TÈCNIQUES BASADES EN REACCIONS AG-AC PRIMÀRIES PDF

UNITAT 3: TÈCNIQUES BASADAS EN REACCIONS AG-AC PRIMÀRIES Tècniques d’Immunodiagnòstic IES ENRIQUE TIERNO GALVÁN CURS 2024-2025 ...

UNITAT 3: TÈCNIQUES BASADAS EN REACCIONS AG-AC PRIMÀRIES Tècniques d’Immunodiagnòstic IES ENRIQUE TIERNO GALVÁN CURS 2024-2025  Índex 1. Introducció 2. Enzimoimmunoassajos (EIA) 3. Radioimmunoassajos (RIA) 4. Fluoroimmunoassajos (FIA) 5. Immunoassajos quimioluminiscents (CLIA) 6. Immunocromatografia 7. Immunofluorescència 8. Immunotransferència Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció DETECCIÓN DIRECTA Les tècniques basades en reaccions d’Ag-Ac primàries es sustenten en la detecció directa de la unió de l’antigen amb l’anticòs mitjançant l’ús d’un marcador que revela la formació del complex Ag-Ac, que no seria detectable por si mateix. Aquesta detecció directa del complex Ag-Ac format és el fonament dels diferents immunoassajos o immunoanàlisis que estudiarem a continuació, i el que els diferencia dels basats en reaccions d’Ag-Ac secundàries. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàries vs secundàries * Recordeu la UD2 Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.1. Classificació dels Immunoanàlisis Un immunoassaig és una prova que utilitza la constitució de complexos antigen-anticòs per a generar un resultat mesurable. Depende de si es necesario retirar las moléculas no implicadas , de la disponibilidad del analito a analizar y del tipo de marcador utilizado. Els immunoanàlisis es poden classificar atenent a diferents factors (3): 1. En funció de si es necessita retirar o no les molècules que no han format l’immunocomplex d’interés. És a dir, si per a la correcta valoració dels resultats cal separar el que s’ha unit del que no s’ha unit. Dos tipus → Homogenis o heterogenis. 2. En funció de la disponibilitat de l’anàlit a determinar (competència o no en la formació dels immunocomplexos) → Competitius i no competitius. 3. En funció del tipus de marcador utilitzat técnica o sustancia empleada para identificar o medir el inmunocomplejo, como fluorescencia, enzimas, radioisótopos, etc. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.1.1. Segons la necessitat de separació de la fracció lliure i la lligada Els immunoanàlisis es poden classificar en: - Homogenis → Quan el compost marcat es comporta de forma diferent segons estiga unit o no No necesitan separar las moléculas unidas al seu lligand. Per aquest motiu no és necessària la separació de les molèculas lligadas i les no de las no unidas. lligades, ja que no es va a produir un fals senyal. Es tracta d’una tècnica més senzilla i ràpida, i s’utilitza principalment per a molècules de baix pes molecular. (Ex. Detecció de drogues) - Heterogenis → El compost marcat genera un senyal de forma pareguda estiga unit o no al lligand. Per la qual cosa és necessària la retirada de les molècules no unides per tal de que no Sí requieren esa separación. inferisquen o destorben en l’anàlisi dels resultats. Són les tècniques més utilitzades, per presentar una major sensibilitat i especificitat, però requereix d'un major processat i temps. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Homogenis vs Heterogenis Homogenis → Com que l’analit marcat actua diferent quan Heterogenis → Com que l’analit marcat actua de igual està formant l’immunocomplex que quan no ho fa, no cal manera quan forma els immunocomplexos que quan no ho separar les molècules unides de les que no s’han unit. (En fa, necessitem separar les molècules unides de les que no aquest cas només emet el senyal quan forma el complex Ag-Ac) s’han unit. (En aquest exemple emet senyal sempre) Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Principals mètodes per a la separació dels immunocomplexos marcats i les molècules no unides - Adsorció → S’utilitza carbó actiu, dextrà o resines. S’uneixen a la fase lliure i sedimenta després de la centrifugació. - Precipitació química → Es pot emprar per exemple etanol que modifica la solubilitat de les proteïnes provocant la seua precipitació, per la qual cosa precipiten els compostos lligats i es trobarien en el sediment després de la centrifugació. Se puede usar etanol para precipitar proteínas modificando su solubilidad, dejando los compuestos ligados en el sedimento tras centrifugar. - Precipitació immunològica → S'utilitza un segon Ac contra el Ac primari, que aconsegueix que precipite tot el complex, pel que es pot recollir el sediment després de la centrifugació. - Fase sòlida → S’immobilitza un Ac o un Ag en un suport sòlid, como una paret d’un tub o una placa. La separació s’aconsegueix per rentat-aspiració del medi d’incubació. És el mètode més utilitzat, per ser el més senzill, ràpid i amb major capacitat d’automatitzar-se. limpieza-aspiración Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.1.2. Segons la disponibilidad del substrat o l’anàlit Poden ser de dos tipus: - Competitiu → Reactiu limitant - No competitiu → Excés de reactiu COMPETITIVO: Varias moléculas compiten por unirse al mismo sitio de unión. AG + AG marcado + AC fijado NO COMPETITIVO: No hay competencia; cada molécula tiene su sitio de unión. AG fijado + AC marcado + MP Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Competitius Per a determinar una quantitat d’Ag (o Ac) s’afegeix l’Ac (o Ag) corresponent en una quantitat limitada, i una quantitat d’Ag marcat (Ag*). L’Ag present en la mostra i l’Ag* competiran pel lloc d’unió amb l’Ac. Una major concentració d’Ag* unit amb l’anticòs indica una menor concentració d’Ag en la mostra. La concentració de l’anàlit en estudi està inversament relacionada amb la de l’anàlit marcat. En termes generals, en els immunoassajos competitius la intensitat del senyal produïda en l’anàlisi disminueix quant més Ag (problema) hi ha present a la mostra. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció No competitius Per a determinar un Ag en una mostra s’afegeix un excés d’Ac marcat (Ac*). La quantitat d’Ac* que forma immunocomplexos (Ac*-Ag) és directament proporcional a la concentració d’Ag. En termes generals, en els immunoassajos no competitius la intensitat del senyal produïda en l’anàlisi augmenta quant més Ag (problema) hi ha present a la mostra. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.1.3. Segons el tipus de marcador El marcador pot incorporar-se tant a l’anticòs com a l’antigen. En funció del tipus de substància utilitzada com a marcador distingim diferents tipus d’immunoassajos: - Enzimoimmunoassaig (EIA) → El marcador és el producte generat mitjançant una reacció enzimàtica. - Fluoroinmmunoassaig (FIA) → El marcador és un fluorocrom. - Radioimmunoassaig (RIA) → El marcador és un radioisòtop. - Immunoassaig quimioluminiscent (CLIA) → El marcador és la llum produïda per una reacció química. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Característiques dels marcadors En tots els immunoassajos es necessita de l’ús d’un marcador per a poder mesurar la quantitat d’antigen o anticòs present en la mostra. Aquesta molècula reacciona durant la tècnica produint un senyal que permet mesurar la concentració de l’anàlit. Els marcadors han de ser: - Substàncies que es poden acoblar a l’Ag o a l’Ac sense que s’altere la capacitat d’aquests per a unir-se entre ells. Sustancias que se pueden unir al Ag o Ac sin alterar - Detectables i mesurables amb facilitat. su capacidad de unión y que son fáciles de detectar y medir. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Diferents tècniques desenvolupades en els immunoassajos Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció FORMATO NORMALIZADO=PROTOCOLOS 1.2. Presentació dels resultats CURVA PATRÓN=CALIBRADORES Els resultats que s’obtenen de la realització dels immunoassajos s’aconsegueixen por dues vies: - Format normalitzat → Assajos protocolitzats on estan clarament establits els criteris d’obtenció i interpretació dels resultats. - Corba patró → S’elabora mitjançant calibradors de valors coneguts (es coneix la seua concentració) que estableixen la relació entre la quantitat del senyal produïda en l'assaig i la concentració de l’anàlit. D’aquesta forma podem elaborar una corba patró i extrapolar els resultats obtinguts per a conèixer amb quin valor es relaciona el senyal generat en l’anàlisi. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3. Limitacions dels immunoanàlisis Els immunoanàlisis es veuen afectats por una sèrie de limitacions pròpies de les unions Ag-Ac que han de tindre’s en consideració a l’hora de dissenyar i valorar les proves. 1. Els immunoassajos presenten diferents graus d’exactitud, precisió, especificitat i sensibilitat. Hem d’intentar dissenyar immunoanàlisis amb el major força d’aquests paràmetres. EPES 2. En molts del assajos es necessita la utilització d’un calibrador 3. L’efecte matriu 4. L’especificitat dels anticossos 5. L’efecte prozona o ganxo. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3.1. Exactitud, precisió, especificitat i sensibilitat - Exactitud → Capacitat de mesurar la concentració correcta (real) de l’anàlit en una mostra. - Precisió → En els immunoassajos es relaciona amb la reproductibilitat dels resultats. - Sensibilitat → Capacitat d’excloure falsos negatius. - Especificitat → Capacitat d’excloure falsos positius. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3.2. Utilització del calibrador Ja que en molts anàlisis es necessita una corba de calibració per a una correcta interpretació dels resultats obtinguts, és necessari un control minuciós dels calibradors emprats, així com del compliment del protocol establert per al seu correcte ús. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3.3. Efecte matriu PROTEINAS COMPLEMENTO, PROTEINAS ENDOGENAS, AUTOAC, AC HETEROFILOS Es tracta de la alteració dels resultats degut als diferents components que formen part de la mostra. Podem parlar de: - Proteïnes del complement → Poden bloquejar el lloc d’unió als anticossos. - Proteïna d’unió endògenes → Poden alterar la mesura d’algunes determinacions (Albúmina). - Autoanticossos → Si existeix presència d’autoanticossos no coneguda que puga interferir en els resultats. - Anticossos heteròfils → Anticossos anti-IgG d’altres animales emprats per a l’obtenció dels reactius de l’immunoanàlisi. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3.4. Especificitat dels anticossos Els assajos immunològics seran més o menys específics i sensibles en funció de l’afinitat que tinguen els anticossos emprats per a la unió amb l’antigen, o per altres anticossos utilitzats en l’anàlisi. Es poden produir també reaccions creuades amb components de la mostra. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció 1.3.5. Efecte prozona o ganxo *Recordeu de l’UD2 Ac Ag Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  1. Introducció Activitats 1. Busca els diferents tipus d’immunoassajos que existeixen en funció del marcador emprat. 2. Selecciona 2 tipus diferents d’immunoassajos (e indica el nom concret si el tinguera) combinant el tipus de marcador que utilitza, i indicant si és homogeni o heterogeni, i si és competitiu o no competitiu. 3. Explica el funcionament dels immunoassajos seleccionats, justificant el perquè es cataloga dins d’un tipus o un altre dels tres paràmetres de l’exercici 2. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos (EIA) Es tracta d’immunoassajos en els quals el marcador utilitzat per a revelar la formació del complex Ag-Ac és un enzim. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos En els enzimoimmunoanàlisis es poden utilitzar tant anticossos com antígens marcats (als quals se’ls ha unit prèviament un enzim), depenent de quina siga la molècula problema que volem analitzar i depenent del tipus de prova escollida. La part diferencial dels immunoassajos respecte a altres immunoanàlisis és que quan s’han format les unions Ag-Ac, s’ha de realitzar altre pas que consisteix en l'addició del substrat específic que és catalitzat per l’enzim emprat, i el producte del qual és un compost acolorit que podrà ser mesurat, mitjançant un espectrofotòmetre, i que, després de l’elaboració de la corba patró, ens permetrà calcular la concentració de la molècula analitzada. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Tipus d’EIAs Hi ha molts tipus de EIA, però la major part d’ells es tracten d’assajos per immunoadsorció lligat a enzims, els coneguts com a ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) per les seues sigles en anglés. Són immunoanàlisis heterogenis on un dels components està insolubilitzat sobre un suport sòlid (immunoadsorbent) i altre és el que està marcat. Quan reaccionen entre ells es genera un complex Ag-Ac que quedarà immobilitzat. Les tècniques ELISA es poden diferenciar en diferents tipus atenent a la diversitat de paràmetres que poden variar en la prova. A més, dins dels enzimoimmunoassajos (EIAs) trobem també altres tipus a banda dels ELISA, com per exemple pot ser la tècnica d’enzimoimmunoanàlisi multiplicat (EMIT), que es tracta d’un immunoassaig de tipus homogeni. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1. ELISA Els diferents tipus d’assajos ELISA tenen particularitats específiques, però es poden establir unes característiques generals que són comunes a tots ells. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.1. Característiques generals dels ELISA - Les fases dels assajos → Protocol mínim - El suport o matriu emprades - Els enzims utilitzats - El sistema de lectura dels resultats - Principals avantatges i inconvenients Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Fases generals dels assajos ELISA (protocol mínim) 1. Fixació d’un dels components en el suport sòlid (entapissat). Procediments realitzats generalment 2. Conjugació de l’anticòs o de l’antigen amb l’enzim. (Preparació de la molècula marcada) prèviament 3. Incubació del reactiu fixat en el suport sòlid amb la mostra a analitzar. 4. Formació dels immunocomplexos. 5. Rentat per a eliminar els elements no units (anàlisi heterogeni). [Si un dels components (Ag o Ac) està conjugat amb el marcador (enzim), es procedeix a aquest pas 6. Addició del substrat de l’enzim. directament, però si no, s’ha d’afegir el rectiu conjugat amb el marcador (Ex. anticòs secundari) i fer el posterior rentat abans d’afegir el substrat] 7. Detenció de la reacció enzimàtica i lectura del senyal (Determinació de la intensitat) 8. Establiment de la concentració de l’anàlit en base a la corba patró. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Suport emprat →Microplaca S’utilitza una microplaca de poliestiré com a suport (sòlid) immunoadsorbent → El que permet la captura i retenció d’antígens o anticossos sobre la superfície sòlida. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Enzims utilitzats Els enzims emprats en els EIA han de complir Els principal enzims emprats són: una sèrie de condicions: - Fosfatasa alcalina - Ser solubles - Peroxidasa de rave - Tindre una elevada activitat específica - Glucosa 6-fosfat deshidrogenasa - Ser estables en les condicions de la prova - β-galactosidasa - Poder-se mesurar de forma senzilla i amb certa rapidesa - No estar present de forma natural en els líquids biològics a analitzar Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Enzims utilitzats - Substrats cromogènics Unidas a un sustrato dan el color Els substrats cromogènics són compostos incolors que després de l’acció enzimàtica es transformen en un producte acolorit. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Sistemes d’amplificació del senyal - Complex (Estrept)Avidina-biotina peroxidasa El complex avidina-biotina es forma entre la proteïna avidina (o estreptavidina) i la vitamina biotina. Aquest complex s'associa amb enzims, com pot ser la peroxidasa de rave, per a generar el senyal detectable. Al generar més llocs d’unió per a l’enzim, s’aconsegueix una major intensitat del senyal acolorit que els enzims conjugats de forma individual a un Ac (o Ag), per la qual cosa augmenta la sensibilitat de la tècnica. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Lectura dels ELISA La lectura dels resultats pot ser valorada tant visual com colorimètricament. La medició mitjançant l’espectrofotòmetre ofereix uns valors numèrics d’Absorbància - Densitat òptica (OD) que s’obtindran al mesurar a una longitud d’onda determinada. Aquestes lectures es poden automatitzar, la qual cosa és una de les grans avantatges de la tècnica ELISA. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Avantatges i inconvenients dels ELISA · Avantatges - Tenen una alta sensibilitat i especificitat - És quantitativa - Relativament econòmica - Es poden processar gran nombre de mostres en un assaig - Els reactius tenen una gran estabilitat · Inconvenients - Dificultats en el diagnòstic d’infeccions actives - Dificultat de detecció d’alguns antígens o anticossos - Es té que conèixer prèviament l’antigen o l’anticòs a estudiar Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.2. Tipus d’ELISA NO COMPETITIU COMPETITIU · ELISA DIRECTE → Detecta Ag Ag · ELISA INDIRECTE → Detecta Ac · ELISA de competició per a la detecció de: · ELISA SÀNDWITX Ac - DAS (Double Antibody Sandwich) → Detecta Ag - HADAS (Heterologic Assays Double Antibody Sandwich) → Detecta Ag Canvi de color indica un resultat → Canvi de color indica un resultat → POSITIU NEGATIU Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.2.1. ELISA Directe Es tracta d’un immunoanàlisi no competitivo per a la detecció d’antigen. Una volta preparat, és el més ràpid i simple dels ELISA. Un anticòs primari marcat amb un enzim s’uneix directament a l’antigen de d’interés estudiat. Avantatges - Ràpid: només s’utilitza un anticòs. - Elimina la reactivitat creuada entre anticossos Desavantatges - Inflexible i car: hi ha que marcar individualment l’anticòs primari i no es pot usar per a experiments múltiples. - El senyal s’amplifica menys. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.2.2. ELISA Indirecte Es tracta d’un immunoanàlisi no competitivo per a la detecció d’anticossos. És similar al directe, però es realitza en dos passos, i entren en joc dos anticossos, un primario, que serà l’anàlit a quantificar, i altre secundari, que és el que estarà conjugat amb un enzim. Avantatges - Alta sensibilitat: l’anticòs primari té varis epítops als quals poden unir-se nombrosos anticossos secundaris marcats, la qual cosa amplifica el senyal. - Flexible: es poden detectar diferents anticossos primaris amb un sol anticòs secundari marcat. - Hi ha moltes variacions d’anticossos secundaris marcats disponibles en el mercat. Desavantatges - Pot haver reactivitat creuada amb l’anticòs secundari. - Es necessiten fases d’incubació adicionals. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.2.3. ELISA Sàndwitx Es tracta d’un immunoanàlisi no competitivo per a la detecció d’antigen. Es sol emprar quan es necessita: analitzar mostres complexes. No és necessari purificar l’antigen abans d’usar aquest mètode. Avantatges - Major especificitat i gran sensibilitat: s’utilitzen dos anticossos per a capturar i detectar l’antigen d’interés, la qual cosa augmenta la seua especificitat. Al emprar dos anticossos, també augmenta la seua sensibilitat com ocorria en l’ELISA directe. - Flexibilitat: es pot gastar tant per a la detecció directa com per a la indirecta. Desavantatges - Es requereix un parell coincident: l’optimització de la combinació d’anticossos pot ser difícil. Cada anticòs té que reaccionar amb un epítop específic de la proteïna diana sense tindre una reacció creuada amb l’anticòs que l’acompanya. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos ELISA Sàndwitx DAS DAS → Double Antibody Sandwich Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos ELISA Sàndwitx HADAS HADAS → Heterologous Antiglobulin Double Antibody Sandwich Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.1.2.4. ELISA Competitiu o d’inhibició Es tracta d’un immunoanàlisi competitiu per a la detecció d’antigen o d’anticòs. S’utilitza generalment per a detectar i/o quantificar antígens presents en quantitats molt menudes en una mostra, o antigens molt menuts. Avantatges - Alta sensibilidad: es pot detectar antígens encara que es presenten en quantitats relativament baixes. - No és necessari processar la mostra. - Precisió, exactitud i reproductibilitat elevades. Desavantatges - Falsos positius: baixa especificitat. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos Resum Tipus d’ELISA Resum d’assajos tipus ELISA: https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 2.3. EMIT La tècnica d’immunoassaig enzimàtic multiplicat (EMIT) o immunoanàlisi mediat per enzims és un EIA de tipus homogeni i competitiu. - Si l’Ag marcat forma part de l’immunocomplex → L’enzim està inactiu i no hi ha canvi de color. - Si l’Ag marcat no forma part de l’immunocomplex → L’enzim està actiu i hi ha un canvi de color. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos (RIA) Els radioimmunoassajos (RIA) són immunoanàlisis que utilitzen isòtops radioactius com marcadors. Els isòtops utilitzats han de posseir una activitat específica elevada, una producció d’energia alta, una vida mitjana adequada per a l’anàlisi, ser de fàcil obtenció i que no interferisquen en la unió entre l’Ag-Ac. Els principals isòtops radioactius emprats en aquestes tècniques són: - ¹²⁵I y ¹³¹I - També ³H, ³²P y ¹⁴C Els antígens marcats es formen substituint alguns àtoms normals de l’antigen pels correspondents isòtops radioactius, o afegint radioisòtops estranys a la molècula. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos Detecció del senyal La radioactivitat que es despren de l’anàlisi es quantifica mitjançant detectors de radiació que poden ser de dos tipus: - Detectors d’ionització → Estan formats per una càmera que té un gas inert que s’ionitza en presència de radiació i es transforma en corrent elèctrica amb una intensitat depenent de l’energia de la radiació rebuda. - Detectors de centelleig → Formats per cristalls de iodur potàssic o iodur sòdic, que al passar la radiació per ells, desprenen llum. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos 3.1. Radioimmunoanalisi clàssic (RIA) Els principals tipus d’anàlisis RIA clàssics es basen en un tipus de prova heterogènia i d’inhibició competitiva, que permet detectar l’antigen present en la mostra. A l’antigen que hi ha present en la mostra (antigen fred o no marcat), i el qual volem determinar, se li afegeix una quantitat coneguda d’antigen marcat (antigen calent). La quantitat d’anticòs afegit a l’anàlisi és limitada i inferior a la quantitat d’antigen total, fred i calent, per la qual cosa els antígens competiran entre sí per la unió amb l’anticòs, i la mescla va a quedar saturada amb ell. Les concentracions de l’antigen marcat (calent) i de l’anticòs són constants, per tant l’única variació que pot patir la prova és la concentració d’antigen no marcat (fred). Quant major siga la quantitat d’antigen fred en la mostra, menor serà el senyal, ja que desplaçarà l’antigen calent en la unió amb l’anticòs, formant-se menys unions Ag*-Ac (antigen marcat-anticòs). Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos 3.1. Radioimmunoanalisi clàssic (RIA) El mètode de separació dels immunocomplexos formats i de la fracció lliure pot ser de dues formes principals: - Mitjançant la precipitació dels immunocomplexos (RIA en fase líquida) → Es mesura l’Ag* lliure - Mitjançant la fixació d’un dels elements a un suport sòlido → Es realitza a través de la fixació d’un Ac específic contra l’antigen de la mostra i el marcat. Es mesura l’Ag* lligat a l’Ac unit a la fase sòlida. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos 3.2. Anàlisi immunorradiomètric (IRMA) És una variació dels RIA clàssics en la que l’element marcat és l’anticòs, amb motiu de preservar l’estabilitat i l'eficàcia de l’antigen. És un tipus de prova heterogènia, que permet detectar l‘antigen present en la mostra. La regió marcada de l’anticòs es troba allunyada del lloc d’unió d’aquest amb l’antigen, per a evitar interferències. Existeixen dos tipus principals en els quals s’utilitza una fase sòlida per a la separació dels elements units dels lliures: - Competitiu o d’inhibició → L’element unit a la fase sòlida és l’antigen. AG-AC-AG - No competitiu o de tipus sàndwitx → L’element unit a la fase sòlida és un anticòs (no marcat). AC-AG-AC Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos IRMA Competitiu o d’inhibició IRMA no competitiu o de tipus sàndwitx Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos RIA (clàssic) vs IRMA Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  3. Radioimmunoassajos Avantatges i desavantatges dels Radioimmunoassajos Avantatges - Tècnica sensible i específica - Permet detectar molècules menudes (s’utilitza per exemple per a la detecció d’hormones) Desavantatges - Necessitat d’emprar equips especials - Ús d’isòtops radioactius que implica diferents perills per a els éssers vius, i el compliment de diferents normes d’utilització, conservació i rebuig. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  4. Fluoroimmunassajos (FIA) Es basen en la utilització de compostos fluorescentes per al marcatge o traçat dels immunocomplexos. Els fluorocroms han de tindre una fluorescència elevada, diferenciable de la del fons present en mostres biològiques. El senyal ha de ser detectat mitjançant un fluorímetre. Existeixen múltiples tècniques de tipus homogeni o heterogeni, així com competitives o no competitives, de entre les quals anem a destacar el FPIA i el MEIA. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  4. Fluoroimmunoassajos 4.1. Fluoroimmunoanàlisi de polarització de fluorescència (FPIA) Es tracta d’una tècnica homogènia de tipus competitiu. S’utilitza molt per a la quantificació d’anàlits en baixa concentració, como hormones, medicaments, drogues… Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  4. Fluoroimmunoassajos 4.1.1. Generació del senyal en FPIA Hi ha que tindre en compte algunes claus: - Fluorescència → La substància és capaç d’absorbir energia en forma de radiacions electromagnètiques més energètiques que les que després emitirá. - Fluoresceïna, marcador fluorescent que absorbeix energia de la llum a 490 nm i la allibera a 520 nm. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  4. Fluoroimmunoassajos 4.1.2. Lectura del senyal en FPIA - Fluorímetre → Aparell que serveix per a mesurar la intensitat de la fluorescència d’una substància que ha sigut prèviament exposada a una radiació d'excitació (llum). Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  2. Enzimoimmunoassajos 4.2. Immunoassaig microparticulat (MEIA) És una tècnica d’immunoassaig que utilitza 1. Les micropartícules recobertes amb anticossos l’aïllament de complexos Ag-Ac en una superfície anti-anàlit i la mostra s’incuben juntes per a sòlida de esferes menudes denominades formar la mescla de reacció. micropartícules. Generalment estes partícules són de làtex. 2. Es transfereix la mescla de reacció a la matriu de fibra de vidre. Barreja el enzimoimmunoassaig amb el fluoroimmunoassaig. 3. Es deixa que els anticossos anti-anàlit marcats Té un format tipus sàndwitx heterogeni no amb fosfatasa alcalina s’unisquen al complex de competitiu. S’utilitza una matriu de vidre com a micropartícules. mètode de separació de l’Ag lliure i l’unit. 4. S’afegeix el substrat fosfat 4-metil umbeliferona (MUP) a la mescla. Es mesura el producte fluorescent, metilumbeliferona (MU), derivat de la reacció enzimàtica. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  5. Immunoassajos quimioluminiscents (CLIA) Els immunoassajos quimioluminiscents (CLIA) són immunoanàlisis que utilitzen compostos químics que quan reaccionen entre si, produeixen luminiscència (llum). Es tracta de reaccions més sensibles que las colorimètriques, i són detectades mitjançant un espectrofotòmetre de quimioluminiscència. Els marcadors són compostos químics que emeten llum quan són oxidats per peròxids en presència de catalitzadors. Entre els principals trobem: Luminol, luciferina, éster d’acridinio i lucigenina. Existeixen gran varietat d’immunoassajos quimioluminiscentes, en las que les tècniques emprades poden ser molt paregudes a les vistes en els enzimoimmunoanàlisis ELISA, però on el marcador, en comptes de ser un enzim, és una molècula quimioluminiscent. A més, existeixen algunes variacions interessants, que no havíem vist anteriorment. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  5. Immunoassajos quimioluminiscents 5.1. Immunoassaig magnètic quimioluminiscent (CMIA) Es tracta d’un immunoanàlisi on s’utilitzen micropartícules magnètiques amb anticossos de captura en la seua superfície per a lligar l’antigen a determinar i els anticossos marcats per a el revelat de la reacció, tractant-se d’un assaig immunomètric no competitiu heterogeni. Es llegeix en un tub fotomultiplicador de quimioluminiscència. S’utilitza per exemple per a la detecció de factor reumatoide (FR) i proteïna C reactiva. També es poden recobrir les micropartícules magnètiques amb antigen, per a detectar anticòs de la mostra. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  6. Immunocromatografia La immunocromatografia és una tècnica senzilla i ràpida que s’utilitza per a la detecció de molèculas gràcies a la interacció Ag-Ac. Està basada en la migració per capil·laritat que fa una substància (la mostra) junt a uns anticossos específics marcats a través d’una membrana de nitrocel·lulosa, en la qual es troben fixats uns anticossos que atraparan l’anàlit d’interés si està present en la mostra, fent que s’acummule en una zona de la membrana i que podrà visualitzar-se gràcies a la presència d’estos anticossos específics marcats amb una molècula acolorida, que també s’unirà als anàlits d’estudi. ¡Recordeu! → La cromatografia és un procediment químic que permet la separació, identificació i quantificació dels components químics individuals de substàncies que formen part de mescles complexes. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  6. Immunocromatografia Es pot detectar tant Ag com Ac, sent el primer el més comú. Respecte al marcador utilitzat, es tracta principalment de nanopartícules d’oro, que presenta un color rosa, o tambi seleni, que presenta un color blau. Es poden distingir diferents zones en la tira: Sembra - Conjugat - Detecció - Control - Absorbent Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  6. Immunocromatografia - Zona de sembra → LLoc on es diposita la mostra. - Zona de conjugat o reacció → Lloc on es troben els Ac específics (en excés) que estan marcats amb la partícula acolorida, i els quals s’uniran a algun epítop de l’antigen, si està present en la mostra. - Zona de detecció → Zona que té unida a la membrana uns Ac també contra l’antigen que es vol estudiar (generalment contra altres epitops), i als quals s’uniran els conjugats formats pel antigen i el anticòs marcat. - Zona control → Zona que conté Ac contra l’Ac marcat, o un antigen al qual s’uneix l’Ac, i en el que s’acummularà el senyal, haja o no presència de la partícula problema, determinant que la migració a través de la membrana ha sigut correcta i la prova funciona. - Zona absorbent → Zona que reté la resta de la mostra i components que no s’han unit en les zones de detecció o control. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  6. Immunocromatografia Exemples: Test del SARS-CoV2 SARS-COV2 Antigen test: https://www.youtube.com/watch?v=VmQmY-_QYWs Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  6. Immunocromatografia Exemples: Test d’embaràs Pregnancy test: https://www.youtube.com/watch?v=I6jE99Fjbvo Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  7. Immunofluorescència És una tècnica que ens permet visualitzar antígens o anticossos d’una mostra de teixits o cultius cel·lulars a l’unir-se a ells anticossos marcats amb un fluorocrom, el que permet que siguen visualitzats gràcies a un microscopi de fluorescència. Immunofluorescence - how it works and application: https://www.youtube.com/watch?v=Z_SNpo0aW34 Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  7. Immunofluorescència Fluorocroms Els dos fluoròfors més utilitzats són l’isotiocianat de fluoresceïna (FITC), que emet una fluorescència verda, i la rodamina, que emet una fluorescència ataronjada-roja. Generalment es gasta el FITC al tindre una major sensibilitat l’ull humà pel color verd. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  7. Immunofluorescència Microscopia de fluorescència Es tracta de microscopis amb característiques especials, ja que tenen filtres que permeten el pas selectiu de determinades longituds d’ona, possibilitant fonts de llum en l’espectre electromagnètic de màxima absorció dels fluorocroms utilitzats. Hi ha que tindre en compte que la intensitat d’emissió de fluorescència de la mostra es va reduint amb cada exposició, per descomposició de les molècules fluorescents. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  7. Immunofluorescència Tipos de Immunofluorescència - Directa (IFD) IGUAL QUE EL ELISA S’utilitza principalment per a detectar Antígens. La mostra problema amb el possible Ag es fixa a la placa o porta i s’afegeix una solució d’Ac marcat amb un fluoròfor. Es renta i es visualitzen els resultats. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  7. Immunofluorescència Tipus de Immunofluorescència - Indirecta (IFI) IGUAL QUE EL ELISA S’utilitza principalment per a detectar Anticossos. L’Ag específic per a l’Ac d’estudi es fixa a una placa o un porta. Després s’afegeix la mostra problema que pot tindre l’Ac, es renta per a eliminar fraccions no unides i a continuació s’afegeix Ac marcat amb un fluoròfor. Per últim es torna a rentar i es visualitzen els resultats. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència La immunotransferència és una tècnica d’alta sensibilitat i especificitat que s’utilitza per a l’estudi d’una amplíssima varietat de molècules. Es tracta d’una combinació de tres tècniques diferents: - La separació dels components d’estudi mitjançant una electroforesi - Electrotransferència (electroblotting) de l’antigen. - Identificació mitjançant immunoassaig amb anticossos coneguts. Es coneixen diferents tipus de mètodes que s’anomenen en funció de la molècula a transferir: Northern blot (ADN), Southern blot (ARN) i Western blot (proteïnes), sent aquest últim el d’interés en aquesta assignatura ja que utilitza com a base de la detecció les interaccions Ag-Ac. Podem dividir la immunotransferència en 6 processos fundamentals: Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 1. Preparació de les proteïnes Per a poder realitzar una separació de les proteïnes en funció únicament del seu pes molecular, es necessita tratar-les prèviament. S’utilitza SDS que desnaturalitza l’estructura primària de la proteïna i la recobreix de càrregues negatives. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 2. Preparació del gel Es prepara un gel de poliacrilamida que permet separar les proteïnes baix un camp elèctric segons la seua mobilitat electroforètica, que en haver-se tractat amb diferents compostos (SDS) i tindre totes càrrega negativa, el seu moviment serà en funció de la seua grandària. El gel pot exercir més o menys resistència al moviment de les proteïnes en funció de la concentració d’acrilamida que ho forme, ja que farà que el porus siga més o menys gran. SDS-PAGE → Dodecilsulfat sòdic (SDS) + Electroforesi en gel de poliacrilamida (PAGE) Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 3. Separació electroforètica de l’antigen Al tindre totes les proteïnes càrrega negativa gràcies a l’acció del SDS, es mouran cap l’ànode avançant més o menys en funció de la seua grandària i de la concentració de poliacrilamida del gel. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 4. Electrotransferència de l’antigen a un suport de membrana Una volta les proteïnes s’han separat, es transfereixen a una membrana per a poder marcar-les i visualitzar-les, ja que el gel no és un bon medi per aquest propòsit. Les membranes solen ser de nitrocel·lulosa o polifluorur de vinilidé (PVDF). Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 5. Bloqueig dels llocs d’unió de proteïnes lliures en la membrana Una volta les proteïnes s’han transferit a la membrana, hi ha que bloquejar els buits d’aquesta amb proteïnes genèriques que eviten unions inespecífiques dels anticossos que es van gastar. Per a això s’utilitza principalment albúmina de sèrum boví (BSA) o llet. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència 6. Immunoassaig Per últim, s’utilitzen Ac específics contra epítops de la proteïna. Primer un Ac primari, i després un Ac anti-Ac que estarà conjugat amb el marcador, que pot ser un enzim (preferentement), un compost radioactiu, o uno quimioluminiscent. Després es llegir el resultat de la tècnica. Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025  8. Immunotransferència Tècnica Western Blot UV: https://www.youtube.com/w atch?v=HocmMZUieFg Tècniques d’Immunodiagnòstic - Unitat 3: Tècniques basades en reaccions Ag-Ac primàrias IES Enrique Tierno Galván - Curs 2024-2025