3er Parcial de Bioquímica PDF

BIOQUIMICA 3 PARCIAL SEMANA 22 Y 23 REPLICACION DEL ADN Dogma central de la biología molecular: Rige el flujo de información genética que ocurre en la célula desde el ADN hasta el ARN. El ADN contenido en el núcleo tie...

BIOQUIMICA 3 PARCIAL SEMANA 22 Y 23 REPLICACION DEL ADN Dogma central de la biología molecular: Rige el flujo de información genética que ocurre en la célula desde el ADN hasta el ARN. El ADN contenido en el núcleo tiene la capacidad de auto duplicarse o replicarse, o bien de generar un ARN mensajero por el proceso de transcripción. Ese ARN mensajero del núcleo va a pasar al citoplasma y a partir de aquí es capaz de codificar en los ribosomas la síntesis de proteínas con el proceso de traducción. Algunos ARN virales poseen una enzima transcriptasa reversa a partir de la cual a partir del ARN podemos formar ADN “retrovirus” Proteínas como los factores de transcripción pueden modular la expresión del ADN y a su vez priones pueden generar nuevas proteínas. PRION: Un prion (proteínas + infección) es considerado un agente infeccioso Está formado sólo por aminoácidos y su forma intracelular puede no contener ácido nucleico (no contiene material genético). Es una proteína mal plegada capaz de transmitir su forma mal plegada a otras variedades de la misma proteína. Produce las llamadas encefalopatías espongiformes transmisibles, enfermedades neurológicas degenerativas tales como: la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (mal de las vacas locas) y la encefalopatía espongiforme bovina. El ADN igual que las proteínas tiene distintos niveles de organización estructural: Estructura primaria: secuencia de los nucleótidos. Estos están unidos entre sí por enlaces fosfodiéster. La cadena presenta dos extremos libres, el 5´unido al grupo fosfato y el 3´unido a un hidroxilo. Las cadenas se diferencian por su tamaño, composición y secuencia de bases. La secuencia se nombra con la inicial de la base que contiene cada nucleótido. La información genética está contenida en el orden de los nucleótidos. Estructura secundaria: consiste en una doble hélice poli nucleotídica enrollada alrededor de un eje imaginario longitudinal. En esta doble hélice tenemos los puentes de hidrogeno entre bases complementarias. Entre CITOCINA y GUANINA 3 puentes Entre ADENINA y TIMINA 2 puentes Los puentes de hidrogeno estabilizan la estructura secundaria del ADN. Las bases de ambas cadenas se mantienen unidas por estos enlaces y su número de enlaces de estos depende de la complementariedad de las bases. Estructura terciaria: Se refiere a la conformación helicoidal tridimensional. Es una doble hélice de 2mm de diámetro, donde las bases nitrogenadas se encuentran en el interior. Las parejas de bases se encuentran unidas por un armazón formado por las pentosas y el grupo fosfato. El enrollamiento es dextrógiro y plectonemico. Cada pareja de nucleótidos está situada a 0,34 mm de la siguiente y cada vuelta de la doble hélice contiene 10 pares de nucleótidos. Las dos cadenas son antiparalelas y complementarias. Niveles superiores de empaquetamiento del ADN: El ADN se une a proteínas básicas llamadas histonas para compactarse mucho. La unión con histonas genera la estructura denominada nucleosoma (primer nivel de empaquetamiento). Cada nucleosoma está compuesto por un octámero de histonas. Cada tipo de histona se presenta en número par. El conjunto de la estructura así enrollada se denomina fibra de cromatina de 100 Å, que tiene un aspecto repetitivo en forma de collar de perlas donde las perlas son los nucleosomas. La fibra de cromatina de 100 Å se enrolla sobre sí misma y forma la fibra de cromatina de 300 Å o solenoide (segundo nivel de empaquetamiento), que también se enrolla sobre sí misma, y así sucesivamente hasta que cada doble hélice de ADN forma un cromosoma (éste es el máximo empaquetamiento y se produce cuando la célula se va a dividir). Replicación o auto duplicación del ADN La replicación de ADN es la síntesis de una molécula bicatenaria de ADN hija idéntica al ADN progenitor. Cada una de las hebras del ADN original actúa como patrón para la copia y el origen de una hebra nueva hija por ese motivo se dice que la replicación es semiconservativa. Ocurre solamente durante la FASE S del clico celular. Características: Semiconservativa. Bidireccional Discontinua Es siempre en sentido 5´a 3´ Posee múltiplexs sitios de origen Replisoma: Es el conjunto de proteínas comprometidas en la replicación del ADN. ETAPAS de la replicación Primera etapa: RECONOCIMIENTO DEL ORIGEN. Se reconoce el punto de iniciación gracias a la ARN POLIMERAZA ADN dirigida. Se denomina replicón a la unidad autónoma de replicación que posee sus propias señales de regulación. En eucariontes, existen proteínas asociadas a las histonas del nucleosoma que sirven para fijar un punto determinado de la doble hélice a partir del cual las cadenas empiezan a desenrollarse. Este desenrollamiento se produce por fijación en sitios específicos de una serie de proteínas que se denominan primosomas. Segunda etapa: DESENRROLAMIENTO DE LA DOBLE HELICE. Se produce gracias a la ruptura de los puentes de hidrogeno que es catalizada por la HELICASA con gasto de energía y a la intervención de las proteínas desarrollantes que mantienen las dos hebras de ADN separadas. HELICASA: Separa las dos hélices por ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen las bases apareadas en los extremos de la horquilla de replicación. Hidrólisis de ATP (gasto de energía). Proteína hélice desestabilizante: Se une en forma estequiometria a restos nucleotídicos una vez que la helicasa separó las cadenas complementarias del ADN patrón, evitando que vuelvan a aparearse. Topoisomerasas: Ya que el desenrollamiento crea tensiones por torsión en otros puntos de la molécula de ADN, estas rompen las uniones fosfodiéster de una las cadenas permitiendo que gire libremente y evitando esa tensión. Una vez que las cadenas se desenrollaron se vuelve a sellar la mella sin gasto de ATP. - Topoisomerasa I: introduce la ruptura en una sola cadena del ADN lineal. - Topoisomerasa II: introduce una ruptura en ambas cadenas y desenrolla el ADN circular mitocondrial. Tercera etapa: SÍNTESIS DEL ARN PRIMER, CEBADOR O INICIADOR PRIMASA: tomando como guía el ADN molde, introduce un ribonucleótido según las leyes de Watson y Crick: o Frente a dAMP --- introduce UTP o dGMP --- CTP o dCMP --- GTP o dTMP --- ATP La síntesis ocurre en sentido 5´--- 3´ A los desoxinucleotidos se le adosan ribonucleótidos Cuarta etapa: SE FORMA ADN SOBRE LOS ARNs CEBO POR LA ADN POLIMERASA La cadena polinucleótida que cursa en sentido 3—5 va a hacerla ir en sentido 5---3 y que la síntesis de la nueva cadena nucleotídica se va a dar de manera continua. Recibe el nombre de hebra líder En la hebra que se extiende en sentido 5—3 la síntesis de ADN también se hace en sentido 5--3 pero en forma de pequeños fragmentos de forma discontinua. Se la denomina hebra seguidora La cadena 5´-3´ no se puede replicar en forma contínua, ya que el avance de la horquilla es en dirección contraria al progreso de la ADN polimerasa alfa, por lo tanto, se hace en fragmentos cortos denominados fragmentos de Okazaki. Este fenómeno se produce porque la síntesis, o replicación, va siempre en el sentido 5´-3´ y la cadena complementaria en neoformación es antiparalela. La replicación es más lenta y la cadena neoformada se llama hebra retrasada ADN POLIMERASA: 1. Alfa: está presente en el núcleo y es responsable de la replicación de los cromosomas. La enzima cataliza la adhesión de desoxinucleotidos trifosfatados de tal manera que la cadena de ADN hija va creciendo de 1:1 en las unidades de nucleótidos y se libera en la reacción pirofosfato en la cual luego es hidrolizado por la pirofosfatasa desplazando el equilibrio de la reacción hacia la formación del nuevo ADN. 2. Beta: repara el ADN dañado. Elimina los trozos de ARN cebador y sintetiza segmentos de ADN en los sitios vacantes. 3. Gamma: sintetiza y replica el ADN mitocondrial. Requerimientos de las ADN polimerasas: o ARN cebador o Tira de ADN molde o patrón o Copolimerasa o SENTIDO DE LECTURA: 3´ --- 5´ o Desoxinucleotidos trifosfato (dNTP) o SENTIDO DE SÍNTESIS: 5´ --- 3´ o Mg++ Quinta etapa: ENDONUCLEASAS producen la escisión de los ARNs cebos, con formación de los FRAGMENTOS DE OKASAKI en la hebra discontinua. Sexta etapa: Se produce el rellenado de brechas por parte de la ADN POLIMERASA (beta) Séptima etapa: La ADN LIGASA une, mediante enlaces fosfodiéster 3´---5´ los segmentos de ADN neoformados. Reparación del ADN 1. DEFECTO PRODUCIDO POR LA LUZ UV GENERANDO DÍMEROS DE TIMINA: Genera que dos nucleótidos de timina se unan entre si formando una sustancia netamente carsinogenetica la célula se va a encargar de reparar la lesión. 2. INCISIÓN POR UNA ENDONUCLEASA: Reconocen a estos dímeros de timina y realizan la incisión para permitir su reparación. 3. REMIENDO POR LA ADN POLIMERASA BETA: Se encargará de remendar la brecha ocasionada por el corte realizado por las endonucleasas. 4. HIDRÓLISIS DEL DÍMERO Y RELLENADO DE LA BRECHA 5. ACCIÓN DE LA ADN LIGASA: Realizara la formación de los respectivos puentes fosfodiéster para sellar definitivamente dicha brecha. Reparación del ADN y genes involucrados: Existen 2 genes involucrados en la reparación de rupturas de ambas cadenas de ADN: BRCA1: presente en cromosoma 17. Reconocido el daño, se fosforila, emitiendo señales para que se detenga el ciclo celular, a fin de permitir la reparación del ADN. Las mujeres portadoras de una mutación en el gen BRCA1 tienen una probabilidad del 55 al 65% de desarrollar cáncer de mama y 40% de presentar cáncer de ovario después de los 70 años. En el hombre, hay mayor incidencia de cáncer de próstata. BRCA2: presente en cromosoma 13. Mutaciones en este gen, también aumentan la incidencia de cáncer de mama y ovario en la mujer y próstata en el hombre. Es necesario para la recombinación homóloga entre cromátides hermanas durante la meiosis y la mitosis. - La reparación de las rupturas de ambas cadenas se consigue mediante la recombinación homóloga (gracias a las actividades de BRCA1 y BRCA2) o bien, mediante la unión de extremos no homólogos, lo cual es un proceso proclive al error. Las rupturas en una cadena son más frecuentes que las rupturas en las dos cadenas de ADN. En una célula en la que falte la actividad de BRCA1 o BRCA2, la única manera de reparar ADN es mediante la unión de extremos no homólogos, un proceso que generalmente es propenso al error. - La acumulación de células con mutaciones lleva a una mayor incidencia de desarrollo de cáncer. El mecanismo celular para reparar la ruptura de una sola cadena de ADN depende de la PARP1 (polimerasa poli-ADP-ribosa). PARP1: Esta enzima produce grandes cantidades ramificadas de poli- ADP-ribosa, derivada de NAD+ en el sitio del daño, cuya función es actuar como estación de carga para las proteínas vinculadas con la reparación de la ruptura de una sola cadena en el ADN. Es importante destacar que la falta de una enzima de reparación de las malas complementariedades en el ADN no causa directamente cáncer; sin embargo, se eleva la frecuencia con la cual, las nuevas mutaciones se introducen en las células somáticas, con particular rapidez en células rápidamente proliferativas, como las del intestino, de modo que una mutación resultará en un gen necesario para controlar el crecimiento de manera adecuada. Una vez que se produce la mutación los tumores pueden empezar a desarrollarse. Xerodermia pigmentosa: La xerodermia pigmentosa (XP) es una rara afección que se transmite de padres a hijos. Ocasiona que la piel y el tejido que cubren el ojo sean extremadamente sensibles a la luz ultravioleta (UV), algunas personas también presentan problemas en el sistema nervioso Se produce por la incapacidad de reparación de los daños que se generan en el ADN SINTESIS DE ARN ✓ La síntesis de ARN a partir de un molde de ADN se llama transcripción. ✓ Los genes se transcriben por enzimas llamadas ARN polimerasas que generan ARN monocatenario idéntico en la secuencia con excepción de URACILO en lugar de TIMINA a una de las cadenas del ADN de la doble cadena. ✓ Cadena molde: es aquella que dirige la secuencia de nucleótidos en el ARN por apareamiento de las bases complementarias. ✓ Transcripto primario: cadena de ARN que se genera de forma inicial. Tipos de ARN: ARN Mensajero ARN Pequeños y estables ARN Transferencia ARN nuclear heterogéneo ARN Ribosomales ARN MENSAJERO: El ARN se sintetiza en el núcleo como una larga cadena inmadura heterogénea el cual recibe el nombre de arn nuclear heterogéneo. A este arn le ocurren una serie de modificaciones que implican en primer lugar la adición de un extremo 5´ CAP y un extremo poli A en el 3’. Luego sucede en SPLICING que consiste en la eliminación de regiones NO codificante llamados INTRONES. El material codificante EXONES, se condensa y forma al ARN MADURO con su extremo 5´CAP y 3´poli A. Este está preparado para pasar al citoplasma para ir a los ribosomas y codificar la síntesis proteica. Características generales: Heterogéneos pero estables. Se sintetizan como largos precursores (ARNnh) Extremo 5´ con trifosfato de 7-metilguanosina (CAP) o Reconocimiento del ARNm por el ribosoma o Estabilización del ARNm o Evitar al ataque por 5´-exonucleasas Extremo 3´ con poli A o Permitir el pasaje del ARNm al citoplasma. o Estabilidad intracelular del ARNm o Evitar el ataque por 3´-exonucleasas ARN DE TRANSFERENCIA: Moléculas adaptadoras: tiene un brazo anticodón que lee el codón que está presente en el ARN mensajero y tienen un brazo aminoacídico el cual se une (por un enlace tipo ester) con el aminoácido para iniciar la síntesis de una proteína. Cuatro brazos principales y uno adicional Apareamiento de las bases en los brazos Poca estabilidad en eucariontes 75 nucleótidos y 20 especies distintas ARN RIBOSOMAL: Los arn ribosomales que participan en el ensamblaje ribosómico y en la fijación ribosomal del ARN mensajero están situados en la SUBUNIDAD MAYOR Y MENOR de los ribosomas, aunque con distintas unidades de flotación: Subunidad mayor: ARN 5S, 5.8S, 28S Subunidad menor: ARN 5S ARN ESTABLES Y PEQUEÑOS: Son ribonucleoproteínas pequeñas distribuidas en núcleo, citoplasma o ambos. Participan en la regulación del gen: Remoción del intrón. Procesamiento de ARNm precursor. Procesamiento del poli A. TRANSCRIPCION DEL ARN: Es el proceso enzimático mediante el cual la información genética contenida en una hebra de ADN se utiliza para sintetizar una secuencia de bases complementaria en una cadena de ARN. Características generales: Es muy similar a la replicación del ADN en términos de mecanismo químico, dirección de síntesis y utilización de un molde. El ADN permanece inalterado al final del proceso. Difiere en que la transcripción no requiere un cebador y en que solo se transcribe una hebra del ADN y a su vez, sólo se transcribe un fragmento de la hebra, no la hebra entera. No tienen la capacidad de corregir errores Necesita de la presencia de factores de transcripción En los eucariontes la transcripción se realiza en el nucleoplasma. Al existir una membrana nuclear este proceso es previo a la traducción que se realizará en el citoplasma. El ARN sintetizado no sirve para la transcripción y debe sufrir un procesamiento postranscripcional para cumplir con su función. Todas estas medidas son tendientes a evitar que la síntesis proteica se realice en el núcleo. En los procariontes, al no existir membranas internas que separen la maquinaria de síntesis proteica de la síntesis de ARN, ambos procesos se realizan simultáneamente. A medida que el ARNm es transcripto, va siendo traducido. La secuencia de ribonucleótidos en una molécula de ARN es complementaria de la secuencia de desoxirribonucleótidos en una tira de ADN bicatenario. La hebra del ADN que se transcribe a ARN se llama tira codificadora La que no se transcribe se denomina tira no codificadora. En el caso de una molécula de ADN bicatenario que contiene varios genes, la tira codificadora para un gen no necesariamente es la misma que para otro. Genes codificados en distintas hebras pueden tener sentido opuesto de lectura: La transcripción tiene 3 etapas: 1) INICIACION: Depende de la unión de la ARN polimerasa con una región del ADN que determina la especificidad de la transcripción de un gen particular (gen promotor). RECONOCIMIENTO DEL GEN PROMOTOR ARN POLIMERASA: Existen 3 tipos de ARN polimerasas en eucariontes, difieren en su secuencia de aminoácidos, en el tipo de ARN que sintetiza y en la sensibilidad a la alfa-amanitina, principio tóxico del hongo Amanita phalloides. Catalizan la reacción general por la cual se produce la unión de nucleótidos (ATP + CTP+ UTP + GTP) para formar ARN mensajero, con pérdida de 4Ppi Requerimientos: NTP (ATP, CTP, UTP, GTP) No necesita cebador para actuar Mg++ Sentido de lectura: 3´ 5´ ADN doble catenario Sentido de síntesis: 5´ 3´ A diferencia de la ADN polimerasa las ARN polimerasas: no necesita cebador y no tiene actividad de endo o exonucleasa conocidas. No tiene capacidad para corregir errores en el ARN, como lo hace la ADN polimerasa, la transcripción si bien tiene un alto grado de fidelidad, no alcanza la extraordinaria fidelidad del proceso de replicación del ADN. Las ARN polimerasas de eucariontes requieren proteínas llamadas factores generales de transcripción (TF) que se unen al ADN y a la polimerasa Ubican a la enzima correctamente en el promotor Colaboran en la separación de las dos hebras de ADN Promueven la iniciación de la transcripción La subunidad sigma permite a la ARN polimerasa reconocer las regiones promotoras del ADN. La subunidad sigma más la enzima central constituyen la holoenzima. PROMOTORES: Las secuencias de nucleótidos que reconocen la subunidad sigma de la ARN polimerasa incluyen: A. Caja de Pribnow (TATA box): Es un segmento de seis nucleótidos (5´-TATAAT-3´) centrados unos 8 a 10 nucleótidos a la izquierda del sitio de inicio de la transcripción. Esta secuencia codifica la base inicial del ARNm B. Secuencia 35: Una segunda secuencia de nucleótidos (5´-TTGACA-3´) se centra a unas 35 bases a la izquierda del sitio de inicio de la transcripción. Actúa en los procariontes como un gen promotor. En los procariontes la subunidad sigma está unida de manera relativamente débil al complejo enzimático de la arn polimerasa formando a la holopolimerasa. Esta subunidad sigma es fundamental para iniciar la transcripción. También es importante que la misma se libere y se separe de la holopolimerasa de tal manera que el núcleo central de la arn polimerasa continuara con la elongación del ARN. 2) ELONGACIÓN: Una vez que la holoenzima reconoce la región promotora, la ARN polimerasa empieza a sintetizar un transcripto de la secuencia de ADN. Por lo general, comienza con una purina y se libera la subunidad sigma. 3) TERMINACIÓN: La terminación de la síntesis de ARN está señalada por una secuencia repetida invertida que se encuentra separada por un segmento de ADN espaciador que también es transcripto. De esta manera se produce la liberación del arn transcripto que en la próxima etapa  sufrirá una serie de modificaciones postranscripcionales. Esto permite un apareamiento intramolecular en el ARN naciente, conformando una horquilla. Esta secuencia es seguida de un tramo de bases T- A, que también es transcripto y que indica la terminación de la síntesis. En procariontes, un factor proteico Rho determina que la ARN polimerasa cese su acción y se separe de la tira molde, liberando la copia primaria. Maduración postranscripcional ARNm: Lo cubre el arn nuclear heterogéneo 1. Perdida de los intrones. 2. El nuevo arn queda con los exones que en el extremo 5´ adoptara CAP y en el extremo 3´ al POLI A. 3. Pasaje del ARNm al citoplasma. 4. Splicing: corte y empalme: Del ARNnh se eliminarán intrones: secuencias internas no codificantes para la proteína que se pretende sintetizar. El proceso se puede ajustar de diversas maneras y permite que de la transcripción una misma porción de ADN se puedan obtener varias proteínas diferentes: Splicing alternativo. La eliminación de los intrones modifica el plegamiento de la molécula afectando su estructura secundaria y se realiza antes de la exportación del ARNm fuera del núcleo. Esto no ocurre en células procariontes, ya que estas no poseen intrones en su ADN. Maduración postranscripcional ARNr: El ARNr sufre todo un procesamiento en el nucleolo: 1. METILACIÓN: Los genes transcriben un precursor único de 45S. Este se metila sobre restos de ribosa en el núcleo antes que se complete la transcripción. El objetivo es marcar zonas que no deben ser degradadas en el siguiente paso. Marca zonas que no van a ser cortadas en el paso siguiente 2. CLIVAJE: Se realiza en zonas no metiladas ricas en C-G. Permite la formación de unidades más pequeñas 3. UNIÓN A PROTEÍNAS RIBOSÓMICAS: Antes que se complete la síntesis del precursor 45 S, en el nucléolo, se le unen proteínas ribosomales por autoensamblaje. 4. TRANSPORTE AL CITOPLASMA: Las subunidades ribosomales están completas al salir del núcleo, pero en el citoplasma tienen lugar pasos de maduración menores que sirven para asegurarse que no comience la síntesis proteica dentro del núcleo. Maduración postranscripcional ARNt: EN EL NÚCLEO: 1. Escisión del extremo 5´ y de una pequeña cola en el extremo 3´. Estas secuencias funcionan como señales para las modificaciones postranscripcionales. 2. Escisión de un intrón de 10 a 60 nucleótidos: Está situado hacia el lado 3´ del asa anticodón. Es escindido por una endonucleasa que no reconoce las secuencias de nucleótidos sino la estructura tridimensional que éstos adoptan. Es un mecanismo para evitar errores en la traducción. 3. Metilaciones e hidroxilaciones: Ocurren tanto en el núcleo como en el citoplasma.  REGULACION DE LA EXPRESION GENETICA Los organismos se adaptan a los cambios ambientales mediante la alteración de la expresión génica. La expresión regulada de los genes se requiere para el desarrollo, diferenciación y adaptación. Existen 2 tipos de regulación genética: A. Regulación positiva: Ocurre cuando la expresión de la información genética se incrementa en forma cuantitativa por la presencia de un elemento regulador específico, llamado activador o inductor. B. Regulación negativa: Ocurre cuando la expresión de la regulación genética está disminuida por la presencia de elemento regulador específico, llamado represor. Regulación genética: represión. Habitualmente el gen represor sintetiza una proteína represora que actuando sobre el sitio promotor inhibe al gen estructural inhibiendo la formación de una determinada enzima. Un efector que inhibe la función de un regulador negativo conlleva una regulación positiva. LA INHIBICION DE UNA INHIBICION TRAE APAREJADA UNA REGULACION +. Regulación genética: inducción. Si la proteína represora generada por el gen correspondiente se encuentra con un inductor su efecto inhibidor queda totalmente bloqueados de tal manera que el gen estructural y el gen promotor quedaran desinhibidos aumentando la formación de una enzima (se observa como la inhibición de una inhibición termina provocando una inducción). Los sistemas biológicos muestran 3 tipos de respuestas temporales a una señal reguladora 1. RESPUESTA TIPO A: La presencia de una señal estimulante provoca el aumento de una respuesta química en tanto y en cuanto dicha señal se mantenga presente. Una vez que cesa el estímulo la actividad enzimática cae, y esto puede ser mantenido en el tiempo. A un efecto estimulante una respuesta que se mantiene en tanto ese efecto se mantenga en el tiempo. 2. RESPUESTA TIPO B: la presencia de una señal o estimulo genera una rápida respuesta temporal sobre la cual sobreviene un periodo latencia, refractariedad o recuperación por más que se mantenga la señal. Pasado ese periodo de recuperación la persistencia de la señal vuelve a desencadenar nueva respuesta que nuevamente vuelve a agotarse en el tiempo hasta pasar el periodo de refractariedad que habíamos mencionado anteriormente. 3. RESPUESTA TIPO C: La presencia de señal o estimulo desencadena una respuesta única, amesetada que se mantiene en el tiempo independientemente de la persistencia de la señal. El proceso de alteración de la expresión génica implica la modulación de la transcripción, debido a cambios en la interacción de las proteínas reguladoras de unión específica con varias regiones del ADN. CROMATINA: puede dividir en dos clases, según su patrón de tinción: Eucromatina: se tiñe suavemente y se corresponde con regiones del genoma que están disponibles para la transcripción. Heterocromatina: se tiñe intensamente y se corresponde con regiones del genoma que están densamente compactadas e inaccesibles para el aparato transcripcional. La compactación de la cromatina afecta la capacidad de unión de las enzimas y factores transcripcionales de genes específicos. Hay proteínas que reconocen secuencias específicas del ADN y una vez unidas, transmiten la señal de descondensación de cerca de 10.000 pares de bases correspondientes a un bucle de la cromatina. Las acetilaciones y desacetilaciones de histonas son modificaciones covalentes frecuentes en estos fenómenos de descompactación cromatínica. Un ejemplo típico, ocurre en la acetilación de coactivadores involucrados en las transcripciones genéticas moduladas por las hormonas tiroideas. Las acetilaciones se producen en los residuos de lisina de los extremos amino-terminales de las histonas, reduciendo su carga positiva y, por lo tanto, su afinidad de unión al ADN cargado negativamente. La desacetilación de las histonas, mediada por desacetilasas, provoca el efecto contrario (recompactación). La metilación de restos de citosina en el ADN, especialmente en los sitios promotores, dificulta la transcripción. Por ejemplo, los genes de globina están más metilados en células no productoras de hemoglobina que en los eritroblastos. Las metilaciones del ADN se producen en secuencias específicamente reconocidas que generalmente se agrupan en “islotes” ricos en G-C, con frecuencia dentro o cerca de regiones reguladoras de la transcripción. Modificación del número y de la estructura de los genes: La eliminación total o parcial de genes impide la formación de ARNm y de la proteína correspondiente. Por ejemplo, en los glóbulos rojos una vez sintetizadas las proteínas estructurales y funcionales, la eliminación del núcleo en la etapa de eritroblasto ortocromático produce una célula incapaz de sintetizar toda otra proteína de novo presentando un 90% del contenido proteico total como hemoglobina. Por otra parte, la presencia de genes en tándem implica la presencia de múltiples copias de un gen que aumentan la capacidad de producción de la proteína requerida en grandes cantidades. Es el caso de los genes codificantes de histonas y ARNr 5S. La regulación génica se puede controlar también en función de la disponibilidad del ADN incrementando el número de copias de un gen accesible. Este mecanismo de regulación se conoce como amplificación génica. Una forma de amplificación es la repetición sucesiva de la replicación de una secuencia específica del ADN. Las regulaciones pueden ser de tipo CIS o TRANS. Cuando el elemento regulador transcripcional es parte de la cadena polinucleotídica donde se localiza el gen a regular, se denomina regulador CIS. Se trata de secuencias especiales del ADN (promotores y enhancers). En esta categoría están incluidos los promotores, la presencia de secuencias regulatorias potenciadoras (enhancers), y la interacción entre múltiples proteínas activadoras o inhibidoras que actúan mediante su unión a secuencias específicas de reconocimiento al ADN. La diferencia clave entre potenciador y promotor es que el promotor debe ubicarse corriente arriba y cerca del sitio del inicio de la transcripción, mientras que un potenciador puede ubicarse corriente arriba o corriente abajo, en cualquier lugar del gen.  El promotor es una secuencia que define el sitio de iniciación de la transcripción del ADN Los promotores más frecuentes son los de tipo CCAAT y TATA, denominados cajas por su alta conservación evolutiva. o La caja TATA está localizada 20-30 pares de bases (pb) corriente arriba (hacia el extremo 5’) del sitio de inicio de la transcripción. o Numerosas proteínas identificadas como TF IIA, B, C, etc. (factores regulatorios de la ARN polimerasa II) interactúan con la caja TATA. Estructura de la región promotora procarionte: Los grupos de bases nucleotídicas que se encuentran próximos al sitio de inicio de la transcripción reciben el nombre de caja s y regiones promotores. En los procariontes tenemos a la caja TATA (abreviatura de Timina-Adenina- Timina-Adenina) la cual está situada algunos elementos hacia la izquierda del punto de iniciación o bien una secuencia 35 que está formada por 35 bases nucleotídicas que actúan también con el mismo propósito favoreciendo la activación del sitio de inicio que es el que va a iniciar la transcripción del arn mensajero. Promotor CCAAT - El promotor CCAAT reside 50-130 pb corriente arriba (hacia el extremo 5’) del sitio de inicio transcripcional - La proteína denominada C/EBP (CCAAT-box/enhancer/binding/protein) se une a esta secuencia - Otra secuencia regulatoria incluye a la caja GC Si bien los promotores están preferentemente localizados corriente arriba (hacia el extremo 5’) del inicio transcripcional, algunos pueden ubicarse corriente abajo (hacia el extremo 3’) o bien ser de tipo intragénicos. El número y tipo de elementos regulatorios varían según cada ARNm. Existen secuencias del ADN que pueden localizarse corriente arriba o abajo del gen, a regular, situadas a miles de pares de bases con respecto al promotor y ADN sobre las cuales se ejercen acciones activadoras. Se denominan secuencias potenciadoras o aumentadoras (enhancers en inglés). En general, una secuencia regulatoria potenciadora o enhancer regula la frecuencia con la que se realiza el proceso transcripcional. La molécula de ADN se dobla en asa para permitir la aproximación de estas zonas alejadas de la doble hélice y ubica a la proteína activadora unida al “enhancer". Cuando los elementos regulatorios son de naturaleza y origen diferente a la secuencia genética a controlar, la regulación es de tipo TRANS (aquí se incluyen a los factores de transcripción generales, histoespecíficos y todas las proteínas regulatorias con capacidad de unión al ADN). Para un mismo gen pueden existir varias secuencias regulatorias. También existen reguladores de acción opuesta (silenciadores o amortiguadores de la transcripción). FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN: Son proteínas que participan en la regulación de la transcripción del ADN, pero que no forman parte de la ARN polimerasa. Los factores de transcripción pueden actuar reconociendo y uniéndose a secuencias concretas de ADN o uniéndose directamente a la ARN polimerasa. Pueden ser: A. Basales: son los componentes del complejo de transcripción basal y son necesarios para la transcripción de cualquier ARN. B. Histoespecíficos: se unen a regiones específicas promotoras/reguladoras de los genes y regulan el grado de transcripción desde el complejo de transcripción basal. Ambos tipos de proteína se unen a secuencias en el surco mayor del ADN. Se consideran 3 modelos de interacción proteína-ADN: 1. Hélice-giro-hélice: Esta clase de proteínas a menudo contiene una región rica en aminoácidos básicos localizada en el extremo amino terminal que les permite su unión a secuencias del ADN reconocidas específicamente. 2. Dedo de guante (Zinc-finger): Su nombre deriva de la forma que adoptan segmentos de unos 30 aminoácidos de estas proteínas reguladoras. Un átomo de Zn. enlaza las cadenas laterales de dos histidinas y dos cisteínas. Generalmente son varios “dedos de Zinc” los que se unen al sector correspondiente del ADN. Ejemplos de este tipo de proteínas reguladoras son algunos receptores nucleares de hormonas esteroides 3. Cierre de leucina: Es una proteína dimérica. Cada mitad de la cremallera de leucina es una corta alfa hélice con un residuo de leucina cada siete posiciones, que se encuentra en contacto con las leucinas de la otra hélice cada dos giros. Las otras dos alfa hélices de cada cadena tienen cargas positivas e interaccionan con el ADN. Las interacciones entre las leucinas son hidrofóbicas y se separan con facilidad. La especificidad involucrada en el control de la transcripción requiere que las proteínas reguladoras se unan con alta afinidad, a la región correcta del ADN La regulación de la expresión genética se realiza por: A. La membrana nuclear: En eucariontes, la membrana nuclear separa físicamente la transcripción génica de la traducción, ya que los ribosomas sólo existen en el citoplasma. Si el ARNm no sale al citoplasma no hay síntesis proteica. B. Por procesamiento del ARNm 1. El proceso de corte y empalme (splicing) puede producir diferentes ARNm del mismo pre-ARNm; 2. La adición del CAP en el extremo 5´ y de la cola poli-A al extremo 3´ estabilizan al ARNm; 3. Regulación de la estabilidad o degradación del ARNm en el citoplasma: a mayor estabilidad mayor síntesis proteica y a la inversa; 4. Los pequeños ARNs regulan la estabilidad del ARNm y la traducción o no a proteínas según las necesidades fisiológicas de las células. Bioquímica del cáncer: La palabra cáncer se aplica a un grupo de enfermedades en las que las células crecen de manera anormal y forman un tumor maligno. Las células malignas son capaces de invadir los tejidos circundantes y metastatizar (viajar a otros lugares del organismo donde establecen zonas secundarias de crecimiento). Este patrón de crecimiento aberrante es el resultado de mutaciones en genes que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia de las células. Debido a estos cambios genéticos, las células malignas ya no responden a las señales que regulan el crecimiento de las células normales. Las mutaciones que provocan cáncer se presentan en ciertas clases de genes: A. los que regulan la proliferación y diferenciación celular B. aquellos que inhiben el crecimiento C. los que dirigen la célula hacia la apoptosis (muerte programada) D. aquellos que reparan el ADN dañado. Las mutaciones que provocan cáncer pueden ser: A. Mutaciones con ganancia de función (protooncogenes que dan origen a oncogenes). Ejemplos de protooncogenes son los relacionados con la transducción de señales y la progresión del ciclo celular: ▪ Factores de crecimiento y sus receptores ▪ Ras (proteína de unión al GTP) ▪ Factores de transcripción ▪ Ciclinas y proteínas que las regulan ▪ Micro ARN, que regula a las proteínas que inhiben el crecimiento B. Mutaciones con pérdida de actividad de una proteína (genes supresores de tumores)  ▪ p 53: vigila el daño al ADN y detiene la progresión del ciclo celular hasta que el daño se haya reparado ▪ Proteínas del gen retinoblastoma (Rb), el cual regula el cambio de fase de G1 a S ▪ Reguladores del Ras. LA PROTEÍNA RAS SE VUELVE UNA PROTEÍNA ONCOGENCIA CUANDO PIERDE SU ACTIVIDAD GTPasica. ▪ Micro ARN, que regula señales que promueven el crecimiento ONCOGENESIS: Los genes que contribuyen a la oncogénesis pueden ser de dos tipos: 1. Protooncogenes: es un gen celular, que normalmente codifica una proteína reguladora, y que por un simple cambio de bases (mutación) puede convertirse en oncogén (es un gen que produce cáncer y se refiere a cualquiera de varios genes mutantes que hacen que una célula, hasta hace poco normal, tenga una proliferación rápida e incontrolada) 2. Genes supresores de tumores: balancean el crecimiento y la quiescencia celulares. Cuando no se expresan, vía mutaciones con perdida de función, el equilibrio se desplaza hacia la proliferación celular y la formación de tumores. Normalmente, los alelos de un protooncogén especifican la síntesis de constituyentes que, a manera de señales, desde el exterior, activan genes relacionados con el crecimiento celular dentro del núcleo. Ej.: una proteína traductora de señales unida a la membrana. Las células normales humanas contienen secuencias de ADN semejantes a las de los oncogenes virales, lo que sugiere que los virus incorporan genes celulares en sus genomas durante su paso a través de las células. Los protooncogenes se activan a oncogenes por diversos mecanismos: INSERCIÓN DE UN PROMOTOR: El promotor es una secuencia de nucleótidos que define el sitio de iniciación de transcripción del ADN. Los promotores se insertan corriente arriba del sitio de iniciación de la transcripción hacia el extremo 5´. Algunos retrovirus pueden insertar parte de su genoma vira en una célula huésped y una vez que se hayan integrado los llamados RTL o fragmentos de repetición larga que son una secuencia de nucleótidos característica que se encuentra en cada extremo de un elemento retroviral que ha sido integrado en el genoma hospedador pueden actuar como promotores de protooncogenes (MYC) el cual se transforma inmediatamente en un oncogén. Estas secuencias RTL se transcriben parcialmente para forma un arn mensajero el cual por transcripción reversa formará el ADN complementario que finalmente dará origen al ADN bicatenaria que ha sido modificado. Está implicada en el proceso de integración. Las células solo producen myc cuando son estimuladas por factores de crecimiento, y una vez producidos estimulan la transcripción de genes que activan la proliferación celular. Sin embargo, en muchos tipos de cáncer (sobre todo en los asociados con los tejidos hematopoyéticos), los niveles de myc permanecen elevados aun en ausencia de factores de crecimiento. INSERCIÓN DE UN AMPLIFICADOR: La inserción de un amplificador puede ser corriente arriba o corriente abajo del sitio de iniciación de la transcripción del ADN. Muchas veces algunos virus pueden insertarse actuando como amplificadores de tal manera que el amplificador viral puede estimular la transcripción del oncogén a partir del promotor de este. CROMOSÓMIC TRANSLOCACIÓN: Translocación es un tipo de anomalía cromosómica en la que un cromosoma se rompe y una parte de él vuelve a unirse a un cromosoma diferente. Este tipo de anomalías cromosómicas se suele observar mucho en los canceres de la sangre como la leucemia y los linfomas. Un ejemplo de traslocación es el Cromosoma Filadelfia: El intercambio de ADN entre los cromosomas ocasiona la formación de un nuevo gen (un oncogén) llamado BCR-ABL. Este gen produce la proteína BCR-ABL, la cual es un tipo de tirosina quinasa. Esta proteína causa que las células de la Leucemia Mieloide Crónica (LMC) crezcan y se dividan sin control. - Esta translocación, entre cromosomas 9 y 22, da como resultado un cromosoma 22, más corto de lo normal. - Este nuevo cromosoma anormal se llama Cromosoma Filadelfia, el cual se encuentra en las células leucémicas de casi todos los pacientes con LMC. La ruptura cromosómica de los cromosomas 9 y 22 permite el intercambio de material genético en lo que se conoce como una translocación. Como consecuencia se forma un cromosoma 22 más corto “cromosoma filadelfia” el cual produce una proteína con carácter de tirosina quinasa que favorece el crecimiento indiferenciado y anárquico de las células de la progenie leucocitaria generando de esa manera la leucemia mieloide crónica. MUTACIÓN EN UN PUNTO y AMPLIFICACIÓN GÉNICA: Tanto la radiación como los carcinógenos químicos producen 3 tipos de deleciones: puntuales, deleciones e inserciones. - Una deleción es un tipo de mutación genética en la cual se pierde material genético, desde un solo par de nucleótidos de ADN hasta todo un fragmento de cromosoma. - Rearreglo genéticos ocasionados por la transposición o translocación de un protooncogen llevan a la amplificación de un protooncogén que permite la producción de mayor cantidad de proteínas. El oncogén Ras pierde su actividad GTPasa y por lo tanto, permanece activo por más tiempo. MODIFICACIONES CELULARES POR CÁNCER NÚCLEO Modificación de proteínas asociadas al ADN Modificaciones del ARNt Patrón enzimático diferenciado CITOPLASMA: Se produce la síntesis y secreción de antígenos oncofetales, otros antígenos asociados al tumor, isoenzimas, etc. Todas estas modificaciones traen como consecuencia: Aparición de nuevos antígenos Modificación del transporte Pérdida de antígenos Alteraciones de la permeabilidad Modificación de glucoproteínas Modificación de la fagocitosis Modificación de la adhesividad e inhibición Enzimas superficiales modificadas de contacto Retrovirus de ARN se han asociado con el desarrollo de cáncer en los seres humanos 1. HTLV-1: produce una proteína llamada proteína tax que actúa como un coactivador transcripcional. Tax activa los protooncogenes celulares c.sis y c-fos con lo cual altera los controles normales de la proliferación celular y lleva a la malignidad. Tax se comporta como un oncogén viral sin una contraparte en el genoma de la célula hospedadora. El resultado es la producción de un linfoma de células T. 2. VIH (virus de la inmuno deficiencia humana): Causa inmuno depresión como consecuencia una pérdida de la supervivencia tumoral mediada por el sistema inmunológico. Los pacientes infectados con VIH tienen la capacidad de producir un factor de transcripción denominado proteína TAT. Esta activa la transcripción de los genes de las IL-6 y IL-10 en las células T infectadas. Ambas actúan como factores de crecimiento que propician la proliferación de células D y por lo tanto el incremento en la producción de esta que lleva al desarrollo de un linfoma “linfoma no Hodgkin” que es una enfermedad de los ganglios linfáticos. SE USA WESTERN BLOT 3. VHC (virus de la hepatitis C): Es capaz de producir hepatocarcinoma en sujetos infectados. La apoptosis es la muerte celular programada, que lleva a la destrucción de células dañadas que no se pueden reparar. Consta de 3 fases: A. Fase de inicio (señales externas o liberación mitocondrial del citocromo c1) B. Fase de integración de la seña C. Fase de ejecución. La apoptosis es regulada por un grupo de proteínas de la familia Bcl-2, la cual consta tanto de factores pro como anti apoptóticos. Las células cancerosas han desarrollado mecanismos para evadir la apoptosis. Las células tumorales pueden producir y liberar a la circulación sanguínea sustancias químicas características, denominadas marcadores tumorales, que dependen de su fenotipo maligno. MARCADORES TUMORALES---CLASIFICACION El marcador tumoral circulante ideal debería: A. Encontrarse en relación directa con la presencia del proceso maligno B. Correlacionarse con la masa tumoral C. Permitir afirmar el tipo, la localización y el estadio del tumor D. Posibilitar un pronóstico. Utilizando métodos físicos de diagnóstico pueden detectarse tumores que ya han alcanzado 1 cm. (109 células) mientras que con la utilización de métodos inmunológicos “in vitro” puede comprobarse la existencia de 106 células. 1. ALFA-FETO-PROTEÍNA: Es una glucoproteína de P.M. 70.000 que se sintetiza en el hígado fetal y pasa al suero materno a través del líquido amniótico. Su elevación aparece en: Hepatocarcinoma Tumores de células germinales. 2. ANTÍGENO CARCINO-EMBRIONARIO (CEA): Es una glucoproteína de P.M.180.000 que durante el desarrollo embrionario es sintetizada en el tracto gastrointestinal y en el páncreas y de allí, pasa a la circulación. Su secreción aumenta en: Carcinomas de: colon, recto, estómago, páncreas, hígado, mama, ovario, bronquio. 3. ANTÍGENO CARCINO-EMBRIONARIO (CEA): También, puede aparecer aumentado en enfermedades benignas, como: Colitis ulcerosa, hepatitis, procesos inflamatorios, cirrosis y grandes fumadores. No es un marcador útil para el screening ni para el diagnóstico, ya que sólo el 40 a 80% de los pacientes con tumores productores de CEA presentan valores elevados. 4. CA-15-3: Se trata de un marcador asociado al cáncer de mama que se utiliza clínicamente para el control evolutivo para determinar la aparición de metástasis en el intervalo libre de enfermedad. Monitoreo de la terapia para evaluar la respuesta 5. CA-125: Es un marcador asociado al cáncer de ovario y puede detectarse en el 80% de los casos. Valores superiores a 35 UI/ml excluyen la necesidad de laparoscopia para confirmar el diagnóstico. 6. CA 19-9: Se asocia al carcinoma del tracto gastrointestinal, páncreas, estómago, colon y recto. Su determinación es útil, tanto para diagnóstico como para seguimiento. TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Y LABORATORIO CLINICO INTRODUCCIÓN: La manipulación de una secuencia de ADN y la construcción de moléculas quiméricas (ingeniería genética) brindan los medios adecuados para estudiar cómo funciona un segmento específico de ADN. La comprensión de esta tecnología es importante para: 1. Establecer las bases moleculares de enfermedades genéticas 2. La producción de proteínas humanas en abundancia con fines terapéuticos (insulina, hormona de crecimiento, eritropoyetina 3. La obtención de proteínas para vacunas (hepatitis B) y para pruebas diagnósticas (HIV/SIDA) 4. El diagnóstico de enfermedades existentes y predicción de riesgos para desarrollar otros padecimiento 5. La medicina forense 6. El desarrollo de terapias génicas para tratar enfermedades. ¿CÓMO SE ESTUDIA EL ADN? La tecnología del ADN recombinante comprende el aislamiento y manipulación del ADN para elaborar moléculas quiméricas o híbridas. Enzimas de restricción cortan las cadenas de ADN en sitios específicos. Estas enzimas son endonucleasas que cortan el ADN en secuencias específicas dentro de la molécula, que generalmente corresponden a secuencias palindrómicas. Ejemplo: CGATCGGCTAGC (se leen igual en ambas direcciones). Deben su nombre ya que en su presencia algunas bacterias restringen el crecimiento de ciertos virus bacterianos, llamados bacteriófagos. Cada una de las enzimas corta una secuencia específica de doble cadena de ADN de 4 a 7 pares de bases. Estas enzimas cortan el ADN de cualquier fuente en piezas cortas y en secuencias específicas, en contraste con muchos métodos que lo hacen al azar. Reciben su nombre a partir de la bacteria de la cual se aíslan. Ej.: Eco III, deriva de E. coli. Hind II: Haemophillus influenzae. Los cortes pueden ser: ROMOS COHESIVOS PLÁSMIDO CIRCULAR DE ADN: Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentra en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. La endonucleasa de restricción introduce 2 cortes en este plásmido circular de ADN dejando los extremos cohesivos. En la brecha restante insertaremos la parte de ADN que nosotros queremos replicar y que va a ser adquirida del ADN humano. ADN HUMANO: El ADN humano con una secuencia especifica de bases que nosotros queremos copiar y pegar dentro del plásmido bacteriano. Exactamente igual que antes las endonucleasas de restricción cortaran el segmento que nosotros queremos modificar y posteriormente ADN ligasas se encargaran del pegado y del sellado de las nueva bases incorporadas al plásmido bacteriano. El producto final es un hibrido que se conoce con el nombre del ADN RECOMBINANTE: es el plásmido que ha recibido material genético extra del ADN humano. TRANSFERENCIAS DE BANDAS: La visualización de un fragmento específico de ADN o de ARN, de entre muchos miles de moléculas contaminantes requiere de la convergencia de varias técnicas, las cuales se conocen en su conjunto como transferencia de bandas. Tecnicas: Southern-Blot (ADN) Northern Blot (ARN) Western Blot (proteínas) Estas técnicas son útiles en la determinación de cuántas copias de un gen se encuentran en un tejido determinado, o si existen grandes alteraciones en un gen. En una transferencia de bandas el ADN, aislado de una línea celular o de un tejido, es digerido con una o más enzimas de restricción. Esta mezcla se coloca en un gel de agarosa o de poliacrilamida y se expone a una corriente eléctrica directa. El ADN, que tiene carga negativa, migra hacia el ánodo. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido. Después de un tiempo apropiado, el ADN se desnaturaliza por la exposición a una solución alcalina ligera y es transferido a un papel de nitrocelulosa y nylon, en una réplica exacta del patrón sobre el gel, por la técnica de bandas diseñada por Southern. TRANSFERENCIA AL PAPEL: El ADN se une al papel por medio de calor y el papel después se expone a la sonda de ADN marcado, con lo cual se hibridan los fragmentos complementarios sobre el papel filtro. En el caso del Western, se adiciona un anticuerpo específico marcado. Después del lavado, el papel se expone a una placa de rayos X, la cual se procesa para revelar las bandas específicas correspondientes a los fragmentos de ADN que reconocieron las secuencias en la sonda de ADN. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): Es un método enzimático para el copiado repetido y de esta manera, amplificado de las dos cadenas de ADN que forman una secuencia génica particular. La especificidad del método se basa en el uso de dos oligonucleótidos iniciadores que se hibridan con secuencias complementarias en cadenas opuestas del ADN y flanquean la secuencia blanco. - Secuencias tan cortas de ADN como de 50 a 100 pb y tan largas como de 10 kb, se pueden amplificar - Veinte ciclos proporcionan una amplificación de 106 y 30 ciclos de 109. - El método permite que el ADN de una sola célula, de un folículo piloso o de esperma, se amplifique y analice. De allí, su aplicación en medicina forense. LA PCR TAMBIÉN SE UTILIZA PARA: 1. Detectar agentes infecciosos, en especial, virus latentes 2. Hacer diagnósticos genéticos prenatales 3. Detectar polimorfismos alélicos. Se detecta con Southern blot y PCR 4. Establecer el tipo específico de tejido para trasplante 5. Estudiar la evolución biológica TÉCNICA DE LA PCR: La muestra de ADN se calienta para separar las dos cadenas, permitiendo que los iniciadores se unan al ADN, y cada una de las cadenas se copia mediante la ADN polimerasa, comenzando en el sitio del iniciador. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): La técnica tiene 3 etapas 1. Desnaturalización: dura aproximadamente 1 minuto. Las dos hebras de ADN son separadas aproximadamente a 94°C. 2. Recocido: Tenemos la introducción de los iniciadores para cada una de las cadenas. 3. Extensión: Tras 45 segundos de adaptación a los 2 minutos y a 72°C ya comienzan a realizar la extensión de ambas cadenas. Adicionan solamente desoxinucleotidos trifosfatados. De esta manera vamos a tener una amplificación exponencial. Para el ciclo 35 tendremos aproximadamente 68 billones de copias. La tecnología del ADN recombinante se utiliza, además, en el análisis molecular de las enfermedades. Esto permite el estudio de: a. VARIACIONES GÉNICAS NORMALES: Las variaciones normales y heredables en la secuencia del ADN en regiones no codificantes se denominan polimorfismos y sólo ocurren aproximadamente en 1 de cada 500 nucleótidos. Su estudio es de interés en medicina forense o bien, para el estudio de genes específicos. b. VARIACIONES GÉNICAS QUE CAUSAN ENFERMEDADES: Mutaciones puntuales pueden generar proteínas alteradas. Ej.: Anemia de células falciformes. - Una sustitución de T por A en el sexto codón del gen de la globina se traduce en el cambio de A por U en el ARNm correspondiente. El codón alterado especifica valina por glutámico y esto causa una alteración estructural de la molécula. - La mutación génica genera una cadena BETA anómala en la cual vamos a encontrar valina por glutámico. En el momento de desoxigenarse la hemoglobina anómala se forma un precipitado de hemoglobina que tiende a acumularse en los vasos sanguíneos generando trombosis que puede llevar a la muerte. - La supresión de un fragmento crítico de ADN, el rearreglo del ADN dentro de un gen o la inserción de un fragmento de ADN en una región de codificación o reguladora pueden cambiar la expresión génica y producir enfermedad. - Este es el caso que ocurre con la BETA talasemia (anemia del mediterraneo) en la cual existe la supresion del gen de la globina (codifica la sintesis de las cadenas beta de la hemoglobina) del cromosoma 11. Consecuentemente se sintetizan hemoglobinas que carecen de cadenas beta, por ejemplo la hemoglobina 2 o fetal. c. DIAGNÓSTICO PRENATAL: Si se conoce la lesión genética y se dispone de una sonda específica, es posible el diagnóstico prenatal. El ADN de células obtenidas de 10 ml de líquido amniótico (o por biopsia de vellosidades coriónicas) puede analizarse por Southern Blot. d. ANIMALES TRANSGÉNICOS: Se basa en la introducción de un nuevo ADN en células germinales por su inyección en el núcleo del huevo. Un porcentaje de genes inyectados en un óvulo fertilizado de ratón se incorpora al genoma y se encontrará tanto en células somáticas como germinales; estas modificaciones pasarán a la descendencia. e. TERAPIA GÉNICA: Las enfermedades causadas por la deficiencia de un producto génico están sujetas a una terapia de reemplazo. La estrategia es clonar un gen en un vector que será fácilmente capturado e incorporado al genoma de una célula huésped. Las células precursoras de la médula ósea son ideales para este propósito ya que se supone que volverán a establecerse en la médula y allí, replicarán. Ej: terapia génica de la b-talasemia BIOSINTESIS PROTEICA Factores intervinientes en la síntesis proteica: ARNm Aminoacil-Arnt sintetasa Peptidil transferas ARNt ATP; GTP Factores de elongación Ribosomas Factores de iniciación Factores de terminación ARNm: características generales Heterogéneos pero estables Se sintetizan como largos precursores; (ARNnh) Extremo 5´ con trifosfato de 7-metilguanosina (CAP). Funciones del CAP: o Reconocimiento del ARNm por el ribosoma o Estabilización del ARNm o Evitar el ataque por 5-exonucleasa Extremo 3´con poliadenilatos (poli A). Funciones del poli A: o Estabilidad intracelular del ARNm o Evitar el ataque por 3´-exonucleasas o Permitir el pasaje del ARNm al citoplasma El ARNm lleva los codones. Cada codón codifica un aminoácido (salvo los codones sin sentido) El ARNm recién sintetizado sufre un procesamiento postranscripcional por el cual se produce la eliminación de regiones no codificantes o intrones (splicing). ARNt: características generales Transporta los aminoácidos para la síntesis Se destaca uno que es aceptor de los proteica aminoácidos y el otro es el anticodón Moléculas adaptadoras Apareamiento de las bases en los brazos Cuatro brazos principales y uno adicional Poca estabilidad en eucarionte Ribosomas: están formados por 2 subunidades, la subunidad mayor (60S) y una subunidad menor (40S). El ribosoma eucarionte tiene (80S). Etapas de la traducción: 1. Activación del aminoácido 2. Iniciación 3. Elongación 4. Terminación 5. Procesamiento postraduccional (maduración) Esquematización de la traducción: Una vez que se realizó la activación del aminoácido se produce la disociación de la subunidad mayor y menor del ribosoma para permitir el acoplamiento del ARNm. Este ARNm trae el primer codón de iniciación AUG que permite la incorporación del aminoácido metionina unido al ARNt. Las dos subunidades disociadas se vuelven a unir y entonces se forma el complejo funcional de iniciación 80S que dará origen a la síntesis de la cadena polipeptídica. El aminoácido metionina quedara en el sitio peptídico quedando un lugar libre que es el siguiente codón que codificara la llegada de un nuevo aminoácido. Es entonces que la enzima peptidil transferasa se encargara de la formación del enlace peptídico y del crecimiento de la cadena polipeptídica hasta llegar a los codones sin sentido que determinaran la finalización del proceso de traducción proteica. En ese momento la cadena polipeptídica será liberada entonces sufrirá una serie de modificaciones estructurales conocidas con el nombre de maduración post traduccional. Características generales de la traducción: El sentido de la traducción es de 5´ a 3´ Las proteínas son sintetizadas desde su extremo amino terminal hacia el carboxilo terminal 1. ACTIVACION DEL AMINOACIDO: Dicha activación es catalizada por enzimas conocidas con el nombre de Aminoacil-ARN t sintetasas cuya reacción general catalizada implica la unión del aminoácido al ARNt con gasto de energía y la formación del complejo Aminoacil-ARNt+AMP+ppi. Posteriormente todo el equilibrio de la reacción estará desplazado hacia la formación del aminoacil-ARNt ya que el ppi será degradado por una enzima piro fosfatasa. La activación del aminoácido se realiza en 2 etapas: 1) 2) La aminoacil-ARNt sintetasa posee 5 dominios funcionales: Reconocimiento del aminoácido (aa) Fijación de ATP y activación del aa Reconocimiento del ARNt Fijación del aa activado sobre el ARNt Eliminación de aa fijados por error Estructura de un aminoacil-ARNt: El aminoácido se une al extremo CCA del ARNt a través de un enlace de tipo ESTER. Este enlace se establece entre el extremo carboxílico del AA y el oxidrilo de posición 3´ de la adenina del extremo CCA. 2. INICIACION DE LA TRADUCCION A. DISOCIACION DEL RIBOSOMA: La subunidad mayor 60S se separa de la subunidad menor 40S gracias a la presencia de un factor proteico conocido como factor de iniciación 3 o disociasa. B. FORMACIÓN DEL COMPLEJO DE ENTRADA: GTP+FI2+Metionina forman el complejo ternario. Este ingresara a la subunidad menor 40S para formar el complejo de entrada. C. FORMACIÓN DEL COMPLEJO DE INICIACIÓN 40 S: Se produce la llegada del ARNm con el codón de iniciación AUG que codifica el acoplamiento del AA metionina que viene de la mano del ARNt. Al finalizar dicho proceso tenemos la formación del complejo de iniciación 40S D. FORMACION DEL COMPLEJO DE INICIACION 80S: Se produce el acoplamiento de la subunidad mayor del ribosoma para cerrar de esa manera el complejo de iniciación 80S que es el que comenzara la síntesis de la cadena polipeptídica. 3. ELONGACION: En el proceso de elongación, el ribosoma se desplaza sobre el ARNm en dirección 5´-> 3’ y avanza un codón por ciclo. La cadena polipeptídica en formación crece un aminoácido por vez desde el extremo amino terminal al carboxilo terminal  El aminoácido metionina que es el AA iniciador situado en el sitio P de la cadena de ARNm. Por su parte el sitio A está dispuesta para recibir un nuevo aminoácido el cual será codificado por el codón correspondiente. La enzima peptidil transferasa forma el enlace peptídico entre ambos de tal manera que el ribosoma queda perfectamente listo para sufrir el proceso de traslocación, de tal manera que ambos AA pasan a transformarse en el sitio peptídico. Un nuevo aminoácido se incorporará según el triplete codificante en el ARNm y así sucesivamente. A. PRIMER CICLO DE ELONGACIÓN: El codón que sigue al codón de iniciación es el codón GCU. Este codón codifica la entrada del AA alanina. Esta entrara formando parte de un complejo ternario alanil- ARNt+GTP+factor de elongación alfa. El GTP será hidrolizado por lo tanto el complejo alanil-ARNt ocupará su lugar en el codón GCU. Quedan enfrentados entre si la metionina en el sitio peptídico y la alanina en el sitio aminoacídico listos para ser unidos por la enzima peptidil transferasa y de esa manera formar el primer enlace peptídico. B. FORMACIÓN DE LA UNIÓN PEPTÍDICA: Se produce la formación de la unión peptídica gracias a la peptidil transferasa. Esta, está situada en la subunidad mayor, cataliza la formación del enlace peptídico entre el grupo carboxilo de la metionina unida al ARNt y la función amina del aminoácido unido al ARNt en el sitio A. Enlace amida C. TRASLOCACIÓN: La traslocación es el desplazamiento del peptidil- ARNt del sitio A al P, con requerimiento de GTP y del FE2. El ribosoma se desplaza 3 nucleótidos en sentido 5´-> 3´. Así, el próximo codón se convertirá en sitio A, ya que el complejo que ahora tiene el dipéptido está en el sitio P. El ARNt que trajo la metionina es descargado. FE 2: es esencial para translocar el ribosoma a lo largo del ARNm; hidroliza GTP durante la elongación de la cadena polipeptídica. - EL FE2 es el sitio de acción de la toxina producida por el Corynebacterium diphteriae, el cual produce una toxina letal. - La toxina diftérica inserta ADP-ribosilo en el FE2 y lo inactiva, así se bloquea la síntesis proteica. D. NUEVOS CICLOS DE ELONGACIÓN: Continuaran los nuevos ciclos de elongación donde según el aminoácido codificado por cada codón ingresara el correspondiente aminoacil ARNt La peptidil transferasa cataliza la formación de un nuevo enlace peptídico La cadena polipeptídica será transferida al sitio A El ARNt del sitio P será descargado y liberado 4. TERMINACION: La señal de terminación es la presencia de un codón de terminación en el ARNm (UAA, UAG, UGA). Este codón de terminación dará por finalizada la síntesis de la cadena polipeptídica. Al llegar el ribosoma a los codones sin sentido, éstos son reconocidos por factores de liberación que catalizan la hidrólisis de la unión entre la cadena peptídica y el ARNt. El factor de liberación actúa en el sitio ribosomal A y requiere que el sitio P contenga el peptidil ARNt La cadena polipeptídica terminada es separada del ARNt y éste es expulsado del ribosoma el cual, a su vez, se libera del ARNm. Si en el medio hay FI3, las subunidades se disocian y se utilizan para una nueva síntesis proteica. Balance energético: El gasto energético para la formación de un enlace peptídico es de 4 uniones fosfato de alta energía: o Síntesis del aminoacil-ARNt: 1 ATP o Unión del aminoacil-ARNt al ribosoma: 1 GTP o Elongación: 1 GTP  o Traslocación ribosomal: 1 GTP Modificaciones postraduccionales: Plegamiento proteico: permite a la proteína adquirir la conformación que determina su actividad biológica. El sentido y variedad de este plegamiento está regido por la estructura primaria o Es facilitado y guiado por chaperonas que son proteínas que dirigen el plegamiento de otras. o Estabilizan las conformaciones que el péptido naciente adopta antes de llegar a su estado final para evitar formas anómalas. Modificación de los extremos amino y carboxilo terminales o En eucariotas el primer aminoácido, metionina, es eliminado por peptidasas. o En proteínas que atraviesan membranas, se elimina del extremo amino-terminal un péptido hidrofóbico denominado señal. Hidroxilación de prolina y lisina: es necesaria para la maduración de las moléculas de colágeno recién sintetizadas (puentes entrecruzados). Fosforilación del hidroxilo de los residuos de serina, treonina y fenilalanina Carboxilación sobre residuos de aspartato y glutamato que permite la activación de proteínas como la trombina. Glicosilación Agregado de grupo prostético, ocurre, por ej., con el grupo hemo de las hemoproteínas después de la síntesis proteica y su completa separación del ribosoma. Formación de puentes disulfuro entre cisteínas permite estabilizar la estructura terciaria proteica. La información que determina el destino postraduccional reside en la estructura primaria de las proteínas. Las glicoproteínas se sintetizan por adición de cadenas laterales de oligosacáridos a restos de asparagina, serina o treonina. Destino de las proteínas sintetizadas: Las proteínas sin señales específicas permanecen en el citoplasma. Las que están destinadas a organelas presentan una cadena denominada péptido señal. Proteínas sintetizadas en el REG: En la membrana del REG existe una partícula de reconocimiento del péptido señal (SRP) que cumple 2 (dos) funciones: 1. Detener momentáneamente la traducción del ARNm hasta que el complejo ARNm-ribosoma–péptido se una a receptores en el REG 2. Fijar el complejo ARNm-ribosoma-péptido-SRP a la membrana del REG Glicosilación proteica: Las glucoproteínas pertenecen al grupo de los héteroglicanos. Contienen cadenas de oligosacáridos covalentemente unidos a su armazón de polipéptidos. Cerca del 50% de las proteínas eucariontes tienen azúcares anexados. Héteroglicanos De acuerdo con la naturaleza de la unión entre sus cadenas polipeptídicas y sus cadenas de oligosacáridos: Las glucoproteínas se clasifican en: A. Las que poseen enlaces N-glucosídicos: Estas glucoproteínas se distinguen por la presencia de uniones: Asn-GluNAc. Constituyen la clase principal de glucoproteínas e incluyen tanto a proteínas circulantes como las unidas a membrana. Su biosíntesis implica la participación del dolicol-PP- oligosacárido. El proceso de N-glicosilación puede dividirse en 2 etapas: 1. Ensamblaje y transferencia del dolicol-PP-oligosacárido: Dicho proceso se lleva a cabo en el REG. Una molécula de dolicol-P reacciona con UDP-gluNac para formar dolicol-pp-gluNAc+UMP. La enzima que cataliza esta reacción es una transferasa. Siguiendo esta etapa, a la gluNac-pp-dolicol se le van agregando distintos glúcidos y así sucesivamente va creciendo la cadena. 2. Procesamiento de la cadena de oligosacárido: Una vez formadas las cadenas oligosacárida a nivel del REG por acción de Proteíntransferasas, Glucosidasas y Manosidasas la cadena oligosacarida ira adoptando su configuración definitiva para pasar al aparato de Golgi donde las proteínas serán almacenadas en vesículas. El oligosacárido (Glu)3-(Man)9 (GluNAc)2 se transfiere a partir del dolicol-P-P-oligosacárido para formar un enlace N-glicosídico con uno o más residuos específicos de Asn de una proteína receptora que emerge de la superficie luminal de la membrana del REG. La transferencia se realiza hacia residuos específicos de asparagina en la secuencia Asn-X- Ser/Tre, donde la X es cualquier residuo, excepto prolina, aspartato o glutamato. La transferencia se realiza de modo cotraduccional en el retículo endoplásmico El oligosacárido unido a la proteína después es procesado parcialmente por las glucosidasas y manosidasas; si no hay adición de azúcares, el resultado es una cadena con alto contenido de manosa El oligosacárido unido a la cadena polipeptídica después de haber sido procesado parcialmente por las Manosidasas y Transferasas si no hay adhesión de nuevos azucares termina resultando en una cadena con alto contenido de manosa. B. Las que poseen enlaces O-glucosídico: Involucra la cadena lateral hidroxilo de serina o treonina y un azúcar como la N-acetilgalactosamina: GalNAc- Ser (Tr). PROTEÍNAS CON ENLACES O- GLICOSÍDICOS: Participan glucosiltransferasas de glucoproteínas unidas a membrana y de acción secuencial. Cada transferasa es específica Las enzimas que participan están localizadas en el Golgi El dolicol-PP-oligosacárido no está involucrado Cada reacción de glicosilación involucra a un nucleótido unido a un azúcar La O-glucosilación se lleva a cabo de manera postraduccional en residuos de serina o treonina. C. Glucosilfosfatidilinositol ancladas (GPI-ancladas). PROTEINAS MITOCONDRIALES: Poseen un péptido señal en el extremo amino terminal rico en aminoácidos con carga positiva. Complejos proteicos actúan como canales para la traslocación de estas proteínas (hay gasto de ATP) Dentro de la mitocondria, una peptidasa hidroliza el péptido señal  Un segmento interno hidrofóbico dirige la reinserción de la cadena en la membrana interna Puede quedar como proteína integral o pasar al espacio intermembrana En su destino final, adquiere plegamiento, con participación de chaperonas de la familia Hsp 70 PROTEINAS LISOSOMALES: En el aparato de Golgi, se fosforilan en un resto de manosa en el carbono 6. La manosa 6 P es reconocida por un receptor de membrana y la proteína se fija a éste. Vesículas se desprenden del Golgi, se fusionan con la membrana y el contenido es liberado en el interior del lisosoma Utilizan un péptido señal, que es un segmento corto de aminoácidos con carga preferentemente positiva localizado en cualquier parte de la cadena La función de este pequeño péptido señal es facilitar el ingreso de la proteína a través de los poros de la membrana nuclear POLISOMAS: Los polisomas libres son estructuras citoplasmáticas compuestas por un ARNm sobre el cual se encuentran múltiples ribosomas traduciendo una proteína. Proteínas sintetizadas por polisomas libres: La función de los polisomas es sintetizar proteínas citoplasmáticas, algunas proteínas mitocondriales y algunas proteínas de membrana y liberarlas al citoplasma. Antibióticos y síntesis proteica: A. ESTREPTOMICINA: Actúa a nivel de la subunidad 30 S de los ribosomas bacterianos, produciendo alteraciones en el mecanismo que permite el encaje entre codón y anticodón. B. TETRACICLINAS: Se unen a la subunidad 30 S inhibiendo el acceso del aminoacil-ARNt al sitio aceptor del ribosoma. C. CLORANFENICOL: Se une a la subunidad 50 S e inhibe a la peptidil transferasa y aumenta la estabilidad de los polisomas. D. ERITROMICINA: Inhibe la síntesis proteica al unirse a la subunidad 50 S del ribosoma bacteriano, bloqueando la peptidil-transferasa. SEMANA 24 BASES QUIMICAS DE LA ENDOCRINOLOGIA: RECEPTORES Mensajeros químicos: Normalmente, cuando usted desea comunicarse con alguien, establece una relación: Emisor---Vía de comunicación---receptor Cuando las células se comunican entre ellas, también se establece una relación: Célula secretora----- Mensajero químico-----Células blanco receptora En el sistema nervioso, los mensajeros químicos se denominan neurotransmisores; en el endócrino, hormonas, y en sistema inmunitario, citoquinas. Existen distintos tipos de mensajeros químicos: A. Neurotransmisores y neuropéptidos B. Hormonas C. Citoquinas D. Eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos) E. Factores de crecimiento (polipéptidos que estimulan el crecimiento y la diferenciación celular) Sus acciones pueden ser: A. Endócrinas; B. Parácrinas; C. Autócrinas. RECEPTORES: Los receptores son macromoléculas cuya función es reconocer y fijar moléculas que provienen del exterior de la célula. Pueden estar situados en la membrana plasmática o en el interior de la célula. Naturaleza química: La mayoría son glucoproteínas. Algunos, poseen naturaleza gangliosídica (receptores para virus); Otros, son de naturaleza glicosamínglicana (moléculas de heparán sulfato) Características Específicos Saturables Reversibles Transducen señales Actúan en bajas concentraciones La molécula a la que se unen se la denomina Alta afinidad de unión ligando Mecanismo de acción: Por otro lado, el receptor tiene un segundo sitio de unión que interviene en la transmisión del mensaje; este segundo sitio puede interactuar con una proteína o bien, con el ADN. Clasificación 1. De Membrana Citoplasmática: Hormonas peptídicas, derivadas de aminoácidos y factores de crecimiento. Todos estos receptores generalmente están situados en la membrana y los ligandos que actúan sobre ellos son moléculas cargadas eléctricamente. Los mencionados anteriormente tiene carga negativa, por lo tanto, dificultan el pasaje de las hormonas a través de la membrana. 2. Citoplasmáticos: Hormonas córticoadrenales. HORMONAS LIPOSOLIBLES 3. Nucleares: Hormonas sexuales, hormona tiroidea, vitamina D. HORMONAS LIPOSOLUBLES Receptores de membrana Los receptores de membrana pueden fijar: o Hormonas peptídicas o que derivan de aminoácidos o Factores de crecimiento o Sustancias varias, como proteínas plasmáticas (LDL). Por su naturaleza, pueden ser: o Receptores heptahelicoidales (son los más comunes): Contienen 7 dominios transmembrana. o Receptores de canal iónico: la transducción de señales consiste en un cambio conformacional cuando se une un ligando, lo cual permite el flujo de iones por el canal. Ej.: el receptor de acetilcolina. o Receptores que son quinasas o se unen a éstas o las activan: El dominio quinasa intracelular del receptor se activa cuando el mensajero se une al dominio extracelular. La vía de transducción de señales se propaga en cascada a través de proteínas transductores que se unen al complejo mensajero-receptor activado. RECEPTORES HEPTAHELICOIDALES: Funcionan a través de proteína G heterotriméricas (subunidad alfa, beta y gamma). Ejemplo: receptor de glucagón (hormona polipeptídica). Estos se dividen en receptores de clase I y receptores de clase II: Receptores de clase I: Los receptores de membrana transmiten el mensaje hormonal a un sistema de proteínas de membrana que libera un segundo mensajero que provoca la activación de ciertas enzimas. Ejemplo DE CLASE I: Hormonas polipeptídicas como el GLUCAGÓN o derivadas de aminoácidos como la ADRENALINA, interactúan sobre un receptor de membrana plasmática. Este receptor esta generalmente ubicado en: o GLUCAGON: El hígado. o ADRENALINA: En el hígado y músculo esquelético. La subunidad alfa fija el GTP y activa una enzima de membrana que es la ADENILCICLASA. Mientras esto ocurre la subunidad alfa tiene actividad GTPasa. De tal manera que el GTP es hidrolizado y no se sigue perpetuando el estímulo hormonal, activada la ADENILCICLASA entonces produce la transformación del ATP en AMPc y este activa una proteína quinasa A INACTIVA A ACTIVA, que lleva al interior de la célula la orden hormonal. Todo este sistema está contrarregulado por una fosfodiesterasa que degrada el AMPc A 5 ́AMP (sustancia inactiva). - El AMPc como segundo mensajero: Es un nucleótido de base púrica que tiene dos enlaces químicos intermoleculares, el enlace beta n glucosídico que se establece entre la base púrica y la ribosa y la unión fosfodiéster que lo hace cíclico que se establece entre las posiciones 3 ́ y 5 ́ de la ribosa. Las tres funciones principales de la subunidad alfa de la proteína G: o FIJAR GTP o ACTIVAR LA ADENILCICLASA o ACCIÓN GTPasa La degradación del glucógeno se realiza a través de la activación de receptores beta- adrenérgicos, que corresponden a la familia de receptores heptahelicoidales que trabajan a través de segundos mensajeros, como el AMP cíclico generado dentro de la célula en respuesta a los mensajeros que se unen a los receptores. Continúan la transmisión intracelular del mensaje de la hormona, que es el “primer mensajero”. La subunidad A de la toxina colérica ADP-ribosila la subunidad alfa de la proteína G, bloqueando su actividad de GTPasa; esto provoca una estimulación permanente de la adenilciclasa, con mayor producción de AMPc; activación de la proteínquinasa A; fosforilación de la proteína CFTR; salida de cloruro de sodio hacia la luz intestinal y con él, el agua. Un segundo ejemplo de RECEPTOR DE CLASE 1: Lo constituye el receptor alfa adrenérgico para catecolaminas, ante la llegada de las catecolaminas la unión de estas a su receptor de membrana produce la ACTIVACIÓN de una enzima que es la FOSFOLIPASA C. Esta hidroliza al FOSFATIDINILOSITOL 4,5 DIFOSFATO, transformándolo en inositol 145 DIFOSFATO (IP3) y DAG. El IP3 provoca un aumento de la movilización del calcio intracelular que provoca la contracción del músculo liso vascular y la contracción del músculo liso genito urinario. El inositol trifosfato produce la liberación de calcio en la célula los principales reservorios son la mitocondria y el REL, ese calcio liberado será fijado por una calmodulina quinasa que realizara la activación de proteínas que llevarán el mensaje hormonal. Por otro lado, el DAG activará a una proteína quinasa C que intervendrá en la fosforilación de proteínas y su activación correspondiente. El efecto alfa 1 adrenérgico de las catecolaminas circulantes (adrenalina, noradrenalina) está mediado por la activación de una fosfolipasa C, que toma al fosfatidilinositol 4,5 difosfato (segundo mensajero) y lo transforma en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol que aumentan la movilización de CALCIO intracelular. Los RECEPTORES DE GUANILCICLASA unidos a la membrana plasmática transforman el GTP en GMPc, que es análogo al AMPc. Estos receptores sintetizan el GMPc como segundo mensajero directamente en respuesta a la unión al ligando. Ese ligando puede ser el Óxido nítrico o el FNA, estos se unen al receptor de guanilciclasa, se produce GMPc y promueve vasodilatación (tratamiento a pacientes con angina de pecho, insuficiencia cardiaca o bien disfunción eréctil) Receptores de clase II: También están situados en la membrana plasmática. A diferencia de los de clase 1 no generan segundos mensajeros. Ejemplo: receptor para LDL. El mejor ejemplo es el receptor para LDL, este receptor situado en la membrana citoplasmática forma un complejo con una proteína CLATRINA, esta proteína es la responsable del reconocimiento y fijación del ligando. Formado este complejo se forma sobre sí mismo formando un ENDOSOMA (endocitosis), este endosoma a medida que desciende hacia las porciones basales de la célula va permitiendo la separación del receptor del ligando para formar lo que se llama el compartimiento de separación receptor ligando o CURL que posteriormente dará origen de alguna manera al reciclaje del receptor para LDL y por el otro lado completar la degradación del ligando a nivel lisosomal tras haber cumplido su función específica. Receptores y enfermedad: Hay 3 mecanismos por los cuales los receptores pueden afectarse: 1. Anticuerpos contra un receptor específico (Miastenia Gravis; Acantosis nigricans con resistencia a la insulina). 2. Deficiencia de receptores (Hiperlipemia IIa). 3. Disminución de fijación de la hormona por regulación anormal de receptores (obesidad, diabetes mellitus tipo 2). RECEPTORES DE CANAL IONICO: La transducción de señales consiste en un cambio conformacional cuando un ligando se une, lo cual permite el flujo de iones por el canal. Receptor nicotínico de acetilcolina: Los receptores de acetilcolina de tipo nicotínico (nAChR) pertenecen a la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando, estos se componen de hetero oligómeros de cinco subunidades cada uno con cuatro dominios transmembrana. En la unión neuromuscular, los receptores nicotínicos de la acetilcolina están constituidos por cinco subunidades: dos α1, una β1, una γ y una δ. Cada una de estas subunidades tiene una estructura con cuatro dominios transmembrana. Los sitios de unión a la acetilcolina se encuentran en las subunidades α, que tienen dos residuos de cisteína próximos entre sí y necesarios para el reconocimiento del agonista. El resto de las subunidades carece de estos elementos y no puede unir la acetilcolina. Cuando la acetilcolina se fija a su sitio, el canal se abre para los CATIONES: si bien el sodio entra en mayor cantidad no es específico para él. También, pasa también calcio y amonio. El potasio puede salir, pero su diferencia de concentración a uno y otro lado de la membrana no permite una variación importante. El resultado de estos movimientos iónicos es la despolarización de la membrana sináptica.  Estructura del receptor: cada receptor está compuesto por 5 subunidades, cada subunidad tiene 4 regiones lipoidales transmembranales. Cuando las moléculas de acetilcolina se unen a la subunidades alfa, estas subunidades cambias su conformación para que el conducto en el centro del receptor se abra lo que posibilita que los iones K salgan y los iones Na entren. Miastenia gravis: es una enfermedad inmunológica neuromuscular debido a la existencia de autoanticuerpos dirigidos contra el receptor nicotínico de la acetilcolina. El receptor no puede ser activado por la acetilcolina y la célula muscular no es capaz de reaccionar al neurotransmisor. Por lo que no ocurre la contracción muscular. Esto se traduce por debilidad muscular (miastenia). Una de las manifestaciones clínicas más comunes es la caída de los párpados al finalizar el día RECEPTORES UNIDOS A TIROSINA QUINASA: Receptor de insulina: Es una glucoproteína integral con actividad tirosina quinasa. El receptor de insulina, a través de su subunidad beta, actúa como tirosina o serina quinasa fosforilando y activando proteínas intracelulares que determinan la acción hormonal (promover el ingreso de glucosa, favorecer la glucólisis, la gluconeogénesis, la lipogénesis e inhibir la gluconeogénesis, etc.). El receptor en si es una glucoproteína integral de la membrana que esta formado por 4 cadenas polipeptídica. - 2 subunidades alfa: encargadas de reconocer y fijar las moléculas de insulina - 2 subunidades beta: tienen la capacidad de auto fosforilarse y tener actividad de tirosina quinasa activando señales de transmembrana intracelulares. Como consecuencia de ellas se producirán los efectos metabólicos de la insulina como la activación d ellos GLUT 4 que permiten la entrada de la glucosa en el musculo esquelético y tejido adiposo. El receptor de insulina es un ejemplo de receptor capaz de activar no sólo la vía de las MAP quinasas sino también la vía de las proteínas quinasas B (PK B o Akt). La subunidad ALFA es la encargada de reconocer y fijar a la insulina. Inmediatamente el cambio conformacional se transmite hacia la subunidad BETA la cual se auto fosforila y genera la activación de proteínas sensibles a la insulina y la activación de sus proteínas que tienen la función de activar al gen de la proteína RAS que a su vez va a activar a una quinasa del map. Las proteínas sensibles a la insulina van a terminar activando una quinasa de fosfatidil inositol trifosfato que va a permitir por ejemplo la activación de GLUT-4 Una falla en la activación de las subunidades beta, que poseen actividad de tirosina quinasa, lleva a una alteración de la transducción del mensaje químico, y esto genera una situación metabólica conocida como insulinorresistencia, que se observa sobre todo en pacientes obesos con o sin diabetes mellitus y que presentan hiperpigmentación de pliegues como consecuencia del hiperinsulinismo (acantosis nigricans). En esta patología falla fundamentalmente la activación de la vía de las MAP quinasas y por ejemplo, no se activan los GLUT 4 en adiposo y músculo esquelético. Receptores de tirosina quinasa: 1. Unión al ligando y dimerización de los receptores 2. Autofosforilación 3. Unión de GRB2 y SOS 4. SOS es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (FIG) que se une a Ras, una proteína G monomérica anclada a la membrana plasmática 5. FIG activa el intercambio de GTP por GDP unida en ras. 6. Ras activada que contiene GTP se une a la enzima objetivo Raf, con lo cual activa ésta y una serie de quinasas corriente abajo, las MAP quinasas (Proteína quinasa activada por mitógenos) Superfamilia de receptores: La mayor parte de los receptores intracelulares corresponden a factores de transcripción específicos de gen, que son proteínas que se unen al ADN y regulan la transcripción de ciertos genes. Las hormonas lipofílicas utilizan factores de transcripción intracelulares específicos de gen, que incluyen: hormonas esteroides (como estrógenos y cortisol); hormonas tiroideas, ácido retinoico (forma activa de la vitamina A) y vitamina D. Los receptores intracelulares para estas hormonas son estructuralmente similares y se los denomina superfamilia de receptores de hormonas esteroides/hormonas tiroideas. Si bien la mayoría de los receptores se encuentran en el núcleo, el receptor para glucocorticoides se encuentra en el citoplasma asociado a proteínas de choque térmico (HSP), de las cuales se disocia. Receptores citoplasmáticos (glucocorticoides): La horma lipofílica atraviesa libremente la membrana citoplasmática y como el caso de los glucocorticoides encuentran a su receptor a nivel del citoplasma. Una vez que se produce la unión del receptor con el ligando, se produce la liberación de la proteína de choque térmico y entonces el complejo receptor-ligando va al núcleo, al ADN a un sitio especifico conocido como “elemento sensible a la hormona” que va a regular la transcripción del gen y de esa manera asegurar la producción de un ARNm que llevara a la síntesis de proteínas codificadas por dicho mensaje. Receptores nucleares: Otras hormonas como la aldosterona, las hormonas tiroideas, Vit A y Vit D tienen su receptor a nivel del núcleo. Se produce la entrada de la hormona lipofílica que atraviesa la membrana nuclear y se forma el complejo receptor ligando a cuál va a interactuar sobre la región del gen conocida como “elemento sensible a la hormona” que será la determinante para transcripción del ADN para la formación del ARNm el cual finalmente codificará la síntesis de nuevas proteínas. TODOS ESTOS RECEPTORES INTRACELULARES ACTUAN COMO VERDADEROS FACTORES DE TRANSCRIPCION FAVORECIENDO LA FORMACION DE DISTINTOS ARNm VASOCONSTRICCION: Los vasos sanguíneos presentes en la piel tienen receptores ALFA 1 adrenérgicos, cuya estimulación produce vasoconstricción (estrés, frio, shock). La estimulación de estos produce activación de la enzima Fosfolipasa C, que hidroliza el fosfatidilinositol 4, 5 di fosfato liberando inositol 1, 4, 5 trifosfato 8IP3) y diacilglicerol (DAG). El IP3 tiene un sitio de unión en el retículo sarcoplásmico y en e retículo endoplásmico que estimula la liberación de calcio. El calcio activa a las enzimas que tiene la subunidad calcio-calmodulina, incluida la proteína quinasa. El DAG, que se mantiene en la membrana, activa a la proteína quinasa, que luego propaga la respuesta al fosforilar a las proteínas blanco, que provoca movilización del calcio intracelular y la correspondiente vasoconstricción. SEMANA 25 ESTRÉS El estrés involucra todas aquellas reacciones del organismo ante situaciones que tiendan a perturbar el equilibrio fisiológico normal u homeostasis. El estrés no solamente puede ser desencadenado por exceso de actividad laboral o una situación emocional. Desde el punto de vista médico también puede implicar: Una infección. Un traumatismo. Una cirugía. Una enfermedad sorpresiva. Una quemadura severa. Situación de estrés--Hipotalamo--CRF--hipófisis--PROPIOMELANOCORTINA Productos de clivaje de la POMC Acciones metabólicas de la ACTH La ACTH secreta glucocorticoides lo que produce un aumento del catabolismo proteico muscular e inducción de enzimas claves----AUMENTO DE LA GLUCONEOGENESIS Los glucocorticoides a través de la metil-transferasa de la medula adrenal AUMENTAN la liberación de adrenalina----Efecto alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2, beta 3. Etapas en la liberación de adrenalina El aminoácido tirosina, por una tirosina hidroxilasa genera di-oxi-fenilalanina (DOPA). La DOPA por la DOPA-decarboxilasa genera DOPAMINA, la DOPAMINA por una dopamina-beta-hidroxilasa genera NORADRENALINA, y finalmente esta noradrenalina en la medula suprarrenal por una metil- transferasa generara ADRENALINA. Las catecolaminas pueden interactuar sobre receptores postsinápticos ya sean de tipo ALFA o BETA, con distintos efectos metabolismos. Parte de dichas catecolaminas pueden ser recaptadas, tener acción sobre receptores alfa-2-presinapticos, pueden ser degradadas por dos enzimas “monoaminooxidasa” y “catecoloximetiltransferasa”. Como producto de la acción de ambas enzimas se genera el ácido VAINILLIN MANDELICO que es el principal metabolito urinario de las catecolaminas en el ser humano. En qué consiste el efecto ALFA 1 de la adrenalina Adrenalina---actúa sobre alfa 1 (vasoconstricción periférica y de los músculos genito-urinarios) causando palidez, sudoración fría y deseo de orinar El efecto alfa 1 adrenérgico está mediado por la activación de una proteína quinasa C, que toma al fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato y lo transforma en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol que aumentan la movilización de CALCIO intracelular. BETA 1---aumenta las 4 propiedades de las fibras miocárdicas---aumenta la glucogenólisis hepática y muscular BETA 2---produce broncodilatación y aumenta la entrada de oxigeno para abastecer las necesidades metabólicas tisulares BETA 3---aumenta la lipolisis adiposa, la beta oxidación y el aporte de acetil coa al CdK Efecto adrenérgico Qué ocurre cuando dejó de actuar la adrenalina: Una vez que la adrenalina cumplió su acción es recaptada o bien, metabolizada por dos enzimas: una llamada COMT (catecoloximetiltransferasa) y la otra, MAO (monoaminooxidasa), las que forman el metabolito final: ACIDO VAINILLÍN MANDÉLICO, que se eliminará por la orina ¿Qué otros cambios metabólicos ocurren en el estrés? Si Krebs aumenta su actividad: A. La lanzadera del citrato disminuye B. Disminuye la síntesis de ácidos grasos C. El aumento de la relación ATP/ADP, NADH2/NAD, inhibe la glucolisis ESTEROIDES Estructura química de esteroides: Son lípidos con núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno. Su principal referente es el colesterol COLESTEROL Estructura química del colesterol: 27 carbonos, un OH en el carbono 3, una doble ligadura entre los carbonos 5 y 6, sustituyentes laterales en los carbonos 10 y 18 y una cadena lateral en carbono 17.  Función estructural como componente de membrana, lipoproteínas plasmáticas y una función metabólica como precursor de la síntesis de ácidos y sales biliares, hormonas esteroideas y Vit d3 Colesterol: fuentes biológicas. Los alimentos con más de 200 mg% incluyen: Vísceras, Embutidos, Fiambres, Yema de huevo, Manteca, Quesos de alta maduración Eje hipotálamo-hipofiso-suprarrenal: El hipotálamo produce CRF, el cual actuando sobre la hipófisis promueve la liberación de ACTH que ejerce su acción sobre las glándulas suprarrenales. Estas últimas van a liberar corticoides. Secreción de Proopiomelanocortina: Ante una situación de estrés el hipotálamo responde con una mayor liberación de CRF que actuando sobre la adenohipófisis va a liberar proopiomelanocortina. Proopiomelanocortina La proopiomelanocortina es una hormona precursora de la ACTH de la BETA-lipotrópina las cuales pueden clivar y generar la ALFA-melanocito estimulante y ACTH, la BETA- msh y la BETA-endorfina. Acciones fisiológicas de la ACTH: ACTH: Aumento en la secreción de glucocorticoides por parte de la corteza adrenal. Estas hormonas aumentan el catabolismo proteico muscular e inducen las enzimas claves de la gluconeogénesis. Por lo tanto, se produce un aumento de la glucemia en situaciones de ayuno intermedio o prolongado ALFA 1: vasoconstricción y la contracción del musculo liso genitourinario. ALFA 2: inhibición de la secreción de insulina BETA 1: aumento de las propiedades de la fibra miocárdica y glucogenólisis BETA 2: broncodilatación y vasodilatación BETA 3: efecto lipolítico Superfamilia de receptores de esteroides Receptores citoplasmáticos: Las hormonas esteroides que tienen en común el ciclo pentanoperhidrofenantreno son hormonas que pueden difundir fácilmente a través de las membranas biológicas, no necesitando de mecanismos de segundos mensajeros. Atravesada la membrana plasmática la hormona esteroidea puede tener su receptor a nivel citoplasmático o nuclear. Independientemente de ello si el receptor se encuentra en el citoplasma el complejo hormona- receptor viaja al núcleo y se une a la región del ADN conocida como “elemento sensible a la hormona”. Esta región está en franco contacto con el gen promotor que es el que inicia la transcripción del ARNm que es el que posteriormente llevara a las proteínas codificadas por dicho gen. Este mecanismo es utilizado por los glucocorticoides y mineralocorticoides. Superfamilia de receptores de esteroides Receptores intranucleares: En el caso de hormonas como los esteroides sexuales y la Vit d3 el receptor para la hormona se encuentra en el núcleo. La hormona atraviesa la membrana plasmática, llega a través del citoplasma, atraviesa la membrana núcleo- plasmática y se une a su receptor en el núcleo. La unión se establece en un sitio conocido como “elemento sensible a la hormona”. Este activa al gen promotor el cual produce un ARNm el cual en el citoplasma codificara la síntesis de las distintas proteínas inducidas por estas hormonas. Biosíntesis de hormonas córticoadrenales: El primer paso en la biosíntesis de hormonas esteroides es el transporte del colesterol a la mitocondria, mediado primeramente por la proteína StAR. Los mecanismos generales de formación de hormonas córticoadrenales implican procesos de: A. Hidroxilación (con participación del citocromo P 450) B. Deshidrogenación (NAD dependiente) C. Isomerización (cambio de posición de la doble ligadura) D. Acortamiento oxidativo de la cadena lateral (catalizada por desmolasas) Biosíntesis de hormonas córticoadrenales: Biosíntesis de glucocorticoides: El colesterol se hidroxila dentro de la glándula suprarrenal a nivel mitocondrial en los carbonos 20 y 22 gracias a la presencia del citocromo p450. El compuesto formado 20,22- hidroxicolesterol, por acción de una liasa 20,22-desmolasa pierde una cadena lateral de 6C y forma la PREGNENOLONA. Una vez que la PREGNENOLONA está en el citoplasma pasa al REL donde por acción de una DELTA-4-isomerasa, cambia la posición de la doble ligadura que originalmente estaba en los carbonos 5 y 6, ahora pasa a la posiciones 4 y 5 Por otro lado, gracias a la 3-BETA-ol-dhg el oxidrilo del carbono 3 se transforma en una cetona. Esta molécula de 21 C recibirá ahora el nombre de PROGESTERONA. Esta se hidroxilará en el carbono 17 para formar la 17- ALFA-progesterona y posteriormente por una 21-hidroxilasa se va a transformar en 11-desoxicortisol. El 11-desoxicortisol ingresa nuevamente a la mitocondria y por una 11-beta- hidroxilasa se transforma finalmente a CORTISOL. Este puede transformarse por una deshidrogenasa en CORTISONA, SIEMPRE A NIVEL MITOCONDRIAL. En la deficiencia de 21 hidroxilasa los pacientes afectados