Unidad 2. El Microscopio PDF

TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO UTILIDAD DEL MICROSCOPIO El microscopio nos permite ver objetos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. Micro = pequeño. Scopio = ver, observar. En el laboratorio de...

TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO UTILIDAD DEL MICROSCOPIO El microscopio nos permite ver objetos demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. Micro = pequeño. Scopio = ver, observar. En el laboratorio de análisis clínicos suelen observarse al microscopio muestras biológicas como sangre, médula ósea, orina, LCR… y en el laboratorio de anatomía patológica se observan cortes histológicos. CLASIFICACIÓN DE LOS MICROSCOPIOS Existen 2 tipos de microscopios: - Microscopios ópticos. Usan una fuente de luz. En el MO la fuente de iluminación permite “iluminar” el objeto a estudio. Los primeros microscopios usaban luz solar pero luego se usaron bombillas y otros métodos de iluminación. - Microscopios electrónicos. Usan un haz de electrones. En el ME se usa un cañón de electrones que chocan con la muestra. PROPIEDADES ESENCIALES EN UN MICROSCOPIO - Aumento: es la capacidad del microscopio de agrandar una imagen. Es el número de veces que se aumenta el tamaño real de la muestra. - Resolución: es la capacidad que tiene un sistema óptico de ver separados dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que estos puntos se puedan ver individualizados. Los microscopios electrónicos proporcionan mayor aumento y resolución que los microscopios ópticos. BREVE HISTORIA DE LA MICROSCOPÍA El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio óptico o fotónico. Este nombre se debe a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas y de luz visible como fuente de iluminación. La historia del microscopio empieza con la invención del microscopio óptico compuesto, es decir, con la idea de combinar más de una lente para observar objetos de forma aumentada. Acorde con esta definición, la historia del microscopio empezaría a finales del siglo XVI, posiblemente con el diseño de Zacharias Janssen. Sin embargo, es importante tener en cuenta que antes de la invención del microscopio ya era común la utilización de lentes de aumento, también conocidas como lupas. Las lupas son también un tipo de microscopio llamado microscopio simple. No obstante, cuando se habla del invento del microscopio se hace generalmente referencia a la idea del microscopio compuesto. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO Desde finales del siglo XIX se tenía claro que el poder de resolución del microscopio óptico estaba limitado. Es decir si se ponían lentes con mayor aumento se perdía la resolución. La posibilidad de lograr un mayor poder de resolución no se vislumbró hasta que se realizaron unos descubrimientos científicos relacionados con las propiedades de los electrones libres y se concibió la idea que las partículas más pequeñas (como por ejemplo la ultraestructura de las células y tejidos) podrían ser observadas con un haz de electrones enfocado con lentes electromagnéticas, naciendo así el microscopio electrónico. El primer MICROSCOPIO ELECTRÓNICO fue construido en el año 1931, es decir, a principios del s.XX. Al mismo tiempo, a principios del siglo XX, para ampliar la gama de posibilidades en la obtención de información al estudiar células y tejidos, se diseñaron diversos tipos de microscopios ópticos que permitieron incrementar el contraste y la nitidez de la imagen, modificando el sistema de iluminación, el tipo de lentes empleados o cualquier otro elemento de la estructura del instrumento. MICROSCOPIOS CON APLICACIONES ESPECIALES (de campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia...). Microscopio de fluorescencia Aumentar el contraste implica destacar un elemento sobre los demás en una misma imagen. También podemos definir el contraste como la diferencia entre el tono más negro y blanco en una imagen. Cuanto mayor sea esta diferencia tonal, mayor contraste tendrá la imagen. Aumentar la nitidez implica aumentar el grado de claridad con que el observador ve los detalles de una imagen. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO A finales del s. XX la informática se constituyó como una herramienta de indispensable en microscopía. SISTEMAS DE CAPTACIÓN Y ARCHIVO DE IMÁGENES DIGITALES. La digitalización y obtención de micrografías de alta resolución que luego son colgadas en internet, para su uso a distancia e intercambio de información con fines docentes o diagnósticos es una realidad. Las imágenes obtenidas mediante un microscopio pueden ser capturadas con cámaras digitales y procesadas con programas especiales para tal fin. El resultado es el incremento de detalles e información que se puede obtener a partir de la imagen original. Una vez capturada la imagen, se procesa con un programa que permite la aplicación de una serie de filtros para modificar el contraste, el brillo y la saturación de colores; variables éstas que son manipuladas para mejorar sustancialmente el aspecto final de la imagen. En la actualidad el procesamiento de las imágenes es una herramienta indispensable en la obtención de micrografías de calidad. En este tema nos centraremos especialmente en el microscopio óptico compuesto de campo claro o de campo luminoso por ser el más usado en análisis clínicos pero también estudiaremos otros tipos de microscopios que se usan en determinadas ocasiones. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO FUNDAMENTOS EN MICROSCOPÍA ÓPTICA LENTES. REFRACCIÓN. La lente en un microscopio óptico es una pieza de material transparente que posee dos superficies pulidas y diseñadas de una manera específica para producir la convergencia de los rayos luminosos que la atraviesan, concentra los rayos de luz en un punto. Las lentes de superficies convexas se denominan positivas, convergentes, recolectoras o de aumento y por tanto son las interesantes en este tema. Sus dos superficies pueden ser curvas como en la imagen y hablamos entonces de lentes biconvexas o una de ellas puede ser plana hablando entonces de lentes plano-convexas. Cuando la luz viaja por un medio y atraviesa otro medio, las ondas luminosas sufren refracción, fenómeno que se manifiesta mediante una desviación en la dirección de la luz. Si el rayo incidente llega de manera perpendicular a la superficie de una lámina de vidrio, de superficies paralelas, no es desviado de su trayecto rectilíneo, pasando del aire al vidrio y de este último al aire nuevamente. Por el contrario, si el rayo incide de manera oblicua sobre la superficie de la lámina de vidrio, es desviado de su dirección rectilínea al entrar al vidrio, pues pasa de un medio menos denso (aire) a otro medio de mayor densidad (vidrio) y es desviado nuevamente al salir del vidrio hacia el aire. Si dividimos la velocidad de la luz en el vacío (c) entre la que tiene en un medio transparente (v), obtenemos el índice de refracción de ese medio (n) Material Índice de refracción Vacío 1 Aire 1,00029 Agua 1,333 Vidrio 1,514 Aceite de cedro 1,515 Glicerina 1,470 Diamante 2,417 Ejemplos del índice de refracción en algunos medios transparentes El índice de refracción de un medio es una medida para saber cuánto se reduce la velocidad de la luz dentro del medio transparente en estudio. Si el índice de refracción del agua es n= 1,333, quiere decir que la luz es 1,333 veces más rápida en el vacío que en el agua. El índice de refracción es un valor que tiene que ver con las propiedades de las lentes. Obsérvense tres rayos a, b, y c, cuya incidencia es normal (perpendicular) en relación a la cara plana de la lente. Al inicio, estos rayos no serán refractados; atravesarán la lente, llegaran a la cara convexa en donde si se refractan y su destino será diferente. El rayo bn no se refracta. Los rayos a y c oblicuos en relación a la cara curva de la lente serán refractados, cortando el rayo bn en el punto f (foco de la lente). Todo rayo que no pasa por el centro de la lente es refractado. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO AUMENTO DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie. Una lente convexa con mayor curvatura originará mayor aumento. En el microscopio óptico se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular. Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces. Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente fórmula: AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular Si usamos el objetivo y el ocular de la imagen ¿cuál sería el aumento total? Aunque esta fórmula básica permite obtener el aumento total de una imagen, con las técnicas de fotografía clásica o fotografía digital y el uso de software de procesamiento de imágenes es posible lograr un aumento suplementario. El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x (objetivo 100x y ocular 10x). Esta limitación ha sido resuelta con la microscopía electrónica empleando un haz de electrones en lugar de un rayo de luz visible. RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO Poder de resolución y límite de resolución El poder de resolución es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro. La distancia entre esos dos puntos que se pueden ver como separados se conoce como límite de resolución. El poder de resolución (PR) es la inversa del límite de resolución (LR). Es de pura lógica. Si el límite de resolución es un número alto implica que el poder de resolución es bajo. Límites de Resolución aproximados: El ojo humano puede separar puntos que estén a una distancia de 0,25 mm El microscopio óptico puede separar puntos que estén a una distancia de 0,25 µm El microscopio electrónico puede separar puntos que estén a una distancia de 0,25 nm TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO ¿Cómo podemos aumentar la resolución? Para hallar el poder de resolución tenemos esta fórmula: PR = n · sen α / λ PR = poder de resolución α = la mitad del ángulo de apertura del objetivo n = el índice de refracción del medio que se encuentra entre el objeto y el objetivo tal como vimos anteriormente. Para el aire n = 1 y para el vidrio y el aceite n = 1.51 λ = longitud de onda de la fuente emisora Interpretando la fórmula, vemos que el poder de resolución de un microscopio depende de: El ángulo de apertura (α). A mayor α mayor PR. El índice de refracción (n). A mayor n mayor PR. La longitud de onda de la fuente emisora (λ). A menor λ, mayor PR. El ángulo de apertura ( α) se aumenta con la lente condensador que es una lente que se coloca entre la fuente de luz y la muestra y consigue aumentar el ángulo de apertura y con ello la resolución. El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formará un cono luminoso frente al objetivo. Se colocó otra lente (4) que recoge y condensa la luz antes que ilumine al objeto. El índice de refracción (n) podemos aumentarlo colocando una gota de aceite de inmersión cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto (1,51). Con el uso del aceite de inmersión la luz que atraviesa la muestra pasa al cubre y luego al aceite (no atraviesa aire que tiene un índice de refracción de 1,00 y que al ser bastante diferente al vidrio produciría mayor refracción). De esta forma se incrementan los rayos capturados por las lentes del objetivo, se consigue que una mayor cantidad de luz llegue al objetivo, mejorando notablemente la resolución. Con el aceite de inmersión se elimina prácticamente la desviación del haz luminoso. Hay objetivos preparados para usar otros líquidos de inmersión distintos al aceite de cedro como agua (n=1,33) o glicerina (n=1,47) que se recomiendan para ver preparaciones de células vivas. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO En resumen: - Para aumentar el poder de resolución de un microscopio óptico usamos la lente condensador (o simplemente el condensador) y los aceites de inmersión. - El aumento del poder de resolución de un microscopio electrónico se consigue porque disminuimos la longitud de onda de la fuente emisora. La longitud de una onda es la distancia a la que se repite la forma de la onda. La luz visible tiene una longitud de onda aproximadamente entre 400 nm y 700 nm. La longitud de onda del haz de electrones está en torno a 5 x 10-11 m. Calcula en nanómetros la longitud de onda del haz de electrones usado en el microscopio electrónico. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO TRANS-ILUMINACIÓN Y EPI-ILUMINACIÓN  Trans-iluminación La trans-iluminación ha sido el primer método de iluminación en la larga historia de la microscopía. El rayo electromagnético (luz visible por ejemplo) debe atravesar el objeto (ej. corte histológico). Como condiciones fundamentales para ser observados al microscopio compuesto, los preparados biológicos deben ser muy delgados y transparentes. Las muestras histológicas para observarlas al microscopio óptico deben ser rebanadas con instrumentos especializados (microtomos) que permiten obtener cortes de espesor entre 1 y 5µm. Para la microscopía electrónica de transmisión se emplean cortes ultra finos (espesor del orden de los nanómetros) debido al bajo poder de penetración de los electrones. La transparencia es otra cualidad que debe tener el objeto (preparado histológico). Las células son incoloras por naturaleza, pero algunas poseen color propio (pigmentos). Para mejorar la transparencia se emplean ciertas sustancias químicas (agente aclarador como el xilol). Ser transparente facilita en gran medida el paso del rayo de luz. La estructura de las células y tejidos es muy heterogénea y crea diferentes densidades en los compartimientos intra y extracelulares. Para mejorar la visualización de tales variaciones en la concentración de los constituyentes celulares, se pueden emplear colorantes que incrementen el contraste entre ellas y permitan su identificación. Esto no siempre es necesario, es factible sin ningún tipo de colorantes observar células con algunos microscopios especiales cuyo sistema de iluminación crea contrastes muy evidentes que de ordinario, no se observan con el microscopio compuesto clásico. El microscopio compuesto clásico, la microscopía electrónica de transmisión y algunos microscopios especiales emplean la transiluminación.  Epi-iluminación Con esta técnica de iluminación el rayo de luz incide de manera oblicua sobre la muestra. Las muestras pueden observarse sin necesidad de realizar cortes finos y en muchos casos tampoco se emplean colorantes. La transparencia del objeto no es imprescindible. Como efecto de la epi-iluminación es posible obtener imágenes tridimensionales. Varios tipos de microscopios emplean este método como los microscopios de epi-fluorescencia y el electrónico de barrido. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO https://www.youtube.com/watch?v=86RmR6Lpo1c A_________________ B________________ C ________________ D _____________ E_________________ F ________________ G ________________ H _____________ I _________________ J _________________ K ________________ L _____________ M _______________ http://www.educaplay.com/es/recursoseducativos/680237/partes_del_microscopio_optico.htm SISTEMA MECÁNICO Soporte (pie o base + brazo o columna) El pie o base, con un peso considerable, garantiza la estabilidad del instrumento. Aloja la fuente de iluminación. Tubo/s Estructura hueca entre ocular/es y objetivos. La platina Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histológicas. Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz. Posee un sistema de fijación e inmovilización del porta (pinzas). El carro (D) se mueve con los tornillos del carro (K) que proporcionan un desplazamiento hacia adelante o hacia atrás y de derecha a izquierda y viceversa. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO Tornillos macrométrico y micrométrico Logran el enfoque desplazando en sentido vertical la platina. El tornillo macrométrico acerca o aleja rápidamente la preparación del objetivo logrando un enfoque grueso pero para enfocar con mejor precisión usamos el tornillo micrométrico que produce un movimiento lento para el enfoque fino. El revólver Permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. En el revólver van atornillados los objetivos. SISTEMA ÓPTICO Los objetivos Constituyen un sistema óptico situado próximo a la preparación a observar y formado por una o varias lentes. Son responsables de la formación primaria de la imagen. Su principal función consiste en recolectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Distinguimos objetivos secos (Ej. 10x, 20x, 40x) y objetivos de inmersión (60x, 100x) según estén fabricados para usarse con aire entre el cubre y el objetivo o con determinadas sustancias líquidas como agua destilada, glicerina o aceite de cedro.  objetivos secos (aire entre el cubre y el objetivo)  objetivos de inmersión (sustancias líquidas entre el cubre y el objetivo) Un objetivo consiste en un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas. En la parte externa posee grabadas las especificaciones y características necesarias para su uso apropiado. La especificación más interesantes a nivel de usuario es el aumento. En el caso de los objetivos de inmersión también es interesante el medio de inmersión (aceite/oil, agua/water/W, GLYC). TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO El ocular Es la parte más próxima al ojo del observador. Los oculares están formados por lentes que producen un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x. Según el número de oculares los microscopios pueden ser monoculares o binoculares. Los usados en clínica son los binoculares que disponen de dos sistemas de ajuste para adaptarse a las peculiaridades de cada observador: anillo giratorio para corregir los defectos visuales de refracción del usuario y un sistema de desplazamiento para ajustar la distancia interpupilar. SISTEMA DE ILUMINACIÓN: Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se verá afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema óptico. La iluminación óptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observación. Fuente de luz En sus inicios, la microscopía utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lámparas de aceite o petróleo) y la desviaba hacia la preparación. Este método se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes. Existen numerosas fuentes de iluminación artificial. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la intensidad. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial entre las que destacamos: Bombillas de tungsteno y halógenas: La mayoría de microscopios de luz están dotados de lámparas con estas bombillas. LED: En comparación con las bombillas incandescentes, permiten ahorro de energía con un mayor rendimiento lumínico. Para microscopía se emplean LED de larga duración que ofrecen una luz muy brillante y fría; esto último es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observación es más cómoda para el usuario. Condensador El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, entre la fuente de luz y el espécimen. Diafragma Dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina en la misma pieza que el condensador. Permite cambios en la apertura, con diámetros variables para graduar la cantidad de luz que recibe el objeto permitiendo obtener conos luminosos más estrechos o más anchos. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO MANEJO Y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Manejo del MO - Enchufar y encender el MO - Graduar el asiento en altura - Ajustar el espacio interocular de los oculares al observador - Bajar la platina al máximo (si no lo estaba ya, que es lo correcto) - Girar el revólver de forma que empecemos por el objetivo de menor aumento - Colocar la muestra sobre la platina de forma que la preparación quede sobre el agujero central y mantenerla con las pinzas - Mirando la muestra desde fuera (no por el ocular) subir la platina con el tornillo macrométrico hasta el tope superior sin que llegue a rozar el objetivo - Bajar lentamente la platina con el macrométrico mirando por los oculares hasta que veamos la muestra lo mejor posible - Ajustar el condensador y el diafragma para conseguir la luz deseada - Ajustar el enfoque con el micrométrico hasta ver con nitidez - Cuando ya la tenemos enfocada podemos pasar al siguiente objetivo (de más aumento) - Usar el micrométrico para mejorar las posibles variaciones en el enfoque que suelen producirse al cambiar de objetivo. Ajustar también la iluminación con el condensado - Para movernos por la preparación movemos los tornillos de la platina - Antes de retirar la preparación, bajar la platina y colocar el objetivo de menor aumento Importante El objetivo de inmersión se utiliza para muestras específicas y requiere aceite para enfocar correctamente. Los objetivos secos nunca se usan con aceite, el daño sería irreversible. Mantenimiento - Cuando el MO no se está usando debe estar apagado y desenchufado, con la platina baja, el objetivo de menor aumento, el condensador bajado y con los protectores de los oculares y la funda del microscopio puestos. Nunca dejar una preparación en el MO. - No tocar las lentes con las yemas de los dedos. - Periódicamente limpiar los objetivos secos y los oculares con papel de óptica o paño suave realizando movimientos circulares. Si es necesario se puede usar el paño humedecido con agua destilada y secar posteriormente. Si la suciedad se resiste puede usarse lavavajillas (5 gotas) en 10 ml de agua destilada. Los procedimientos de limpieza son variables dependiendo de lo que decida la persona responsable del laboratorio. - Si se usa el objetivo de inmersión, se limpia inmediatamente después de cada utilización. Tras finalizar su uso se limpiará con él paño suave impregnado con una gota de etanol. - Periódicamente limpiar las partes mecánicas del microscopio. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO TIPOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS usados en el laboratorio MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO o DE CAMPO LUMINOSO Permite obtener un campo de visión con una cantidad de luz importante, resaltando la estructura observada sobre un fondo muy iluminado. Vertical: Posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. Es el microscopio de uso más común. Invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparación al microscopio común. La fuente de luz está por encima de la platina. El principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento). MICROSCOPIOS FOTÓNICOS ESPECIALES: Ciertos especímenes, principalmente las células vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio común de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras. En el microscopio común de campo claro los detalles de las muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural tienen poco contraste, permanecen invisibles, pues las estructuras incoloras absorben muy poca luz. Hay células (eritrocitos por ejemplo) que poseen pigmentos propios que le confieren color y contraste suficientes, pero esto es la excepción. La adición de sustancias químicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones en la estructura de la célula e incluso producirle la muerte. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO El interés de observar células vivas radica en la posibilidad de captar procesos vitales en pleno desarrollo, tales como la motilidad, la división, la fagocitosis y muchos otros. De ordinario, en el microscopio convencional, se puede lograr aumentar el contraste de cierta manera si se reduce la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz; pero lamentablemente también se reduce seriamente la resolución y la nitidez. Por ello se crearon microscopios con particularidades que permiten la observación de ese tipo de especímenes con un incremento muy satisfactorio del contraste. Más recientemente, con el empleo de programas informáticos de digitalización y edición de imágenes, las micrografías de células incoloras pueden ser tratadas mejorando el contraste, sin embargo, para observar más detalles hay que emplear otros métodos ópticos de contraste más sofisticados. Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa bucal antes (izquierda) y después (derecha) de modificación digital para mejorar el contraste. Las limitaciones de los microscopios compuestos ordinarios han sido superadas mediante microscopios particulares o de accesorios especiales. Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en: La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen empleando condensadores y filtros - Microscopio de campo oscuro. - Microscopio de contraste de fase. - Microscopio de luz polarizada. - Microscopio de contraste por interferencia diferencial. La modificación de la fuente emisora de luz cambiando la luz blanca por otra - Microscopio de fluorescencia (el más interesante para análisis clínicos) - Microscopio confocal (usa laser) - Microscopio ultravioleta Estudiaremos solamente algunos de ellos. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO Microscopio de campo oscuro De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una linterna un cuarto oscuro y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque reflejan o difractan la luz, los especímenes observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro). La iluminación de campo oscuro se realiza con el empleo de un condensador característico. Con este dispositivo se forma un cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro) que incide lateralmente sobre la muestra. La célula aparece como un objeto luminoso sobre un fondo oscuro. Aplicaciones del microscopio de campo oscuro: Estudio de especímenes de tamaño pequeño no coloreados, tales como microorganismos acuáticos, ovocitos, células en cultivo. Observación de células móviles, como el Treponema pallidum. Estudio de procesos fisiológicos como mitosis y migración celular. Microscopio de contraste por interferencia diferencial Los objetos se ven oscuros o claros en un fondo gris. Se observa una imagen del espécimen en 3D o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad óptica de la muestra con énfasis en líneas y bordes, como si la célula proyectara sombras hacia un lado. Células epiteliales. Tratamiento de fertilización in-vitro. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO Microscopio de fluorescencia De los microscopios especiales es el más usado en los laboratorios de análisis clínicos. La fluorescencia es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda. El rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Existen numerosos tipos de fluorocromos para teñir la muestra y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico. Longitud de onda de absorción Longitud de onda de Fluorocromo (nm) emisión (nm) Cascade blue 374-403 422-430 Fluoresceína (FITC) 495 520 Rodamina (TRITC) 540 570 El microscopio de fluorescencia requiere fuente de luz, filtros, objetivos y espejos especiales. Es muy útil porque la molécula fluorescente, aunque sea muy pequeña, puede observarse debido a la luz que emite. Micrografias de células en división con microscopio de fluorescencia empleando dos fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomasy rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo precisa el uso de filtros específicos. Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia en biología y medicina pero destacamos: Estudios inmunológicos. Por ejemplo detectar antígenos marcando con un fluorocromo su anticuerpo específico. Si se forma el complejo Ag-Ac se observará gracias a la fluorescencia emitida. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO MICROSCOPIO ELECTRÓNICO La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,05 nanómetros. Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. - Un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. - Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. - El sistema de vacío que es una parte relevante del microscopio electrónico. Los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vacío casi total en el interior de un microscopio. - Un sistema que transforma la imagen que crean los electrones (no visible para el ojo humano) en una imagen que puede ser captada por nuestro ojo. TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO Hay dos tipos básicos de microscopios electrónicos: Microscopio electrónico de transmisión (MET) = Transmission Electron Microscope (TEM). Permite la observación de grandes regiones de muestra para lo que precisa de cortes ultrafinos. Un microscopio electrónico de transmisión dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por la muestra y otros la atraviesan. Los que atraviesan la muestra consiguen la imagen aumentada del espécimen sobre una pantalla. Estos microscopios electrónicos pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. ¿Qué orgánulo es el de la imagen? Microscopio electrónico de barrido (MEB) = Scanning Electron Microscope, (SEM). Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo. Los electrones que al chocar con la muestra se dispersan son los que se van a recoger para formar la imagen. El microscopio electrónico de barrido explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, el haz de electrones barre la muestra. Cada pixel de la imagen digital corresponderá con un punto bombardeado. Según se van escaneando, va apareciendo la figura. Los microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este tipo de microscopio, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos, produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto. ¿Qué elemento forme de la sangre es el de la imagen? TÉCNICAS GENERALES DE LABORATORIO. UNIDAD 2. EL MICROSCOPIO CURIOSEANDO ¿Qué podemos observar con el MO? En casa: En tu cuerpo: Animales: La naturaleza: La suciedad de la Cabello Alas y patas de Tierra aspiradora Lágrimas mariposas e insectos Arena Hilo Pedazos de uñas Moscas de la fruta Semillas Lana Caspa Las escamas de pescado Agua estancada Tela La cera de las orejas La tela de araña Musgo Sal Semen reciente Plumas Alpiste Azúcar Frotis al pasar Hormigas Polen Piel de cebolla. bastoncillo por mucosa Partes de las flores, Epidermis cebolla. oral, nasal, vaginal como estambres y Levadura (pruebas en pistilos seco y después en agua Hierba caliente con azúcar) Agua del tanque de los Fibras de apio peces o tortugas Harina Moho Algas