Ανίχνευση και Προσδιορισμός Τοξικών Ουσιών σε Βιολογικά Υλικά PDF

Ανίχνευση και Προσδιορισμός Τοξικών Ουσιών σε Βιολογικά Υλικά Χριστίνα Τσιτσιμπίκου, MSc, PhD, ERT Χημικός-Τοξικολόγος Γενικό Χημείο του Κράτους, Επιτροπή Αξιολόγησης Κινδύνου Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Επίτιμη Γεν. Γραμματέας Ελληνική...

Ανίχνευση και Προσδιορισμός Τοξικών Ουσιών σε Βιολογικά Υλικά Χριστίνα Τσιτσιμπίκου, MSc, PhD, ERT Χημικός-Τοξικολόγος Γενικό Χημείο του Κράτους, Επιτροπή Αξιολόγησης Κινδύνου Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Επίτιμη Γεν. Γραμματέας Ελληνικής Εταιρείας Τοξικολογίας  Τοξική ουσία vs επικίνδυνη ουσία (hazardous) vs δηλητήριο  Επιπτώσεις στην υγεία, στο περιβάλλον και λόγω των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της  Οποιοδήποτε χημικό μπορεί να είναι τοξικό σε συγκεκριμένες συνθήκες  Προϊόντα που χρησιμοποιούμε και/ ή εκτιθέμεθα καθημερινά, όπως  Χημικές ουσίες και μείγματα (βαρέα μέταλλα, διοξίνες, κ.ά.)  Καθαριστικά, καύσιμα, αλκοόλ, φυτοφάρμακα, καλλυντικά κ.α. καταναλωτικά προϊόντα  συνταγογραφούμενα και μη φάρμακα (ναρκωτικά, παράγοντες ντόπινγκ)  Επικίνδυνα απόβλητα  Μικροοργανισμοί – Τοξίνες Τοξίνη: Μία δηλητηριώδης ουσία που παράγεται κατά μικροοργανισμών και κάποιων ανώτο μεταβολισμό και την ανάπτυξη συγκεκριμένων τερων ειδών φυτών και ζώων Θεόφραστος Παράκελσος (1493 - 1541) πατέρας της Τοξικολογίας Δόση: «Η δόση κάνει το δηλητήριο» είναι η θεμελιώδης αρχή της τοξικολογίας, αλλά η πραγματική μελέτη της τοξικολογίας είναι πολύ πιο περίπλοκη από αυτή την απλή δήλωση. Τοξικολογία: Η μελέτη της φύσης, των επιδράσεων και η ανίχνευση δηλητηρίων, και η θεραπεία δηλητηριάσεων. Κίνδυνος  Hazard εγγενής κίνδυνος  Risk εξαρτάται από τη συγκέντρωση (δόση, συχνότητα χορήγησης, μεταβολισμός, βιοδιαθεσιμότητα κλπ)  Η δοσολογία είναι πράγματι σημαντική για την εκδήλωση της τοξικότητας, όπως και τα ακόλουθα: – Η μορφή της ουσίας Αδιάλυτη – διαλυτή – Η οδός εισόδου στο σώμα Εισπνοή – κατάποση – ένεση – δερματική έκθεση κλπ – Σωματικό βάρος / ηλικία / φύλο ατόμου – Περίοδος έκθεσης Οξεία – χρόνια τοξικότητα – Αλληλεπιδράσεις με άλλα χημικά στο σώμα Συνεργική – ανταγωνιστική δράση «Μονάδες μέτρησης» τοξικότητας – Παραδείγματα DNEL (derived no-effect level) NOAEL (no-adverse effect level) MTD (maximum tolerable dose) LD50 – αναφέρεται στην ποσότητα ουσίας η οποία σκοτώνει το 50% του εξεταζόμενου πληθυσμού σε διάστημα 4 ωρών (Οξεία τοξικότητα) mg ουσίας / kg σωματικού βάρους  Κλινική Τοξικολογία  Ιατρική Τοξικολογία  Εγκληματολογική Τοξικολογία  Βιομηχανική Τοξικολογία  Περιβαλλοντική Τοξικολογία  Βιοχημική και Μοριακή Τοξικολογία  Τοξικολογία Ανάπτυξης Προϊόντος  Κανονιστική Τοξικολογία  ΛΙΠΑΣΜΑΤΑ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΓΙΑ ΤΑ ΛΙΠΑΣΜΑΤΑ (Νομοθετικο πλαίσιο 2019) ΕΚΚΡΗΚΤΙΚΑ ΠΥΡΟΤΕΧΝΙΚΑ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ ΠΡΟΔΡΟΜΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΙΑΤΡΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ - ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΣ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΓΙΑ ΤΑ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ – ΚΑΘΑΡΙΣΤΙΚΑ ΟΔΗΓΙΑ ΓΙΑ ΤΑ ΑΠΟΒΛΗΤΑ (WASTE FRAMEWORK DIRECTIVE) ΟΡΘΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΡΑΚΤΙΚΗ (GOOD LABORATORY PRACICE – GLP) ΕΜΜΟΝΟΙ ΟΡΓΑΝΙΚΟΙ ΡΥΠΟΙ Τάξεις κινδύνου λόγω φυσικοχημικών ιδιοτήτων (Κανονισμός CLP)  Γενικά και για τις ουσίες και τα μείγματα τα δεδομένα που απαιτούνται είναι αποτελέσματα δοκιμών, εκτός εάν επιτρέπονται σε ειδικές περιπτώσεις εναλλακτικοί τρόποι (όπως αναζήτηση δεδομένων από βιβλιογραφία ή χρήση υπολογιστικής μεθόδου για μείγματα – “εύφλεκτα υγρά”) Testing proposals – Άδεια δοκιμών για χημικές ουσίες Δοκιμές σε μείγματα – Animals welfare – Δοκιμές σε ζώα απαγορεύονται στα καλλυντικά Για την ταξινόμηση στις περισσότερες τάξεις κινδύνου, οι μέθοδοι δοκιμών που αναφέρονται στο Παράρτημα Ι, Μέρος 2 του CLP περιγράφονται στο Εγχειρίδιο : UN Manual of Tests and Criteria (εκδόσεις UNECE, 4η έκδοση 2003) που χρησιμοποιείται κυρίως για την ταξινόμηση για τις μεταφορές (ΑDR). Για τα αέρια και τα υγρά γίνεται αναφορά σε διεθνή πρότυπα. Από τον Ιανουάριο του 2014 οι δοκιμές πρέπει να γίνονται σύμφωνα με κάποιο αναγνωρισμένο σύστημα ποιότητας (GLP, EN ISO, κλπ) Μέθοδοι δοκιμών σε ζώα και φυσικοχημικές μέθοδοι δοκιμών Τάξεις κινδύνου για την ανθρώπινη υγεία (Κανονισμός CLP, 1272/2008/ΕΚ) Τάξεις κινδύνου για το περιβάλλον (Κανονισμός CLP)  Ενδοκρινείς – ενδοκρινικοί διαταράκτες (Endocrine disruptors) Οι ενδοκρινικοί διαταράκτες επηρεάζουν την ορμονική δράση και με αυτόν τον τρόπο μπορούν να προκαλέσουν δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου και της άγριας πανίδας (περιβάλλον). Το ενδοκρινικό σύστημα είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο αδένων, ορμονών και υποδοχέων. Παρέχει τη βασική σχέση επικοινωνίας και ελέγχου μεταξύ του νευρικού συστήματος και των σωματικών λειτουργιών όπως η αναπαραγωγή, η ανοσία, ο μεταβολισμός και η συμπεριφορά. Στους ανθρώπους, οι παράγοντες ενδοκρινικής διαταραχής έχει βρεθεί ότι είναι υπεύθυνοι για εμφανείς αυξήσεις που παρατηρούνται στις νόσους και στις διαταραχές που σχετίζονται με το ανθρώπινο ενδοκρινικό σύστημα τις τελευταίες δεκαετίες (νόσοι του θυρεοειδούς, μεταβολικό σύνδρομο, παχυσαρκία, διαταραχές γονιμότητας κλπ). 2023 Παραδείγματα ανίχνευσης χημικών ουσιών σε βιολογικά υγρά για κανονιστικούς σκοπούς Βιοπαρακολούθηση Απορρόφηση/ έλεγχος τρόπου χορήγησης (εύρεση ενεργού δόσης) Παρακολούθηση θεραπευτικών επιπέδων Μεταβολισμός (πχ ενεργοί-τοξικοί μεταβολίτες) Φαρμακοκινητική (πχ ρυθμός απέκκρισης) Κατανομή στους ιστούς – Βιοσυσσώρευση (πχ υπολείμματα στο μητρικό γάλα)  Κλινική Τοξικολογία  Ιατρική Τοξικολογία  Εγκληματολογική Τοξικολογία  Βιομηχανική Τοξικολογία  Περιβαλλοντική Τοξικολογία  Βιοχημική και Μοριακή Τοξικολογία  Τοξικολογία Ανάπτυξης Προϊόντος  Κανονιστική Τοξικολογία  Εγκληματολογική Τοξικολογία είναι… Η ανίχνευση και ταυτοποίηση φαρμάκων και δηλητηρίων σε σωματικά υγρά, ιστούς και όργανα για την ενίσχυση της ιατρικής ή/και νομικής έρευνας. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Προ θάνατον Μετά θάνατον Αναλυτικός / Εγκληματολόγος Τοξικολόγος Πρέπει να ταυτοποιήσει ένα από τα χιλιάδες φάρμακα και δηλητήρια Πρέπει να ανιχνεύσει ποσότητες της τάξης των nanogram (picogram) - microgram ποσοτήτων διάχυτα μέσα στο σώμα Δεν αναζητά πάντα τις μητρικές ενώσεις αλλά και μεταβολίτες αυτών (π.χ. ηρωΐνη  μορφίνη μέσα σε λίγα δευτερόλεπτα) Διαφοροδιάγνωση χορήγησης vs παθητικής έκθεσης Δειγματοληψία Επιμέλεια Δοχεία σφράγισης Το αρχικό δείγμα χωρίζεται σε 2 μέρη – 1ο μέρος για γενικό screening και ταυτοποίηση της ουσίας αν τα αποτελέσματα είναι θετικά – 2ο μέρος για 2η επιβεβαίωση (confirmation) αν ζητηθεί (έφεση) Μέθοδοι ανάλυσης Γενικό Screening – Γρήγορο τεστ για περιορισμό των πιθανοτήτων – Ανοσοδιάγνωση (π.χ. ELISA) Ταυτοποίηση/ επιβεβαίωση – Προσδιορίζει την ακριβή ταυτότητα των ουσιών – Φασματομετρία Μάζας – Ανοσοηλεκτροφόρηση (e.g. rEPO) Γενικό Screening (Ανοσοδιάγνωση) Κίνδυνοι ανοσοδιάγνωσης… Ψευδώς θετικά αποτελέσματα!!! Επιβεβαιώτικές μέθοδοι ανάλυσης Φασματομετρία Μάζας– Μέθοδος επιλογής  Φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry, MS) ονομάζεται η αναλυτική τεχνική κατά την οποία τα μόρια (συστατικά) ενός δείγματος μετατρέπονται σε ταχύτατα κινούμενα ιόντα και στη συνέχεια διαχωρίζονται σε σχέση με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z). Η φασματομετρία μαζών είναι από τις πλέον διαδεδομένες τεχνικές ανάλυσης και εφαρμόζεται, ευρέως, σε πολλούς τομείς τεχνολογίας και έρευνας. Η πρόοδος στη μικροηλεκτρονική και οι αυξανόμενες απαιτήσεις στη χημική ανάλυση, έχουν προωθήσει την ανάπτυξη της τεχνικής και την έχουν καταστήσει απαραίτητο εργαλείο για μεγάλο φάσμα επιστημονικών, ερευνητικών δραστηριοτήτων. Κύριο πεδίο εφαρμογής είναι οι επιστήμες ζωής, των τροφίμων, οι περιβαλλοντικές επιστήμες και οι τεχνολογίες omics. Αυτό συμβαίνει γιατί η φασματομετρία μαζών προσφέρει πληροφορίες για: α) την ποιοτική και ποσοτική σύσταση αγνώστων μιγμάτων, β) τη χημική δομή πολύ μεγάλου αριθμού ενώσεων, γ) την παρουσία και το ποσοστό ισοτόπων, δ) τη δομή και σύσταση επιφανειών με μορφή απεικόνισης (MS Imaging). Η δυναμική της φασματομετρίας μαζών στη βιοανάλυση θα μπορούσε να αποδοθεί στις εξής ιδιότητες: α) τη μεγάλη εκλεκτικότητα που επιτυγχάνεται με την ακριβή μέτρηση των σχετικών μοριακών μαζών, γεγονός που επιτρέπει την απόλυτη ταυτοποίηση ενώσεων ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Η δυνατότητα αυτή έχει ως αποτέλεσμα την απόλυτη κυριαρχία των τεχνικών LC-MS στον έλεγχο τοξικότητας μεταβολισμού φαρμάκων και φαρμακοκινητικής, στη φαρμακευτική βιομηχανία (99% των εφαρμογών είναι σε LC-MS ήδη από το 2008). Αντίστοιχη είναι η εφαρμογή της MS σε περιπτώσεις ελέγχου απαγορευμένων ενώσεων π.χ. anti-doping, έλεγχος ναρκωτικών κ.ά. β) την πολύ υψηλή ευαισθησία, που φτάνει έως τα 10-18 mol. γ) το γεγονός ότι η φασματομετρία μαζών μπορεί θεωρητικά να δράσει σαν ολικός ανιχνευτής (universal detector) και, επομένως, να εφαρμοστεί για την ανάλυση οποιασδήποτε ενώσεως. δ) τη δυνατότητα εύρεσης δομής αγνώστων ενώσεων, η οποία έχει βρει μεγάλη εφαρμογή στις τεχνολογίες omics καθώς επιτυγχάνει αποδοτική εύρεση δομής πεπτιδίων, πρωτεϊνών, νουκλεοτιδίων. Για παράδειγμα, η μεταβολομική πραγματοποιείται πλέον, κυρίως, με φασματομετρία μαζών. Στην πρωτεομική, η φασματομετρία μαζών εφαρμόζεται σε πολλά διαφορετικά στάδια: εύρεση μοριακών βαρών, ταυτοποίηση και ποσοτική αποτίμηση πεπτιδίων πρωτεϊνών, εύρεση δομής (πρωτοταγούς), μελέτη μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών κλπ. Σχηματικό διάγραμμα των τμημάτων ενός φασματογράφου μαζών με τις συντομογραφίες των κυριότερων τεχνικών κάθε σταδίου  Παραδείγματα εφαρμογής MS  Εγκληματολογικές αναλύσεις (πιστοποίηση και ποσοτικοποίηση ναρκωτικών)  Προσδιορισμός συμπεριφοράς φαρμάκων στο σώμα (φαρμακοκινητική, κατανομή φαρμάκων)  Προσδιορισμός γονιδιακής βλάβης εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων  Anti-doping tests: ανίχνευση και ταυτοποίηση παράνομων στεροειδών σε αθλητές  Παρακολούθηση της αναπνοής ασθενών από αναισθησιολόγους κατά τη διάρκεια χειρουργείων  Προσδιορισμός της σύνθεσης μοριακών ειδών στο διάστημα  Εντοπισμός κοιτασμάτων πετρελαίου μετρώντας τις πρόδρομες ουσίες πετρελαίου σε βράχους  Παρακολούθηση διαδικασιών ζύμωσης για τη βιομηχανία βιοτεχνολογίας  Καθορισμός της στοιχειακής σύνθεσης ημιαγώγιμων υλικών  Χαρακτηριστικά παραδείγματα εφαρμογών MS  Προσδιορισμός της νοθείας του μελιού με συρόπι καλαμποκιού  Ταυτοποίηση δομών βιομορίων, όπως υδατάθρακες, νουκλεϊκά οξέα και στεροειδή  Αλληλούχηση βιοπολυμερών όπως προτεΐνες και ολιγοσακχαρίτες  Ανάλυση περιβαλλοντικών ρυπαντών (π.χ. διοξίνες σε μολυσμένα ψάρια)  Προσδιορισμός ηλικίας και προέλευσης γεωχημικών και αρχαιολογικών δειγμάτων  Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση συστατικών περίπλοκων οργανικών μιγμάτων  Υπερευαίσθητη πολυστοιχειακή ανόργανη ανάλυση Παράδειγμα χρωματογραφήματος μάζας Θραυσματοποίηση κοκαΐνης  Εισαγωγή δείγματος στο MS  Για καθαρά στερεά το δείγμα μπορεί να τοποθετηθεί στην άκρη μίας ράβδου που εισάγεται στην εκκενωμένη πηγή μέσω στεγανού πώματος – Καθετήρας (probe) άμεσης εισαγωγής  Για να λάβουμε χρωματογράφημα μίας ουσίας σε ένα δείγμα, τα συστατικά του μίγματος πρέπει να διαχωριστούν πριν την ανάλυση στο MS. Από τη δεκαετία 1960 η αέρια χρωματογραφία (gas chromatography, GC) συζεύχθηκε με το MS. Αυτή η σύνδεση επιτρέπει στις ενώσεις να εισέλθουν στο MS σε αέρια φάση σε διαφορετικούς χρόνους και έτσι τα συστατικά ενός μίγματος ανιχνεύονται και ταυτοποιούνται.  Υγρή χρωματογραφία (Liquid chromatography, LC/MS) GC/MS 8th September 2009 EAFS 2009 Workshop, ENFSI Christina Tsitsimpikou, MSc, PhD Παράδειγμα GC/MS χρωματογραφήματος ΕΠΙΛΟΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Αίμα Αίμα (επήρεια) Ούρα Ούρα (πρόσφατη χρήση) Σίελος Σίελος (επήρεια) Τρίχες Τρίχες (μεγάλο χρονικό παράθυρο ανίχνευσης) Ιστοί Ήπαρ, νεφροί (νεκροτομείο) Δόση Διάρκεια έκθεσης Μεταβολισμός Analyte Analyte: ανιχνευόμενη ουσία Αίμα Δείχνει εάν ένας οργανισμός είναι υπό την φαρμακολογική επήρεια Η παρουσία μιας ουσίας στο αίμα εξαρτάται από την ημιπερίοδο ζωής της ΟΠΙΟΥΧA Ηρωίνη : 5 min 6-ΜΑΜ : 45 min Μορφίνη : 2-4h Κωδεϊνη: 2-4h ΑΜΦΕΤΑΜΙΝΕΣ Μεθαμφεταμίνη : 6 - 15 h MDMA : 8h ΚΟΚΑΪΝΗ : 40 - 90 min Βενζοϋλεκγονίνη 7,5 h THC : 14 - 38 h LSD : 3-4h  Πλεονεκτήματα Κύριο βιολογικό υλικό στο οποίο γίνεται ποσοτική ανάλυση Δυνατότητα ερμηνείας των αποτελεσμάτων σε σύγκριση με διεθνή βιβλιογραφία Καταδεικνύει τη φαρμακολογική κατάσταση του χρήστη (επήρεια) (ναρκωτικά) Μειονεκτήματα Σήψη, μεγάλη απώλεια αίματος Μεταθανάτια ανακατανομή Παράγοντες που επιδρούν στις μεταθανάτιες συγκεντρώσεις των ουσιών στο αίμα Χημική αστάθεια (υδρόλυση ηρωίνης κλπ) Δράση ενδογενών ενζύμων (π.χ. εστερασών) Μεταθανάτια ανακατανομή Ούρα Πλεονεκτήματα Μεγάλος όγκος υλικού για ανάλυση Ανιχνεύονται συχνά οι μητρικές ενώσεις καθώς και οι μεταβολίτες τους Οι περισσότερες ουσίες και οι μεταβολίτες τους είναι ανιχνεύσιμες για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα απ’ ότι στο αίμα Δειγματοληψία μη επεμβατική Μειονεκτήματα Δυσκολία συσχέτισης της συγκέντρωσης μιας ουσίας στα ούρα με την δόση Ποσοτικός προσδιορισμός μίας ουσίας στα ούρα: τι δεικνύει;; ΧΡΟΝΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΟΥΣΙΩΝ ΣΤΑ ΟΥΡΑ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΤΕΛΕΥΤΑΙΑ ΧΡΗΣΗ Οπιούχα : 1 - 2 ημέρες Κοκαίνη : 1 - 5 ημέρες Αμφεταμίνες : 1 - 2 ημέρες LSD : 1 - 3 ημέρες Κανναβινοειδή Περιστασιακή χρήση : 1 - 3 ημέρες Χρόνια χρήση : 7+ ημέρες  Ήπαρ, νεφροί (ιστοί) Η ανάλυση ιστών χρησιμοποιείται συμπληρωματικά ως προς την ανάλυση του αίματος Σε περιπτώσεις αποσύνθεσης είναι το μοναδικό διαθέσιμο δείγμα Δυσκολία στην ερμηνεία των συγκεντρώσεων των ουσιών στους ιστούς  Ενδοφθάλμιο υγρό Υγρό με μικρό πρωτεϊνικό περιεχόμενο Χρήσιμο υλικό σε περιπτώσεις μερικής σήψης του σώματος (ανίχνευση αλκοόλης κλπ)  Σίελος  Δυνατότητα διέγερσης της ροής του σιέλου  Δυσκολία παραποίησης ή νοθείας του δείγματος  Συσχέτιση των συγκεντρώσεων στο σίελο μ’ αυτές στο αίμα  ΤΡΙΧΑ – Μηχανισμοί εναπόθεσης ουσιών στην τρίχα o Διάχυση από το αίμα στο θυλάκιο των τριχών o Εκκρίσεις των ιδρωτοποιών αδένων o Εκκρίσεις των σμηγματογόνων αδένων  Περιβαλλοντολογική επιμόλυνση (εξωτερική εναπόθεση) Πλεονεκτήματα της εξέτασης των τριχών για πιστοποίηση χρήσης/ έκθεσης ουσιών  Ανίχνευση ουσιών σε βάθος χρόνου  Μικρές περίοδοι αποχής δεν επηρεάζουν το αποτέλεσμα  Διευκρίνιση είδους χρήσης/έκθεσης (ευκαιριακή ή συστηματική, κατάχριση, βαρύτητα)  Τα δείγματα παραλαμβάνονται και φυλάσσονται εύκολα  Η δειγματοληψία είναι ελάχιστα επεμβατική  Η επαναληπτική δειγματοληψία είναι δυνατή  Προβλήματα στην ανάλυση τρίχας Επίδραση του χρώματος των μαλλιών (περιεκτικότητα σε μελανίνη) Επίδραση της περιοχής συλλογής του δείγματος και του ρυθμού ανάπτυξης της τρίχας Επίδραση των ειδών περιποίησης μαλλιών (βάψιμο, λούσιμο) – Τα φάρμακα μειώνονται σε μαλλιά που έχουν υποστεί λεύκανση Λιποφιλικότητα της ουσίας Αντιφάσεις στα δεδομένα που αφορούν στη σχέση δόσης – συγκέντρωσης Έλλειψη συσχέτισης μεταξύ των συγκεντρώσεων σε ούρα και τρίχα Χρονικό παράθυρο ανίχνευσης ουσιών σε συμβατικά βιολογικά δείγματα Αίμα Ούρα Κοκαΐνη ~ 1-2 ημέρες 2-3 ημέρες Κανναβινόλες ~ 5-6 ημέρες 3-15 ημέρες Αμφεταμίνες ~ 1-2 ημέρες 2-4 ημέρες Οπιούχα ~ 1-2 ημέρες 3-4 ημέρες Κομμένες τρίχες ~ εβδομάδες, μήνες, έτη Σύγκριση βιολογικών υλικών Δείγμα Χρόνος Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα ανίχνευσης Τρίχες Μήνες Παρελθοντική χρήση. Πρόσφατη χρήση ναρκωτικών όχι Εύκολη δειγματοληψία με δυνατότητα εύκολα ανιχνεύσιμη. επανάληψης. Πιθανή περιβαλλοντική μόλυνση. Νύχια Μήνες Παρελθοντική χρήση. Όχι εύκολη προσπέλαση. Πρόσφατη χρήση του ναρκωτικού δεν ανιχνεύεται. Πιθανή περιβαλλοντική μόλυνση. Σίελος 12-24 ώρες Εύκολη δειγματοληψία Βραχυπρόθεσμη μέτρηση της χρήσης Ανίχνευση μητρικής ένωσης και ναρκωτικού μεταβολιτών Πιθανή στοματική μόλυνση του ναρκωτικού Ιδρώτας 1-4 Αθροιστικά αποτελέσματα Πιθανή περιβαλλοντική μόλυνση Εβδομάδες (συσσώρευση). Μεγάλες διακυμάνσεις ανάμεσα στα Εύκολη πρόσβαση άτομα Αρχικό ναρκωτικό παρόν Παρακολούθηση χρήσης για περίοδο βδομάδων. Κλινικές Εφαρμογές της Εξέτασης των Τριχών Η ΕΞΕΤΑΣΗ ΤΩΝ ΤΡΙΧΩΝ ΩΣ SCREENING TEST ΣΕ ΨΥΧΙΑΤΡΙΚΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΟΙ ΤΡΙΧΕΣ ΩΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΣΕ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Η ΝΙΚΟΤΙΝΗ ΤΩΝ ΤΡΙΧΩΝ ΣΑΝ ΔΕΙΚΤΗΣ ΠΑΘΗΤΙΚΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΣΤΟΝ ΚΑΠΝΟ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΜΜΟΡΦΩΣΗΣ ΣΕ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΑΓΩΓΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΘΕΣΗΣ ΣΕ ΦΥΤΟΦΑΡΜΑΚΑ-ΡΥΠΑΝΤΕΣ Τμηματική ανάλυση τριχών Ανάλυση της τρίχας ανά τμήματα Διερεύνηση έκθεσης ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα Στηρίζεται στο σχεδόν σταθερό ρυθμό ανάπτυξης της τρίχας (κεφαλής) Τρίχα μήκους 10 εκατοστών αντιστοιχεί στους 10 τελευταίους μήνες. Δειγματοληψία Κατεργασία δείγματος τρίχας Hair Decontamination of 100 mg hair sample water (for 5 min) and then methanol (for seconds). Fragmentation and ultrasonic assisted methanol (2ml) extraction for 4 hours. Methanol phase separation and evaporation Reconstitution in methanol (100μL). LC-MS analysis of extract (20μL) Προπαρασκευή δείγματος τρίχας Urine (5 ml) Enzymatic hydrolysis: + 1 ml phosphate buf f er (pH = 7.0) + 40 l -glucoronidase Incubation at 50±2oC f or 1.5 h + 1.5 g of NaHCO3:Na2CO3 (10:1) Extraction with 5.0 ml acetate f or 15 min Centrif ugation and evaporation under N2 Reconstitution in 100  l methanol 20 l injected into LC-MS Βιοπαρακολούθηση Η βιοπαρακολούθηση χρησιμοποιεί αναλυτικές μεθόδους που επιτρέπουν την ακριβή μέτρηση χαμηλών επιπέδων περιβαλλοντικών χημικών σε βιολογικά υλικά Βιοπαρακολούθηση ΟΡΙΣΜΟΙ ❖ Βιομάρτυρας (Biomarker): μία χημική ουσία, κάποιος μεταβολίτης της ή το προϊόν της αλληλεπίδρασης μεταξύ της χημικής ουσίας και κάποιου ιστού-στόχου ή κυττάρου. Προσδιορίζεται στο ανθρώπινο σώμα. ❖ Περιβαλλοντική παρακολούθηση (Environmental monitoring): ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης ενός ρυπαντή σε ένα μέσο (πχ. αέρας, χώμα, νερό ή τροφή). ❖ Ανθρώπινη Βιοπαρακολούθηση (Human biomonitoring): ο άμεσος προσδιορισμός της έκθεσης του ανθρώπου σε τοξικές ουσίες του περιβάλλοντος μέσω του προσδιορισμού των ουσιών αυτών (ή των μεταβολιτών τους) σε ανθρώπινα δείγματα (αίμα, ούρα κλπ).  Βιοπαρακολούθηση ⚫ Βιομάρτυρας έκθεσης (Βiomarker of exposure): (π.χ. κοτινίνη στο αίμα ή στα ούρα των παθητικών καπνιστών, μεταβολίτες της βενζίνης στα ούρα των ανθρώπων της πόλης κλπ). ⚫ Βιομάρτυρας αποτελέσματος (Βiomarker of effect): Μία μετρήσιμη βιοχημική, φυσιολογική, συμπεριφοριστική ή άλλη τροποποίηση σε έναν οργανισμό, η οποία ανάλογα με την έκτασή της μπορεί να αναγνωριστεί ότι σχετίζεται με επιδείνωση της υγείας ή με ασθένεια (πχ. DNA adducts). ⚫ Βιομάρτυρας ευαισθησίας (Βiomarker of susceptibility): Δείκτης της κληρονομικής ή επίκτητης ικανότητας ενός οργανισμού να αντιδρά στην έκθεση σε μία συγκεκριμένη χημική ουσία (πχ. G6PD deficiency) Παράδειγμα Ποιο από τα δύο τοξικά χημικά είναι πιο επικίνδυνο; Ένας περιβαλλοντικός χημικός τύπος θα περάσει πολλά στάδια μέχρι να καταστεί απειλή για την υγεία. Ο τοξικός παράγοντας 1 παρόλο που βρίσκεται σε μεγαλύτερη αφθονία στο περιβάλλον, λόγω άλλων ιδιοτήτων του δεν αποτελεί τόσο μεγάλο κίνδυνο για την υγεία όσο ο παράγοντας 2. Η ανάλυση βιομαρτύρων παρέχει τις πλέον κατάλληλες πληροφορίες για την προστασία της υγείας  Αναλυτικές μέθοδοι/ Βιοδείκτες έκθεσης Περίπτωση μελέτης – Φθαλικά Ευρεία χρήση (Calafat and McKee 2006) Παράδειγμα: di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) και diethyl phthalate (DEP) Κύριοι βιοδείκτες: μονοεστέρες Οι πιθανές πηγές έκθεσης σε DEHP είναι πολυάριθμες (π.χ. ιατρικά πλαστικά, όπως σωληνάρια και σύριγγες, υλικά στο νοικοκυριό, όπως επικάλυψη πατωμάτων ή τοίχων, πλαστικά παιχνίδια) (Calafat and McKee 2006). Μπορούν να μετρηθούν επιπλέον μεταβολίτες σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα ούρα, καλύτεροι δείκτες έκθεσης σε DEHP σε σχέση με τον μονοεστέρα Περίπτωση μελέτης – Φθαλικά Όσον αφορά το DEP, είναι γνωστό ότι αρώματα (καλλυντικά) και άλλα καταναλωτικά προϊόντα ενδέχεται να περιέχουν DEP. Ωστόσο, η χρήση DEP στη βιομηχανία καλλυντικών και αρωμάτων αποτελεί < 20% όλης της παραγωγής DEP (Api 2001). Επομένως, πολλές άλλες πηγές έκθεσης είναι πιθανό να συνεισφέρουν στην επιβάρυνση του ανθρώπου σε DEP.  Περίπτωση μελέτης – Φθαλικά Υπόψιν πρέπει να λαμβάνεται και ο τρόπος δειγματοληψίας καθώς μπορεί να αποτελεί πηγή επιμόλυνσης των δειγμάτων. (Calafat and McKee 2006 ). Επειδή τα DEP και DEHP είναι υλικά που βρίσκονται σε πλαστικά (DEHP) και σαπούνια / καθαριστικά διαλύματα (DEP), τα δοχεία και τα καθαριστικά διαλύματα (με άρωμα) που χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο μπορεί να αποτελέσουν πηγή επιμόλυνσης. Μια απλή λύση για να λυθεί αυτό το πρόβλημα κατά τη δειγματοληψία είναι η μέτρηση των φθαλικών μεταβολιτών στα ούρα αντί για τις μητρικές ενώσεις. Περίπτωση μελέτης – Φθαλικά Μεταβολίτες  Περίπτωση μελέτης – Φθαλικά Καθώς οι μητρικές ενώσεις μεταβολίζονται πριν την απέκκριση στα ούρα, εξετάσθηκαν σε ιδρώτα και αίμα αλλά όχι στα ούρα: μεταβολίτες εξετάσθηκαν και στα τρία σωματικά υγρά – ούρα, ιδρώτας, αίμα Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης / φασματομετρία μάζας (High performance liquid chromatography/mass spectrometry, HPCL/MS) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό φθαλικών μεταβολιτών, ενώ αέρια χρωματογραφία / φασματομετρία μάζας (gas chromatography/mass spectrometry, GC/MS) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των μητρικών ενώσεων  Περίπτωση μελέτης – Οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Τα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα χρησιμοποιούνται ευρέως στη γεωργία και σε μικρότερο βαθμό σε οικίες. Επειδή έχουν ανιχνευθεί υπολείμματα οργανοφωσφορικών φυατοφαρμάκων σε επιτρεπτά (και κάποιες φορές μη επιτρεπτά) επίπεδα σε πολλά γεωργικά προϊόντα, είναι πιθανή η διατροφική έκθεση σε οργανοφωσφορικά σε χαμηλά επίπεδα. Άλλες πιθανές πηγές έκθεσης σε κάποια οργανοφωσφορικά που χρησιμοποιούνται σε οικίες περιλαμβάνουν τον περιορισμό των τερμιτών πριν την κατασκευή καθώς και χρήση τους στον κήπο αλλά και μέσα στο σπίτι. Περίπτωση μελέτης – Οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Γενικά, η επαγγελματική έκθεση σε οργανοφωσφορικά φαίνεται να είναι πολύ μικρή σε σχέση με την περιβαλλοντική έκθεση (Barr et al. 2004, 2005). Ωστόσο, συγκεκριμένοι πληθυσμοί όπως παιδιά γεωργών ενδέχεται να εκτίθενται περισσότερο. Η έκθεση του γενικού πληθυσμού φαίνεται να είναι χαμηλή ανεξάρτητα από το αν συνυπολογίζεται ή όχι η έκθεση σε προσχηματισμένους μεταβολίτες. Τα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα (π.χ. chlorpyrifos and malathion), ως δυνητικοί αναστολείς του ενζύμου ακτετυλοχολινεστεράση που διασπά το νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη, προκαλούν καρδιοτοξικότητα, ναυτία, πονοκεφάλους, αυξημένο πτυαλισμό, ακόμα και θάνατο, ανάλογα με το μέγεθος της έκθεσης.  Περίπτωση μελέτης – Οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Τα οργανοφωσφορικά μεταβολίζονται αμέσως και απεκκρίνονται στα ούρα. Πολλοί από τους μεταβολίτες στα ούρα είναι κοινοί, εμποδίζοντας την ταυτοποίηση της μητρικής ένωσης στην οποία εκτέθηκε κάποιος. Η μέτρηση του φυτοφαρμάκου στο αίμα είναι ο πιο επιλεκτικός δείκτης έκθεσης σε ένα συγκεκριμένο φυτοφάρμακο. Ωστόσο, αυτές οι μετρήσεις είναι περίπλοκες και μπορεί να παρεμποδιστούν από την αστάθειά τους στο αίμα. Περίπτωση μελέτης – Οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα Τα οργανοφωσφορικά μεταβολίζονται αμέσως και απεκκρίνονται στα ούρα (Barr and Angerer 2006). Υπάρχουν πολλοί μέθοδοι για τη μέτρηση των κοινών μεταβολιτών των malathion and chlorpyrifos (οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα). Στις περισσότερες περιπτώσεις, η σύγκριση των μεθόδων δεν δείχνει σημαντικές διαφορές, αν και οι αναλυτικές τεχνικές που χρησιμοποιούν HPLC συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μάζας (tandem mass spectrometry) παρέχει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα. Επίσης, πολλοί από τους οργανοφωσφορικούς μεταβολίτες που μετρώνται μπορεί να προέρχονται από περιβαλλοντική έκθεση στον προσχηματισμένο μεταβολίτη, περιπλέκοντας έτσι την ερμηνεία των δεδομένων βιοπαρακολούθησης (Barr and Angerer 2006). Ανίχνευση και Προσδιορισμός Τοξικών Ουσιών στα Βιολογικά Υλικά ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ – ΣΥΖΗΤΗΣΗ