DNA ao RNA PDF - BCM Santa's Nightmare 2022/2023

Aula 8 DNA ao RNA Gene: unidade de DNA que contém a informação para a síntese de uma cadeia polipeptídica ou de um RNA funcional. Expressão genética Procarióticas: DNA é transcrito formando mRNA, que depois é traduzido formando proteínas Eucarióticas: DNA, que...

Aula 8 DNA ao RNA Gene: unidade de DNA que contém a informação para a síntese de uma cadeia polipeptídica ou de um RNA funcional. Expressão genética Procarióticas: DNA é transcrito formando mRNA, que depois é traduzido formando proteínas Eucarióticas: DNA, que é composto por 2 tipos de sequências: intrões (sequências não codificantes) e exões (codificantes), é transcrito formando transcrito de RNA primário, que depois sofre diversas modificações, ou seja, o processamento do RNA. Seguidamente é exportado para o citoplasma e traduzido em proteína. O DNA contém toda a informação necessária para codificar todas as nossas proteínas. No entanto, o RNA para além de ter um papel muito importante na síntese de proteínas também possui funções de regulação (miRNA) e de catalisação, funcionado como enzimas (as ribozimas). TRANSCRIÇÃO - Quem é o responsável? RNA polimerase O que faz? Lê apenas uma das cadeias de DNA e por incorporação de ribonucleótidos, na presença de magnésio, sintetiza o RNA mensageiro, uma cadeia complementar à cadeia de DNA molde, com o U a substituir T. - Características da polimerização: orientada (5’-3’) e sequencial. Dividida em 3 etapas: - Iniciação: RNA polimerase liga-se à dupla cadeia de DNA, promove a abertura da dupla hélice e incorpora o primeiro ribonucleótido da cadeia de RNA nascente. Mas como é a RNA polimerase sabe onde se ligar na cadeia de RNA? Sabe porque existe uma zona do DNA, designada de promotor, que sinaliza à RNA polimerase para se ligar naquela zona. No entanto, a transcrição só vai começar em +1, local onde existe uma adenina. Mas como é que começa? Através da associação de um conjunto de fatores proteicos num complexo. Qual associação? TBP liga-se à TATA box e a ele liga-se o TF2D. Este último vai servir de ancorarem para o TF2B, que permite o posicionamento da RNA polimerase 2 no local de início de transcrição. Seguidamente liga-se o TF2F, que vai estabilizar a interação da RNA polimerase com o TF2B e TBP e recrutar mais um fator o TF2E. Este último vai recrutar o TF2H que tem atividade helicase, ou seja, um papel essencial na abertura/separação da duas cadeias de DNA. Além disso vai ter atividade cinase, ou seja, vai promover a fosfolarização do CTD, que ativa a subunidade menor da RNA polimerase. Quando os primeiros nucleótidos são incorporados há a libertação de todos os TFs, excepto do TF2D que mantém a RNA polimerase ancorada. Assim podemos passar à elongação *Composição do promotor: - na zona central, que é relativamente curta, existe a TATAbox, que é essencial para determinar o local para o início da transcrição e que se localiza aproximadamente a 25-39 nucleótidos do início da transcrição. Para além do promotor, existem zonas adjacentes, designadas de zonas de rolatórias, que podem estimular ou reprimir a transcrição. Como assim? Lá existem: - ativadores transcricionais que se ligam a sequências específicas do DNA e que promovem a transcrição - mediadores: enzimas que fazem parte de um complexo e que podem ativar ou inibir a transcrição - complexos remodeladores de cromatina: podem impedir ou promover a transcrição - enzimas modificadoras de histonas *Estas zonas podem estar entre 50 a 100 nucleótidos do local onde se inicia a transcrição. Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 - Elongação: RNA polimerase continua a sua polimerização, ou seja, a incorporação de ribonucleótidos na cadeia que está a nascer no sentido 5’-3’. No entanto, é importante ressalvar que no DNA, a RNA polimerase está a avançar de 3’-5’ - Terminação: RNA polimerase dissocia-se do DNA, quando chega a um local de fim de transcrição/ encontra um codão STOP e liberta a cadeia de mRNA completa. Que tipo de cadeia é libertada? - na extremidade 5’: existe uma guanina metilada, que se designada de 5’cap. Tem como função proteger o RNA de se degradar, por parte de enzimas hidrolíticas e sinalizar local de ligação de ribossomas. No entanto a adição deste composto é feita antes de o mRNA ser libertado no citoplasma. Como? 1) fosfatasse remove o grupo fosfato a 5’ 2) Guanilil-transferase adiciona guanina tri-fosfato a 5’ 3) Metil-transferase adiciona o grupo metil à guanosina - na parte central: existe a sequência codificante e os intrões - na extremidade 3’: existe uma cauda de adeninas, designada de cauda poli-A e que pode ter 150-250 adeninas. Tem como função facilitar a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma e a ligação ao ribossoma e protegê-lo da degradação (por ação das enzimas hidrolíticas). Mas quando é que é feita? Quando a endonuclease liberta 3’OH, ou seja, torna-o disponível para adicionar adenina pela poli-A polimerase. PROCESSAMENTO: Splicing do mRNA -> remoção dos intrões e junção dos exões, de modo a originar uma molécula de mRNA com uma sequência codificante continua. Só a partir daqui é que esta molécula pode ser lida pelos ribossomas *Tipos de RNA polimerase - I: localiza-se no nucléolo e é responsável por fazer a transcrição de rRNAs - II: localiza-se no nucleoplasma e é responsável por fazer a transcrição do mRNA e outros - III: localiza-se no nucleoplasma e é responsável pela síntese de tRNA e 1 tipo de rRNA Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 Aula 9 Visão Geral da Tradução Proteica e Modificações Pós-traducionais Como é que 4 tipos de nucleótidos geram 20 tipos diferentes de aminoácidos? Nucleótidos de RNA são lidos de 3 em 3 e simultaneamente existem grupos de 3 nucleótidos (codões) diferentes que codificam o mesmo aminoácido (REDUNDÂNCIA DO CÓDIGO GENÉTICO) e por isso é que em vez de 64 aminoácidos diferentes temos apenas 20. AUG- metionina: 1º codão sintetizado Codões stop: codões que não correspondem a nenhum aminoácido e como tal quando aparecem a tradução é interrompida. Quais são? UAA, UAG e UGA Todo o DNA é transcrito, mas nem todo é traduzido. Como tal, existem sempre nucleótidos antes e depois do segmento traduzido. Isso faz com que existam 3 módulos de leitura, sendo que cada um origina uma proteína diferente. Assim, é fácil concluir que cada proteína tem o seu modulo de leitura. Precisamos do quê para realizar a tradução? - RNA mensageiro: provém do núcleo e vai para o citoplasma-> para isso, está anexado a inúmeras proteínas, pois só assim passará pelo poro nuclear. Mal chega ao citoplasma é reconhecido e ocorrem logo alguns processos - Energia (ATP e GTP) - RNA transportadores: são adaptadores/descodificadores -> vão ler os codões, por complementaridade, através de anti-codões e consequentemente libertar/associar o aminoácido correto. São as 2 primeiras bases as mais importantes e por isso é que diferentes tRNAs podem trazer o mesmo aminoácido/ mesmo tRNA pode reconhecer diferentes codões - > REDUNDÂNCIA. Mas para isso é necessário que o aminoácido se ligue ao correto tRNA e isso é assegurado pela aminoacil tRNA sintetase. Para cada tRNA existe uma enzima destas especifica e a ligação ocorre: 1º com a ativação do aa que ocorre no sítio de síntese e apenas se o aminácido tiver um tamanho semelhante ao aminoácido correto e depois com a ligação do aa ao tRNA (extremidade carboxi-terminal liga-se à extremidade 3’ do tRNA), que só ocorre se no sítio de edição o aminoácido não lá conseguir entrar, porque os de menor tamanho vão conseguir entrar. Têm uma estrutura complexa (em forma de trevo); - Ribossomas: formados por 2 subunidades: uma grande e uma pequena. Na grande ocorre a ligação entre os diferentes tipos de aminoácidos e na pequena é onde o anti-codão no tRNA Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 encontra o codão no mRNA. São formados por 2/3 de rRNA e 1/3 de proteínas. O rRNA é responsável pela estrutura do ribossoma, pelo posicionamento dos tRNA e do mRNA e catalisa a ligação peptídica. Já as proteínas estabilizam a estrutura do ribossoma e ajudam nas mudanças conformacionais. Assim, ao contrário das restantes células, aqui o rRNA é muito mais importante/assume um papel mais importante que as proteínas. Cada ribossoma tem espaço para 3 tRNAs e possui 3 sítios muito importantes: sítio E, por onde os tRNAs que já fizeram o seu trabalho saem; sítio P, onde está o tRNA com o polipeptídeo e sítio A onde está a aminacil tRNA sintetase para ocorrer a ligação entre tRNA e respetivo aminoácido - Proteínas que auxiliam este processo. Quais são: eIFs (Fatores de Iniciação Eucarióticos, que mal o mRNA chega ao citoplasma o reconhecem); EF (Fatores de Alongamento); Fatores de Libertação Tradução- 3 etapas: - Iniciação: RNA é lido de 5’ para 3’ e proteína é feita de N-terminal para C-terminal mRNA está ligado a várias proteínas e está no citoplasma. Quem o reconhece? Subunidade menor já com o tRNA iniciador ligado a ela (sítio P). Este está associada ao aa metionina e é o único que é capaz de se ligar apenas à subunidade menor, sem o ribossoma estar montado. É trazido por um eIF2, que está junto a um GTP. mRNA é lido e quando aparecer o codão correspondente ao aa metionina, o GTP é clivado, a energia é libertada, o Eif2 é libertado também e como tal, a subunidade maior liga-se à subunidade menor. Mas todas as proteínas funcionam começam com metionina? Não!! Na maior parte das vezes, a extremidade é cortada e eliminada, indo com ela a metionina. - Alongamento: sítio A está livre e chega um novo tRNA com o seu aa e com um EF associado, sendo que a esta proteína ainda está associado um GTP. Lá testa-se o aminoácido, para ver se é o correto. Se o é, o GTP é clivado, energia é libertada e o EF também. Esta libertação permite que o aa seja libertado e se ligue à cadeia polipeptídica. Mas antes, a complementaridade entre codão e anti-codão é avaliada e se não for boa, o tRNA juntamente com o seu aa são eliminados. Esta avaliação é possível de ser feita porque há um atraso entre a libertação da EF e a do aa. Após a ligação, o sítio A fica ocupada por um polipeptídeo e por isso liga-se á subunidade maior um EF2 com um GTP, para provocar a deslocação desta mesma subunidade. Após esta deslocação, o GTP é clivado, o EF2 é libertado e o sítio A já fica livre, o tRNA é libertado pelo sítio E e a cadeia de mRNA anda 3 nucleóticos para a frente. Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 - Terminação: Encontramos 3 nucleótidos que não correspondem a nenhum aa e como tal, no sítio A entra uma proteína ligada ao GTP. O GTP é clivado e provoca uma mudança conformacional: subunidade maior move-se para a frente, a ligação entre o polipeptídeo e o tRNA é quebrada e como tal, o polipeptídeo é libertado. Todas os componentes após esta libertação são separados para se puder começar um novo processo. No entanto, como a célula precisa de várias proteínas é necessário otimizar este processo. Como? Através de polirribossomas. Como assim? O mesmo mRNA é lido por vários ribossomas. Quem regula o processo de tradução? Exemplo: Se a proteína não é precisa, não vale a pena continuar a tradução, porque é gastar energia atoa… ou se a célula está em stress nutricional, não vale a pena gastar energia e começar a tradução, se depois esta vai ser parada a meio devido à falta de aa. Assim para evitar todos estes gastos desnecessários, EF2 é fosforilado e como tal, a tradução é bloqueada… nem o ribossoma é montado! Para além disso, a maior parte dos antibióticos o que faz é bloquear a tradução dos ribossomas das bactérias. Proteína está feita… mas não está pronta para fazer a sua função! Então após a cadeia polipeptídica ser libertada, esta tem de alcançar a sua estrutura terciária/funcional. Mas elas precisam de ajuda neste processo (folding). Quem ajuda? Chaperones -> Como tal, estão próximas da saída do ribossoma para puderem atuar logo. As proteínas não executam a sua função todas no mesmo sítio e como tal, mal os primeiros aa contactem com o citoplasma, existem proteínas que os reconhecem e que, portanto, os levam (alguns ainda em plena formação – é o que acontece com as proteínas que vão para o retículo endoplasmático) para os seus locais de atuação. Exploremos então este caso: Mal a parte hidrofóbica é exposta, o ribossoma com a proteína é levado para a membrana do reticulo endoplasmático e por isso é que existe um rugoso e um liso, sendo o rugoso, rugoso, apenas porque possui acoplado a ele vários ribossomas a executar tradução (NÃO existem ribossomas lá sem estarem a realizar tradução). Quando lá chegam, o ribossoma liga-se ao recetor/ protein translocator que permite que a cadeia polipeptídica, à medida que está a ser formada, entre para o lúmen do retículo endoplasmático, neste caso, rugoso. *Quando a proteína está a ser feita em polirribossomas, todos vão até ao RER. ** Existem vezes em que a proteína só entra para o lúmen do RER após ter sido completamente traduzida Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023 Modificações Pós-traducionais/Co-traducionais - Clivagem Proteolítica: consiste na remoção de certas partes da proteína; exemplo: remoção das metioninas iniciais, de peptídeos sinais, etc.; é irreversível e pode ser tanto co-traducional como pós-traducional - Glicosilação: consiste na adição de açucares ao grupo amina ou ao grupo OH, melhorando assim o folding da proteína, a estabilidade da proteína, etc.; comum em glicoproteínas, ou seja, proteínas de membranas; pode ser tanto co-traducional ou pós-traducional; - Acetilação: consiste na adição do grupo acetil a lisinas; é reversível; - Metilação: consiste na adição do grupo metil a argininas ou lisinas; é reversível *As duas alterações de cima provocam a modificação da carga e da conformação da proteína, sendo essas lidas pela célula e responsáveis pelo futura da proteína. - Fosforilação: consiste na adição de um grupo fosfato de um ATP ao grupo R de tirosinas, serinas ou treoninas; causam mudanças conformacionais, que ou ativam ou desativam a proteína – forma mais comum de regular a ativação das proteínas na célula; é reversível e pós- traducional; - Ubiquitinação: consiste na adição covalente de uma pequena proteína (ubiquitina-36 aa) a um resíduo de lisina; a quantidade de ubiquitinas e a posição da lisina envolvida determina o futuro da mesma proteína – exemplo: quando estão em série significa que a proteína é para ser degradada. - Sumoilação - Lipidação: consiste na adição covalente de grupos lípidos, permitindo que as proteínas sejam integradas nas membranas/áreas hidrofóbicas; melhora a estabilidade da mesma; pode ser tanto co-traducional ou pós-traducional; - Carboxilação - Hidroxilação - Adição de grupos químicos tornando a proteína ativa - Adição de pequenos grupos químicos que mudam a conformação da proteína No caso de histonas, 8 histonas formam um nucleossoma que organiza o DNA no núcleo da célula. Como estão por fora, estão mais sujeitas a sofrerem alterações e como tal podem perder ou ganhar afinidade para com o DNA, provocando a maior ou menor expressão de genes naquele local, respetivamente. Estas são necessárias para a proteína atingir a sua forma madura/funcional; são essenciais para a estabilidade da mesma e para a estabilidade da célula, pois muitas vezes indicam o que próximo passo na sua “vida”; são na maioria ligações covalentes reversíveis; não ocorrem em todos os aa, etc. Catarina Cruz BCM Santa’s Nightmare 2022/2023