Immunology Practical Work B3103 PDF 2024-2025

TRAVAUX PRATIQUES & DIRIGES D’IMMUNOLOGIE B3103 DEPARTEMENT SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE UNIVERSITE LIBANAISE – FACULTE DES SCIENCES II DR. RANIA JOUNBLAT DR. YOUSSEF EL FAKHRY SEMESTRE S5 (2024-2025)  Programme des travaux pra...

TRAVAUX PRATIQUES & DIRIGES D’IMMUNOLOGIE B3103 DEPARTEMENT SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE UNIVERSITE LIBANAISE – FACULTE DES SCIENCES II DR. RANIA JOUNBLAT DR. YOUSSEF EL FAKHRY SEMESTRE S5 (2024-2025)  Programme des travaux pratiques et dirigés d’Immunologie (B3103 - 18 heures) 1- Les anticorps polyclonaux et monoclonaux (TD) 2- Les réactions de précipitation et d’agglutination (CRP- agglutination passive du latex) 3- Immunohématologie- les réactions d’hémagglutination (groupage ABO, rhésus et test de Coombs) 4- Immunofluorescence (IF/IHC/ FACS ou cytométrie en flux), l'isolation des cellules mononucléaires sanguines (Ficoll) (TD) 5- Versions d’ELISA (TD) 6- Immunodétections par technique enzymatique (ELISA : indirecte / directe ou Sandwich) 7- Immunodiffusion : les réactions de précipitation en gel et Western Blotting 8- Test hémolytique du complément 9- Test Rapide 1  ‫كيفية احتساب عالمات األعمال التطبيقية‬ ‫إذا كانت األعمال التطبيقية من ضمن المقررات النظرية‪:‬‬ ‫ ‬ ‫تحتسب عالمات األعمال التطبيقية نسبيا ً حسب عدد الساعة الملحوظة في المقرر على أن ال تتعدى ‪ ٪٣٠‬من العالمة‬ ‫النهائية (العالمة النهائية = عالمة االمتحان الجزئي ‪ +‬عالمة االمتحان النهائي ‪ +‬عالمة األعمال التطبيقية)‬ ‫على أن يقوم مجلس الوحدة بتحديد النسب العائدة لعالمة االمتحان الجزئي ولعالمة االمتحان النهائي‬ ‫إذا كان المقرر يحتوي فقط على أعمال تطبيقية‪:‬‬ ‫ ‬ ‫تحتسب العالمة النهائية للمقرر وفقا ً للنسب االتية ‪:‬‬ ‫‪ ٪١٠‬حضور‬ ‫‪ ٪٢٠‬عالمة التقرير المرفوع لألستاذ (ربرت)‬ ‫‪ ٪٤٠‬لإلمتحان العملي‬ ‫‪ ٪٣٠‬لإلمتحان الخطي‬ ‫في حل ع دم القدرة على إنجاز إمتحان عملي لالعمال التطبيقية توزع النسبة المخصصة لها في العالمة النهائية بالتساوي‬ ‫بين النسبة المحددة لعالمة التقرير المرفوع لألستاذ والنسبة المحددة لعالمة االمتحان الخطي‬ ‫حاالت خاصة ‪:‬‬ ‫إذا كان المقرر التطبيقي يحتوي أكثر من محور‪:‬‬ ‫‪ -‬يخضع الطالب إلمتحان عملي في كل محور تطبيقي الورد في توصف المقرر‪.‬‬ ‫‪ -‬يخضع الطالب إلمتحان نظري واحد لمدة ساعتين يشمل مجمل المحاور الواردة في توصيف المقرر‪.‬‬ ‫‪ -‬تنقل العالمة النهائية حسب عدد الساعات المخصصة لكل محور‪.‬‬ ‫‪ -‬يعتبر راسبا ً كل طالب يتغيب أكثر من مرتين إثنين في كل المحاور العائدة للمقرر وال يحق له تقديم االمتحانات العملية‬ ‫للمحاور وكذلك اإلمتحان الخطي‪.‬‬ ‫‪ -‬يعتبر الطالب راسبا ً في المقرر إذا لم ينل عالمة نهائية في المقرر ‪. ١٠٠/٥٠‬‬ ‫‪ -‬يحتفظ الطالب الراسب بالعالمات التي نالها عن حضوره للتجارب العملية‪ ،‬التقارير المرفوعة لألستاذ واالمتحانات العملية‬ ‫التي خدعة لها ويخضع إلمتحان خطي فقط كدورة الثانية‪.‬‬ ‫‪ -‬ال يحتفظ الطالب للسنة التالية بعالمة المختبر في حل رسوبه في الدورة الثانية‪.‬‬ ‫‪2‬‬  Instructions générales pour les travaux pratiques d’Immunologie Fondamentale Matériel indispensable - Blouse de laboratoire en coton, manches longues - Gants de latex usage unique, non stériles - Un rouleau de papier cuisine - Marqueurs permanents noirs, pour écriture sur verre, Stabilo grosseur F - Matériel d’écriture - Calculatrice Mesures de sécurité: - Porter en permanence la blouse et les gants pendant toute la séance de travaux pratiques - Considérer tout spécimen biologique comme potentiellement infectieux: éviter tout contact avec la peau ou les muqueuses, jeter judicieusement (voir ci-dessous) et nettoyer tout épanchement accidentel - Ne pas manger, boire ou mastiquer du chewing-gum au laboratoire - Ne pas utiliser votre téléphone portable - Les cheveux longs doivent être attachés - Eviter de toucher avec vos gants à tout objet en contact potentiel avec la bouche - Jeter chaque type de déchet de manière adéquate: o Ejecter les cônes de pipette automatique directement dans le cristallisoir contenant de l’eau de Javel à 30% (l’eau de Javel est le meilleur désinfectant) o Verser tous les liquides biologiques dans un cristallisoir contenant de l’eau de Javel à 30% o Remplir ou rincer tout le matériel de laboratoire à usage unique ou multiple ayant contenu du matériel biologique avec de l’eau de Javel à 30% et incuber pour 1 minute au moins o Jeter le matériel de laboratoire à usage unique (tubes et plaques en plastiques…), désinfecté à l’eau de Javel, dans les sacs poubelle o Laver le matériel à usage multiple, désinfecté, très abondamment à l’eau de robinet. Savonner, rincer à l’eau de robinet puis à l’eau distillée, retourner pour sécher sur du papier cuisine propre - Après avoir terminé, nettoyer la paillasse avec de l’éthanol 70% - Enlever les gants, les jeter dans les poubelles, et se laver toujours les mains pour 30 secondes au moins avant de quitter le laboratoire. 3 Rédaction d’un rapport scientifique Un rapport scientifique est la conclusion logique et essentielle qui complète un travail scientifique. Le rapport doit être explicite, objectif, instructif, concis et précis. Afin d’assurer ces critères, tout rapport scientifique doit être impérativement organisé en quatre sections : 1. Introduction : problématique, objectif du travail, principe du travail 2. Matériel et Méthodologie 3. Résultats 4. Conclusion Directives générales concernant les différentes sections d’un rapport scientifique de Travaux Pratiques : 1. Introduction 1.1. Problématique Cette section place le travail dans son contexte : elle résume ce que l’on sait du sujet et relie les différents éléments de ce savoir entre eux. Cette section est rédigée au temps présent et elle est appuyée par une bibliographie. 1.2. Objectif du travail Cette section doit indiquer le but de l’expérience, c’est-à-dire pourquoi elle a été choisie et réalisée, ce que l’on cherche à savoir. Cette section doit être rédigée au temps présent. 1.3 Principe Cette section indique comment des anticorps ou antigènes sont recherchés selon la technique utilisée dans le test. Cette section doit être également rédigée au temps présent. 2- Matériel et Méthodologie 2.1. Matériel Il comporte essentiellement les réactifs spécifiques à ce test : Le sérum test (on indique ici son numéro), Les contrôles positif et négatif sélectionnés, Les tampons utilisés : nature, molarité et pH. Il ne faut pas mentionner dans le rapport les solutions d’usage usuel, récipients, équipement, etc… 2.2. Méthodes : Cette section est destinée à permettre au lecteur d’évaluer les conditions de l’expérience, et par conséquent de faire sa propre interprétation des résultats, ainsi que de répéter l’expérience dans les mêmes conditions si nécessaire. Elle indique donc les étapes de la procédure de manière quantitative et objective, en donnant les éléments suivants : Les dilutions de sérum testées et le nombre de points expérimentaux, Les contrôles, Le volume et la concentration des bactéries rajoutées, La durée et la température d’incubation, La durée et la vitesse de centrifugation, Le mode de lecture, La méthode d’estimation des résultats..etc. Il ne faut pas dans cette section détailler la façon de faire les dilutions ou les « trucs » de manipulation, tels que pipetage, calcul des dilutions, homogénéisation, fermeture des tubes, etc…). Cette section est rédigée au passé composé actif (Nous avons dilué le sérum ….) ou, encore mieux, passif (le sérum a été dilué…). 4 3- Résultats Cette section décrit ce qui a été observé à la fin de l’expérience. Elle doit en premier lieu démontrer la validité de l’expérience en donnant les résultats des contrôles positif et négatif et en indiquant si ces résultats sont conformes à ceux escomptés. Seulement alors on peut s’assurer que l’expérience s’est déroulée dans les bonnes conditions de qualité et que les résultats sont fiables. Ensuite, on indique les résultats de l’ensemble du test. Ceci peut être fait de différentes manières, généralement à l’aide d’un texte rédigé, de tableaux, de graphes, de diagrammes, de photos, etc… Tous ces éléments graphiques doivent être impérativement numérotés, titrés et légendés. Comme la section « Méthodologie », cette section est rédigée au passé composé actif (Nous avons dilué le sérum ….) ou, encore mieux, passif (le sérum a été dilué…). 4- Conclusion Cette section doit indiquer la ou les interprétations possibles des résultats de l’expérience, les limites de cette interprétation, et éventuellement les recommandations pour affiner dans le futur la réponse à la problématique. Cette section doit être rédigée au temps présent. 5  Les Anticorps Polyclonaux et Monoclonaux 1- Antisérum polyclonal La plupart des antigènes possèdent de nombreux épitopes Prolifération et différentiation d’une série de clones de cellules B Réponse anticorps polyclonale: - Avantages et -Désavantages 6 Méthode pour la préparation d’un anticorps monoclonal: Köhler & Milstein (1975) 7  Difficultés Techniques dans la Production des Anticorps Monoclonaux Humains - Manque de cellules humaines: immortelles, HGPRT- et Ig- - Difficultés d’obtenir facilement des cellules B activées par un antigène a partir de tissus lymphoïdes humains!! - Reconstitution des souris SCID (severe combined immunodeficiency) Souris: SCID- humanisées (Hu-SCID) 8  Utilisation des Anticorps Monoclonaux - Sont des réactifs très utiles pour médecine clinique: En diagnostic En Imagerie (Acs marqués par 131I) En thérapie ex: Immunotoxine 9  Les techniques immunologiques basées sur l’interaction Ag/Ac A- Techniques sans marquage : 1- Réactions de précipitation 2- Réactions d’agglutination immunologique 3- Réaction impliquant le complément 4- Réactions de neutralisation B- Techniques avec marquage : 1- Immunofluorescence 2- Radio-Immunologie – Enzymologie C- Sensibilité des tests TECHNIQUES D’IMMUNOANALYSE La spécificité de la réaction Ag-Ac permet : - la recherche, l'identification ou le dosage de toute molécule capable d'induire la production d'anticorps - la recherche, l'identification ou le dosage d'anticorps grâce à l'antigène correspondant. Liaison Ag-Ac ---> réaction équilibrée réaction réversible. Lors de la réaction Ag-Ac, deux cas peuvent se présenter : on peut observer la survenue de phénomènes secondaires, physiques ou biologiques, inconstants mais visibles d’où différents types de technique: - Précipitation - Agglutination immunologique - Techniques du complément L’union des molécules d'Ag au Fab des anticorps, est un phénomène constant mais invisible. Cette union peut être mise en évidence par le marquage de l’Ag ou de l’Ac ce sont les techniques dites de marquage : - Immunofluorescence - Radio-immunologie - Immuno-enzymologie 10 A)TECHNIQUES SANS MARQUAGE PRECIPITATION 1- Généralités La réaction de précipitation en milieu liquide est l’illustration classique de la réaction antigène-anticorps. Restriction : Ag et l'Ac tous les deux en phase soluble Ac précipitants. 2- Etude de la courbe de précipitation Des concentrations croissantes d’Ag sont ajoutées pour une concentration fixe d’Ac. Trois zones sont à distinguer : -zone d’excès d’Ac, -zone d’équivalence (précipité maximum), -zone d’excès d’Ag 3- Mécanisme La théorie du réseau (MARRACK) = formation d’un réseau tridimensionnel et multimoléculaire insoluble = union d’Ag multivalents avec des Ac au moins bivalents Importance des différents paramètres : pH, température, force ionique 4- Précipitation en milieu liquide 4.1 Réactions qualitatives Ring test 4.2 Réactions quantitatives Immunonéphélémétrie laser = Mesure de la diffusion de la lumière sous un angle différent de zéro (par rapport à l’axe de propagation de la lumière incidente) Les particules dispersant la lumière sont des complexes immuns précipités en milieu liquide. Il existe donc une relation entre l'intensité de la lumière mesurée par néphélémétrie et la quantité de précipité Ag-Ac. Le dosage d’un Ag s’effectue par précipitation avec l’immunsérum spécifique et par référence à une courbe d’étalonnage préétablie avec des solutions d'Ag de concentrations croissantes connues. (Dosage de nombreuses protéines du sérum IgG, IgM, IgA, protéines du complément...) 11 Le test est peu sensible (seuil 0,5mg/ml). Une variante permet de baisser le seuil de détection en utilisant des microparticules (latex par ex) sur lesquelles sont fixés des Ac (dosage des IgE). 5- Précipitation en milieu gélifié Analyse qualitative de mélanges d’Ag, Immunodosage d’un Ag. - Les solutions d’Ag et d’Ac diffusent dans le milieu gélifié à partir de réservoirs--> gradients réguliers de concentrations décroissantes - A l’équivalence, précipitation du complexe Ag-Ac, le précipité retenu dans les mailles du gel sera lavé et éventuellement coloré. 5.1 Les gels Gélose (polyosides d’algue marine) Agarose. Gel de polyacrylamide 5.2 Les méthodes 5.2.1 Immunodiffusion simple L’Ac est inclus dans la gélose à concentration constante Immunodiffusion radiale = Technique de MANCINI 5.2.2 Double immunodiffusion : Ac et Ag migrent l’un vers l’autre à partir de réservoirs pratiqués dans un gel a) Diffusion spontanée Technique d'OUCHTERLONY --> arcs de précipitation 12 13  b) Electro-immunodiffusion Immunotransfert ou Immunoempreinte ou Western blot 1er tps : séparation électrophorétique des protéines en gel de polyacrylamide 2ème tps : transfert électrique de ces protéines sur une feuille de nitrocellulose 3ème tps : révélation immunologique : des sérums contenant des Ac sont appliqués sur la nitrocellulose / lavage / les Ac, fixés sur les bandes protéiniques sont révélés par une anti- globuline marquée par une enzyme (on ajoute son substrat= réaction colorée) ou par un radioélément (autoradiographie). Cette méthode permet : - de déterminer la masse moléculaire d'un Ag. - de mettre en évidence dans un sérum des Ac dirigés contre différentes protéines (virales par ex : application, anticorps anti HIV). 14  AGGLUTINATION IMMUNOLOGIQUE Agglutination immunologique = réunion en amas de particules à la suite d'une réaction Ag-Ac (suspension homogène de particules puis agrégats visibles à l'oeil nu). Restriction : Ag particulaire Hémagglutination : repose sur la capacité de l’anticorps à agréger les GR grâce à la présence d’antigène à leur surface. 1- Théorie de l'agglutination Réaction complexe qui met en jeu des modifications des charges électriques à la surface des particules empêchant leur agglutination spontanée. 2- Conditions expérimentales Anticorps agglutinants : IgM surtout (10 à 100 fois plus que IgG) Densité des sites antigéniques : relations entre agglutinabilité et densité en sites antigéniques Facteurs expérimentaux : température, pH (6 à 8), force ionique. 3- Agglutination directe L'antigène est situé sur la face externe de la particule, sur une membrane cellulaire ou bactérienne, directement accessible par l'anticorps. détermination des groupes sanguins agglutination de bactéries (typage des salmonelles etc…) 4- Agglutination artificielle Utilisation d'artifices techniques permettant de favoriser l'agglutination ou permettant la détection d'anticorps non agglutinants. 4.1 Substances macromoléculaires Albumine, polyvinyl pyrolidone, dextran 4.2 Enzymes protéolytiques Papaïne, pepsine, broméline 4.3 Antiglobuline Permet de déceler des anticorps anti-globules rouges non agglutinants = Test de Coombs direct : (test globulaire) étude des hématies du patient pour rechercher une immunisation in vivo (Ac fixés sur ses hématies) mal. hémolytique du nouveau né, mal. hémolytique autoimmune indirect : (test sérique) détection d’Ac libres anti-globules rouges dans le sérum du patient 1) contact sérum + panel de GR à 37°, lavage 2) + antiglobuline--> agglut. si positif recherche d’agglutinines irrégulières 5- Agglutination passive L'antigène soluble est fixé sur une particule neutre servant uniquement de support. 5.1 Particules : - hématies (humaines groupe O, mouton, dinde) formolées = stables plusieurs mois à 4°C - particules de latex (inertes et calibrées) 5.2 Fixation de l'antigène sur les particules: Selon les particules et l’Ag à fixer : simple contact ou fixation chimique ou fixation Immunologique. 6- Modalités techniques des réactions d'agglutination : Réaction sur lame, en tubes, en microplaque, étude quantitative. 10  TECHNIQUES UTILISANT LE COMPLEMENT 1- Etude du complément 1.1 Réaction d'hémolyse Basée principalement sur la réaction d’immuno-hémolyse = le complément se fixe sur les complexes Ag-Ac et provoque la lyse de la membrane cellulaire des hématies 1.2 Le système hémolytique = globules rouges de mouton / sérum de lapin anti-globules rouges de mouton Mises en présence de complément (présent dans un liquide biologique à étudier) ces hématies sensibilisées vont être lysées--> libération de l’hémoglobine et lecture photométrique Relation entre le degré d’hémolyse et quantité de complément présent dans le liquide 1.3 Applications Dosage du complément (et de ces composants) dans un liquide biologique. 2- Réaction de fixation du complément 2.1 Principe 2.2 Applications Sérodiagnostics d’infections bactériennes, virales, parasitaires par recherche et titrage d’Ac spécifiques présents à des concentrations inférieures à 1 g/ml. Détection des Ag d’histocompatibilité de classe I et II (groupage HLA) par la réaction de microlymphocytotoxicité - les lymphocytes sont mis en contact avec une “batterie”d’Ac anti-HLA de spécificité connue, pré-déposés dans les puits d’une plaque, - après incubation on ajoute du sérum de lapin (= source de complément) - les lymphocytes sont lysés dans les puits où les Ac se sont fixés sur les Ag HLA (visualisée par la pénétration d’un colorant normalement exclu des cellules vivantes). 11 B)TECHNIQUES DE MARQUAGE La réaction antigène-anticorps est rendue visible par un marquage préalable de l'antigène, de l'anticorps ou d'une antiglobuline (anti-Ig ou anti-C). Différents marqueurs sont utilisés : - corps fluorescents: immunofluorescence (IF) - enzymes: immuno-enzymologie (EIA) - éléments radioactifs: radio-immunologie (RIA) Dans les réactions utilisant un marquage, le problème est de pouvoir distinguer le corps marqué qui a réagi dans la réaction Ag-Ac, de celui qui est resté libre. En fonction de la modification ou non de l'activité du marqueur enzymatique lors de la réaction Ag-Ac, on a les deux schémas réactionnels: - dans les techniques en phase homogène, l'activité du marqueur est modifiée par la réaction Ag-Ac (extinction du signal) et permet de révéler directement le développement de la réaction Ag-Ac. L'Ac = réactif liant et révélateur de la formation du complexe spécifique d'où une étape de séparation inutile. - dans les techniques en phase hétérogène, le comportement du marqueur est inchangé par la réaction Ag-Ac ; une étape de séparation est obligatoire entre les complexes Ag-Ac marqués formés d'une part et l'Ag ou l'Ac marqué resté libre d'autre part, avant la lecture du signal fixé. IMMUNOFLUORESCENCE Méthode qui utilise un marquage par un corps fluorescent pour déceler une réaction Ag-Ac. On marque l'anticorps ou l'antigène ou encore un réactif réagissant avec le complexe Ag-Ac. 1- Principes fondamentaux 1.1 La fluorescence = Phénomène physique : absorption d’un rayonnement par une molécule et émission d’une lumière de plus faible énergie. 1.2 Les fluorochromes Fluorescéine (Isothiocyanate de), Rhodamine, Phycoérythrine 12 1.3 Microscope à fluorescence Source lumineuse : lampe à vapeur de Hg Filtres d’excitation Miroir séparateur dichroïque Filtre d’arrêt 2- Le système immunologique 2.1 Antigènes Coupes d’organes, frottis de micro-organismes ou cellules, suspension de cellules 2.2 Conjugaison au fluorochrome de l'anticorps ou immunoglobuline, de l’antigène 3 - Méthodes : 3.1 Immunofluorescence directe La réaction se fait en un temps : le réactif, antigène ou anticorps, marqué avec le fluorochrome permet de déceler l'anticorps ou l'antigène correspondant. 3.2 Immunofluorescence indirecte Méthode en deux temps : 1er temps - on fait agir un anticorps non marqué qui se fixe spécifiquement sur l'antigène 2ème temps - après lavage pour éliminer le premier réactif en excès, on fait agir une antiglobuline fluorescente révélatrice de la fixation de l'anticorps du premier temps (= deux réactions Ag-Ac successives). Mise en évidence de l'antigène, Mise en évidence d'Ac dans le sérum. 14 3.3 Cytométrie de flux Numération de cellules exprimant des Ag au sein d'une suspension hétérogène: Les cellules de l'échantillon sont marquées avec des réactifs fluorescents qui se fixent spécifiquement à des molécules de la surface cellulaire (ex : anti-CD4, anti-CD8...) Les cellules sont entraînées dans une veine liquide. Chaque cellule passe devant un faisceau laser. Le système mesure la diffusion de la lumière aux petits angles, à angle droit et les intensités de fluorescence pour trois longueurs d'ondes différentes. Grâce à des filtres et des photomultiplicateurs, l'appareil enregistre l'intensité de fluorescence de chaque cellule passant devant la source laser. Les résultats sont présentés sous la forme d'histogrammes. Permet une analyse multiparamétrique en déterminant pour chaque cellule, la taille, la granulosité, l'intensité de fluorescence avec différents fluorochromes. 15  RADIO-IMMUNOLOGIE - IMMUNOENZYMOLOGIE 1- Principe Met à profit le signal émis par les molécules marquées par un radio-isotope : RIA = Radio Immuno Assay ou une enzyme : ELISA = Enzyme Immuno Sorbent Assay. Permet la mise en évidence et le dosage de substances présentes en très faible quantité dans les milieux complexes, en associant l'utilisation de la spécificité très stricte de la combinaison Ag-Ac mise en jeu dans la réaction et l'introduction d'un signal très sensible marquant cette combinaison. Radio-immunologie révélation du complexe Ag-Ac radioactif par un compteur Immuno-enzymologie révélation du complexe Ag-Ac marqué par l’enzyme par mise en présence du substrat spécifique de cette enzyme. 2- Système immunologique 1.1 L'antigène Liquide biologique, haptène Coupes de tissus, cellules. 1.2 L'anticorps Sérums, Ig poly ou monoclonales, anti-globulines. 3- Les marqueurs (= traceurs) 3.1 Radio-isotope Choix du radio-isotope Activité spécifique élevée Période suffisamment longue Détection facile du rayonnement émis Stabilité des molécules marquées Principaux radio-isotopes utilisés en biologie médicale. 125 I I/2 vie de 60 jours (le plus utilisé) Rayonnement gamma 3 H I/2 vie de 12 ans Rayonnement beta 3.2 Enzyme Critères de choix de l'enzyme et de son substrat pureté, bonne conservation, révélation simple et rapide, absence dans le milieu biologique étudié, degré de transformation important. Principales enzymes utilisées Les enzymes : peroxydase de raifort, phosphatase alcaline d’E. coli, béta- galactosidase d’E.coli, etc..... Lecture du signal enzymatique Substrat choisi suivant la nature de l’enzyme utilisé, le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie ou par colorimétrie, 3.3 Autres marqueurs Marqueurs luminescents qui émettent de la lumière après une excitation photonique de longueur d’onde appropriée : - Fluorescéine, rhodamine, ombelliférone - détection par fluorimétrie, luminescence. 4- Expression des résultats Dosage d'Ag : courbe d'étalonnage (5 ou 6 étalons) 16 Dosage d'Ac : notion de seuil de positivité (présence ou absence de l'Ac) ou référence à une courbe établie avec un sérum étalon international. 5- Méthodes 5.1 Analyse par méthode indirecte (ELISA indirect) Permet le dosage d’anticorps. - l’échantillon contenant l’Ac primaire (Ac1) est déposé dans un puits où est adsorbé l’antigène, avec lequel il réagit, - après lavage, la présence de l’Ac1 est détectée en ajoutant un Ac secondaire (Ac2) anti-isotype conjugué à un enzyme, - l’Ac2 libre est éliminé par lavage, et un substrat de l’enzyme est ajouté - la quantité de produit coloré est mesurée par un lecteur spectrophotométrique approprié. 17 5.2 Analyse par compétition On dispose : - d'un liquide biologique contenant une substance X à doser qui constitue l'antigène "froid" (Ag°) en quantité inconnue; - de l'anticorps spécifique anti-X en quantité fixe et limitée fixé sur un support solide (tube ou plaque de polystyrène par ex) - d'un traceur constitué de l'antigène marqué (Ag*) identique à l'antigène X à doser, en quantité fixe et très faible. - Compétition entre l’Ag marqué et l’Ag non marqué à doser : les complexes Ag°-Ac et Ag*- Ac se forment selon la loi d'action de masse - Lavage pour éliminer les réactifs non fixés et séparer phase libre et liée du marqueur - Mesure du signal final fixé sur le support qui est inverse de la quantité d'Ag à doser fixé, par référence à une courbe d'étalonnage - en phase solide, Ac est fixé sur un support solide ; un simple lavage suffit pour séparer phase libre et liée du marqu 18 5.3 Analyse immunométrique On met en jeu un excès d'anticorps. Basée sur protocole dit "sandwich" ou "à deux sites" La réaction sera totale (et non à l'équilibre). Ce sont les molécules d'anticorps qui sont marquées (sauf exception). Après des lavages, le signal fixé est mesuré, il est proportionnel à la concentration d'Ag à doser par référence à une courbe d'étalonnage. 19 C)SENSIBILITE DESTESTS -20- Isolation des cellules mononucléaires sanguines Les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) (ou parfois dites « cellules mononucléaires périphériques sanguines » sont toutes les cellules du sang périphérique ayant un seul noyau. Ces cellules sont constitués de lymphocytes (cellules T, cellules B, cellules NK) et de monocytes, alors que les érythrocytes et les plaquettes n'ont pas de noyaux, et que les granulocytes (neutrophiles, basophiles et éosinophiles) ont des noyaux multilobés. Ces cellules peuvent être extraites à partir du sang total par la « méthode Ficoll-Hypaque » à l'aide de ficoll, un polysaccharide hydrophile qui sépare le sang en couches que l'on peut aussi récupérer par centrifugation en gradient de densité. De nombreux scientifiques effectuant des recherches en immunologie (notamment concernant les maladies auto-immunes) ou dans le domaine des maladies infectieuses, des hémopathies malignes, ou encore concernant le développement de vaccins, ou dans le domaine de l'immunologie de la transplantation (rejet de greffe) sont des utilisateurs fréquents de PBMC. Dans de nombreux cas, les PBMC proviennent de banques de sang. -21- 1ére Séance: Détermination semi-quantitative de la protéine C réactive dans le sérum humain Introduction La protéine C réactive (CRP, découverte en 1930 en grâce à sa propriété de précipiter le polysaccharide C du pneumocoque) est une protéine secrétée par le foie au cours de la phase aigüe de l’inflammation. Son dosage dans le sérum est utilisée comme indicateur d’un état inflammatoire (taux normal : CRP ≤6 mg/l). En l’absence d’un syndrome inflammatoire, la CRP peut être influencée par un traitement oestrogénique. Son niveau peut être élevé chez la femme enceinte. Matériel disponible -Une suspension de particules de latex couplées à un anticorps de chèvre anti-CRP -Un sérum contrôle positif -Un sérum contrôle négatif -Un sérum à tester -Une solution de NaCl 0.9% -Une carte noire pour visualiser les agglutinations -Des agitateurs à usage unique Protocole à suivre - Effectuer une série de dilutions du sérum à tester allant de 1/2 à 1/16 (facteur de dilution est 2 entre 2 dilutions successives) - Sur les lames, déposer 50μl des dilutions du sérum et une goutte de chacun des contrôles - Agiter le flacon de latex et déposer une goutte de latex près de chaque échantillon à tester - Mélanger à l’aide d’un agitateur - Observer et noter les agglutinations au bout de 2 à 5 min. La concentration approximative du sérum en CRP (en mg/l) peut être obtenue en multipliant le titre par le facteur de conversion fourni par le fabricant et qui est égal à 6. -22- 2ème Séance: Immunohématologie et test de Coombs Introduction L’immunohématologie correspond à l’étude des antigènes portés par les éléments figurés du sang, de l’immunisation qu’ils peuvent induire et des conflits qui en résultent. Un groupe sanguin correspond à un ensemble d’antigènes allotypiques, génétiquement induits et portés par la membrane du globule rouge. Les antigènes du groupe sanguin peuvent être localisés uniquement sur le globule rouge ou localisés à la fois sur le globule rouge et d’autres tissus. Le système ABO : Découverte des agglutinogènes A et B et de leur anticorps respectifs anti-A et anti-B (1900 Karl Landsteiner) ; localisation et nature biochimique : les antigènes A et B sont construits par des enzymes spécifiques : glycosyltransférases A et B (gène sur le chromosome 9) ; les anticorps anti-A et anti-B naturels ou réguliers ; les anticorps anti-A et anti-B immuns acquis par stimulation immune et responsables d’accident d’hémolyse indirect. Epreuve de Groupage ABO standard : Détermination des antigènes (épreuve globulaire ou de Beth- Vincent) et recherche des anticorps correspondants (épreuve sérique ou de Simonin). La règle élémentaire de compatibilité transfusionnelle est de ne jamais transfuser des globules rouges portant l’antigène A et/ou B correspondant à l’anticorps du receveur. Le système Rhésus : Découverte dans le cadre de la maladie hémolytique du nouveau-né (1939 Levine), antigènes D, C, E, c et e ; localisation et nature biochimique ; la complexité des antigènes du système Rhésus; les anticorps anti-D irréguliers acquis par grossesse, transfusion. Ce sont des anticorps incomplets. Groupage Rhésus : technique directe. La recherche d’anticorps irréguliers anti-érythrocytaires (R.A.I.): Indispensable pour la sécurité transfusionnelle. Test à l’antiglobuline (Test de Coombs) : Test direct (test globulaire, met en évidence les anticorps fixés sur les globules rouges in vivo) et test indirect (test sérique, met en évidence la présence d’anticorps dans le sérum en plaçant ce dernier en contact in vitro avec les globules rouges de phénotypes connus (schémas). Test de groupage sanguin But du test : Déterminer le groupe sanguin pour les systèmes ABO et Rhésus par la recherche des agglutinogènes A, B et D à la surface des globules rouges. Principe du test : Les globules rouges portant un agglutinogène donné sont agglutinés lorsqu’ils sont mis en présence d’anticorps spécifiques de cet antigène. Les anticorps utilisés dans ce test sont monoclonaux, donc monospécifiques, assurant l’absence de réactivité croisée. L’agglutination peut être mise en évidence dans des tests qualitatifs, réalisés en tube ou sur des plaques de verre ou d’opaline. -23- Protocole expérimental ABO - Déposer 50μl de sang à tester (en suspension à 5%) dans 3 tubes eppendorf bien étiquetés - Dans le 1er tube ajouter 50μl de l’anti-A et agiter -Dans le 2eme tube ajouter 50μl de l’anti-B et agiter -Dans le 3eme tube ajouter 50μl de l’anti-D et agiter -Centrifuger pendant 1 minute à 450g - Observer les résultats macroscopiquement et interpréter selon la présence ou l’absence de l’agglutination. - Déterminer le groupe sanguin de l’individu. Résultats et interprétation Le groupe sanguin pour le système ABO peut être déterminé per référence au tableau suivant : Agglutination avec Agglutination avec Agglutination avec anti-A anti-B (anti-A + anti-B) Groupe O - - - Groupe A + - + Groupe B - + + Groupe AB + + + Généralement, ces agglutinations sont rapides et nettes. Par contre, l’agglutination avec les anticorps anti-D est beaucoup plus difficile à mettre en évidence. Dans certains cas, elle est même inexistante. Un test de Coombs est alors nécessaire pour trancher le diagnostic. -24- -25- Protocole expérimental Rhésus- Test de Coombs indirect Technique de détection de l’antigène D faible - Déposer 50μl de sang à tester (en suspension à 5%) dans un tube eppendorf bien étiqueté - Déposer 50μl de sang témoin (en suspension à 5%) dans un tube eppendorf bien étiqueté - Ajouter 50μl de l’anti-D et agiter dans chacun des 2 tubes - Incuber pendant 45 min à 37֯C - Laver 3 fois la pastille globulaire avec du sérum physiologique (NaCl 9%) - Ajouter 50μl de l’antiglobuline polyvalente et agiter dans chacun des deux tubes - Centrifuger pendant 1 minute à 450g -Observer les résultats macroscopiquement et interpréter selon la présence ou l’absence de l’agglutination. -Déterminer le système Rhésus de l’individu. -26- 3ème séance: Test ELISA pour la détection des anticorps IgG contre Toxoplasma gondii en sérum ou plasma humains Introduction: Toxoplasma gondii est un petit parasite intracellulaire, dont le cycle de vie comprend une phase sexuelle et une phase asexuelle. Le développement sexuel est limité aux cellules intestinales des chats. Les animaux et l'homme sont les hôtes intermédiaires pour la prolifération asexuelle de Toxoplasma gondii. T. gondii est le parasite le plus commun chez l'homme, mais son abondance (7-80%) dépend fortement de la région géographique, du statut socio-économique et des coutumes alimentaires. L'infection ne cause que rarement la toxoplasmose et d’habitude, il n’y a pas de symptômes cliniques. Néanmoins, l’infection peut produire de graves problèmes chez les personnes immunosupprimées et les foetus. Puisque seulement une infection primaire pendant la grossesse peut être dangereuse et même mortelle pour le foetus (la probabilité d’une infection congénitale est d’environ 50%). Dans les femmes enceintes, dans plus de 98% de cas, l'absence d'IgM exclut la possibilité d'infection récente. Dans les nouveaux- nés, rien que la présence d'anti-toxoplasme IgM est suffisante pour confirmer une toxoplasmose congénitale, car IgM maternel, contrairement à l’IgG, ne franchit pas la barrière placentaire. Cependant, un nombre significatif de nourrissons infectés ne développe pas des niveaux discernables d'IgM et se montre ainsi faux négatif. La toxoplasmose cause de graves complications dans les patients immunosupprimés, souvent provoquées par la réactivation d'une infection latente. Recherche des anticorps anti-Toxoplasmose par ELISA 1. Principe La détermination immunoenzymatique quantitative des anticorps IgG contre Toxoplasma gondii est basée sur la technique d'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Des puits dans les bandes du plaque microtitre sont recouverts d’antigènes de Toxoplasma gondii pour attacher les anticorps correspondants du spécimen. Après le lavage des puits ayant pour but d’enlever l’échantillon détaché, l’anti-humain IgG conjugué à HRP (horseradish peroxidase) est ajouté. Ce conjugué s’attache aux anticorps spécifiques pour Toxoplasma gondii. Le complexe immun constitué par le conjugué attaché est visualisé en ajoutant le substrat de Tetramethyl benzidine (TMB) qui donne un produit de réaction bleu. L'intensité de ce produit est proportionnelle à la quantité d'anticorps IgG spécifiques pour Toxoplasma gondii dans le spécimen. De l’acide sulfurique est ajouté pour arrêter la réaction. Ceci produit une couleur couleur jaune. L'absorbance à 450 nm est lue en utilisant un lecteur plaque microtitre (microwell plate reader) d’ELISA.La concentration d’anticorps anti-T. gondii dans chaque sérum est déduite par extrapolation de la densité optique qui lui correspond sur la courbe étalon. -27- 2. Matériel et méthodologie Matériel - « Strips » d’une plaque de microtitration recouvertes d’antigènes de T.gondii et bloqués. - Tampon de lavage : PBS contenant 0.05% de Tween 20 (PT). Le Tween 20 est un détergent qui sert à diminuer la liaison des protéines non spécifiques du sérum au plastique, par augmentation de la tension de surface. Le tampon PT est contenu dans une pissette et placé sur la paillasse. - Sérums prêts à l’emploi (dans des tubes Eppendorf, sur le portoir): ▪ Sérum test (noter son numéro) ▪ Sérums standards contenant (Standard A : 0 UI/mL, Standard B : 50 UI/mL, Standard C : 100 UI/mL Standard D: 200 UI/mL standard: 1000UI/ml) d’IgG humaines anti-T.gondii - Anticorps de mouton anti-IgG humaines, couplés à la péroxydase (Ac secondaire). Ces anticorps sont dilués et prêts à l’emploi. - Substrat de la péroxydase, tétraméthylbenzidine (TMB). Ce substrat doit être préparé extemporanément. - Solution stop: HCL 3N. L’addition de l’acide arrête la réaction enzymatique et transforme le produit bleu en un produit jaune dont la densité optique est lisible à 450 nm. Méthodologie 1- Incubation des sérums humains : Plan de la plaque : Sérum étalon 1000 UI/ml A Sérum étalon 200 UI/ml B Sérum étalon 100 UI/ml C Sérum étalon 50 UI/ml D Sérum étalon 0 UI/ml E Blanc F Sérum test G Sérum test H - Introduire 100 μl dans tous les puits. Incuber la plaque, recouverte de parafilm, 30 minutes à température ambiante, sur la paillasse 2- Incubation des anticorps anti-Ig humaines - Laver les strips trois fois : Vider la plaque au-dessus de la cuvette en la retournant vivement. A l’aide de la pissette de PT (tampon de lavage), laver les puits en les remplissant à ras-bord et en les retournant vivement. Faire trois lavages. Tapoter énergiquement la plaque retournée contre le papier cuisine pour la vider totalement. - Distribuer 100 μl de l’anticorps secondaire dans tous les puits. -28- -Incuber la plaque, recouverte de parafilm, 20 minutes à température ambiante, sur la paillasse. 3- Révélation de la réaction : - Laver les strips trois fois comme précédemment. - Obtenir le substrat TMB. - Distribuer 100 μl de TMB dans tous les puits. - Observer le développement de la couleur bleue pour 10 minutes (ou plus, ou moins, pour avoir une gamme de couleur pour l’étalon). - Arrêter la réaction en rajoutant 100 l de HCL 3N dans tous les puits. La couleur tourne au jaune. - Lire la densité optique à 450 nm. 4. Critères de validité Afin qu’une analyse soit considérée valide, les critères suivants doive être respectés : Blanc Substrat: valeur d’absorbance < 0.100. Etalon E: valeur d’absorbance < 0.200. Etalon D: valeur d’absorbance > 0.300 Etalon C: valeur d’absorbance > 0.500 Etalon B: valeur d’absorbance > 1.000 Etalon E < Etalon D < Etalon C < Etalon B< Etalon A Lorsque ces critères ne sont pas remplis, le test n’est pas valide et doit être recommencé. 5-Calculs et Interprétation : - Calculer la moyenne de densité des puits G et H (sérum test). - Sur du papier millimétré ou à l’aide d’un logiciel tel qu’Excel, tracer la courbe étalon de D.O. en fonction des unités internationales du sérum étalon. - En extrapolant la densité optique du sérum test sur la courbe étalon, déterminer la concentration de ce dernier en anticorps IgG anti-T.gondii. -29- Test ELISA pour la détermination de CRP dans des échantillons humains A) Réactifs: Tampon de revêtement (coating) (tampon carbonate / bicarbonate 100 mM pH = 9.6) Tampon de lavage (PBS + 0.05% Tween-20 ou TBS + 0.05% Tween-20) Tampon de blocage (PBS + 3% de lait écrémé) Tampon de dilution (tampon de blocage + 0.05% tween 20) Anticorps primaire (chèvre anti- CRP humaine [1mg /ml]) Anticorps secondaire conjugué (chèvre anti-CRP humaine + HRP [1mg /ml]) Substrat chromogène (colorimétrique): (3,3 ', 5,5'-tétraméthybenzidine (TMB) ou OrthoPhénylène Diamine (OPD) Solution d'arrêt: H2SO4 B) Procédure: Diluer l'anticorps primaire jusqu'à 1μg / ml avec le tampon de revêtement. Ajouter 100 ul à chaque puits de la microplaque. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium et incuber à 4 °C pendant une nuit dans une boîte humide. Vider la plaque et laver 3 à 4 fois avec le tampon de lavage. Bloquer les sites inoccupés en ajoutant 200 μl de tampon de blocage dans chaque puits. Couvrir et incuber la plaque à température ambiante pendant 60 min. Vider la plaque et laver 3 à 4 fois avec le tampon de lavage. Préparer des dilutions en série d'étalons (S1-S7: 100ng/ml-1.56ng/ml utilisant un stock : [CRP] = 1.23μg / ml) et d'échantillons (dilution 1/10, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600). Ajouter à la plaque dans un volume de 100μl par puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 ± 2 min. Vider la plaque et laver 3 à 4 fois avec le tampon de lavage. Diluer l'anticorps secondaire avec un tampon de dilution (0.1 μg / ml). Ajouter 100 μl à chaque puits. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante pendant 15 ± 2 min. Vider la plaque et laver 3 à 4 fois avec le tampon de lavage. Ajouter 100 μl d'OPD ou de TMB dans chaque puits. Couvrir et incuber la plaque jusqu'à 10 min dans l'obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 100 μl de H2SO4 dans chaque puits. Mesurer l'absorbance de chaque puits à l'aide d'un lecteur de microplaques (filtre de référence: 630 nm et filtre de lecture pour TMB: 450 nm ou OPD: 492 nm). Utilisez les valeurs d'absorbance ci-dessous pour tracer la courbe standard: S1 (100 ng /ml) 2.239 S2 (50 ng /ml) 1.752 S3 (25 ng /ml) 1.030 S4 (12.5 ng /ml) 0.546 S5 (6.25 ng /ml) 0.265 S6 (3.125 ng /ml) 0.163 S7 (1.56 ng / ml) 0.084 Blanc 0.021 -30- 4ème séance : Immunodiffusion L'immunodiffusion double (ou test d'Ouchterlony) est une technique immunologique utilisée dans la détection, l'identification et la quantification d'anticorps et d'antigènes, comme les immunoglobulines et les antigènes nucléaires. Cette technique est nommée d'après Örjan Ouchterlony, un physicien suédois qui a inventé le test en 1948. Procédure : Une couche de gel est percée de trous (ou "puits"). L'échantillon à étudier est placé dans un puits et un sérum ou des anticorps purifiés sont placés dans un puits adjacent. On les laisse se développer pendant 48 heures. Pendant ce temps, les deux échantillons vont se diffuser autour de leurs puits respectifs. Là où les fronts de diffusion se rencontrent, si les anticorps reconnaissent un des antigènes de l'échantillon, ils s'y lieront et formeront un complexe immun. Le complexe immun créera un précipité blanc en forme de ligne ou d'arc, ce qui est une signature visuelle de la reconnaissance d'un antigène. Cette méthode peut être utilisée en parallèle avec plusieurs puits remplis de différentes solutions d'antigènes et d'anticorps. Lorsqu'on utilise plusieurs puits, on peut observer différents résultats en fonction de la réactivité des antigènes et des anticorps choisis. 1- Objectifs: On cherche à mettre en évidence par une méthode expérimentale si à un antigène ciblé on associe spécifiquement un anticorps. Autrement dit, on cherche à vérifier la spécificité d’un couple antigène/anticorps. 2- Principe : On met en relation grâce à de la gélose, différents produits. C'est-à-dire qu’on confrontera des anticorps anti-GH à différents antigènes qui se rencontreront par diffusion. La formation de complexe immun indiquera une complémentarité entre ces anticorps et l’antigène concerné. Ainsi en fonction du nombre de complexes immun on pourra déterminer l’éventuelle spécificité des couples anticorps/antigènes. 3- Préparation des solutions - Gel d’agarose : Peser 1g d’agarose. Ajuster avec 100 ml du tampon PBS 0.1M ou de l’eau physiologique. La solution est chauffée à 90֯C dans un bain-marie. - Solution de lavage : Eau physiologique. - Solution de coloration du gel : 1g de bleu de Coomassie dans (éthanol 45ml, acide acétique 10 ml, et eau distillée 45 ml). -Solution de décoloration : La même solution que la coloration mais sans le bleu de Coomassie. Mode opératoire -Préparation du gel : Verser doucement 5ml du gel dans une petite boite de pétri. Laisser polymériser pendant 15 minutes. Creuser à l’aide des cônes jaunes 4 puits périphériques et un puits central. -Préparation des Ac/Ag : Préparer une série de dilutions de ou des Ag(s) à tester allant de 1/2 à 1/16 (facteur de dilution est 2 entre 2 dilutions successives) Déposer 20μl des différentes dilutions d’antigène (s) dans les puits périphériques. Déposer 20μl d’anticorps à une concentration de 0.1 mg à 5 mg/ml dans le puits central. -Incubation : La diffusion s’effectue dans une chambre humide pendant 24h à 37֯C. -31- -Coloration : Le gel est lavé 3 fois avec de l’eau physiologique et coloré pendant 2-5 minutes avec le tampon de coloration. -Décoloration : Le gel est décoloré pendant 1 à 48 heures avec le tampon de décoloration. -Interprétation des résultats : La réaction est positive si un arc de précipitation est formé entre l’antigène et l’anticorps. Cette réaction présente parfois une réaction d’identité ou de non- identité. Conclusion Ces tests mettent donc en évidence que des complexes immuns ne se forment qu’entre les anticorps anti-GH et les produits contenant des GH. Le complexe immun indiquant une réaction entre un anticorps et un antigène on en déduit que les anticorps anti-GH ne réagissent qu’avec des antigènes GH. On conclut donc qu’un anticorps est spécifique d’un antigène donné. -32- 5ème séance : Activité lytique du complément (Test hémolytique) Introduction La liaison d'anticorps, notamment les immunoglobulines G et M, avec des antigènes présents à la surface de cellules étrangères introduites dans l'organisme provoque l'agglutination de ces dernières par la formation de complexes immuns. Les cellules étrangères sont ainsi immobilisées mais elles ne sont pas détruites directement par les anticorps. Cependant, la liaison antigène-anticorps est susceptible de stimuler la phagocytose ou d’activer le complément, ce qui aboutit à la destruction des cellules reconnues par les anticorps. L’hémolyse immune est une technique de mise en évidence de l’action complémentaire des anticorps et du complément sur des cellules cibles constituées par des globules rouges étrangers. Leur destruction (hémolyse) peut être détectée à l'œil nu car elle libère l'hémoglobine dans le milieu tandis qu'en l'absence d'hémolyse les globules rouges sédimentent au fond du tube sans que l'hémoglobine soit libérée. Le système du complément est constitué par un ensemble d’une trentaine de protéines et glycoprotéines dont la plupart se trouvent dans le sérum sanguin sous une forme inactive. Ces protéines sont solubles ou liées aux cellules et synthétisées majoritairement dans le foie. Elles constituent environ 5 % des globulines sériques. La plupart des protéines du complément acquièrent leur activité au cours d’une cascade de réactions enzymatiques complexe. De nombreux composants sont des proenzymes (inactif) – désignées par des numéros (C1-C9) ou des lettres (B,D) selon l’ordre de découverte – activation après un clivage protéolytique avec séparation de 2 fragments le plus petit appelé «a » – diffuse loin du site de clivage, action à distance sur la réaction inflammatoire (activation et chimiotactisme des phagocytes) le plus gros appelé «b» (sérine protéase) – se lie à la cible, action enzymatique locale (à la surface de l’agent pathogène) entre en interaction avec un autre fragment pour former des complexes fonctionnels Les différentes voies d’activation du complément L’activation du complément peut être déclenchée par différents processus : la "voie classique" lorsqu’il s’agit de la formation de complexes immuns ; la "voie alterne", indépendante des anticorps mais dépendante de constituants chimiques présents à la surface des cellules étrangères ; la "voie lectine", également indépendante des anticorps mais dépendante d’une lectine spécifique du mannose, constituant courant des parois des microorganismes, la MBL (mannose binding lectin). -33-  Voie classique voie alterne voie des lectines complexes antigène- surface d’agents liaison au mannose à la anticorps étrangers surface des pathogènes C C MBL 1 C 3 C4 4 B C2 C D 2 (C4b2b ) (C3bBb) (C4b2b) C3 convertase C3b C3a C4a C5a - Médiateurs (C4b2b3b ) -(C3bBb3b) peptidiques de C5 convertase l’inflammation - liaison aux récepteurs du Complexe de lyse - Recrutement des complément (CAM)C5b C6 C7 C8 C9 phagocytes - opsonisation des pathogènes - lyse cellulaire - clairance des complexes immuns Aspects historiques La découverte du complément est due au chercheur belge Jules Bordet (1870-1961) alors qu’il menait des recherches sur le vibrion cholérique (Vibrio cholerae) à l'Institut Pasteur de Paris. En 1898, il découvrit que le sérum d’un lapin immunisé contre le vibrion cholérique (antisérum) produisait la lyse des bactéries mais que cette action ne se produisait plus si l’antisérum avait d’abord été placé pendant quelque temps à la température de 56°C, température des étuves utilisées à l'époque pour maintenir la paraffine fondue. En revanche, en présence de ce sérum, les vibrions habituellement mobiles, comme leur nom l’indique, étaient immobilisés. De plus, s’il ajoutait alors à la préparation du sérum frais, non traité par la chaleur et dépourvu d’anticorps anti-vibrion, il obtenait la lyse des bactéries. Bordet en déduisit que l’activité lytique de l’antisérum sur les bactéries nécessitait deux composants. D’une part les anticorps anti-vibrion spécifiquement formés lors de l’immunisation et qui résistent à une température de 56°C et, d’autre part, une substance thermolabile présente en permanence dans le sérum et qu’il appela "alexine". Le terme "complément" qui a remplacé aujourd’hui celui d’alexine a été forgé par Paul Ehrlich à la même époque. Ce dernier obtint le prix Nobel de médecine ou physiologie en 1908 conjointement avec Élie Metchnikoff tandis que Jules Bordet le reçut en 1919. Bordet montra également que l'action hémolytique d'un immun sérum sur des globules rouges étrangers est similaire à celle qui se produit dans l'organisme contre des bactéries. Il mit au point un test simple utilisant l’hémolyse de globules rouges de mammifères pour montrer que l’activité lytique d’un sérum vis à vis de cellules cibles nécessite simultanément la présence -34- d’anticorps spécifiques et du complément. C’est le protocole de ce test qui est présenté ci- dessous. La découverte du complément vibrio Jules Bordet (1898) Lyse (I. Pasteur) Sérum anti-vibrio cholerae Pas lyse Sérum anti-vibrio + chaleur (56°) Sérum naif (sans Activité bactériolytique Ac) Ac anti-bactérie Lyse (résistants à la chaleur) Composant sérique (thermolabile) responsable de la lyse Sérum anti-vibrio + chaleur (56°) -35-  Protocole Remplir quatre microcentrifuge tubes selon le tableau ci-dessous (volume total de chaque tube : 0.5 mL) Numéros des tubes : Tous les volumes indiqués dans le tableau sont donnés 1 2 3 4 en mL Globules rouges humains (GRH) (suspension 0.2 0.2 0.2 0.2 2%) Tampon (PBS) 0.3 0.1 0.28 0.08 Sérum anti-GRH (Sérum de lapin hyperimmunisé - 0.2 - 0.2 contre les GRH) Complément (Complément de cobaye à 5 UH 50 - - 0.02 0.02 (5 unités hémolytiques par 50 µL) Retourner les tubes bouchés pour mélanger les solutions sans les agiter et incuber pendant 60 minutes à l'étuve à 37°C. Observer et noter le résultat dans les différents tubes. 6ème séance : Test rapide (Test de Grossesse hCG en une étape- Cassette) -36- -37-