Nükleik Asitlerin Tıpta Kullanımı PDF

Nükleik asitlerin tıpta kullanımı DNA’nın manipülasyonu Bir gen klonlama deneyinde Saf DNA molekününün hazırlanmasından sonraki basamak rekombinant DNA molekülünün oluşturulmasıdır. Bu rekombinant molekünün oluşturulması için; «Vektör ve Klonlanacak DNA belirli noktalardan kesilmeli ve kontrollü bir...

Nükleik asitlerin tıpta kullanımı DNA’nın manipülasyonu Bir gen klonlama deneyinde Saf DNA molekününün hazırlanmasından sonraki basamak rekombinant DNA molekülünün oluşturulmasıdır. Bu rekombinant molekünün oluşturulması için; «Vektör ve Klonlanacak DNA belirli noktalardan kesilmeli ve kontrollü bir şekilde bir araya getirilmelidir.» Kesme ve birleştirme DNA manipülasyon tekniklerinin iki örneğidir. Aynı zamanda DNA molekülleri; ◦ ◦ ◦ ◦ kısaltılabilir, uzatılabilir, RNA veya DNA molekülleri içerisine kopyalanabilir, spesifik kimyasal grupların eklenmesi ya da çıkarılması ile modifiye edilebili2r. DNA’nın manipülasyonu Neredeyse tüm DNA manipülasyon teknikleri purifiye enzimleri kullanır. Hücre içerisinde bu enzimler; ◦ DNA replikasyonu ve transkripsiyonu, ◦ istenmeyen ya da yabancı DNA’nın parçalanması, ◦ mutasyona uğramış DNA’nın onarımı ve ◦ farklı DNA molekülleri arasında rekombinasyon gibi temel işlemlerde görev alırlar. 3 DNA’nın manipülasyonu Gen klonlamadaki kesme ve yapıştırma manipülasyonları restriksiyon endonükleaz (kesme) ve ligaz (yapıştırma) adlı enzimlerle gerçekleştirilir. 4 DNA manipüle edici enzimler Katalizledikleri reaksiyon tipine göre dört genel sınıfa ayrılabilirler: ◦ Nükleazlar; nükleik asit moleküllerini kesen, kısaltan veya parçalayan enzimlerdir. ◦ Ligazlar; nükleik asit moleküllerini biraraya getiren enzimlerdir. ◦ Polimerazlar; moleküllerin kopyalarını yapan enzimlerdir. ◦ Modifiye edici enzimler; kimyasal grup çıkaran veya ekleyen enzimlerdir. 5 Birçok enzim belli bir sınıfa dahil olsa da bazıları iki ya da daha çok sınıfa giren çoklu aktivite sergilemektedir. En önemlisi, polimerazlar yeni DNA molekülü sentezleme yetenekleri ile birlikte DNA degredasyon (örneğin nükleaz) aktivitesi de sergilemektedirler. 6 DNA manipüle edici enzimler: NÜKLEAZlar Bir DNA zincirinde bir nükleotidi diğerine bağlayan fosfodiester bağlarını kırarak DNA moleküllerini parçalarlar. İki tip nükleaz bulunmaktadır: Ekzonükleazlar; Bir DNA molekülünün ucundaki bir bazı uzaklaştırırlar. Endonükleazlar; Bir DNA molekülü içerisindeki iç fosfodiester bağlarını kırabilirler. 7 Farklı ekzonükleazlar arasındaki ana fark çift zincirli DNA molekülüne saldırdıklarında parçaladıkları zincir sayısıdır. Bal31 (Alteromonas espejiana bakterisinden izole): çift zincirli DNA’nın her iki zincirinden nükleotidleri uzaklaştırır. Ne kadar uzun süre reaksiyonda kalırsa o kadar kısa DNA molekülleri meydana gelir. E. coli ekzonükleaz III: çift zincirli bir DNA molekülünün sadece bir zincirini parçalayarak tek zincirli bir molekül meydana getirir. 8 4.1.1.DNA manipüle edici enzimler: NÜKLEAZlar Aynı kriter endonükleazların sınıflandırılmasında da geçerlidir. ◦ S1 endonükleaz (Aspergillus oryzae fungusundan izole) sadece tek bir zinciri kırarken, ◦ Deoksiribonükleaz I (hem tek hem de çift zincirli DNA DNaz I) moleküllerini kırar. Dnaz I spesifik olmayıp (non spesifik) DNA’ya içteki herhangi bir fosfodiester bağından saldırabilir, uzun süre DNazI ile muamele sonrasında mononükleotid karışımı ve çok kısa oligonükleotidler oluşur. 9 Diğer taraftan, restriksiyon endonükleaz adı verilen özel bir grup enzim DNA’yı sadece sınırlı sayıda spesifik tanıma bölgesinden keser. DNA üzerinde kesim yaparak yapışkan uçlar meydana getiren enzimdir. 10 LİGAZlar Hücrede DNA ligazın fonksiyonu DNA replikasyonu gibi süreçte çift zincirli DNA moleküllerinde meydana gelen tek zincir kırıklarını (devamsızlıklar-kesikler) onarmaktır. DNA ligazlar ayrıca çift zincirli DNA’nın iki fragmentini bir araya getirip yapıştırabilir. 11 POLİMERAZlar Var olan DNA ya da RNA kalıbına komplementer (tamamlayıcı) yeni bir DNA zinciri sentezleyen enzimlerdir. 12 ◦ DNA polimeraz I: Genellikle E. coli’den elde edilir. Esas olarak çift zincirli DNA molekülünde kısa tek zincirli bölgeye (nick) bağlanır ve ardından ilerleyerek var olan zinciri parçalarken tamamen yeni bir zincir sentezler. 13 DNA polII’in polimeraz ve nükleaz aktiviteleri enzim molekülünün farklı bölgeleri tarafından kontrol edilir. Nükleaz aktivitesi polipeptidin ilk 323 aminoasidinde gerçekleşir, bu segmentin çıkarılması polimeraz işlevi olan ve fakat nükleaz aktivitesinden yoksun modifiye bir enzim oluşmasına neden olur. 14 Taq DNA polimeraz; PCR da kullanılan enzimdir Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen bir DNA pol I’dir. Bu organizma sıcak su kaynaklarında yaşar ve termostabildir (DNA’sı ısı muamelesiyle denatürasyona dirençli) Bu özellik Taq DNA polimerazı yüksek sıcaklıkların kullanıldığı PCR uygulamaları için uygun kılar 15 Diğer bir DNA polimeraz Revers transkriptaz enzimidir. RNA virüslerinin replikasyonunda görev alır. Bu enzimin RNA’ya komplementer bir DNA zincirini sentezleme yeteneği komplementer DNA (cDNA) klonlama tekniğinin ana bileşeni olmasını sağlar. 16 DNA modifiye edici enzimler Spesifik kimyasal grupların eklenmesi ya da çıkarılmasıyla DNA moleküllerini değiştiren enzimler bulunmaktadır. ◦ Alkalin fosfataz Bir DNA molekülünün 5′ ucunda bulunan fosfat gruplarını uzaklaştıran enzimdir. ◦ Polinükleotid kinaz DNA molekülünün serbest 5′ ucuna fosfat grupları ekleyen enzimdir. ◦ Terminal deoksinükleotidil transferaz Bir DNA molekülünün 3′ ucuna bir ya da daha fazla deoksiribonükleotidi ekleyen enzimdir. 17 DNA’yı kesen enzimlerrestriksiyon endonükleazlar Gen klonlama çok doğru ve tekrarlanabilir tarzda kesilen DNA moleküllerine ihtiyaç duymaktadır. Bunun için özel enzimlere gerekmektedir. Pürifiye restriksiyon endonükleazlar moleküler biyologların gen klonlama çalışmalarında doğru yerlerden DNA moleküllerinin kesmelerine imkan tanırlar. 18 Bu parçalayıcı enzimler restriksiyon endonükleaz adını alırlar ve birçok belki de tüm bakteri türleri tarafından sentezlenirler: 2500 ten fazla çeşidi izole edilmiştir ve 300 den fazlası laboratuvarda kullanıma uygundur. Üç farklı restriksiyon endonükleaz sınıfı tanımlanmıştır, her biri birbirinden azda olsa farklı etki mekanizması ile ayırt edilebilirler. Diğer taraftan, tip II restriksiyon endonükleazlar gen klonlamasında çok önemli işlevi olan kesici enzimlerdir. 19 Tip II restriksiyon endonükleazlar DNA’yı spesifik nükleotid dizilerinden keserler TipII endonükleazların (restriksiyon endonükleazlar) temel özelliği enzimin bir DNA molekülünü kestiği spesifik bir tanıma dizisine sahip olmasıdır. Belirli bir enzim DNA yı sadece tanıma dizisinden keser. Sözgelimi, PvuI (Proteus vulgaris’ten izole) DNA’yı sadece CGATCG hekzanükleotidinden keser. Aksine, aynı bakteriye ait bir diğer enzim olan PvuII farklı bir nükleotid dizisinden (CGATCG) keser. 20 Birçok restriksiyon endonükleaz hekzanükleotid hedef bölgelerini tanır, fakat diğerleri 4lü, 5li veya daha uzun nükleotid dizilerini keser. Sau3A (Staphylococcus aureus suş 3A’dan izole) GATC yi tanırken, AluI (Arthrobacter luteus) AGCT’den keser. Dejenere tanıma dizileri olan restriksiyon endonükleaz enzimleri de bulunur; bunlar DNA’yı ilgili bölge ailesinin herhangi birinden kesebilir. HinfI (Haemophilus influenzae suş Rf), GANTC’yi tanır dolayısıyla GAATC, GATTC, GAGTC, ve GACTC dizileriden keser. 21 Küt uçlar ve yapışkan uçlar Bir restriksiyon endonükleaz tarafından kesim işlemi gen klonlama deneylerinin dizaynında oldukça önemlidir. Birçok restriksiyon endonükleaz tanıma dizisinin ortasında basit bir çift-zincir kırık kesiği yapar ve küt uç oluşturur. 22 Diğer restriksiyon endonükleazlar DNA yı biraz faklı bir yönden kırar. Bu enzimlerle iki DNA zinciri aynı yerden kesilmezler. Yerine, kesim pozisyonları 2 ya da 4 nükleotid fark gösterir. Bu şekilde, oluşan DNA fragmentileri her iki uçta kısa tek zincirli çıkıntılar (sarkıklar)a sahiptir. Bunlar; yapışkan veya kohesiv uçlar adını alırlar. Yani bu çıkıntılar arasındaki baz eşleşmesi DNA molekülünü yeniden bir araya getirebilir. 23 Compatible ends-Uyumlu uçlar Bu tip yapışkan uç enzimlerin önemli özelliklerinden biri farklı tanıma dizili restriksiyon endonükleazların aynı yapışkan ucu üretebilmeleridir. Bu enzimlerden herhangi biri ile kesim sonucunda üretilen DNA fragmentleri, her parça komplementer bir yapışkan uç taşıdığından birbiriyle birleşebilir. 24 Vektör Konuk hücreye hedef DNA parçasını göndermekte kullanılan araç. Plazmidler, virüsler vektör olarak kulllanılabilir. Plazmid Dairesel, çift zincirli ve kendi kendini eşleyebilen, kromozomlardan ayrı DNA parçasıdır. Çoğunlukla bakterilerde görülürler. Antibiyotik direnci gibi bazı genleri taşırlar.  Konjugasyon DNA Klonlanması DNA dizilerini belirlemek için teknikler Özgün DNA sekans tanınması DNA dizi analizi