BASE DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE 2024.pptx

LES BASES DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Laboratoire National de référence VIH/IST – Centre Hospitalier Abass NDAO 1 PLAN HISTORIQUE RAPPELS SUR LA CELLULE RAPPEL SUR LES ACIDES...

LES BASES DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Laboratoire National de référence VIH/IST – Centre Hospitalier Abass NDAO 1 PLAN HISTORIQUE RAPPELS SUR LA CELLULE RAPPEL SUR LES ACIDES NUCLÉIQUES MÉTHODES D’ÉTUDE Extraction des acides nucléiques Les techniques d’amplification et de détection ORGANISATION DU LABORATOIRE 2  Un peu d’histoire! Selon Michel Morange, la biologie moléculaire est "l'ensemble des techniques et découvertes qui ont permis l'analyse moléculaire des processus les plus intimes du vivant, de ceux qui en assurent la perennité et la reproduction" 1866: Les "lois de l'hérédité" (Mendel) 1928 : Expérience de Griffith sur les principes de la transformation 1944 : ADN= support de l’information génétique (Avery, Mac Leod, Mc Carthy) 1952: L'expérience de Herschey et Chase sur le marquage de l’ADN 1953 : Structure de l’ADN (Watson et Crick) Prix Nobel de Médecine 1962 3  Crick et Watson, 1953 Découverte de la structure de la molécule d'ADN – Base des lois de réplication et synthèse protéique  ADN et ARN = acides nucléiques 4 Une science ….. Des Prix Nobel 5 RAPPELS SUR LA CELLULE 6  LA CELLULE LES ORGANISMES VIVANTS Etres pluricellulaires ou êtres unicellulaires Base de tout être vivant 7  LA CELLULE té in es e s pr o vie u it d à l a prod essaires né c es tc a mu pab ltip le d lie e s r e cellule  Pour fabriquer une protéine, il faut deux choses:  Des acides aminés.  La « recette » : quels acides aminés faut-il assembler et dans quel ordre ? 8 LA CELLULE EUCARYOATE « Recettes » contenues dans le noyau Noyau contient une matière appelée chromatine Chromatine = protéines appelées histones et d'ADN ADN = « recettes » des protéines 9  BACTÉRIES Est ce la même chose pour les bactéries ? Bactérie : être unicellulaire sans noyau mais avec la présence d’ADN SCHEMA BACTERIE 1µ 10  VIRUS Et les virus ? - Les virus contiennent des acides nucléiques - Un seul type et ils sont incapables de se multiplier seuls. - Ils ont besoin de coloniser d’autres cellules vivantes ADN ARN Hepatite B Hepatite A 11 RAPPELS SUR LES ACIDES NUCLÉIQUES: ADN / ARN STRUCTURES / FONCTIONS 12  LES ACIDES NUCLÉIQUES Un sucre Un nucléoside Une base Un nucléotide Un groupe phosphate P Acides nucléiques = polymères de nucléotides 13 STRUCTURE  NUCLÉOTIDE = ose + base azotée + acide phosphorique Base azotée Groupement phosphate 5’ 4’ 1’ Sucre 3’ 2’ 14 STRUCTURE  L’ose : pentose cyclique 5’ 5’ HOH2C OH HOH2C OH 4’ 1’ 4’ 1’ 3’ 2’ 3’ 2’ OH OH OH Ribose Désoxy-ribose  L’acide phosphorique : OH O P OH OH 15 STRUCTURE  Les bases azotées : puriques ou pyrimidiques Uracile 16 STRUCTURE : ADN 1/3  ADN = Acide DésoxyriboNucléique  Polymères de nucléotides reliés par des fonctions esters 4’ 1’ 5’ 5’ 3’ 2’ 3’ Liaison 3’OH-5’P  Ose = désoxyribose  Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Thymine A=T et G=C Pourquoi ? 17 STRUCTURE : ADN 2/3  Hypothèse de Crick et Watson : A peut s'apparier avec T et C avec G: A avec T : deux liaisons hydrogène C avec G : trois liaisons hydrogène 18 STRUCTURE : ADN  ADN: 2 brins de nucléotides (bicatenaire)  Ces deux brins ont trois propriétés essentielles :  antiparallèles  complémentaires  hélicoïdaux 19 STRUCTURE : ADN 3/3  L'orientation entre les liaisons donne une structure en forme de double hélice à pas droit :  Les plans des bases sont perpendiculaires à l’axe de l’hélice  Donc les bases s’empilent 20 ADN DES DIFFÉRENTS ÊTRE VIVANTS  Dans tous les organismes : Support de l’information génétique Structure en double hélice (sauf certains virus)  Différences : Nombre de molécules d’ADN : 1 pour E. Coli et 46 pour l’Homme Longueur : quelques milliers de nucléotides à plusieurs millions Forme : linéaire ou circulaire Localisation dans la cellule : séparé ou non du cytoplasme par une membrane 21 ADN DES DIFFÉRENTS ÊTRE VIVANTS  Procaryotes : ADN dans le cytoplasme Un seul chromosome « circulaire » = continu Plusieurs millions de nucléotides Présence de plasmides = petits morceaux d’ADN circulaires, indépendants de l’ADN principal  Eucaryotes : ADN dans le noyau Plusieurs chromosomes avec ADN fortement ADN compacté et linéaire Plusieurs milliards de nucléotides Histones ADN associé à des protéines  Virus: pas de noyau ADN ou ARN double ou simple brin 1 ou 2 copies segmenté ou non 22 STRUCTURE : ARN  ARN = Acide RiboNucléique  Polymères de nucléotides reliés entre eux par des fonctions esters 5’ HOH2C OH  Ose = ribose 4’ 1’ Ribose 3’ 2’ OH OH Les bases : Adénine, Guanine, Cytosine et Uracile  ARN = un seul brin (monocatenaire) Appariement :A avec U et G avec C  entre 2 ARN différents, entre ADN et ARN ou sur lui même 23  ARN Vs ADN Bases ADN Bases ARN Bases 24 ARN Vs ADN Image adapted from National Human Genome Research Institute 25  CONFIGURATION REVERSIBLE DE L'ARN Eléments de structure secondaire Structure tertiaire 26  Different types of RNA 3 types majeurs d’ARN mRNA (mesensger RNA): Product of DNA transcription tRNA (transfer RNA): Transport aminoacids during translation rRNA (ribosomal RNA): Involved in protein synthesis 28 ACIDES NUCLÉIQUES : RÉSUMÉ ATTACGCCA - double brin 5’ 3’ ADN - désoxyribose 3’ 5’ TAATGC GGT - thymine Transcription - simple brin AUUACGCCA - ribose RNA 5’ 3’ - uracile L’ARN A LA MEME SPECIFICITE QUE L’ADN 29 LE CODE GÉNÉTIQUE :  ADN = Lieu de stockage de l’information génétique  Sous forme CODÉE = chaque protéine est codée par un gène (ou plusieurs si la protéine est polymérique) L’unité de base des protéines est l’acide aminé Chaque acide aminé est codé par un codon Codon = triplet de nucléotides (ex : AGC = Ser)  Pourquoi utiliser un code de trois nucléotides ?  4 nucléotides : Si 2 nucléotides = 1 acide aminé On ne disposerait que de 16 acides aminés (42) Si 3 nucléotides = 1 acide aminé On disposerait de 64 acides aminés (43)  Or il existe 20 acides aminés différents 31  Le code génétique : (déchiffré entre 1960 et 1964) AAA Phénylalanine AGA Sérine ATA Tyrosine ACA Cystéine AAG Phénylalanine AGG Sérine ATG Tyrosine ACG Cystéine AAT Leucine AGT Sérine ATT STOP ACT STOP AAC Leucine AGC Sérine ATC STOP ACC Tryptophane GAA Leucine GCA Proline GTA Histidine GCA Arginine GAG Leucine GCG Proline GTG Histidine GCG Arginine GAT Leucine GCT Proline GTT Glutamine GCT Arginine GAC Leucine GCC Proline GTC Glutamine GCC Arginine TAA Isoleucine TGA Thréonine TTA Asparagine TCA Sérine TAT Isoleucine TGG Thréonine TTG Asparagine TCG Sérine TAG Isoleucine TGT Thréonine TTT Lysine TCT Arginine TAC Méthionine TGC Thréonine TTC Lysine TCC Arginine CAA Valine CGA Alanine CTA Asparagine CCA Glycine CAT Valine CGG Alanine CTG Asparagine CCG Glycine CAG Valine CGT Alanine CTT Ac. glutamique CCT Glycine CAC Valine CGC Alanine CTC Ac. glutamique CCC Glycine N.B. 64 combinaisons pour 20 acides aminés Code redondant (il est dit dégénéré): plusieurs triplets différents peuvent coder pour le même acide aminé. Trois triplets signifient la fin du message = triplets STOP 32 MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES.Préparation de l’échantillon.Amplification.Détection 33 MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES Comment peut on isoler (extraire) l’ADN et l’ARN ? Préparation de l’échantillon 34 Techniques de biologie moléculaire : 3 étapes PREPARATION ECHANTILLON AMPLIFICATION DETECTION From …to nucleic amplified sample… acids product result. 35 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Extraction des acides nucléiques : ADN ou ARN Lyse des parois et enveloppes Lyse des protéines Précipitation des acides nucléiques Lavage pour élimination des détergents Resuspension de la matrice (ADN / ARN) 36  EXTRACTION : 3 ÉTAPES Lyse Echantillons Capture avec la silice Extrait pur d’ADN et d’ARN Elution 37 MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES Comment peut on amplifier l’ADN et l’ARN ? Amplification 38 POURQUOI AMPLIFIER ??? Avant Après 39 AMPLIFICATION PCR : révolutionnaire mise au point en 1985 par Kary Mullis, (Nobel,1993) couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante Amplification in vitro d’une région spécifique d'un acide nucléique donné Obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier 40 TRANSCRIPTION INVERSE OU RÉTROTRANSCRIPTION (RT) Processus transformation en ADN complémentaire(ADNc) par une transcriptase inverse(RT) Transcriptase inverse est la principale enzyme impliquée rétrotranscription La transcription inverse est une caractéristique intéressante pour le diagnostic in vitro permet d'amplifier les cibles d'ARN, après l'obtention de l'ADNc Reverse Transcription PCR (RT-PCR) est adaptée pour les cibles ARN Certains virus d'intérêt médical majeur ont un génome ARN --> VIH, VHC »plus stable chimiquement »obligatoire pour permettre une PCR 41 PCR: Eléments nécessaires DNA Polymerase Nucleotides ou dNTPs Amorces ou Primers ThermoCycleur 42 PCR: ETAPE DE DENATURATION chauffage à 94-98°C 43 PCR: ETAPE D’HYBRIDATION Refroidir vers 55-65°C 44 PCR:ETAPE D’ÉLONGATION Chauffage vers 72°C 45 CYCLE DE PCR 1. Dénaturation 2. Hybridation 3. Extension 46 PCR : 3 étapes Zone à amplifier ADN + amorces + dNTP + DNA polymérase Dénaturation 95°C Hybridation à 55-60°C de l’amorce en 5’ et de l’amorce en 3’ (amorce =primer =oligonucléotide) Synthèse de chaque brin Complémentaire par la DNA Polymérase (Thermus Aquaticus) 47  TECHNIQUES DE DÉTECTION EN TEMPS RÉEL  Détection couplée à la réaction d’amplification Fluophores, sondes... automatique Détection précoce du produit amplifié Haute sensibilité et précision Pas de manipulation post PCR 48  DÉTECTION EN TEMPS RÉEL Plusieurs techniques ‫٭‬des systèmes en tubes fermés et automatisés ‫٭‬utilisent des émetteurs de fluorescence → agents se liant à l’ADN → les sondes d’Hydrolyse: Sonde TaqMan → les Sondes d’Hybridation: Sonde Molecular Beacons 49 PLATEFORMES DE CHARGE VIRALE ET DIAGNOSTIC PRÉCOCE 50 MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES NUCLÉIQUES - Comment peut on amplifier l’ADN et l’ARN ? Organisation du travail 51 AMPLIFICATION SYNONYME DE ….?  SENSIBILITÉ  RISQUE DE CONTAMINATION  INHIBITEURS  ORGANISATION SPÉCIFIQUE DANS LE LABORATOIRE 52  CONTAMINATION POURQUOI ?  échantillon – contamination inter échantillons, aérosols  amplicons – mauvaise organisation de travail Se rappeler qu’avec les techniques d’amplification seulement une séquence cible suffit pour avoir une réponse positive ! 53  ORGANISATION DU TRAVAIL Pour éviter les contaminations... FLUX DE TRAVAIL A SENS UNIQUE  Matériel spécifique à chaque poste +  Pièces séparées x x x Prep Réactif Prep échantillon Amplification Détection “propre” “propre” “Contaminé” “Contaminé” 54 Plan de laboratoire : 2 ou 3 salles de manips CLEAN Bidirectional traffic CLEAN ROOM ROOM  Sample  Reagent Area Area DIRTY ROOM  Amplification One Way traffic only Area  Detection Area 55 AUTRES DIFFICULTÉS : PRÉSENCE D’INHIBITEURS DÉFINITION : Substance qui peut être présente dans l’échantillon ou dans le matériel et qui va inhiber l’amplification conduisant à un résultat faussement négatif - ex. crystal, hemoglobin... 56 INHIBITEURS - COMMENT PEUT ON LES DÉTECTER ? CONTROLE INTERNE Solution dont le résultat est connu Utilisé pour évaluer une technique 2 types Contrôle qualité Contrôle interne 57  CONTRÔLES CONT QUAL. vérifie CONT. INTERNE vérifie le réactif le réactif l’instrument l’instrument la manipulation la manipulation l’amplification Pour une série pour chaque échantillon 58  CONTRÔLE QUALITÉ sample 1 sample 3 sample 5 neg cont pos cont sample 2 sample 4 sample 6 CONTRÔLE INTERNE échantillon CI amplicon + sonde CI détection amplification amplicon + sonde cible 59 MERCI DE VOTRE ATTENTION 60