural product already exhibited many of the properties required of a lead or even a clinical candidate and entred the process at a relatively late stage Speed-up lead discovery E’ necessario accelerare il processo di drug discovery in modo da determinare fin dalle prime fasi il potenziale di sviluppabilità farmaceutica (developability) di un nuovo farmaco e da assicurarsi la Propieta’ Intellettuale (brevetto) il prima possibile. Discovery phase Disease selection Gene to function Function to Target 6 years Target to Hit Hit to Lead Lead Pre-dev. optimisacompound tion milligrams grams Chemical Synthesis Biological Assay Drug Design Hit ADME Profiling Lead Combinatorial Chemistry What is Combinatorial Chemistry ! Combinatorial chemistry (“CombiChem”) is a discipline that uses a set of techniques for the generation of (large) numbers of compounds (library) very quickly. ! The compound libraries undergo high-throughput screening for a desired property. ! The pharmaceutical industry is the major user of combichem for drug discovery. ! Other applications of combichem include catalysis and materials science. Librerie combinatoriali Basi della chimica combinatoriale: Costruire, tutte in una volta e con i principi del calcolo statistico (combinatorio), vaste collezioni di prodotti (librerie) contenenti un alto numero di varianti di una struttura fondamentale La necessità di introdurre queste libreria è dovuta al fatto che la diversità chimica delle legacy libraries sarà sempre condizionata dalla storia del target per il quale sono state sviluppate piuttosto che per nuovi target Il numero di piccole molecole con proprietà farmaco-simili che potrebbero essere utilizzate come base di partenza per lo sviluppo di farmaci è enorme limitando il conto agli atomi C, N, O e F il numero di composti drug-like è di oltre 110 miliardi Se vengono usati 30 atomi pesanti, il numero sale a 10 60 ! I composti finali possono essere preparati come miscele o isolate come composti singoli ! Si possono usare metodi Aspetti sintetici ! ! In fase solida ! In fase liquida ! In fluorous phase Approcci generali ! Split and mix ! Sintesi parallela Librerie sintetiche ! Sintesi parallela - Di composti singoli: ciascuna reazione viene effettuata in pozzetti separati in maniera che ciascun pozzetto contenga un singolo composto - ! E’ necessario semplificare/automatizzare alcune procedure come work-up, estrazione, evaporazione dei solventi, purificazione etc Sintesi combinatoriale ! Viene utilizzata per produrre una miscela di composti in ciascun reattore utilizzando una vasta gamma di composti di partenza e di reagenti - Metodo “mix and split” Sintesi parallela ! ! Sintesi parallela in fase solida Sintesi parallela in fase liquida Procedura convenzionale: estrazione della fase organica con acqua per rimuovere l’ammina che non ha reagito (estrazione liquido-liquido, imbuto separatore) Separazione delle due fasi Essiccamento della fase organica con solfato di sodio Rimozione dell’agente essiccante per filtrazione Evaporazione del solvente Purificazione per cristallizzazione o cromatografia Sintesi su fase solida I reattivi possono essere usati in eccesso per portare le reazioni a completamento Il supporto caricato puo’ essere facilmente separato dai reattivi Semplifica e velocizza la lavorazione delle reazioni Le procedure sintetiche permettono l’automazione I supporti ! ! ! ! ! ! Stabilita’ meccanica e chimica Inerti verso i reattivi ed i solventi Compatibili con le condizioni di reazione Presentano gruppi funzionali Facilmente purificabili I supporti insolubili classici sono in genere polimeri sotto forma di perline (beads) di diametro 100-500 um, chiamati comunemente resine, costituiti da catene lineari intrecciate tra loro. Copolimero di polistirene (stirene legato con legami crociati a divinilbenzene all’1% Sintesi di Merrifield La resina è idrofobica mentre la catena nascente è idrofilica per cui tende a ripiegarsi su se stessa in ambienti apolari Resina poliammidica di Sheppard Resina di Tenta-gel (80% glicole polietilenico ancorato ad un copolimero polistirenedivinlbenzene) Proprieta’ dei supporti usati in SPOS ! Loading Capacita’ di carico (mmol/g o nmol bead) ! Swelling Capacita’ di rigonfiamento (diffusione di solventi e reattivi all’intero dei supporti) Il linker ! Connessione tra la molecola ed il polimero (puo’ essere presente o meno uno spaziatore) Loading: veloce ed efficace Stabile Cleavage: efficiente in condizioni “sicure” semplice non deve introdurre impurezze Linker adatto per l’attacco e il rilascio di acidi carbossilici Linker lega i composti carbossilici attraverso un legame ammidico Linker per alcoli primari e secondari Linker trifenilmetilico progettato per evitare la racemizzazione del primo AA Sintesi in fase solida di composti eterociclici I gruppi funzionali staccati dalla resina prendono parte alla reazione di ciclizzazione e non rimangono come prodotti secondari Metodo split&mix Ciascuna di queste miscele potrebbe essere saggiata per valutare l’attività biologica Analisi delle librerie ! Produzione di singoli composti Produrre singoli composti che possono essere isolati, identificati e la cui attivita’ biologica viene valutata individualmente ! Produzione di librerie Ciascuna miscela viene valutata come tale. Non attiva: la miscela viene eliminata Attiva: si deve individuare il componente responsabile Deconvoluzione della libreria How to overcome the deconvolution obstacle? Encoding strategies using tags (Encoded Bead Based Libraries) Tags decoding using analytical methodologies (HPLC/MS, HPLC/Fluorescence detection, FIA-MS, GC, etc) Sintesi codificata (tag synthesis): encoding ! Encoding chimico Ad ogni passaggio vengono eseguite due tipi di reazioni: 1. Reazioni di costruzione della libreria 2. Attacco di un prodotto che permetta di riconoscere il reattivo aggiunto in quel passaggio. Al termine la perlina conterra’ il prodotto voluto e una molecola sequenziabile che permette di identificare il prodotto Dinamic combinational chemistry ! Bersaglio nel recipiente di reazione insieme ai blocchi molecolari da assemblare ! ! Le reazioni adoperate devono essere reversibili ! ! I blocchi devono potersi legare al bersaglio non appena si formano e deve esistere un dispositivo per identificare rapidamente i composti provvisti di maggiore affinità per il bersaglio amplificazione selettiva della produzione del composto attivo rispetto agli altri composti della miscela Per identificare i composti attivi è necessario arrestare l’equilibrio di formazione dei prodotti Svantaggi della sintesi su fase solida ! A causa della natura bifasica del processo le reazioni possono procedere a velocita’ relativamente basse ! La natura eteragenea puo’ dare luogo a cinetiche di reazione non-lineari ! L’accessibilita’ dei reattivi e la compatibilita’ del supporto con le condizioni di reazione applicate ! La difficolta’ di monitorare il progresso dei singoli steps di reazione ! Steps aggiuntivi sono necessari per legare e rilasciare il prodotto dal supporto ! Purezza e/o purificazione dei prodotti finali ! ! Sintesi parallela in fase solida Sintesi parallela in fase liquida Procedura convenzionale: estrazione della fase organica con acqua per rimuovere l’ammina che non ha reagito (estrazione liquido-liquido, imbuto separatore) Separazione delle due fasi Essiccamento della fase organica con solfato di sodio Rimozione dell’agente essiccante per filtrazione Evaporazione del solvente Purificazione per cristallizzazione o cromatografia Solid supported reagents ! Excess reagent can be used to drive reaction to completion ! The work-up involves simple filtration and evaporation of the solvent ! The filtration process allows the recovering of the solid-supported species: this aspect is essential ! ! where the reagent acts as a catalyst where the spent material can be regenerated and recycled ! Toxic, noxious or hazardous reagents can be immobilised and not released thereby improving their general acceptability, utility and safety profile into solution ! More than one reagent can be used simultaneously and even species that are incompatible in solution may be used together to achieve one-pot transformations that are not possible in homogenous solution ! Reactions can be monitored using conventional methods (TLC, LC-MS, GC-MS, SFC-MS, NMR etc.) thus allowing a rapid optimisation and scale up Ley, S. V. et al. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 3815–4195. Solid-supported reagents and catalysts The use of solid-supported reagents (SSRs) can combine the benefits of solid-phase and solution-phase chemistry. - simplification of reaction work-up and product isolation Other advantages – potential for recycling, higher stability, reduced toxicity, simple reaction monitoring by TLC, simplified automation Scavenger resins The issue is wheter the reagent is Electrophilic or Nucleophilic: If the reagent is electrophilic, use a nucleophilic scavenger If the reagent is nucleophilic, use an electrophilic scavenger Cattura e rilascio Compound 4 could be successfully prepared from thioamide 1 by this route. Problem : Final compound contaminatied by numerous Impurity, from which the desired product had to be chromatographylly isolated in poor yield. Catch and release strategy was developed to facilitate the production of libraries free of those impurity. Application of combinatorial libraries ! Hit identification Lead optimization search Split -Mix synthesis - “compound mixtures” ! Parallel synthesis - “individuals” ! Focused libraries ! Random libraries ! 10000 products ! >1mg per product ! 90% " Saggiate per l’attività farmacologica primaria @1-10 uM " Dovrebbero produrre un maggiore hit rate Librerie Focused (secondarie) " Progettazione guidata dalla SAR " Basso numero di componenti (50100) " Composti rigorosamente singoli # Sintesi in soluzione preponderante " Alta purezza chimica (95%) " Saggiate per l’attività e selettività " Saggiate in farmacocinetica (e pretox) Progettazione delle librerie di composti ! La sintesi in fase solida permette di produrre grandi quantità di composti che possono essere immagazzinati come librerie per la ricerca di nuovi hit/lead ! E’ quindi importante che le molecole in queste librerie siano strutturalmente diverse per aumentare la possibilità di successo, per cui è necessario pianificare e disegnare in maniera razionale Strutture a ragno Una buona strategia è quella di sintetizzare molecole a ragno costituite da un corpo centrale (lo scaffold) da cui si dipartono le «zampe» che contengono vari gruppi funzionali utili per sondare lo spazio tridimensionale intorno alla molecola Molecole drug-like: rule of five o altre metriche per impedire la sintesi di composti con caratteristiche chimico-fisiche non appropriate Tipi di scaffold ! Benzodiazepine, idantoine, beta-lattami e piridine sono esempi di scaffold ottimali ! Basso peso molecolare ! Possono essere sintetizzati attraverso numerose vie sintetiche con differenti sostituenti Scaffold peptidici Sono flessibili e possono formare molteplici legami idrogeno Facili da sintetizzare Disponibilità di numerosi building blocks Permettono una buona esplorazione dello spazio conformazionale Di- o tri-peptidi Tipi di scaffold ! Benzodiazepine, idantoine, beta-lattami e piridine sono esempi di scaffold ottimali ! Basso peso molecolare ! Possono essere sintetizzati attraverso numerose vie sintetiche con differenti sostituenti Glucosio Gruppi ossidrilici Difficilmente funzionalizzabili in maniera indipendente Steroidi Elevato peso molecolare limita il numero e la tipologia di sostituenti Indolo Può essere funzionalizzato in posizioni molto vicine l’una all’altra Qualita’ delle librerie ! La dimensione della libreria non e’ associata alla sua qualita’ ! Complessita’ e diversita’ dei componenti ! Progettazione di librerie con molecole con proprieta’ famaco-simili (drug-like) ! Progettazione di librerie con molecole con struttura simile ai prodotti naturali (natural product like) ! Il concetto di diversità ! ! ! Per ogni molecola può essere definito uno spazio chimico ad n dimensioni, dove ogni dimensione è rappresentata da una proprietà chimico-fisica. Un SET di composti con un più alto contenuto di diversità ha maggiori probabilità di contenere molecole “attive”. La diversità tuttavia non è una grandezza assoluta ma dipende dal particolare ambito biologico Spazio chimico ! è uno spazio virtuale a n dimensioni, dove le dimensioni sono “descrittori” di caratteristiche strutturali o chimico-fisiche (ad es. formula bruta, polarità (logP), volume molare, numeri di legami liberi di ruotare etc.) ! Lo spazio chimico dà un’idea della diversità delle molecole. ! E’ stato stimato che il numero di molecole possibili con PM < 700 sia pari a 10200 ! Anche limitandosi a molecole “drug-like” il numero è pari a 1060 ! Il numero di molecole ad oggi note e caratterizzate (Chemical Abstract) è pari a 2.5* 107 ! Il termine diversità può essere soggettivo, tuttavia ci sono 4 principali componenti della diversità strutturale che vengono presi considerazione ! ! ! ! ! Diversità dei sostituenti (o dei building blocks) – variazioni nelle porzioni strutturali che decorano uno scheletro comune Diversità dei gruppi funzionali – variazioni dei gruppi funzionali presenti Diversità stereochimica – variazione nell’orientazione degli elementi potenzialmente coinvolti nell’interazione con la macromolecola Diversità dello scaffold – presenza di molti distinti scaffold strutturali Bisogna in ogni caso ricordare che è la struttura 3D di una piccola molecola il fattore fondamentale che controlla l’effetto biologico ! Diversità della forma molecolare: indicatore principale della diversità funzionale Il principale fattore che condiziona la forma molecolare è la struttura dello scaffold ! Prodotti naturali: sono caratterizzati da una enorme diversità strutturale, inclusa diversità di scaffold ! Collezioni di composti commerciali: alto numero di composti strutturalmente semplici (spesso piatti) con diversità limitata soprattutto ai sostituenti legati ad un piccolo numero di scheletri comuni ! Per esplorare lo spazio chimico bisogna avere a disposizione milioni di composti ! Coprono prevalentemente uno spazio chimico noto legato alla loro bioattività «low-hanging fruit» ! ! Nuove collezioni di composti ! Identificazione ed accesso efficiente ad aree dello spazio chimico che abbiano maggiore probabilità di contenere composti bioattivi ! ! Generazione di librerie di composti basate sulle strutture di composti biologicamente attivi: prevalidated natural products Esplorare in maniera efficiente ampie regioni dello spazio chimico simultaneamente ! Diversity oriented synthesis (DOS) Diversity oriented synthesis (DOS) ! Non è sinteticamente possibile produrre tutte le possibili piccole molecole stabili basate sul carbonio ! La sintesi ideale di una libreria strutturalmente diversa è quella in cui si realizza tale diversità nella maniera più efficiente possibile: obiettivo della DOS ! DOS: deliberate, simultaneous and efficient synthesis of more than one target compound in a diversity-driven approach ! Spazio chimico noto (quello dei composti biologicamente attivi) ma strutture completamente nuove Complexity to diversity Priviledged substructure-based DOS creative reconstruction of privileged substructures frequently observed in natural products or bioactive small molecules complexity-to-diversity (CtD) strategy, for the efficient construction of natural product-like small-molecule collections starting from commercially available natural products Strutture privilegiate The term ‘privileged structures’, was firstly introduced by Evans in 1988 describing them as simple structural subunits present in the molecules of several drugs, with distinctive therapeutic uses, or affinities to several different receptors Esempi La sintesi combinatoria / high-throughput ha contribuito a un certo numero di farmaci. Il farmaco per il diabete Galvus (Vildagliptin) proveniva da librerie di sintesi in fase solida : Villhauer, E. B.; et al. J. Med. Chem. 2002, 45, 2362-2368 e J. Med. Chem., 2003, 46, 2774-2789. L'antidepressivo Brintellix (Vortioxetine) è stato identificato da una libreria di sintesi in fase solida: BangAndersen, B; et al. J. Med. Chem. 2011, 54, 3206-21. J. Org. Chem. 2002, 67, 5257-5268 Vildagliptin Inibitore DPP-4 Vortioxetine Antidepressivo atipico Modulatore e stimolatore della serotonina Il Sorafenib (Nexavar, Bayer Pharmaceuticals), il primo inibitore multichinasico, deriva dallo screening iniziale di una libreria combinatoriale. (Nature Reviews Drug Discovery 2006, 5, 835–844, Bioorg Med Chem Lett. 2001,11, 2775-2778) Lomitapide (Juxtapid in US es Lojuxta in EU, Aegerion Pharmaceuticals) nasce da sintesi combichem/parallela. Sorafenib Lomitapide Storia della scoperta degli anticorpi contro la tossina difterica ! La storia della scoperta degli anticorpi contro la difterite è un importante capitolo nella storia della medicina e dell'immunologia. La difterite è una malattia causata dal batterio Corynebacterium diphtheriae, che produce una tossina dannosa per il corpo umano. Questa malattia era particolarmente temuta prima dell'avvento dei vaccini. ! La ricerca sugli anticorpi contro la difterite è stata guidata principalmente da due scienziati, Emile Roux e Alexandre Yersin, che lavoravano nell'ambito dell'Institut Pasteur a Parigi. Nel 1888, il batteriologo tedesco Emil von Behring e il fisiologo giapponese Shibasaburo Kitasato, che lavoravano nell'ambito dell'Istituto di Igiene di Berlino, scoprirono che il siero di cavalli precedentemente infettati con il batterio C. diphtheriae poteva proteggere altri animali dalla malattia. ! Behring e Kitasato scoprirono che il siero sottratto da questi cavalli conteneva una sostanza che poteva neutralizzare la tossina difterica. Questa sostanza, che ora sappiamo essere gli anticorpi, è stata chiamata "antitossina difterica". Questa scoperta segnò l'inizio della terapia con siero antitossina difterica, un precursore dell'immunizzazione moderna. ! Emile Roux, lavorando all'Institut Pasteur, svolse ulteriori ricerche sull'antitossina difterica, dimostrando la sua efficacia nel trattamento della malattia. Questi studi sono stati fondamentali per stabilire l'efficacia dell'antitossina nel trattamento della difterite. ! La scoperta dell'antitossina difterica e il suo successivo utilizzo come trattamento rappresentarono un grande passo avanti nella lotta contro la difterite e contribuirono in modo significativo allo sviluppo della medicina moderna e della vaccinazione Classi di proteine terapeutiche Anticorpi Fattori di coagulazione Prodotti dalle cellule B linfocitarie in risposta a patogeni. Proteine essenziali nel processo di coagulazione del sangue. Legano antigeni specifici sulle superfici dei patogeni. Usati per bloccare vie di segnalazione specifiche o indurre la morte cellulare. Usati per trattare emofilia A e B e altre condizioni legate alle emorragie. Ormoni proteici Possono veicolare farmaci citotossici alle cellule tumorali. Secernuti dalle ghiandole endocrine. Gli anticorpi monoclonali sono il tipo più comune. Agiscono come messaggeri chimici per innescare risposte fisiologiche. Esempi includono insulina, eritropoietina e gonadotropina. Enzimi Catalizzano reazioni biochimiche nel corpo umano. Usati nella terapia di sostituzione enzimatica o per modificare bersagli terapeutici. Esempi includono PEG-asparaginasi, sacrosidasi, pegvaliase e laronidasi. Citochine Proteine che mediano la comunicazione cellula-cellula durante le risposte immunitarie. Usate come immunomodulatori per trattare condizioni come la sclerosi multipla e la leucemia a cellule pilifere. Timeline ! Tappe significative nello sviluppo delle proteine terapeutiche ! Storia della produzione dell’insulina ricombinante Timeline ! Tappe significative nello sviluppo delle proteine terapeutiche ! Storia della produzione dell’insulina ricombinante 1982 la tecnologia del DNA ricombinante è stata utilizzata per produrre insulina in un ospite batterico L'uso so della tecnologia del DNA ricombinante ha contribuito a superare le sfide legate sia alla scala di produzione che all'immunogenicità delle proteine derivate dagli animali. Considerando che, in linea di principio, si potrebbe esprimere qualsiasi proteina per la quale sia conosciuto il gene associato, era effettivamente emerso un concorrente valido al lavoro principale della medicina dell'epoca - le piccolo molecole Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Stabilità ! Aggregazione ! Degradazione (demidazione/ossidazione in vitro; proteolisi in vivo) Denaturazione ! ! ! Sensibilità a variazioni di temperature Adsorbimento sulla superficie dei contenitori PEGilazione Mutazioni sito-specifiche Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Farmacocinetica ! ! Tempo di eliminazione Farmacodinamica ! Interfernza con funzioni naturali ! Risposte immunitarie indesiderate PEGilazione Glicosilazione Lipidazione Fusione proteica Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Direzionamento al target ! Capacità di indirizzare i farmaci a tessuti specifici o organi (riduzione effetti collaterali) ! Molte protein sono. Sequestrate in fegato, reni e milza Coniugati farmaco-anticorpo Introduzione di molecole capaci di direzionare al di fuori di questi organi e.g. proteine lgate covalentemente all’aptamero della trasferrina si accumulano nel SNC Caratteristiche ottimali per le proteine terapeutiche ! Rilascio intracellulare ! Le dimensioni relativamente grandi rispetto ai farmaci a piccole molecole e le cariche superficiali eterogenee rendono la maggior parte delle proteine impermeabili alla membrana cellulare. Coniugazione con cell-penetrating peptides «Supercharging» Dense DNA grafting