Trabajo Práctico N° 12 Genética Humana PDF

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE MEDICINA TRABAJO PRÁCTICO N° 12 GENÉTICA HUMANA GENEALOGÍA CITOGENÉTICA GENÉTICA MOLECULAR CARTILLA PARA EL ALUMNO 1 CONTENIDOS: Genética Humana. Genealogía. Citogenética. Genétic...

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN FACULTAD DE MEDICINA TRABAJO PRÁCTICO N° 12 GENÉTICA HUMANA GENEALOGÍA CITOGENÉTICA GENÉTICA MOLECULAR CARTILLA PARA EL ALUMNO 1 CONTENIDOS: Genética Humana. Genealogía. Citogenética. Genética Molecular. OBJETIVO GENERAL: Que el estudiante se familiarice con conceptos básicos de Genética Humana y acceda al análisis de la herencia y la variación mediante herramientas genealógicas, citogenéticas y moleculares aplicables al diagnóstico médico actual. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Al finalizar las actividades de este teórico-práctico, Ud. deberá ser capaz de: 1) Identificar individuos no penetrantes en genealogías de herencia dominante. 2) Identificar portadores sanos en genealogías de herencia recesiva. 3) Interpretar resultados obtenidos mediante FISH con sondas monolocus. 4) Combinar estrategias diferentes en la investigación de una anomalía cromosómica. 5) Interpretar resultados de una genotipificación mediante PCR. 6) Inferir los aminoácidos codificados por una secuencia de ADN en base al código genético. INTRODUCCIÓN Conceptos básicos 2  Mucho antes de que se descubriera la naturaleza del material responsable de la herencia y la variación en los seres vivos, la Genética intuyó que los rasgos observables –fenotipo- resultaban de la acción de los genes –genotipo- condicionada por el ambiente, y que este último podía también causar cambios en los genes –mutaciones- e imitar rasgos genéticamente determinados –fenocopias- (Fig.1). Fig 1: Paradigma fundamental de la Genética El desarrollo de la teoría cromosómica de la herencia se enriqueció con las observaciones sobre el comportamiento del material genético humano durante el ciclo celular –en particular su segregación meiótica (Fig. 2)-, y habilitó la comprensión de los patrones que presentan nuestras herencias monogénicas (Tabla I) y sus irregularidades (Tabla II). 3 Fig 2: A. Cariotipos humanos normales, femenino y masculino. B. Segregación de los genes autosómicos (esferas), ligados al X y al Y, y mitocondriales (óvalos), en los gametos. Patrones Genealógicos Reconocibles Característica HAD HAR HLXD HLXR HLY HM ¿Línea? Vertical Horizontal Vertical Oblicua Vertical Vertical ¿Generaciones Sucesi Sucesi Sucesi Sucesiv Una Alternas ? vas vas vas as ¿Hnos. comprometidos 50% 25% 50% 25% 50% 100% ? ¿Mujeres: 1:1 1:1 2:1 0:1 0:1 1:1 varones? ¿Portadores No MyV No M No No sanos? ¿Al varón por? M y/o P MyP M M P M ¿Del varón a? MyV MyV M M V Nadie Tabla I: Patrones genealógicos de las herencias monogénicas humanas. 4  Irregularidades Mecanismos HLXD HLXR HAD HAR HLY Genealógicas HM Coexistencia de afecciones X X X X X X Heterogeneidad de locus genéticas Contexto, inactivación del Expresividad variable X X X X X, heteroplasmia Fenocopia X X X X X X Acción del ambiente Mutación dominante fresca o somática, rasgo recesivo Esporadicidad X X X X X X que afecta a un solo miembro de la hermandad o no se transmite Esterilidad familiar X Iatrogenia reproductiva Indemnidad feno y genotípica de los hijos de dos X X Doble heterocigosidad progenitores afectados por un rasgo recesivo Indemnidad feno y genotípica Mosaicismo gonadal para de progenitores con varios X X X X una mutación fresca hijos afectados Letalidad en hemicigosis con Nulisomía funcional parcial X muerte prenatal de varones por mutación amórfica Contexto, inactivación del Penetrancia incompleta X X X X X, heteroplasmia Unión de un homocigota Pseudodominancia X X recesivo o hemicigota con un heterocigota Tabla II: Irregularidades genealógicas y sus mecanismos de producción. Sin embargo, fue la identificación de las moléculas responsables de la génesis de los rasgos y sus roles respectivos en la década del ’50 (fig. 3), lo que puso en marcha la serie de avances científicos y tecnológicos que hoy nos está permitiendo cruzar, el umbral de la modificación selectiva del material genético y de la optimización de su expresión mediante manipulaciones ambientales. 5  Fig. 3: “Dogma” fundamental de la Genética Molecular, actualizado. A partir de entonces, los Biólogos Moleculares han ido perfeccionando la descripción del material genético humano, su expresión y el control epigenético de la misma. El material genético humano El material genético humano incluye fundamentalmente ADN, ARN y proteínas, y sobre él se imprimen las marcas epigenéticas que como la metilación lo modifican sin alterar su secuencia. Las tres moléculas son polímeros con estructura primaria –secuencia de sus monómeros-, secundaria –plegamiento bidimensional-, terciaria –repliegue tridimensional- y cuaternaria –formación de complejos con otras moléculas. El ADN es el mismo en todas las células, excepto las diferencias atribuibles por ejemplo a heteroplasmia, quimerismo o mosaicismo; a reordenamiento genómico y demás mecanismos operantes en la diferenciación de la progenie linfoide, o a la recombinación y segregación meióticas en el caso de los gametos. El ARN y la proteínas, en cambio, no lo son, y las especies presentes en una determinada célula dependen de los múltiples factores que condicionan la expresión de sus genes. Lo mismo cabe afirmar de la metilación del ADN y otras marcas epigenéticas, excepto las que corresponden a impronta genómica. ADN 6  El ADN se hereda, ya sea que integre un cromosoma nuclear linear o la dotación mitocondrial de ADN circular. Y se replica de manera semiconservativa para pasar a las células o mitocondrias hijas. Por síntesis semiconservativa se entiende que cada cadena nueva de ADN se forma incorporando nucleótido a nucleótido conforme a complementariedad con una cadena antiparalela preexistente. La polimerización progresa en sentido 5’ a 3’ de la nueva cadena (Fig. 4), y la secuencia resultante se escribe de izquierda a derecha en el sentido de su síntesis, siendo innecesario hacerlo con su complementaria. Fig. 4: Síntesis de la secuencia ACTGT. Cada cromosoma nuclear y cada anillo de ADN mitocondrial, constan de una o dos moléculas bicatenarias de ADN, según se los observe antes o después de su replicación. Salvo errores, las dos moléculas producto de la replicación son idénticas. Los cromosomas nucleares integran usualmente pares homólogos –excepto por las regiones no homólogas del X y el Y-, proviniendo cada uno de los 7 miembros de un par de un progenitor distinto, y difiriendo entre sí en cada sitio de heterocigosidad. Los anillos de ADN mitocondrial –varias decenas en cada uno de los cientos de mitocondrias de una célula- pueden dar lugar a una variedad mucho mayor, detectable como heteroplasmia. Una célula somática en G0 o G1 tiene 46 moléculas de ADN nuclear, cada una de varias decenas a varios cientos de millones de pares de nucleótidos, por lo que para estudiarlo hay que dividirlo en pedazos o seleccionar regiones de interés más pequeñas y copiarlas. Un anillo de ADN mitocondrial normal, en cambio, tiene solamente 16569 pares de nucleótidos. ARN Cada molécula de ARN es en principio monocatenaria, se sintetiza incorporando nucleótido a nucleótido conforme a complementariedad con una secuencia antiparalela de ADN que le sirve de molde, de tal modo que el transcripto original viene a ser una copia de la cadena de ADN complementaria a tal secuencia, pero utilizando ribonucleótidos. La síntesis progresa siempre desde el extremo 5’ hacia el extremo 3’ del ARN naciente, y se escribe de izquierda a derecha en el mismo sentido. En conjunto, el ARN de una célula incluye una gran cantidad y variedad de moléculas, cada una de ellas mucho más corta que la molécula de ADN nuclear a partir de la cual se originó, y adaptada para desempeñar una o más de una gama amplia de funciones. Las especies mejor conocidas son: - el ARN mensajero (ARNm), que lleva la información codificada para la síntesis de una molécula de proteína desde el ADN hasta los ribosomas, - el ARN de transferencia (ARNt), que aporta los aminoácidos individuales para ello, y - el ARN ribosómico (ARNr), que forma parte del organoide efector del proceso. 8  Por su tamaño relativamente reducido, el ARN puede ser estudiado sin necesidad de dividirlo previamente, pero a veces es necesario retrotranscribirlo primero en ADN complementario (ADNc). La dotación de ARN de una célula incluye especies comunes a todas y otras que no lo son. Las primeras corresponden a los genes de mantenimiento, y las otras a genes regulados cuya expresión depende del tipo de célula, grado de diferenciación, especialización funcional o situación metabólica. Proteínas La información codificada en el ARNm es traducida por los ribosomas en polipéptidos discretos, esto es, cadenas individuales de aminoácidos unidos entre sí por uniones peptídicas, con un extremo NH2 (amino) terminal –colinear con el extremo 5’ del ARNm, y el primero en sintetizarse y salir del ribosoma-, y un extremo COOH (carboxilo) terminal. También en este caso la secuencia de un péptido se escribe en el sentido de su síntesis. De los 20 aminoácidos que se encuentran en nuestras proteínas, nosotros podemos sintetizar algunos, los no esenciales, pero necesitamos incorporar los esenciales con la dieta (Tabla III). Tabla III: Aminoácidos esenciales y no esenciales, y su notación internacional de tres y una letra. 9  Cada aminoácido ingresa al ribosoma esterificado mediante su carboxilo al OH del extremo 3’ de un ARNt. Ni el grupo NH2 ni el grupo COOH de los aminoácidos interactúan con el ARNm: éste lo hace con el ARNt al que cada aminoácido viene unido. La secuencia del ARNm va determinando qué aminoacil ARNt ingresa al ribosoma y cede su aminoácido al polipéptido en formación, mediante la interacción de cada trinucleótido o codón de ARNm –homólogo a un codón del ADN- con un triplete homólogo o anticodón ubicado en el ARNt, siempre en función de complementariedad de bases y antiparalelismo. Lo que sí, existiría una cierta flexibilidad (tambaleo, wobble) en la interacción entre las bases del tercer nucleótido del codón y primer nucleótido del anticodón (Fig. 5), la cual permitiría que aminoacil ARNts diferentes tengan el mismo anticodón, y aún así puedan interactuar cada uno con un codón distinto. Fig. 5: Interacción codón-anticodón. De esta manera, - G en 5’ del anticodón podría aparearse con C o U en 3’ del codón. - U en 5’ del anticodón podría aparearse con A o G en 3’ del codón. - I (inosina) en 5’ del anticodón podría aparearse con A, C o U en 3’ del codón. 10  La variedad de proteínas que puede existir en una célula es mucho mayor que la que presenta su dotación de ARN, debido a que a la que resulta directamente de ésta debe sumarse la generada mediante procesamiento postraduccional. Código genético Se denomina código genético a la clave que permite predecir qué evento de incorporación de aminoácido, iniciación o terminación de la síntesis corresponderá a cada codón del ARNm, dado que secuencias correspondientes de ADN, ARNm y proteína son colineares. De los 64 codones posibles (43), uno codifica metionina (incluyendo la que comienza la síntesis), tres terminación y 60 los demás aminoácidos. La hipótesis del tambaleo explicaría esta “degeneración” (redundancia) del código genético nuclear y más aún la del mitocondrial,1 ya que sólo la metionina y el triptófano cuentan cada uno con un solo codón, mientras que los demás aminoácidos tienen hasta seis. Microorganización de los genes Sin intentar profundizar demasiado en ello, es interesante considerar que la mayoría de los genes humanos que codifican proteínas tienen la información correspondiente “fragmentada” en exones –secuencias de ADN representadas en las proteínas- separados por secuencias de ADN que no lo están –o intrones-. Y que parte importante del proceso de expresión de los genes es la eliminación de los intrones, la cual ocurre durante el procesamiento del transcripto primario que da lugar al ARNm (Fig. 6). 1 Shixin Ye, Jean Lehmann, Genetic code degeneracy is established by the decoding center of the ribosome, Nucleic Acids Research, Volume 50, Issue 7, 22 April 2022, Pages 4113–4126, en https://academic.oup.com/nar/article/50/7/4113/6553691. 11  Fig. 6: Eliminación de los intrones y empalme de los exones durante el procesamiento del transcripto primario. A ello se debe que la colinearidad que permite inferir la secuencia de aminoácidos de una proteína a partir de las secuencias de ADN o de ARN correspondientes, involucre sólo a exones. Expresión de los genes Con respecto a la expresión de los genes, la siguiente es una representación gráfica actualizada de la misma (Fig. 7).2 2 Orphanides, George and Danny Reinberg. “A Unified Theory of Gene Expression.” Cell 108 (2002): 439-451, en https://www.semanticscholar.org/paper/A-Unified-Theory-of-Gene-Expression-Orphanides- Reinberg/5909ecee2d98fd5a12a21912302eb38501da0bd6. 12  marcha el proceso: 13 La imagen ilustra lo que ocurre cuando un inductor extracelular pone en Fig. 7: Esquema de la expresión de los genes con transcripción y procesamiento acoplados, 2 que incluye la traducción o síntesis proteica.  - El inductor provoca la dimerización y activación del receptor en la membrana celular. - Su ingreso activa un factor de transcripción que se halla en el citoplasma. - El factor de transcripción activado pasa al núcleo, y previa descompactación de la cromatina se une a una secuencia regulatoria específica en el ADN. - Sigue la iniciación de la transcripción acoplada al encapuchamiento del extremo 5’ del ARN en formación. - El transcripto primario es procesado a medida que se sintetiza, con lo cual se eliminan los intrones y empalman los exones para dar lugar al ARN maduro. - Sintetizado el extremo 3’, se produce su clivado y poliadenilación. - El ARN maduro se une a proteínas antes de pasar al citoplasma. - Allí el ARNm es traducido por los ribosomas. - La proteína es transportada al compartimiento de destino, donde se pliega. Técnicas de estudio aplicables al diagnóstico médico en Genética Humana De las técnicas empleadas en Genética Humana que tienen aplicación diagnóstica, en este teórico-práctico abordaremos dos grandes grupos: - Las técnicas genealógicas, que estudian la historia familiar para identificar las manifestaciones fenotípicas de una o más afecciones, y la manera en que se segrega cada una de éstas. - Las técnicas citogenéticas, citogenético-moleculares y moleculares, que analizan el material genético tratando de vincular el fenotipo anormal hallado con una anomalía cromosómica numérica o estructural, con el exceso o defecto de un fragmento por debajo del límite de resolución del microscopio óptico, o con una alteración que afecte a un solo o a unos pocos nucleótidos. 14 Genealogía Médica La genealogía médica se utiliza en principio siempre que la ocurrencia familiar de una afección permita sospechar que estamos en presencia de una anomalía hereditaria del material genético. Esta hipótesis podrá ser apoyada o refutada mediante el consiguiente análisis de la segregación, informatizado o no, y eventualmente verificada por el hallazgo de la alteración causal en el material genético. El estudio de la historia familiar permite confeccionar el árbol genealógico respectivo. La ausencia de una convención internacional de nomenclatura y simbología genealógicas ha generado de la necesidad de avanzar en ese sentido.3 Utilizar correctamente símbolos comunes (Fig. 8) y respetar ciertas pautas (Cuadro I), permiten no sólo sistematizar la información e interpretarla acertadamente, sino también facilitar su comunicación clínica y científica. Fig. 8: Símbolos genealógicos de uso común. 3 Bennett RL, French KS, Resta RG, Doyle DL. Standardized human pedigree nomenclature: update and assessment of the recommendations of the National Society of Genetic Counselors. J Genet Couns. 2008 Oct;17(5):424-33, en https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1007/s10897-008-9169-9. 15  INSTRUCTIVO Utilizar en lo posible símbolos de uso común, y aclarar en las referencias el significado de todos los símbolos poco comunes. Colocar a todos los miembros de cada generación a la misma altura. Dibujar todos los símbolos del mismo tamaño, excepto los correspondientes a individuos aún no nacidos o abortados –que deben ser más pequeños-. Ubicar al padre a la izquierda siempre que sea factible hacerlo, y ordenar a los hermanos de mayor a menor comenzando desde la izquierda. Si alguien –usualmente el propósito, su madre o su padre- no puede ser ordenado correctamente entre sus hermanos, señalar el sitio que le corresponde mediante una marca en la línea de hermandad. Numerar las generaciones con números romanos comenzando por la más antigua, y los miembros de cada generación con números arábigos, comenzando a la izquierda con el 1. Enunciar en las referencias la enfermedad o enfermedades que motivan el estudio. Identificar a cada individuo en el anverso mediante el número de generación y el número individual. De cada individuo, registrar al menos apellido, nombre, fechas de nacimiento y defunción, causa de ésta y situación de afectado o no afectado. En la descripción verbal de una genealogía, referir todos los individuos al propósito. Cuadro I: Pautas para confeccionar un árbol genealógico. En los casos de herencia monogénica, el árbol genealógico permite inferir cómo se transmite un rasgo familiar a través de las generaciones, y evidenciar otras características útiles para el asesoramiento genético, como penetrancia, expresividad, portadores obligados, etc. Con respecto a cómo abordar un caso concreto de afección presuntamente monogénica: 1. Si la afección es esporádica no está indicado confeccionar el árbol genealógico, pero si es familiar sí cabe hacerlo. 2. Si la afección compromete al menos a tres generaciones sucesivas, puede ser dominante. 3. Si la herencia es dominante, afecta a varones y mujeres y hay transmisión de varón a varón, es autosómica. 4. Si la herencia es dominante, afecta a varones y mujeres y no hay transmisión de varón a varón, puede ser ligada al X. 16  5. Si la herencia es dominante, afecta a varones y mujeres y sólo las mujeres la transmiten, puede ser mitocondrial. 6. Si la herencia es dominante y afecta a varones exclusivamente, puede ser ligada al Y. 7. Si la herencia es dominante pero no compromete a varones o los mata antes de nacer, puede ser ligada al X. 8. Si la herencia es recesiva y todos los afectados están en la misma generación –línea horizontal-, puede ser autosómica. 9. Si la herencia es recesiva y los afectados son mayoritaria o exclusivamente varones vinculados mediante mujeres mayoritaria o exclusivamente no afectadas, puede ser ligada al X. Planteada una herencia en particular, cabe verificar su factibilidad analizando la segregación e identificando posibles irregularidades. Lo que sí, hay que tener siempre presente que lo que la genealogía permite es plantear hipótesis más o menos firmes, pero que necesitan ser validadas mediante la demostración de una variante pertinente en el material genético. Herramientas de Citogenética y Citogenética Molecular Médicas Las herramientas de la Citogenética y de la Citogenética Molecular Médicas permiten estudiar el material genético humano mediante técnicas citológicas, y en conjunto detectar anomalías de número o estructura no menores de 3 Mb. Cada cromosoma divisional humano y hasta cierto punto cada segmento del mismo, pueden ser identificados citológicamente mediante la diferenciación longitudinal que presenta al ser estudiado con técnicas de bandeo, o molecularmente recurriendo a sondas apropiadas, las cuales también pueden utilizarse en interfase (Fig. 9). 17 Fig. 9: A. Núcleo interfásico teñido con isotiocianato de fluoresceína (FITC). B. Cariotipo con bandeo G. C. Núcleo interfásico hibridado con una sonda multilocus para cromosoma 21 y otra de control, y teñido con diaminofenilindol (DAPI) como coloración de contraste. D. Cariotipo espectral (SKY) hibridado con sondas multilocus para cada cromosoma. E. Cariotipo con bandeo multicolor (M- banding) por hibridación con sondas apropiadas. F. Cromosomas analizados con sondas monolocus de cromosoma 15 para SNRPN –marcador de la región comprometida en los síndromes de Prader-Will y Angelman-, un marcador centromérico (CEP 15) y otro telomérico (PML), y teñidos con DAPI para contraste. 18  Aplicabilidad, requerimientos y limitaciones de estas técnicas se tabulan a continuación (Tabla IV). ¿TÉCNICA? ¿FASE ¿CU ¿HIBRI ¿FLUORES ¿ÚTIL PARA REORD. DEL LTIV DACIÓN? CENCIA? INTRACROMOSÓMI CICLO? O? COS? A. Tinción con Interfa No No Sí No isotiocianato se de fluoresceína (FITC) B. Bandeo G Metafa Sí No No Sí se C. FISH con Interfa No Sí Sí No sondas se monolocus D. Cariotipeado Metafa Sí Sí Sí No espectral se (SKY) E. Bandeo Metafa Sí Sí Sí Sí multicolor (M- se banding) F. FISH con Metafa Sí Sí Sí Sí sondas se monolocus Tabla IV: Aplicabilidad, requerimientos y limitaciones de técnicas citogenéticas y citogenético-moleculares. Anomalías cromosómicas numéricas y estructurales A continuación se clasifican las anomalías cromosómicas numéricas y estructurales, y detallan sus mecanismos. 19  ANOMALÍAS TIPOS SUBTIPOS MECANISMOS NUMÉRICAS POLIPLOIDÍAS (3n o más) Triploidías Polispermia, retención del II cuerpo polar o gameto diploide ANEUPLOIDÍAS (2n ± 1 o más) Monosomías No disyunción Trisomías ESTRUCTURALES INTRACROMOSÓMICAS Anillos Fracturas o recombinación Deleciones anormal y sus Duplicaciones consecuencias Inversiones Isocromosomas INTERCROMOSÓMICAS Translocaciones Tabla V: Aberraciones cromosómicas numéricas y estructurales, y sus mecanismos de producción. Nomenclatura citogenética A diferencia de lo que ocurre en Genealogía, los citogenetistas humanos han priorizado la estandarización de la nomenclatura y acompañado cada hito tecnológico con la actualización correspondiente.4,5 El cariotipo de una célula puede representarse gráficamente ordenando los cromosomas de una metafase, o simbólicamente. En el caso ilustrado (Fig. 10), la trisomía 21 en una mujer se simboliza detallando el número total de cromosomas - 47-, la dotación gonosómica –XX-, y el cromosoma en exceso precedido por el signo +, separando los tres componentes con comas y sin dejar espacios libres. 4 ISCN 2024: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (2024) Paperback – 13 Nov. 2024 English edition by Ros J. Hastings (Herausgeber), Sarah Moore (Herausgeber), Chia Nicole (Herausgeber) – S. Karger, New York, Nov. 13, 2024. 5 Moore S, McGowan-Jordan J, Smith AC, Rack K, Koehler U, Stevens-Kroef M, Barseghyan H, Kanagal-Shamanna R, Hastings R; ISCN Standing Committee. Genome Mapping Nomenclature. Cytogenet Genome Res. 2023;163(5-6):236-246, en https://karger.com/cgr/article/163/5-6/236/871427/Genome-Mapping-Nomenclature. 20  En cambio, las anomalías estructurales requieren especificar también el tipo de anomalía, el o los cromosomas afectados y el o los sitios de corte, encerrando a unos y otros entre paréntesis, y separando mediante punto y coma si hay más de un cromosoma o segmento involucrado. En la imagen, si el anillo fuera detectado en un varón por lo demás cromosómicamente normal, la notación simbólica sería 46,XY,r(8)(p23q24). Fig. 10: Arriba, núcleo interfásico y metafase hibridados con sondas para SKY, idiograma humano normal (22 autosomas, un X y un Y), y abreviaturas que designan diversas anomalías estructurales. Abajo, cariotipo con bandeo G de una mujer con trisomía 21, e idiograma de un anillo céntrico del cromosoma 8 resultado de la pérdida de material del 8 normal distal a la banda 3 de la región 2 del brazo corto, y a la banda 4 de la región 2 del brazo largo, con fusión de los extremos remanentes. En verde, las simbolizaciones respectivas. 21 Recursos para el diagnóstico molecular Anomalías menores de 3 Mb pueden abordarse mediante recursos moleculares, ya sea que ellos permitan estudiar sólo un blanco a la vez, ya sea que hagan posible analizar múltiples blancos: - Amplificación: al aumentar selectivamente el número de copias de un blanco permite detectarlo y obtener suficiente material para análisis posteriores de su tamaño, afinidad o secuencia. La técnica más empleada es la termoamplificación cíclica (PCR) de ADN genómico o ADN complementario (ADN retrotranscripto a partir de un molde de ARN), utilizando un par de cebadores para definir cada amplicón (secuencia a amplificar) de interés (Fig. 11). 22 23 mediante cultivos celulares o sistemas libres de células. Por su parte, las proteínas pueden ser biosintetizadas Fig. 11: Termoamplificación cíclica (PCR). Nótese los elementos necesarios, cómo se hace la definición del amplicón, y cómo aumenta exponencialmente el número de copias. - Exploración con sondas: el uso de fragmentos monocatenarios de ADN genómico, ADN complementario u oligonucleótido como sondas, permite detectar y hasta semicuantificar un blanco de ADN o ARN previamente desnaturalizado, al que se unen por complementariedad de bases (Fig. 12). Fig. 12: Desnaturalización, renaturalización e hibridación. Las proteínas, en cambio, deben ser reconocidas mediante otros tipos de moléculas afines, como por ejemplo anticuerpos. o Técnicas clásicamente empleadas en estudios de Genética Molecular, son las que utilizan sondas marcadas y en suspensión para investigar macromoléculas fijadas en membranas (Tabla VI). Se las denomina técnicas de blotting, y a sus productos blots, haciendo referencia a las manchas que las macromoléculas mencionadas producen en las membranas, y a la forma en la que tales manchas eran generadas al principio, homóloga al enjugado de una mancha 24  de tinta con un papel secante. Las técnicas de blotting permiten detectar un o unos pocos blancos en múltiples individuos. Tabla VI: Técnicas de blotting. o Alternativamente, múltiples sondas dispuestas bidimensionalmente en un soporte sólido, pueden utilizarse para estudiar competitivamente o no ADN genómico, ADN complementario resultante de retrotranscribir el ARNm total de una o más células, o proteína de idéntico origen, previamente marcados. Los diferentes tipos de micromatriz así generados (Fig. 13) pueden analizar hasta millones de secuencias simultáneamente, pero sólo estudiar un individuo por vez. Y sus límites de resolución en general son mayores que el de las técnicas de secuenciación. 25 26 secuencia del ADN, ARN previamente retrotranscripto o no a ADN - Secuenciación: permite conocer directamente la estructura primaria o Fig. 13: Se utiliza micromatrices cromosómicas para hibridación genómica comparativa (CGH) y análisis de polimorfismos puntuales (SNP), y “chips” de proteínas para estudios analíticos (AN) o funcionales (FN).  complementario, o proteínas, y también identificar modificaciones epigenéticas como la metilación del ADN, al mismo tiempo o no (Fig. 14). También es posible secuenciar proteínas, pero las técnicas son diferentes. Lo que sí, toda técnica de secuenciación tiene un límite de resolución de un solo residuo. Fig. 14: A. Secuenciación manual utilizando un nucleótido radioactivo, y automática con nucleótidos fluorescentes. La secuencia es la misma, la flecha roja indica el sentido de la corrida electroforética, y la verde el sentido de la lectura. B. Las metilcitosinas pretratadas con bisulfito se convierten en citosinas, pero las citosinas no metiladas son reemplazadas por uracilos y replicadas como timinas. El último medio siglo ha visto aparecer la secuenciación manual y luego la automática de ácidos nucleicos. Comenzó por recurrirse a la síntesis de múltiples copias definidas de una secuencia complementaria a la de interés, luego se logró detectar cada evento de incorporación de un nucleótido conocido en una única copia de la secuencia molde, y ahora basta con hacer que la secuencia de interés atraviese un nanoporo y al 27  hacerlo produzca un bloqueo mensurable en el flujo iónico preexistente (Fig. 15). Fig. 15: Secuenciamiento de ácidos nucleicos mediante nanoporos. La molécula monocatenaria es forzada de izquierda a derecha por el nanoporo. El pasaje de cada nucleótido obstruye un flujo iónico preestablecido a través de éste, y provoca un cambio en el trazado (arriba a la derecha) cuya magnitud difiere según cuál sea el nucleótido en tránsito. Investigación de variantes moleculares La aplicación de las técnicas moleculares de diagnóstico está condicionada por el tipo de variantes que se intenta detectar: - Las variantes subcromosómicas extensas pueden detectarse hibridando una micromatriz cromosómica o de SNPs, siempre que aquéllas hayan alterado el número de copias de una o más secuencias blanco. Una vez detectadas, su caracterización puede continuarse mediante sondas apropiadas y Southern blotting, por ejemplo. - En cambio, la detección de sustituciones (Fig. 16) y variantes segmentarias de unos pocos nucleótidos de longitud se hace mediante secuenciación, 28  aunque una vez halladas pueda recurrirse por ejemplo al dot blotting o a la PCR para buscarlas en individuos adicionales. Fig. 16: Las sustituciones se clasifican en transiciones –cuando implican reemplazo de una base por otra con el mismo número de ciclos- y transversiones, cuando el número de ciclos de las bases involucradas es diferente. Por lo demás, cada técnica es útil dentro de ciertos límites cuali y cuantitativos que conviene tener presentes, a fin de poder recurrir a ellos maximizando la probabilidad de arribar al diagnóstico, e interpretar correctamente sus resultados.6 El registro y comunicación formal de tales resultados requiere atenerse a pautas de nomenclatura convencionales, si bien en permanente evolución.7,8,9 6 Miller DT, Adam MP, Aradhya S, Biesecker LG, Brothman AR, Carter NP, Church DM, Crolla JA, Eichler EE, Epstein CJ, Faucett WA, Feuk L, Friedman JM, Hamosh A, Jackson L, Kaminsky EB, Kok K, Krantz ID, Kuhn RM, Lee C, Ostell JM, Rosenberg C, Scherer SW, Spinner NB, Stavropoulos DJ, Tepperberg JH, Thorland EC, Vermeesch JR, Waggoner DJ, Watson MS, Martin CL, Ledbetter DH. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am J Hum Genet. 2010 May 14;86(5):749-64, en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2869000/. 7 ISCN 2020: An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (2020). Edited by: Jean McGowan-Jordan, Ros J. Hastings, Sarah Moore. https://doi.org/10.1159/isbn.978-3-318-06867-2. ISBN (print): 978-3-318-06706-4. ISBN (electronic): 978-3-318-06867-2. Publisher: S.Karger AG. Published: 2020. 8 Liehr, Thomas. (2021). International System for Human Cytogenetic or Cytogenomic Nomenclature (ISCN): Some Thoughts. Cytogenetic and Genome Research. 161. 1-2. 10.1159/000516654, en https://www.researchgate.net/publication/353986295_International_System_for_Human_Cytogenetic_or_Cytogenomic_Nom enclature_ISCN_Some_Thoughts. 9 den Dunnen JT, Dalgleish R, Maglott DR, Hart RK, Greenblatt MS, McGowan-Jordan J, Roux AF, Smith T, Antonarakis SE, Taschner PE. HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants: 2016 Update. Hum Mutat. 2016 Jun;37(6):564-9, en https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26931183/. 29 ACTIVIDADES ACTIVIDAD N° 1 El siguiente es un esquema de la transmisión familiar de un rasgo dominante con penetrancia incompleta que puede deberse a varios tipos de herencia. Obsérvelo con atención. Luego de hacerlo, complete la tabla al pie. HERENCIAS SÍMBOLOS PARA INDIVIDUOS NO PENETRANTES DOMINANTES FALTA DE (OBLIGADOS) POSIBLES PENETRANCIA ACTIVIDAD N° 2 El siguiente es un esquema de la transmisión familiar de un rasgo recesivo que puede deberse a varios tipos de herencia. Obsérvelo con atención. Luego de hacerlo, complete la tabla al pie. 30  HERENCIAS SÍMBOLOS PARA INDIVIDUOS PORTADORES SANOS RECESIVAS PORTADORES SANOS (OBLIGADOS) POSIBLES ACTIVIDAD N° 3 El síndrome de DiGeorge se debe a hemicigosis para varios genes importantes para el desarrollo del sistema inmunológico, el corazón, el paladar y otros sistemas del cuerpo. Utilizando sondas monolocus apropiadas –Tuple1, roja, para la región crítica en 22q11.2- y ARSA, verde, para una región control en 22q13.3-, se obtiene mediante FISH y microscopía de epifluorescencia las siguientes imágenes a 400 X (izquierda) y 1000 X (derecha), respectivamente. 31 a) Marque con una (X) la fase ilustrada por cada imagen. FASE 400 X 1000 X Interfase Profase Metafase Anafase Telofase b) Recuadre la posición relativa de ARSA con respecto a Tuple1. Centromérica Telomérica c) Subraye la mutación identificada. Deleción Duplicación Inversión Translocación 32 ACTIVIDAD N° 4 A fin de confirmar la identificación lograda mediante citogenética de bandas, de un cromosoma anular derivado de un cromosoma 4, se realiza un estudio de FISH con sondas monolocus para las regiones subteloméricas de ese cromosoma (primer panel), la proteína centromérica 4 y la región alterada en el síndrome de Wolf-Hirschhorn (WHS) (segundo panel). Luego se hace un análisis mediante hibridación genómica comparativa micromatricial (aCGH) para cuantificar la extensión cromosómica afectada. Los resultados se presentan a continuación: obsérvelos atentamente y luego satisfaga las respectivas consignas. a) Indique en el recuadro al pie si se trata de un anillo céntrico (con centrómero) o acéntrico (sin centrómero). 33 b) Recuadre el impacto sobre la región WHS asociado a la formación del anillo. Deleción Duplicación Inversión c) Subraye la extensión aproximada en Mb de la región afectada en el cromosoma 4, teniendo en cuenta que éste tiene unos 190 Mb. 34  Menos de 10 Mb 10 a 40 Mb Más de 40 Mb ACTIVIDAD N° 5 Una mujer no afectada pero heterocigota para la mutación ∆F508 – ausencia del codón para la fenilalanina 508- en el gen CFTR, tiene un hijo afectado por fibrosis quística (HAR). Se termoamplifica directamente ADN genómico del paciente (P) y de sendos controles homocigotas (C1 y C2), el primero normal y el segundo anormal, con cebadores apropiados, se analiza los productos mediante electroforesis, y se obtiene el siguiente resultado. a) Recuadre el tamaño del amplicón normal. 54 pb 95 pb 98 pb b) Subraye el genotipo del paciente. Hemicigota Heterocigota Homocigota c) Marque con una (X) la explicación más probable de la aparente discrepancia. 35  ( ) Muestra de paciente homocigota mutante contaminada con ADN homocigota normal. ( ) Uno de los cebadores utilizados no es perfectamente complementario al blanco. ( ) El alelo de origen paterno incluye una mutación patogénica que no es ∆F508. ( ) El paciente es un heterocigota doble para fibrosis quística. ACTIVIDAD N° 6 La investigación de mutaciones puntiformes y segmentarias pequeñas requiere recurrir a las técnicas de secuenciación. Las siguientes secuencias representan el genotipo parcial de tres individuos emparentados. En ellas se ha destacado un codón en particular. Obsérvelas atentamente. 36  Luego de hacerlo: a) Indique en el recuadro que precede a cada secuencia si el genotipo representado es homo o heterocigota. b) Señale en el siguiente recuadro si la sustitución hallada es una transición o una transversión. c) En base al código genético al pie, señale en el recuadro que sigue a cada secuencia el o los aminoácidos que resultarían de transcribir y traducir el codón destacado. BIBLIOGRAFÍA GENERAL Temas de Introducción a la Medicina y Genética en el Campus Virtual. 37  Jorde LB, Carey JC y Bamshad MJ. Genética Médica, 5ª Edición. Elsevier, España, 2016. BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA NHGRI – Glosario Parlante de Términos Genómicos y Genéticos, accesible en https://www.genome.gov/es/genetics-glossary. Dallaire L, Huret JL Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology 2002-12- 01 Patrones mendelianos y atípicos de herencia, en https://atlasgeneticsoncology.org/teaching/30116/patrones-mendelianos-y-at-iacute;picos-de- herencia. Genetic Alliance; The New York-Mid-Atlantic Consortium for Genetic and Newborn Screening Services. Cómo entender la genética: Una guía para pacientes y profesionales médicos en la región de Nueva York y el Atlántico Medio. Washington (DC): Genetic Alliance; 2009 Jul 8. Anexo I, MÉTODOLOGÍAS DE PRUEBAS GENÉTICAS, en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK132206/. 38