UD 2. FUNDAMENTOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR PDF

Técnico Superior en Laboratorio Clínico y Biomédico MP. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA UD2. – Fundamentos de biología molecular 1|Página UD1.1. – LA UNIDAD CELULAR  BIOLOGÍA MOLECU...

Técnico Superior en Laboratorio Clínico y Biomédico MP. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA UD2. – Fundamentos de biología molecular 1|Página UD1.1. – LA UNIDAD CELULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA UNIDAD 2. Los laboratorios de biología molecular INDICE 1. Introducción. Los ácidos nucleicos.................................................................................................................... 3 2. El ácido desoxirribonucleico.............................................................................................................................. 9 3. El ARN.............................................................................................................................................................. 12 4. El flujo de la información genética.................................................................................................................. 16 5. Enzimas empleadas en la biología molecular.................................................................................................. 30 2|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 1. Introducción. Los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos son moléculas fibrilares muy grandes, que desempeñan funciones biológicas importantísimas para todos los seres vivos. Contienen la información genética, la información codificada que permite a los organismos disponer de los necesario para desarrollarse, desde el nacimiento a la muerte. No solamente cuentan con el mensaje genético” que serían los genes, sino que también tienen las instrucciones” precisas para su lectura. Así, los ácidos nucleicos son biopolímeros formados por otras unidades estructurales más pequeñas o monómeros denominados nucleótidos Los nucleótidos son moléculas complejas que resultan de la combinación de una molécula de ácido fosfórico (en forma de grupo fosfato), un azúcar (pentosa) y una base nitrogenada. Hay dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Se diferencian en su estructura y composición química, pero ambas están formadas por largas cadenas de nucleótidos. En el caso del ADN, es el almacén de información genética que se hereda y se controla su transmisión en la descendencia. En el caso del ARN, se encarga de la expresión de la información genética mediante la síntesis de proteínas. Las bases nitrogenadas: Son compuestos heterocíclicos (anillos) planos de carbono y nitrógeno con diferentes radicales. Estos pueden ser de dos tipos: o Bases púricas: Derivan de la purina y son la Adenina (A) y la Guanina (G) o Bases pirimidínicas: Derivan de la pirimidina y son la Citosina (C), Timina (T) y el uracilo (C). La adenina, la guanina y la citosina están presentes tanto en el ADN como en el ARN, sin embargo, la timina solo está en el ADN y el uracilo está solo en el ARN. 3|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA La pentosa es un glúcido de 5 átomos de carbono que forma parte de la estructura de un nucleótido y puede ser de dos tipos: o D-ribosa: En los nucleótidos de ARN o 2-desoxi-D—ribosa: En los nucleótidos que componen el ADN El ácido fosfórico es el tercer componente de los nucelótidos, en los que se encuentra en forma de anión fosfato o grupo fosfato. Este tiene una estructura tetraédrica con el átomo de fósforo en posición central y los cuatro átomos de oxígeno ocupando los vértices del 4|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA tetraedro. Tiene carga negativa y es el responsable de que los ácidos nucleicos también tengan carga neta negativa. Nucleósidos Se denomina nucleósido a la molécula que resulta de la unión entre la pentosa (ribosa o desoxirribosa) y una base nitrogenada (púrica o pirimidínica). El enlace entre la pentosa y la base nitrogenada es de tipo N-glucosídico y se establece, con la pérdida de una molécula de agua entre el -OH hemiacetálico del C1’ de la pentosa (ribosa o desoxirribosa) y el hidrógeno del N1 si se trata de una base pridmidínica o del N9 si es una base púrica. (Para evitar confusiones, los átomos de la base nitrogenada se enumeran con la serie 1, 2, 3, 4…mientras que los átomos de la pentosa lo hacen con la serie 1’, 2’, 3’, 4’, 5’): Los ribonucleósidos contienen A, G, C y U unidas a la ribosa. Los desoxirribonucleósidos contienen A, G, C y T unidas a la desoxirribosa. Los nucleósidos se nombran añadiendo a la base nitrogenada: La terminación -osina en el caso de las bases púricas. La terminación -idina en el caso de las bases pirimidínicas. Si la pentosa es la desoxirribosa, se añade el prefijo desoxi- al nombre. Nucleótidos Proceden de la unión mediante enlace éster de una molécula de ácido fosfórico en forma de grupo fosfato con el -OH del carbono 5’ de la pentosa de un nucleósido, de manera que el nucleótido es el nucleósido fosforilado en posición 5’. Una vez, el grupo fosfato de los nucleótidos -5’-monofosfato puede unirse a otros grupos y da lugar a las siguientes combinaciones de gran interés biológico: Forma enlaces ricos en energía con otros grupos fosfato para dar lugar a los nucleótidos difosfato y trifosfato, como el ADP y el ATP, capaces de transportar la energía almacenada en sus enlaces que son fácilmente hidrolizables. Establece en un segundo enlace éster con el -OH en posición 3’, lo que origina un puente intramolecular como el AMP cíclico (AMPc), que es una molécula señalizadora que actúa de segundo mensajero entre las moléculas extracelulares portadoras de información (neurotransmisores, hormonas, prostaglandinas, etc.) y el interior de la célula. 5|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Si se une a un grupo fosfato de otro mononucleótido o de otra sustancia, da lugar a los nucleótidos no nucleicos, que no forman parte de los ácidos nucleicos, sino que actúan como coenzimas. Por ejemplo, el coenzima A, el FAD (flavin adenín dinucleótido) y el NAD+ (nicotín adenín dinucleótido). Si forma otro enlace éster con el -OH en posición 3’ de otro nucleótido, que a su vez puede incorporar otro nucleótido y así sucesivamente hasta originar cadenas de polinuceótidos consecutivas de los ácidos nucleicos. Son estas las que se van a enfocar en este tema. 6|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 7|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster entre el carbono 5’ de un nuceótido y el carbono C3’ del siguiente nucleótido, dando lugar a las cadenas lineales polinucleotídicas que constituen los polinucleótidos o ácidos nucleicos. Cuando el número de nucleótidos que integran la cadena no es muy grande, se habla de oligonucleótidos. Toda cadena de nucleótidos tiene dos extremos libres: el extremo 5’ con un grupo fosfato unido al C5’ de la pentosa del primer nucleótido y el extremo 3’, con un radical hidroxilo (-OH) unido al C3’ de la pentosa del último nucleótido. Las moléculas de ácidos nucleicos, constituidas por largas cadenas de nucleótidos, se caracterizan por las siguientes propiedades fisicoquímicas: Son fuertemente ácidas en solución acuosa debido a los grupos fosfato. Presentan una elevada viscosidad incluso a concentraciones bajas. Muestran un característico pico de absorción de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm. Esta propiedad resulta útil para determinar su concentración: midiendo la absorbancia de una solución a 260 nm podremos determinar su concentración en ácidos nucleicos. Las dos cadenas de nucleótidos que forman la doble hélice de una molécula de ADN se pueden separar elevando la temperatura o aumentando el pH (pH alcalino). Este proceso se denomina desnaturalización y se produce por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La desnaturalización es reversible, de manera que al disminuir la temperatura 8|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA lentamente o bajar el pH hasta valores neutros, se vuelven a formar los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias y la molécula de ADN recupera su conformación nativa en doble hélice. Este fenómeno se denomina renaturalización. Dos cadenas de ácidos nucleicos con una secuencia de bases nitrogenadas complementaria, en condiciones adecuadas de temperatura, pH y fuerza iónica, se unen mediante puentes de hidrógeno entre las bases complementarias en un proceso denominado hibridación. 2. El ácido desoxirribonucleico El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas. En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células como parte de los cromosomas pero también existen pequeñas cantidades dentro de las mitocondrias y en los cloroplastos. En los procariotas, la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en una menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos. También algunos virus contienen ADN como material genético. Las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) son biopolímeros lineales formados por la polimerización de desorribonucleótidos-5’-monofosfato de adenina, guanina, citosina y timidina (no existe de uracilo). En medio acuoso celular, los largos filamentos de ADN adoptan igual que las proteínas, una estructura tridimensional, una conformación espacial. En este caso, solo tiene una conformación primaria y secundaria, nada más aunque como se ha visto en anteriores temas, combinándose con determinadas proteínas puede alcanzar grandes niveles de complejidad estructural en su compactado hasta llegar a formar los cromosomas. Estructura primaria del ADN. El ADN es un polímero formado por largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la 9|Página UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA pentosa es siempre desoxirribosa) de adenina, guanina, citosina y timina (no contiene uracilo). La estructura primaria de una molécula de ADN es la secuencia de bases nitrogenadas en el esqueleto de su cadena de desoxinucleótidos. Principio de complementariedad Cuando algunos nucleótidos se enfrentan, se mantienen unidos mediante puentes de hidrógeno entre los grupos polares de sus bases nitrogenadas. Esto solo se produce entre bases nitrogenadas complementarias en función de su tamaño y su estructura. Concretamente, son complementarias: La adenina y la timina, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno (A=T). La citosina y la guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C≡G). Ninguna otra combinación de bases presenta complementariedad en el ADN. Esta propiedad de los nucleótidos se conoce como principio de complementariedad. Para 10 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA que la unión sea estable, es necesario además que los dos nucleótidos que portan las bases complementarias sitúen sus grupos fosfato en posiciones opuestas. La doble hélice En 1953 Watson y Crick propusieron un modelo para describir la estructura del ADN que permite explicar el principio de complementariedad y que sostiene que el ADN es una doble hélice. La configuración en doble hélice del ADN constituye su estructura secundaria y sostiene que el ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos que forman una doble hélice alrededor de un eje central. Organización de las moléculas de ADN En virus de ADN Los virus presentan la mayor diversidad en cuanto a organización de su material genético. En el caso de los virus que contienen ADN, presentan una única molécula que puede ser lineal o circular, bicatenaria o monocatenaria. En organismos procariotas En los procariotas, el ADN se encuentra en su mayor parte en un solo cromosoma y en 11 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA una menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos. En organismos eucariotas En los organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células como parte de los cromosomas, ADN cromosómico nuclear, pero también existen pequeñas cantidades dentro de las mitocondrias, ADN mitocondrial, y en los cloroplastos, ADN de cloroplastos. ADN copia El ADN copia (ADNc) es un tipo de ADN especial obtenido in vitro. No existe como tal en la naturaleza, se obtiene en el laboratorio a partir del ARN aislado de una célula, mediante una enzima denominada retrotranscriptasa que sintetiza ADN utilizando como molde ARN. Esta enzima permite obtener una copia en ADN de todas las moléculas de ARN presentes en una célula en un estado metabólico concreto, lo que constituye una herramienta muy útil para conocer la información almacenada en el ADN con los estudios de expresión génica. 3. El ARN El ácido ribonucleico controla la síntesis de proteínas a partir de la información contenida en el ADN. En los organismos eucariotas se encuentra en el núcleo, en el citoplasma y en los ribosomas del citoplasma. Algunos virus solo contienen ARN mientras que otros tipos de virus solo contienen ADN. 12 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Tipos de ARN Existen varios tipos de ARN que podemos clasificar según su estructura y función de la siguiente manera: ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ANRr) y ARN de transferencia (ARNt), como tipos principales. Con función reguladora de la expresión génica: ARNsi, ARNmi. ARN mensajero 13 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA El ARN mensajero (ARNm) está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños, cada una de las cuales porta la información para la síntesis de una proteína. Supone entre el 2% y el 5% del ARN total de una célula. Concretamente, su secuencia de bases nitrogenadas, es copia exacta de la secuencia de un gen de ADN, determina la ordenación secuencial de los aminoácidos que constituyen la proteína (un codón constituido por tres bases codifica un aminoácido). En consecuencia, el ARNm transmite la información genética contenida en el ADN a la maquinaria celular de síntesis de proteínas. Las moléculas de ARNm procariota son policistrónicas, es decir, portan información para la síntesis de varias proteínas distintas. Por el contrario, las moléculas de ARNm eucariota son monocistrónicas, es decir,contienen información para la síntesis de una única proteína. ARN ribosómico El ARN ribosómico (ARNr) es el mayoritario en las células (aproximadamente el 80%). Combinado con proteínas forma los ribosomas, orgánulos citoplasmáticos responsables de la síntesis de proteínas.Los ARNr se clasifican según su coeficiente de sedimentación: En las células procariotas hay tres tipos: 5S, 16S y 23S. En las células eucariotas hay cuatro tipos: 5S, 5.8S, 18S y 28S. Presentan múltiples regiones complementarias, por lo que tienen una estructura secundaria muy compleja, con numerosas horquillas y bucles. 14 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA ARN de transferencia Los ARN de transferencia (ARNt) transportan los aminoácidos hasta los ribosomas para su incorporación en la cadena proteica que se está sintetizando. ARN con función reguladora Se conocen varios tipos de ARN que toman parte en la regulación de la expresión génica. Son moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas de ARNm. Algunas de estas moléculas son bicatenarias (ARN interferente pequeño o ARNsi) y otras son monocatenarias con regiones complementarias que forman una horquilla (microARN o ARNmi). Estas moléculas se unen a las regiones complementarias del ARNm y bloquean la traduccióna proteína o activan enzimas que 15 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA degradan el ARNm. Otros tipos de ARN ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Es una mezcla de largas moléculas lineales precursoras del ARNm (pre-ARNm). Se encuentra en el núcleo de la célula y tras un proceso de maduración dan lugar al ARNm, que sale al citoplasma. ARN pequeño nuclear (ARNsn). Es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se localizan en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con actividad enzimática. Concretamente intervienen en la maduración del ARNm. ARN pequeño nucleolar (ARNsno). Se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios ARNr. Tiene un coeficiente de sedimentación de 45S y cuando se fragmenta da lugar a los ARNr 5.8S, 18S y 28S. 4. El flujo de la información genética Flujo de información genética que interrelaciona ADN, ARN y proteínas. Los procesos en rojo solo se producen en algunos tipos de virus ARN.Ya hemos podido observar que el ADN almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas. Para que el ADN pueda llevar a cabo estas funciones 16 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA son necesarios tres procesos metabólicos principales: la replicación, la transcripción y la traducción. Replicación del ADN Es el proceso por el cual una molécula de ADN se duplica para dar lugar a dos moléculas de ADN hijas idénticas, que conservan la misma secuencia de bases que la molécula inicial. Por lo tanto, mediante la replicación el ADN se copia para transmitirse a la descendencia. Características generales de la replicación. La replicación presenta varias características comunes a procariotas y eucariotas: Es semiconservativa. En cada molécula hija, una de las cadenas procede de la molécula original que se replica y la otra cadena es de nueva síntesis. Comienza en un origen de replicación. Es bidireccional. Es semidiscontinua Las enzimas del proceso de replicación La replicación del ADN es un proceso complejo que se puede dividir en fases y en el que participan múltiples enzimas. La explicación de las fases en que se produce será más fácil si se conocen antes las enzimas que toman parte en él: Helicasa. Desenrolla y separa las dos cadenas de la doble hélice. Empieza en el origen de replicación y continúa en ambos sentidos a medida que avanzan las 17 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA horquillas de replicación. Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP). Se unen a las cadenas desenrolladas evitando que se vuelva a formar la doble hélice. Girasa y topoisomerasa. La separación de las dos cadenas de ADN en la burbuja de replicación genera un superenrollamiento en el resto de la doble hélice. Estas dos enzimas relajan la tensión de la doble hélice mediante cortes y empalmes. ADN polimerasa. Es la responsable de la síntesis de la nueva cadena, añadiendo desoxinucleótidos al extremo 3’ de una cadena en crecimiento. La ADN polimerasa no puede iniciar una cadena, solo puede elongar una preexistente de ADN o ARN, añadiendo desoxinucleótidos a la posición 3’ libre. Primasa. Es una enzima con función ARN polimerasa que sintetiza cortos fragmentos de ARN (aproximadamente 10 nucleótidos) denominados cebadores o primers, complementarios de zonas concretas de la cadena de ADN que se está replicando. Ligasa. Es la enzima responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí y con la hebra conductora para conseguir la continuidad de la cadena de nueva síntesis. Fases de la replicación Aunque existen diferencias entre el proceso de replicación en procariotas y eucariotas, el desarrollo del proceso en procariotas nos servirá como explicación de las fases de la replicación; sobre esta veremos las variaciones que se producen en eucariotas. La replicación en procariotas se puede dividir en dos fases: iniciación y elongación. 1. La primasa sintetiza los cebadores en dirección 5’ 3’. En la hebra conductora solo se requiere un cebador inicial en el origen de replicación, puesto que la elongación de la cadena se produce en el mismo sentido en que avanza la horquilla de replicación. En la hebra retardada, por el contrario, la primasa sintetiza un primer cebador en una zona próxima a la horquilla inicial de replicación y alejada del origen de replicación, pero, a medida que la horquilla de replicación avanza, se requiere la síntesis sucesiva de nuevos cebadores que darán lugar a los fragmentos de Okazaki. 2. La primasa se separa de la cadena molde y entra la ADN polimerasa III que inicia la elongación del cebador mediante la incorporación de desoxinucleótidos en la posición 3’ libre. A medida que crece la cadena, la ADN polimerasa III se va desplazando 18 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA sobre la cadena molde, «leyendo» su secuencia e incorporando secuencialmente los desoxinucleótidos complementarios. En la cadena conductora, la elongación de la cadena continúa hasta que se fusionan ambas horquillas de replicación (hay que recordar que el cromosoma bacteriano es circular). En la cadena retardada la ADN polimerasa se separa de la cadena molde cuando la elongación de la cadena alcanza el cebador del fragmento de Okazaki anterior. 3. La ADN polimerasa I se une a la cadena a nivel de los cebadores, los elimina mediante su actividad exonucleasa 5’ 3’ y los sustituye por ADN mediante su actividad polimerasa. 4. La ligasa une los fragmentos de Okazaki consecutivos, dando continuidad a la hebra retardada. Los posibles errores en la incorporación de bases se reparan gracias a la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa III. Trasncripción del ADN a ARN La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza una molécula de ARN utilizando como molde una cadena de ADN. Las enzimas del proceso de transcripción son las siguientes: ARN polimerasa-ADN dependiente o transcriptasa: o Tipos en eucariontes: ▪ ARN polimerasa I. ▪ ARN polimerasa II. 19 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA ▪ ARN polimerasa III. Fases de la transcripción: o Iniciación. o Elongación. o Terminación Maduración del ARN La maduración es el proceso que requieren las cadenas de ARN transcritas para dar lugar a los tipos principales de ARN que se han explicado (ARNt, ARNr, ARNm). PROCARIOTAS En estos organismos los ARNt y ARNr se sintetizan en forma de largas moléculas de ARN denominadas transcitos primarios, que contienen numerosas copias de cada uno de ellos. Estos transcritos son posteriormente cortados por enzimas específicas para dar lugar a los distintos tipos de ARNt y ARNr. Por el contrario, el ARNm transcrito no requiere ninguna modificación posterior. EUCARIOTAS En estos organismos, la maduración de los ARNt y ARNr es similar a como sucede en los procariotas, pero por el contrario la maduración del ARNm requiere un proceso 20 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA complejo de maduración antes de poderse traducir a proteínas. Esto es debido a que en la mayoría de genes eucariotas se alternan dos tipos de secuencias, denominadas intrones y exones. Los exones son secuencias que se transcriben y se traducen, ya que portan información para la síntesis de una región de una proteína.Los intrones son secuencias que se transcriben pero no se traducen puesto que no codifican para una cadena de aminoácidos. A este ARN sintetizado directamente mediante el proceso de transcripción se le denomina ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) o pre-ARNm. La maduración se puede esquematizar en tres pasos: 1. Adición de la caperuza en 5’. Esta caperuza consiste en la incorporación de una 7- metilguanosina-trifofato que lo protege de la degradación. 2. Adición de la cola de Poli-A en 3’. Una enzima denominada Poli-A polimerasa añade una cola de poli-A en el extremo 3´ de la nueva cadena de ARN. El número de residuos de adenina varia dependiendo de la especie desde unas decenas a varios cientos, esta cola le sirve al ARNm maduro salir del núcleo. 3. Eliminación de los intrones: tiene lugar mediante un proceso de corte y empalme denominado splicing, en este proceso intervienen proteínas denominadas ribonucleoprotínas pequeñas nucleares (RNPsn) se agupan formando el espliceosoma, estos complejos proteicos forman bucles en las secuencias intronicas y finalmente la cadena de ARN se corta en la base de esos bucles y se empalman los exones dando lugar al ARNm maduro. Maduración del ARNm en eucariotas antes de salir al citoplasma. El proceso incluye la adición de una caperuza en el extremo 5’, la adición de una cola de Poli-A en el extremo 3’ y la eliminación de intrones. 21 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Maduración del ARNm en eucariotas antes de salir al citoplasma. El proceso incluye la adición de una caperuza en el extremo 5’, la adición de una cola de Poli-A en el extremo 3’ y la eliminación de intrones. 22 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Corte y empalme o splicing del ARNm en eucariotas para eliminar las secuencias intrónicas. Traducción del ARN La traducción es el proceso por el cual a partir de una molécula de ARNm se sintetiza una proteína. Durante la traducción, los aminoácidos se van incorporando secuencialmente de manera precisa a la cadena polipeptídica en crecimiento de acuerdo con la información contenida en la secuencia de nucleótidos del ARNm. Ahora bien, ¿cómo se pasa de un «lenguaje» de cuatro letras (las cuatro bases nitrogenadas del ARN) a un «lenguaje» de 20 letras (los 20 aminoácidos que forman las proteínas)? Esto es posible gracias al código genético. El código genético es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas a una secuencia de aminoácidos. Se basa en que una secuencia de tres bases nitrogenadas codifica un aminoácido. Cada triplete de bases nitrogenadas que codifican un aminoácido se denomina codón.De las 64 posibles codones que existen (43), 61 codifican aminoácidos y 3 soncodones de terminación. Características del código genético Es universal. El código genético es el mismo para todos los organismos. Es decir, un codón específico codifica el mismo aminoácido en un eucarionte, en un procarionte y en un virus. Una excepción es el código genético mitocondrial, en el que algunos codones concretos codifican un aminoácido distinto. No es ambiguo. Cada codón codifica un único aminoácido. Es degenerado. Dado que hay 20 aminoácidos y 61 codones codificantes, es evidente que el código genético tiene redundancia. Esto es, la mayor parte de los aminoácidos están codificados por más de un codón. Los distintos codones que codifican un mismo aminoácido se denominan codones sinónimos. Es continuo y no solapado: en la cadena de ARNm, los codones se disponen de manera secuencial uno a continuación de otro, sin espacios ni comas y sin compartir ninguna base. 23 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Codones para la iniciación y para la erminación Todas las secuencias de ARNm que se van a traducir empiezan con el codón de inicio AUG,que codifica para metionina. Los codones UAA, UAG y UGA son codones de terminación. Fases del proceso de traducción Para que se lleve a cabo la síntesis de polipéptidos se requiere: Una molécula de ARNm, que contiene la información de la secuencia de aminoácidos. Los 20 aminoácidos, que son los componentes de las proteínas. Los ribosomas, que son los orgánulos en los que se realiza el proceso y están constituidos por ARNr y proteínas. Los ARNt, que transportan los aminoácidos hasta los ribosomas. Las enzimas que catalizan la unión entre aminoácidos. Los ribosomas constan de dos subunidades de distinto tamaño: la subunidad menor y la subunidad mayor. La subunidad menor tiene un sitio de unión al ARNm. 24 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA La subunidad mayor tiene dos sitios de unión a los ARNt: El sitio peptidil o sitio P, donde se sitúa el ARNt que porta la cadena polipeptídica en crecimiento. El sitio aminoacil o sitio A, donde se sitúa el ARNt que porta el siguiente aminoácido que se va a incorporar a la cadena. Cada aminoácido se une a su respectivo ARNt por la acción de una enzima aminoacil- ARNtsintetasa, específica. Cada ARNt tiene en el lazo anticodón un triplete de bases nitrogenadas (anticodón) complementarias del codón que codifica el aminoácido que porta. Iniciación El proceso se inicia con la unión de la subunidad menor del ribosoma a un ARNm, a la altura del codón de inicio AUG A continuación un ARNt con un anticodón UAC (complementario del codón AUG) se incorpora al conjunto mediante la formación de puentes de hidrógeno entre las bases delcodónanticodón. Este ARNt transporta el aminoácido metionina. A este conjunto se le denomina complejo de iniciación. Posteriormente se incorpora la subunidad grande del ribosoma, de manera que el ARNt-Met se sitúa en el sitio P. 25 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Elongación Comienza con la incorporación al sitio A de un segundo aminoacil-ARNt que tiene un anticodón complementario al segundo codón del ARNm. A continuación la enzima peptidil-transferasa cataliza la formación de un enlace peptídico entre la metionina (en el sitio P) y el aminoácido que se encuentra en el sitio A. De esta manera, el ARNt del sitio P queda sin aminoácido y el ARNt del sitio A está ahora unido a un dipéptido. Una vez formado el enlace peptídico, el ribosoma se desplaza a lo largo de la molécula de ARNm en dirección 5‘ 3', en un movimiento denominado translocación.De esta 26 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA manera, el primer ARNt, ahora sin aminoácido, se separa del complejo; el ARNt que porta el dipéptido se traslada al sitio P y en el sitio A entra un nuevo aminoacil-ARNt con un anticodón complementario al tercer codón del ARNm. Cada vez que se repite este ciclo se incorpora un nuevo aminoácido a la cadena polipeptídica en crecimiento. 27 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 28 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Terminación Se produce cuando el ribosoma alcanza en el ARNm un codón de terminación (UAA, UGA o UAG). No existe ningún ARNt que tenga un anticodón complementario de algún codón de terminación. Por el contrario, existen los llamados factores de liberación que sí reconocen estas secuencias, se sitúan en el sitio A y hacen que la peptidil-transferasa hidrolice la unión entre la cadena polipeptídica y el ARNt que la porta en el sitio P. con lo quedicha cadena se libera del complejo. A continuación, se disocia todo el complejo: las dos subunidades del ribosoma se separan y los factores de liberación, el ARNm y el ARNt se liberan. 29 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 5. Enzimas empleadas en la biología molecular Las técnicas de biología molecular que iremos abordando en las siguientes unidades implican manipulaciones de ácidos nucleicos, tales como amplificación, degradación, corte, unión, marcaje, secuenciación, etc. Todas estas acciones son posibles gracias a la actividad catalizadora de enzimas específicas que son aisladas de todo tipo de organismos (virus, bacterias y células eucariotas). Realizan in vitro la misma actividad que llevarían a cabo in vivo en condiciones fisiológicas. Estas enzimas son, por tanto, una parte muy importante de las herramientas que se van a utilizar en biología molecular. Nucleasas Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos. Clasificación de las nucleasas Dependiendo de sus características se pueden clasificar de varias maneras: Según el tipo de ácido nucleico que atacan: o Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa). Son enzimas capaces de romper enlaces fosfodiéster entre ribonucleótidos. o Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa). Son enzimas capaces de romper enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos. Según el tipo de cadena que atacan: o Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias, rompiendo enlaces en ambas cadenas. o Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias. Por ejemplo, la nucleasa S1 degrada ARNss, ADNss y zonas monocatenarias de ADNds, como lazos o bucles. Según la situación del punto de corte: o Exonucleasas, que eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo (en dirección 5‘a3', 3‘a5' o en ambas). o Endonucleasas, que cortan en puntos intermedios de la molécula. Algunas endonucleasas como la ADNasa 1, son muy útiles cuando se usan a baja concentración porque son capaces de producir en moléculas bicatenarias de ADN la rotura de un 30 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos solamente en una de las cadenas Estas roturas se denominan mellas (nick en inglés) y son fundamentales para un tipo de marcaje de sondas denominado desplazamiento de mella (nick translation). Según la especificidad del corte: o Nucleasas que cortan aleatoriamente. Son enzimas que cortan la cadena de nucleótidos de forma aleatoria. o Nucleasas que cortan en sitios concretos de la molécula. Son enzimas que se unen a una cadena de nucleótidos en una secuencia específica y la cortan, como es el caso de las endonucleasas de restricción que abordaremos en el apartado siguiente dada su especial relevancia. Endonucleasas de restricción Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario (de entre 4 y 8 pares de bases) y producen un corte en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula. A las secuencias de ADN específicas que reconocen se las denomina dianas de restricción. En las bacterias, las endonucleasas de restricción, de alguna manera, constituyen un sistema de defensa inmune, puesto que su función biológica es degradar el ADN exógeno o ajeno, principalmente procedente de virus. Para evitar fragmentar su propio ADN, las bacterias se protegen modificando sus dianas de restricción mediante metilación de bases nitrogenadas. De hecho, en muchas ocasiones la enzima de restricción tiene ambas funciones (corte y metilación). Tipos de enzimas de restricción Enzimas de restricción tipo I: la enzima reconoce su diana de restricción y efectúa un corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta 1000 pb. Estas enzimas no generan patrones específicos de fragmentos, es decir, cada vez que cortan una misma molécula de ADN generan fragmentos distintos, por lo que no tienen gran utilidad en biología molecular. Enzimas de restricción tipo II: reconocen la diana de restricción y cortan en puntos específicos, generalmente dentro de la misma diana. En consecuencia, estas enzimas generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre que se enfrentan a la misma molécula cortan por los mismos puntos. Son una herramienta 31 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA fundamental en biología molecular y se las llama tijeras moleculares. Enzimas de restricción tipo III: reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a una distancia corta (25-30 pb). Nomenclatura Las enzimas de restricción se nombran normalmente con tres letras y un número romano. Las tres letras se escriben en cursiva y corresponden al nombre científico de la bacteria de la que se han obtenido. La primera letra es la inicial del género; las otras dos, las primeras letras de la especie. El número romano indica el orden en que se ha aislado la enzima en la misma especie. Por ejemplo, Pvu II es el nombre de la segunda enzima de restricción aislada de Proteus vulgaris. En ocasiones, cuando la enzima se ha aislado de una cepa concreta de una especie bacteriana, se añade una cuarta letra mayúscula que la representa. Así, EcoR V es el nombre de la quinta enzima de restricción aislada de Escherichia coli, cepa RY13. Tipos de corte El corte realizado por una enzima de restricción puede ser de dos maneras distintas que se caracterizan por los extremos generados: Extremos romos. El corte se produce en el mismo punto en las dos cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción. Extremos cohesivos. El corte se produce en puntos distintos de ambas cadenas, normalmente en los extremos de la diana de restricción. Esto genera en cada extremo sendas regiones monocatenarias cortas y complementarias entre sí, lo que hace que sean muy reactivos al poderse adherir a fragmentos de ADN que 32 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA tengan secuencias de bases complementarias. Aplicaciones en biología molecular Permite crear moléculas de ADN recombinante El procedimiento es el siguiente: 1. Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción. 2. Cuando los fragmentos con extremos cohesivos de ambas moléculas se mezclan, se unirán por la complementariedad de bases de sus respectivas regiones monocatenarias generadas por la enzima de restricción. 3. Finalmente, las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante De esta manera se puede insertar un determinado gen de un organismo -que sea responsable de la producción de una determinada proteína- en otro diferente, con la finalidad de producirlaen grandes cantidades. Así por ejemplo actualmente la insulina humana de uso terapéutico es producida en gran escala por bacterias gracias a la tecnología del ADN recombinante. 33 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Patrones de restricción Para una enzima de restricción concreta una molécula de ADN presenta un número relativamente pequeño de dianas de restricción. En consecuencia, la digestión con esa enzima genera un número discreto de fragmentos de distintos tamaños. Estos fragmentos se pueden separar según su tamaño mediante la técnica de electroforesis en gel de manera que se obtiene un conjunto de bandas que es único para un ADN en particular y que se denomina patrón de restricción. Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN dada tiene muchas utilidades como pueden ser la identificación de muestras pertenecientes a un mismo individuo, la realización de estudios filogenéticos (relación evolutiva entre organismos) y la detección de posibles anomalías en el diagnóstico prenatal o en la detección de mutaciones (si se produce una mutación que afecta a una diana de restricción, el patrón de restricción que se obtendrá será diferente). 34 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Actualmente se conocen cientos de enzimas de restricción, cada una con una diana de restricción diferente, lo que supone un inmenso material para la realización de estudios filogenéticos y de mutaciones. (véase la imagen de la página anterior) ADN Polimerasas La mayor parte de las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos requiere una fase previa de amplificación Las ADN polimerasas permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación. De hecho, la técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PC R) que permite obtener millones de copias de una secuencia de interés. Actualmente se dispone de numerosas polimerasas, que se diferencian en: La velocidad de polimerización (número de nucleótidos incorporados por segundo). La fidelidad en la replicación (proporción de errores). La termoestabilidad (la temperatura a la que se inactivan). La procesividad (número de nucleótidos que pueden incorporar antes de separarse de la cadena molde). La presencia o ausencia de actividad exonucleasa además de la actividad polimerasa. Dependiendo de la técnica en la que se vayan a usar, interesarán unos tipos u otros. Por ejemplo: En la PC R, las muestras se someten a ciclos de desnaturalización, hibridación y polimerización. Como en la fase de desnaturalización se alcanzan temperaturas por encima de los 90 ºC, interesará trabajar con polimerasas de gran termoestabilidad. Además, convendrá que su procesividad, su velocidad de polimerización y su fidelidad sean altas. En el marcaje de sondas mediante la técnica de desplazamiento de mella, los requerimientos son diferentes (se verá más detallado en temas consecutivos). Otras enzimas 35 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Retrotranscriptasas Las retrotranscriptasas o transcriptasas inversas son ADN polimerasas-ARN dependientes. Es decir, sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN como molde. El ADN sintetizado se denomina ADN copia (ADNc). Se han aislado de los retrovirus, virus cuyo material genético es ARN, el cual se retrotranscribe a ADN en la célula infectada y se integra en el genoma de la célula huésped. El empleo de estas enzimas ha permitido: Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en combinación con técnicas de ADN recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADNc, fiel reflejo de la expresión génica de una célula en un momento dado. La amplificación de ARN. La PCR convencional no amplifica ARN, puesto que las ADN polimerasas que se emplean son ADN dependientes. Sin embargo, un paso previo de retrotranscripción con un cebador específico permite obtener un ADNc de la secuencia de ARN que queremos amplificar, sobre el cual podemos aplicar después una PCR convencional. Este tipo de PCR que amplifica ARN se denomina RT-PCR. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) La desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3‘ de una molécula de ADN.A diferencia de otras ADN polimerasas, no requiere de un cebador ni de una cadena molde para ejercer su actividad. En presencia de una molécula bicatenaria de ADN y desoxinucleótidos, sintetiza colas de ADN monocatenarias en ambos extremos 3'.Se han aislado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfomas y leucemias. Una de sus principales utilidades es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos marcados. Ligasas Las ligasas unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3' de una molécula y 5' de la otra.Pueden también reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds mediante la formación del correspondiente enlace fosfodiéster. 36 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Son muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN de distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción. Existen también ligasas de ARN que permiten circularizar moléculas monocatenarias. Topoisomerasas Las topoisomerasas relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas de replicación o transcripción.Se utilizan para relajar estructuras superenrolladas de ADN, como paso previo a la aplicación de otras técnicas de biología molecular. 37 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR  BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA 38 | P á g i n a UD2. – FUNDAMENTOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR