TP n° 02 Diagnostic Hémtologique - Université Saad Dahleb de Blida 1 PDF

Université Saad Dahleb de Blida 1 Département de Biologie des Populations et des Organismes 3ème Année Licence. Option : Parasitologie Module : Technique de diagnostic en parasitologie Mme H.SADOUKI TP n° 02 Dia...

Université Saad Dahleb de Blida 1 Département de Biologie des Populations et des Organismes 3ème Année Licence. Option : Parasitologie Module : Technique de diagnostic en parasitologie Mme H.SADOUKI TP n° 02 Diagnostic Hematologique (Techniques de recherche des parasites dans le sang)  Plan de travail les objectifs: 1- Généralités sur les parasites sanguicoles. 2- Le prélèvement de sang. 3- Le diagnostic des parasites dans le sang. 4- Examen direct d’une goutte fraiche. 5- Examen sur frottis secs colorés. 6- Examen d’une goutte épaisse. 7- observation.  les parasites sanguicoles Les espèces et formes parasitaires sont nombreuses et peuvent parasiter sous formes 1-Intracellulaires 2-Extracellulaires des protozoaires : les plasmodies, Formes mobiles les babésies, extracellulaires les toxoplasmes, les leishmanies (trypanosomes et (formes viscérales), microfilaires).  Le prélèvement Le moment le plus favorable pour effectuer le prélèvement varie selon l'espèce parasitaire recherchée. De manière générale, il devra être pratiqué avant la mise en oeuvre d'un traitement spécifique. Pour la recherche du Plasmodium/ on prélèvera au moment des pics fébriles. Concernant les microfilaires, il faut tenir compte de leur périodicité diurne (Loa loa) ou nocturne (Wuchereria bancrofti). Le prélèvement se fait soit par piqûre au bout du doigt soit par ponction veineuse sur anticoagulant  Le diagnostic des parasites dans le sang. -C’est l’examen de certitude pour la recherche des parasites sanguicoles. L'examen parasitologique du sang recherche les parasites qui se multiplient ou qui séjournent pendant une phase de leur cycle dans le sang ou dans les organes hématopoïétiques. Cette analyse a essentiellement pour but de montrer la présence éventuelle Les parasites : Plasmodium; Leishmania; Trypanosoma; Microfilaires; Toxoplasma  Le diagnostic des parasites dans le sang. Un examen direct Un examen indirect 1- Examen direct d’une Spécifique: goutte fraiche. sérologique à la recherche d’anticorps ou d’antigènes 2- Examen sur frottis secs colorés. Aspécifique: circulants. 3- Examen d’une goutte épaisse.  Examen direct d’une goutte fraiche. Examen direct reconnaissant les parasites extracellulaires mobiles -II n'est pas toujours efficace mais il peut donner une réponse immédiate en cas d'infestation massive. - En particulier pour les trypanosomes et les microfilaires qui sont très aisés à repérer dans une goutte de sang entre lame et lamelle même ou faible grossissement grâce à leur mobilité.  Examen direct d’une goutte fraiche. 1-prelever une goutte du sang et déposer sur une lame propre. 2-poser la lamelle. 3-Observer a l’objectif 40.  Examen sur frottis secs colorés REALISATION DU FROTTIS SANGUIN: 1-Déposer une goutte de sang la plus petite possible à l'extrémité d'une lame avec une pipette Pasteur. 2-A l’aide d’une lame rodée en position inclinée de 45° faire un étalement fin en un mouvement rapide et continu 3-Sécher le frottis rapidement en agitant la lame. Confectionner un frottis sanguin corps queue tête Qualité du frottis: Le frottis sanguin doit être régulier (sans coupures), avec des bords parallèles à la lame mais distants de ceux-ci et avec l’extrémité arrondie ou en pinceau. Ne doit pas présenter de trous ni de stries. ne doit pas être trop épais ni trop mince, ni trop long  Examen sur frottis secs colorés COLORATION AU MAY-GRÜNWALD GIEMSA: 1-FIXATION: Placer la lame du frottis sur un support horizontal au dessus d’un bac de coloration. Verser sur la lame quelques gouttes de colorant May- Grünwald pur de façon à recouvrir complètement le frottis. Laisser agir pendant 3 minutes. 2-COLORATION AU MAY-GRÜNWALD: Ajouter autant de gouttes d’eau neutre que de gouttes de colorant, le mélange est rapide. Laisser agir 2 minutes. (Préparer la dilution du Giemsa pendant ce temps.) Rejeter le colorant par un jet d’eau neutre.  Examen sur frottis secs colorés 3-COLORATION AU GIEMSA: A- Préparer la dilution du Giemsa pendant les 3 minutes précédentes. pour cela introduire 20 Ml d’eau neutre dans une éprouvette graduée, ajouter 30 gouttes de colorant. B- Verser le contenu de l’éprouvette dans une boîte de Pétri. Dès que la lame est prête, mélanger en agitant doucement C- Déposer la lame dans la boîte, laisser agir 35 minutes( Giemsa lent).  Examen sur frottis secs colorés 4- SECHAGE A- Laisser sécher la lame à l’air, en position inclinée, après avoir essuyé la face inférieure de la lame avec du papier filtre. B- Attendre au moins 5 minutes avant C- l’examen microscopique du frottis grossissement (x 100) à l’huile d’immersion..  Examen sur frottis secs colorés Coloration au Giemsa Attendre au moins 30 minutes avant l’examen microscopique du frottis  Examen d’une goutte épaisse. Méthode très simple mais dont les résultats ne sont observables que 24 heures après. Elle permet une certaine concentration des parasites. Mode opératoire 1-Prélever une grosse goutte de sang par ponction des capillaires cutanés. 2-Déposer la goutte sur une lame en lui imprimant des mouvements circulaires à l'aide de l'extrémité de la pipette ou d'un coin de lamelle. Ne pas étaler. 3-Laisser sécher 12 heures à l'abri de la poussière. 4-Déposer une goutte d'eau distillée et laisser agir 20 minutes (hémolyse). 5- Sécher. 6-Effectuer une coloration (May-Grünwald-Giemsa) puis observer au microscope.  un mouvement une cuve à coloration baguettes de verre pour poser tournant pour Giemsa les lames lors de la coloration défibriner le sang. on étale le sang pour obtenir un cercle d'un centimètre. On laisse égoutter les on rince les lames à l’eau claire sans faire couler La lecture se fait au lames en le jet directement sur le sang coloré ce qui microscope au position risquerait de le décoller de la lame grossissement 40 verticale sur un portoir Figure 1: Plasmodium falciparum. Figure 2: Plasmodium malariae. Figure 3: Plasmodium falciparum. -Frottis sanguin coloré - Frottis coloré. Schizonte - Goutte épaisse colorée Gamétocyte en bande contenant de nombreux femelle de P.falciparum équatoriale de P. malariae trophozoïtes de P. obj x100. Figure 4: Babesia. obj x100). Figure 5: Trypanosoma cruzi. falciparum Figure obj x 100. 6: Leishmania. Formes amastigotes de leishmanie - Frottis de sang d’un - Forme mince, petit kinétoplaste. chien Coloration obj 100 sur un frottis de moelle chez un enfant atteint de leishmaniose gure 7: Toxoplasma gondii. Figure 8 : Microfilaire de Loa loa. achyzoïtes intracellulaires. Examen direct entre lame et lamelle d’une goutte de Figure 9: Microfilaire de Figure 10:obj sang Sérologie x 100 de filariose. Wüchereria bancrofti Frottis coloré Noyaux petits, Réaction d’IFI positive avec comme sphéroïdes, séparés, pourpres gaine antigène les coupes de filaire rose (G). Corps de Manson (CM), masse adulte Dipetalonema viteae. Merci de votre Attention