Tecniche di trasferimento genico, Virus adeno-associati (AAV) PDF

​14.2 Biologia Molecolare​​ 4 dicembre 2023​ TECNICHE DI TRASFERIMENTO GENICO VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAV) I virus adeno-associati sono vettori non patogenetici largamente diffusi nella popolazione. La loro struttura comprende un capside proteico, la...

​14.2 Biologia Molecolare​​ 4 dicembre 2023​ TECNICHE DI TRASFERIMENTO GENICO VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAV) I virus adeno-associati sono vettori non patogenetici largamente diffusi nella popolazione. La loro struttura comprende un capside proteico, la capsula esterna di rivestimento, caratterizzata da proteine espresse sulla sua superficie che garantiscono al vettore la tessuto-specificità di infezione. Questa è una caratteristica molto importante in ambito terapeutico, in quanto sierotipi diversi sono dati da proteine del capside diverse, permettendo ai virus di bersagliare ad alta efficienza solo alcuni distretti. La caratteristica principale dei virus adeno-associati è quella di infettare specificamente tessuti post-mitotici: muscolo scheletrico, cuore, retina e cervello. Il vettore, di piccole dimensioni, riconosce e infetta il proprio bersaglio e rimane in forma episomale (non si integra) nel citosol delle cellule infettate. Per la produzione di un transgene, i geni virali sono sostituiti dai geni terapeutici, impedendo così la sintesi delle proteine proprie del virus e permettono quindi ai geni terapeutici di agire sulla cellula infettata. Una volta sostituiti, i “nuovi” geni terapeutici procedono il normale ciclo vitale tipico delle cellule eucariotiche(da DNA, RNA fino a tradurre PROTEINE). Per garantire maggiormente la tessuto-specificità del virus, l’espressione genica può essere regolata da un promotore tessuto-specifico che, in base alla modificazione da effettuare, viene scelto a cura del ricercatore. Questo tipo di vettore non esprime quindi nessuna proteina propria, fatta eccezione per le proteine del capside. Ciò rappresenta un grande difetto degli adeno-associati, infatti, data l'elevata presenza nella popolazione, l’infezione da parte di uno di questi virus innesca una reazione immunitaria nell’organismo trattato. Sbobinatore: Davide Cercato Revisore: Robert Ciobanu ​14.2 Biologia Molecolare​​ 4 dicembre 2023​ Questo determina in modo necessario l’utilizzo della tipologia di trattamento One-shot (terapia endovenosa proattiva), trattamento che è costituito da una sola singola infusione, fondamentale in quanto il sistema immunitario, dopo la prima infusione, riconosce facilmente i vettori virali e ulteriori infusioni risulterebbero inefficaci. Uno dei vantaggi di questi vettori virali è la possibilità di produzione a titolo estremamente alto, risulta quindi ottimale trasferire un numero elevato (1x10^3 – 1x10^4 per cellula) in un unico trattamento. Viene mostrata un’immagine del laboratorio in cui gli adeno-associati vengono prodotti a partire da cellule in coltivazione all’interno di grandi bottiglie. Il vettore ingegnerizzato viene infatti trasfettato (trasferito) in cellule in coltura che portano alla produzione ad alto titolo. Dopodiché il “brodo di coltura” viene prelevato e purificato in modo da isolare il vettore pronto ad essere iniettato nelle cellule target. STRATEGIE DI TERAPIA GENICA Tramite i virus adeno-associati sono possibili 4 diverse strategia di terapia: Gene replacement: usato per malattie monogeniche, costituisce la sostituzione del gene mutato tramite un vettore caricato con il gene funzionale·. Gene addition: variazione del gene replacement, usata ad esempio per mutazioni puntiformi in geni grandi per essere sostituite dalla versione funzionale (es. distrofina). In questo caso viene affiancata una versione funzionante al gene mutato. Nel caso della distrofina, vengono usate versioni corte, dette mini-distrofine, che vengono trasferite all’interno delle cellule per fare fronte al malfunzionamento della proteina. Sbobinatore: Davide Cercato Revisore: Robert Ciobanu ​14.2 Biologia Molecolare​​ 4 dicembre 2023​ Gene knockdown: silenziamento di un gene mutato veicolando nel vettore virale un siRNA specifico per il gene. Gene editing: manipolazione del genoma della cellula mutata usando l’allele sano come stampo. Attraverso il sistema di riconoscimento di errori nella duplicazione, viene riconosciuta la distorsione dell’elica data da un appaiamento sbagliato e viene quindi rimossa la zona mutata e viene riempito lo spazio lasciato. Si può quindi pensare di effettuare una correzione mirata veicolando le endonucleasi che rimuovono la porzione di DNA che contiene il danno e quindi di effettuare una correzione genica in vivo. TRATTAMENTO DI PATOLOGIE OCULARI L’occhio rappresenta il modello tissutale ideale per i trattamenti di terapia genica, perché è un organo che racchiude tessuti e tipi cellulari diversi con patologie ben definite, oltre al fatto di essere un organo circoscritto garantisce la non dispersione dei trattamenti terapeutici. La terapia genica permette quindi di trattare patologie legate alla vascolarizzazione del fondo dell’occhio, causative delle varie forme del glaucoma, come anche patologie corneali, in quanto i trattamenti possono essere effettuati nella camera anteriore del bulbo oculare. In particolare, gli adeno-associati sono in grado di infettare le cellule neuronali all’interno della retina e anche alcuni fotorecettori. Ciò permette di trattare alcune delle principali malattie genetiche legate alla vista. Infatti, il ciclo della visione (ciclo di fototrasduzione) è legato a proteine specifiche che garantiscono la trasformazione dell’energia in un segnale chimico e poi elettrico che arriva ai neuroni. Sbobinatore: Davide Cercato Revisore: Robert Ciobanu ​14.2 Biologia Molecolare​​ 4 dicembre 2023​ ESEMPIO:AMAUROSI CONGENITA DI LEBER Malattia che porta alla degenerazione retinica con insorgenza in età infantile che porta a cecità intorno ai 20 anni. Dal punto di vista terapeutico, la caratteristica più importante delle diverse forme di amaurosi è che sono tutte collegate a mutazioni di uno stesso gene: RPE65. Questo gene codifica per l’enzima chiave che rende possibile la trasformazione del segnale luminoso in un segnale chimico. La mutazione di questo gene comporta quindi una progressiva perdita di visione a partire dal centro del campo visivo fino alla completa cecità. Questa patologia è ideale per lo studio delle terapie geniche:la sua peculiarità è quella di essere a carico di una mutazione monogenica espressa solo da un tipo cellulare ed essere presente all’interno di un organo circoscritto. Sbobinatore: Davide Cercato Revisore: Robert Ciobanu