Tema 6: Virus de células animales (vertebrados) - Primera Parte

Tema 6. Virus de células animales (vertebrados) 1. Adsorción y entrada en células animales Los tropismos vienen marcados por interacciones específicas con una serie de receptores en la superficie de la célula, pero antes de eso, existe una concentración de viriones en el tejido fomentada por fu...

Tema 6. Virus de células animales (vertebrados) 1. Adsorción y entrada en células animales Los tropismos vienen marcados por interacciones específicas con una serie de receptores en la superficie de la célula, pero antes de eso, existe una concentración de viriones en el tejido fomentada por fuerzas de tipo electrostático (la carga de la superficie de la célula con respecto a la de los virus). En definitiva, inicialmente se produce una atracción de carácter inespecífica y reversible, producida por las fuerzas de tipo electrostático, que promueven la concentración de viriones en el tejido. Estas no marcan el tropismo del virus, especificidad de un virus para infectar a un tipo particular de célula o tejido (pues como su definición deja ver, estos están marcados por interacciones específicas), simplemente facilitan la acumulación, pues hay tejidos que aunque se produzcan estas interacciones inespecíficas, no presentan receptores específicos y no produciéndose la infección. En los tejidos que sí existan los receptores específicos se va a poder producir la infección. Interacción específica con receptores: - Receptores de baja afinidad: se producen con moléculas presentes en muchos tejidos (como el heparán sulfato o el ácido siálico), no siendo estos los receptores que marquen la especificidad del virus. Son interacciones reversibles. Abundan en muchas células del tejido y presentan residuos glucídicos. Esto no indica que el ácido siálico, por ejemplo, no pueda ser receptor primario (lo es para el virus de la gripe), simplemente son receptores reconocidos por muchos virus. 1  - Receptores primarios y correceptores: una vez se produce la unión, se unen de manera irreversible, son muy específicas y consolidadas. Un receptor primario no es más importante que un correceptor. El que sea un receptor primario solo va a indicar muchas veces que fue el primero en ser descubierto como receptor del virus, con lo que el resto de los que se descubren son correceptores. Otras veces se dice que es el primario porque es el primero con el que interacciona el virus en la superficie de la célula, esta interacción facilita la posterior interacción con el correceptor, como es el caso del virus del sida (la primera interacción de la glicoproteína del virus se da con CD4 (linfocitos y macrófagos), que produce un cambio conformacional que facilita la posterior interacción con el correceptor CCR-5 o CXCR4. Veamos un ejemplo con este virus: puede interaccionar con el heparán de manera reversible (interacciones de baja afinidad). Con respecto a los receptores primarios y correceptores, primero interacciona con CD4 (linfocitos y macrófagos). Esta unión produce un cambio conformacional que va a favorecer la unión a CCR-5 o CXCR4 (según si es linfocito o macrófago respectivamente). Diferentes dominios de unión en la proteína viral: Baja afinidad → alta avidez. La interacción con un receptor se produce a nivel de diferentes dominios. La glicoproteína de la superficie del virus interacciona con diferentes dominios de receptores y correceptores, lo que permite una unión sólida con los receptores que presentan baja afinidad. Adsorción facilitada por anticuerpos. El organismo hospedador genera anticuerpos frente a diferentes epítopos de los antígenos virales, estando entre ellos las glicoproteínas que interaccionan con el receptor. La síntesis e interacción de anticuerpos frente a un determinado virus puede facilitar su adsorción a la célula, fijación o reconocimiento. Regionalización del proceso de adsorción viral a nivel de membrana celular (“lipid raft”, mb reforzada con caveolina o clatrina). Los lipid rafts son zonas ricas en lípidos especialmente implicadas en el proceso de entrada y salida de virus de la célula. Es decir, la adsorción muchas veces está zonalizada (siendo un tipo de zona los lipid rafts), al igual que la salida, pues la membrana no es algo completamente homogéneo. También hay zonas especialmente reforzadas de caveolina o clatrina donde se produce la entrada. 2. Diferentes mecanismos de entrada: internalización en la célula. a. Fusión en la membrana plasmática de la célula Los virus envueltos son muy comunes en los virus de células animales. La entrada de un virus envuelto conlleva un paso adicional y anterior a la decapsidación, la fusión de la membrana del virus con la membrana celular (membrana plasmática o vesículas de endocitosis). Dicho esto, la entrada, ya hablemos de un virus envuelto o desnudo, por fusión/decapsidación, puede tener lugar a nivel de membrana plasmática. Los virus que liberan genoma a nivel de membrana plasmática de esta forma van a poder formar sincitios celulares (ejemplo: virus del sarampión), aunque no son los únicos que lo hacen. Esto facilita a los virus una transmisión más rápida y más segura, favorece la multiplicación dentro del organismo. 2  b. Entrada por endocitosis (suficón a nivel de la membrana endosomal o lisosomal) En este caso, la unión de los virus con el receptor dispara la formación de una vesícula, de un endosoma. Puede ser un proceso de endocitosis mediada por clatrina o caveolina, o independiente de estas. Dentro de una misma familia podemos encontrar virus que liberen el genoma a nivel de la membrana plasmática o virus que lo hagan a nivel de los endosomas. En el caso de los virus que entran por endocitosis, la fusión tendrá lugar a nivel de la membrana del endosoma que se forme (la fusión ya no tiene lugar a nivel de membrana plasmática). Este proceso (fusión/decapsidación dentro del endosoma) está asociado muchas veces a la bajada de pH. Hay virus que van a liberar el genoma a nivel de endosomas tempranos (los pegados en la ruta endocítica a la membrana plasmática), no necesitando un pH muy bajo, de 6,5 por ejemplo; mientras que hay otros que van a liberar o decapsidarse total o parcialmente en endosomas tardíos o en endolisosomas, que requieren de una bajada de pH mayor y muchas veces de la participación de una serie de proteasas presentes en esos endolisosomas. Recordemos que el proceso de entrada (la decapsidación y liberación del genoma hasta quedar decapsidado por completo y tener la máxima estabilidad posible) requería de un aumento de energía que venía de la mano de una bajada de pH, la interacción con el receptor (en el caso de los que lo hacen a nivel de membrana plasmática) o de la activación de una serie de proteasas celulares. En el ejemplo podemos ver cómo en algunos se produce una decapsidación cuando dentro del endosoma se alcanza un determinado pH. Aquellos que decapsidan a nivel de MP no requieren de una acidificación, se produce a pH 7. c. Entrada por macropinocitosis Aquí tenemos el caso del virus del ébola. La interacción del virión con el receptor específico produce una reordenación de los filamentos de actina (sustentan la membrana plasmática) hasta formarse un pseudópodo que engloba la partícula viral formando un macropinosoma. 3 Simplemente en lugar de una invaginación (endocitosis) tenemos una proyección. Para que se produzca cualquiera de las dos cosas es necesario que la interacción con el receptor modifique la reorganización de la actina. El virus del ébola es envuelto, la liberación del genoma se produce a nivel de macropinosoma o liberación como molécula transportadora (no va a preguntar esto, solo quiere que veamos que hay una tercera vía diferente a las anteriores). 3. Transporte de las partículas virales dentro de la célula Desde que se produce la entrada hasta que comienza el proceso de expresión hay un transporte del genoma del virus a ese punto de la célula en el que va a tener lugar la expresión. A diferencia de lo que ocurría en procariotas, donde no hay compartimentalización (espacios compartimentalizados por membranas), aquí sí. Como norma, podemos pensar que casi todos los virus que tengan genoma de RNA van a desarrollar todo su ciclo de multiplicación en el citoplasma de la célula, casi todos. Una excepción, por ejemplo, sería el virus de la gripe, que es un virus de ssRNA de polaridad -. Su genoma va a migrar al interior del núcleo de la célula, para poder transcribirse y replicarse. Otra excepción sería la de los retrovirus (clase VI de la clasificación de Baltimore), en este caso su genoma también va a migrar hasta el núcleo, pero lo hace en forma de DNA, transformándose previamente mediante la retrotranscriptasa. De la misma forma, casi todos los virus de DNA van a ser transcritos y replicados en el núcleo de la célula. En este caso la excepción es el grupo de los poxvirus, que lo hacen en el citoplasma. El transporte, ya sea del genoma o de la partícula viral dentro de la célula, corre a cargo de elementos del citoesqueleto celular, aquí cobran importancia proteínas motoras como la 4 miosina (filamentos de actina) o la quinesina y la dineína (microtúbulos). Cuando se trata de un transporte a “larga distancia” se encargan los microtúbulos. Vamos a verlo con un ejemplo, algunos herpesvirus (como el virus del herpes simple), se pueden acumular en las neuronas de los ganglios sensoriales donde permanecen en estado de latencia, pero el virus puede penetrar a nivel del axón. De esta forma, este transporte del virus hasta el soma de la neurona corre a cargo de los microtúbulos. Ejemplo: transporte de adenovirus hasta la membrana nuclear. Este es un caso curioso pero muy ✨bonito✨ (según Toni) porque podemos ver todo el proceso. Los adenovirus (virus desnudos) empiezan a decapsidarse a nivel de membrana plasmática, pero entran por endocitosis. Siguen decapsidándose a nivel de endosoma (endosoma tardío y endolisosoma), pero de forma incompleta, no decapsidan totalmente a pesar de que llegan hasta el endolisosoma. La bajada progresiva del pH favorece la decapsidación parcial, que no es completa, una cápsida incompleta conteniendo el genoma es transportado por los microtúbulos hasta el poro nuclear y ahí suelta el genoma. 3.1 Transporte al interior del núcleo Existen diversas formas de que el genoma viral llegue al núcleo. En el caso del virus de la gripe, su genoma está segmentado, distribuido en un total de 8 segmentos diferentes de ssRNA de polaridad negativa. Estos segmentos de RNA están rodeados por moléculas de la proteína de la cápsida. De esta forma, se forman 8 nucleocápsidas helicoidales o ribonucleoproteínas víricas. La entrada de estos segmentos dentro del núcleo se da gracias a que esa proteína de la cápsida del virus de la gripe tiene una señal de localización nuclear 5 en su secuencia de aminoácidos: secuencias que cumplen una serie de normas (menos de 20 aa, abundan aa básicos como la lisina…). Esta secuencia de localización nuclear en este caso no solo está en la proteína de la cápsida, también en otras proteínas. Ocurre lo mismo con el virus SV40, un virus oncogénico de DNA. Una de sus proteínas reguladoras, el antígeno T grande, también tiene señal de localización nuclear. En el caso del herpes simple tipo I, a nivel del poro entra solamente el genoma del virus, al igual que en el Adenovirus. Los Parvovirus y Hepadnavirus son tan pequeños que se produce la entrada de la partícula viral en el núcleo: la cápsida interacciona con las proteínas del poro nuclear. Hay veces que las proteínas no tienen señal de localización nuclear, sino que interaccionan con proteínas transportadoras, importinas, que interaccionan con el poro y ayudan a entrar el genoma del virus en el núcleo. 4. Virus de RNA monocatenarios con polaridad positiva En la imagen podemos observar las familias de virus de eucariotas con genoma de RNA con polaridad positiva. En este tema nos centraremos en Coronavirus y Picornavirus, mencionando algunos aspectos de Flavivirus y Togavirus. 4.1 Familia Picornaviridae (Picornavirus) Virus desnudos y pequeños. Genoma de RNA monocatenario de polaridad positiva. Con respecto a la estructura de la partícula viral, hemos dicho que es desnuda, con una cápsida 6 formada por 4 proteínas estructurales, 3 externas (VP1, VP2 y VP3) y 1 interna (VP4), interaccionando esta con el genoma en la partícula viral. Dentro de esta familia tenemos virus que tienen como tropismo el tracto gastrointestinal (virus de la polio), hepatovirus (virus de la hepatitis A), también encontramos rinovirus (causan resfriados comunes) y cardiovirus. Estructura del genoma y síntesis de proteínas El genoma es una cadena de RNA de polaridad positiva similar a un mensajero (tiene incluso cola de poliA), pero en el extremo 5’ presenta 2 particularidades: - En lugar de tener modificado ese extremo para el reconocimiento del ribosoma con un CAP, presenta una estructura secundaria, un plegamiento en la secuencia, que se conoce como secuencia IRES. Esta es la secuencia reconocida por el ribosoma. - Lleva asociada una proteína precursora y necesaria en dicho extremo, usada como cebadora en la replicación del genoma, la proteína VPg. Esta molécula se encuentra así dentro del virión. Lo primero que va a ocurrir con el genoma viral es la traducción, pues es RNA de polaridad positiva (codificante). La principal diferencia que apreciamos con respecto a los virus de células procariotas es que tenemos una lectura monocistrónica del genoma, como procede en una célula eucariota. Veámoslo con un ejemplo, con el virus MS2, el ribosoma podía reconocer diferentes codones de iniciación, leyendo y sintetizando proteínas individuales. En este caso, solo hay un punto de entrada para el ribosoma, la secuencia IRES, de manera que a partir de un virión se sintetiza una poliproteína. Esta poliproteína tiene actividad proteinasa, varias subunidades, que tienen una función catalítica de degradación de proteínas. Esta poliproteína se autoprocesa hasta proteínas de tamaño menor y finalmente se procesan hasta proteínas individuales. Esta capacidad de autoprocesamiento la veremos también en los flavivirus. 7 Recordemos que cuando el genoma es de RNA, se debe sintetizar una RNA polimerasa para replicarlo, porque la RNA polimerasa de la célula no puede replicar a partir de RNA (a la célula no le es útil en absoluto esta replicación). Traducción del genoma vírico: Dirigida por la secuencia IRES (Internal Ribosome Entry Site), situada en la región 5’ no codificante Requiere algunos factores celulares Genera una poliproteína que será autoprocesada por proteasas víricas hasta enzimas y proteínas estructurales funcionalmente activas Una peculiaridad de los virus de esta familia es la inhibición de la expresión del genoma de la célula (traducción de mensajeros celulares), haciéndolo a distintos niveles, con diferentes mecanismos al mismo tiempo. Las propias proteasas del virus no solo sirven para autoprocesar la poliproteína, sino que además degradan una serie de factores proteicos necesarios para la traducción de mensajeros celulares, como el factor de iniciación 4G o 4E. De esta forma, se ponen los ribosomas a disposición del genoma del virus. Dichas proteasas son capaces de degradar también la RNA polimerasa de la célula (en el núcleo), bloqueando la transcripción del genoma celular. En definitiva, tienen diferentes estrategias que lo que hacen es promover la expresión del genoma del virus. Un pequeño detalle: todo este proceso es la generalidad de los Picornavirus, pero cada virus tiene sus particularidades: el virus de la polio entra a nivel de membrana plasmática y los rinovirus entran a nivel de los endosomas tempranos, decapsidándose a pH 6. En definitiva, cada uno tiene su peculiaridad, pero no vamos a entrar en tanto detalle. 8 Replicación del genoma vírico Al presentar un genoma de RNA van a completar el ciclo en el citoplasma de la célula, el núcleo no es necesario. Puntos clave (desarrollo abajo): Se inicia en complejos multiproteicos asociados a vesículas formadas a partir del RE como consecuencia de la infección viral. COMPARTIMENTALIZACIÓN. Utiliza como cebador un precursor de la proteína VPg unido a residuos de Uridina. Tras completar la síntesis de la hebra (+ o - ), dicho precursor es procesado hasta VPg, que se mantiene unido covalentemente al extremo 5´. Las hebras + podrán ser traducidas por los ribosomas celulares o serán encapsidadas como genoma de la nueva progenie viral. Compartimentalización en la célula de los procesos de traducción y replicación del genoma vírico: Vamos a recordar un conflicto que ya hemos estudiado, el que hay entre la maquinaria de traducción (empieza por el extremo 5’) y replicación (empieza en el extremo 3’) con moldes de ssRNA +. Si no hay una regulación temporal de los procesos, colisionan y el ciclo no llega a terminar. En Qβ y MS2 esto se solucionaba porque la RNA polimerasa de la replicasa del fago se unía a algunos factores proteicos celulares, para fomentar la replicación sobre la traducción. En Picornavirus y Flavivirus, la compartimentalización de ambos procesos evita dicho colapso. La replicación está asociada a vesículas inducidas desde el RE: una peculiaridad de estos virus (y de muchos virus de RNA) es que inducen la formación de vesículas a partir del retículo endoplasmático de la célula. Aunque la replicación del genoma tiene lugar en el citoplasma de la célula, va a estar asociada a estas vesículas inducidas. Tras la entrada del genoma en la célula, este se traduce, sintetizándose la poliproteína que se autoprocesa, generando proteínas individuales, entre ellas aquellas implicadas en el proceso de replicación del genoma viral. Se forma una vesícula a partir del RE, teniendo lugar la replicación asociada a estas, obteniendo cadenas negativas a partir de las positivas. A partir de las cadenas negativas se generan nuevas cadenas positivas con dos destinos: ser traducidas nuevamente, amplificando la cantidad de proteínas del virus, o bien constituir el genoma de la nueva progenie viral. El cebador del proceso de replicación es un precursor de la proteína VPg (proteína inmadura que se procesa y genera una proteína madura unida a las cadenas del genoma). Esta 9 proteína va a quedar siempre unida en el extremo 5’ de las hebras de nueva síntesis, formando parte del genoma que va a quedar encapsidado dentro del virus. Recapitulamos el ciclo de multiplicación (perdonen la pesadez, pero creo que quedará claro): la entrada puede ser a nivel de endosoma o de membrana plasmática, dependiendo de la especie. El genoma, con la cola de poliA y secuencia IRES, es traducido a una poliproteína (las tijeras indican actividad autoproteolítica), se sintetizan péptidos más pequeños, sigue el autoprocesamiento hasta proteínas individuales. La proteína del gen 2A (una de las proteasas) se encarga de degradar los factores de iniciación de la traducción celulares, pero también puede bloquear la salida de mensajeros del polo nuclear (anulando la transcripción en parte). A continuación se conforma el complejo de replicación a partir del RE. En este orgánulo se forman vesículas, asociadas a las cuales se produce la síntesis de RNA, usando como molde las cadenas de polaridad +, a partir de las negativas se sintetizan nuevas hebras positivas que volverán a empezar la traducción o que conformarán el genoma de la nueva progenie viral. Tras atravesar el Golgi en la ruta secretora, la salida se produce por exocitosis, llevando en algunos casos a la lisis celular (esto dependerá) del virus. 10 4.2 Familia Flaviviridae (Flavivirus) Virus envueltos con un ciclo de multiplicación similar al de la familia Picornaviridae (ocurre igual con los Togavirus). Muchos de ellos se transmiten por mosquitos. Con respecto a su genoma, encontramos diferentes géneros, destacando Flavivirus y Hepacivirus. Los del primer grupo presentan en el extremo 5’ el CAP típico de mensajeros celulares en lugar de la secuencia IRES, mientras que en el extremo 3’ llevan una estructura de plegamiento encargada de regular el proceso de traducción. Dentro de los Hepacivirus encontramos el virus de la hepatitis C (detalle a darse cuenta, las hepatitis las producen diferentes grupos de virus). Este grupo conserva en el extremo 5’ la secuencia IRES (en lugar de CAP), que aparece también en Picornavirus (extremo 5’). Esto no es muy importante, lo que viene ahora sí. Estructura del genoma de los Flavivirus (común a los diferentes géneros): En el extremo 5’ encontramos genes que codifican para proteínas estructurales de la envuelta y la cápsida. Encontramos entre ellas la proteína E, de la envuelta, involucrada en interacción con el receptor, y la proteína M, de la cápsida, que se sintetiza como proteína inmadura (pre- proteína). En el resto del genoma (⅔ de este hacia el extremo 3’) encontramos el resto de genes que codifican para proteínas de carácter enzimático, no estructurales (NS). En el extremo se encuentra NS5, que codifica para la RNA polimerasa del virus. El proceso de expresión del genoma es similar al de los Picornavirus: cuando el genoma entra en la célula, se produce la síntesis de una poliproteína completa, que es procesada hasta proteínas individuales. La peculiaridad en este grupo es que el procesamiento se produce por proteasas de origen celular (en Picornavirus todas eran víricas), tanto del retículo endoplasmático como del aparato de Golgi, estando esta última involucrada en el proceso de maduración. El procesamiento a nivel del aparato de Golgi está catalizado por proteasas de tipo furina, que actúan a nivel de la proteína M, siendo procesamientos requeridos en el proceso de maduración de los nuevos viriones, para que estos puedan ser infectivos e infectar una nueva cepa. 11 Por lo demás, es muy similar a los Picornavirus. Por ejemplo, en la replicación, su genoma también está asociado a vesículas del retículo endoplasmático de la célula. De esta forma, un indicativo de que existe una infección por alguno de estos dos grupos de virus es la presencia de estas vesículas formadas en el retículo endoplasmático. A los puntos en los que ocurre la replicación se les denomina factoría de viriones, es ahí donde se están produciendo (con microscopía electrónica podría observarse). Las factorías de viriones no son exclusivas de este grupo, encontramos estos puntos en todos los grupos de virus en los que se produce replicación asociada a vesículas membranosas (retículo endoplasmático o endosoma). En resumen, el ensamblaje tiene lugar en el retículo endoplasmático, la maduración en el Golgi y tras esto se produce la salida. 4.3 Familia Togaviridae Virus envueltos con cola de poli A (como Picornavirus). En Togavirus encontramos un extremo 5’CAP típico de los mensajeros de la bacteria. Dentro de este grupo encontramos por ejemplo los Sindbis virus, pertenecientes al género Alphavirus. La mayoría son transmisibles por mosquitos. Tip de cara al estudio para todos los grupos de virus: observar cómo están posicionados los genes nos va a indicar cómo se regula la expresión del genoma. Genoma: en los Flavivirus, los genes estructurales estaban en el extremo 5’, sintetizándose la misma cantidad de todas las proteínas (una poliproteína que se procesa). En este caso, los genes estructurales están en el extremo 3’ (como ocurre con los Coronavirus), estando el extremo 5’ reservado para los genes que codifican para las proteínas no estructurales (RNA polimerasa, entre ellas). Peculiaridad: en el momento en el que entra el virus, el ribosoma empieza a traducir los genes no estructurales a partir del 5’ CAP, sintetizando una poliproteína de carácter enzimático que es autoprocesada (autoprocesamiento proteolítico) por una de las subunidades (nsP2) hasta proteínas individuales. De esta forma, se conforma el complejo de replicación-transcripción del virus y comienza la replicación por el extremo 3’, sintetizándose una cadena negativa. Observemos que hay una parte que no ha sido traducida aún (genes que codifican para proteínas estructurales). El propio complejo de replicación-transcripción 12 sufre un procesamiento adicional que permite la síntesis de dos tipos de cadenas de polaridad positiva, completas y subgenómicas (todas las subgenómicas de la misma longitud). Las subgenómicas van destinadas a la traducción de los genes que codifican para las proteínas estructurales, mientras que las otras vuelven a ser traducidas para generar más complejo de replicación-transcripción y llegado a un momento determinado, conforman el genoma de la progenie viral. En definitiva, las proteínas estructurales van a producirse a partir de fragmentos de RNA subgenómicos, más cortos, lo que hace que se produzcan en mayor cantidad. Como observación, las proteínas estructurales se sintetizan todas en la misma cantidad. Se sintetiza una poliproteína estructural que se procesa, aquí intervienen también proteasas de la célula. Detalle no muy importante. La replicación en lugar de estar asociada a vesículas del RE, se forma asociada a endosomas (factorías de viriones). 4.4 Familia Coronaviridae No vamos a entrar en taxonomía, solo destacamos que existen cuatro géneros: alpha, beta, gamma y delta. Aunque todos infectan animales, no todos infectan a humanos (gamma y delta no lo hacen). Todos los virus de RNA son emergentes, causan epidemias importantes responsables de las zoonosis. Hay muchos coronavirus ampliamente extendidos y que causan afecciones respiratorias leves (a, b y los dos c en el esquema). Los tres últimos de la lista, MERS y SARS (letras d y e), causan síndromes respiratorios severos. En la actualidad, las afecciones respiratorias que causa el SARS-CoV son importantes y se les debe prestar atención, pero no es como al principio, pues las cepas han ido evolucionando 13 hacia una mayor propagación y menor virulencia. No todos los coronavirus son respiratorios, otros producen infecciones gastrointestinales. Receptores: se han encontrado diferentes receptores. El SARS- CoV fue el primero que causó síndrome respiratorio agudo. Su receptor es ACE2, al igual que en el SARS-CoV 2. MERS tiene un receptor diferente, DPP4. Probablemente no sean los únicos, hay muchos coronavirus que reconocen estas proteínas como receptores primarios, pero luego reconocen algunas moléculas con glúcidos como receptor secundario (heparán sulfato, ácido siálico…). La molécula vírica encargada de interaccionar con los receptores es la glicoproteína S que forma trímeros, conformando cada trímero una espícula. Presenta dos subunidades, S1 en la región amino-terminal, cuya función es la interacción con los receptores y S2 en la región carboxi-terminal, más integrada en la membrana, responsable de la fusión (necesaria en virus envueltos). Dos motores de evolución: mutaciones puntuales (de la misma forma y con la misma frecuencia en todas las regiones del genoma, afectando a ambas subunidades) y recombinación. Las mutaciones en S2 generan variantes genéticas menos eficientes e infectivas porque afectan a un proceso muy conservado, el de fusión, de esta forma la región está más conservada entre diferentes cepas o variantes genéticas. Sin embargo, las mutaciones en S1 son las responsables de las variantes genéticas más competitivas, que pueden burlar los anticuerpos, by-passear el proceso de neutralización de anticuerpos y vacunas, generando las nuevas variantes genéticas responsables de los brotes anuales. Esta glicoproteína tiene puntos de procesamiento donde actúan las proteasas celulares, claves en la entrada y maduración. - Uno de los puntos de corte está entre S1 y S2, actuando sobre él una furina celular situada en el aparato de Golgi. Durante la salida de la progenie viral de la célula, que sigue la ruta secretora, pasa por el aparato de Golgi, donde se produce el corte, madurando la glicoproteína para que pueda interaccionar con un nuevo receptor en la siguiente cepa. La maduración tiene lugar durante la salida de la progenie viral, no hay separación, hay cambio conformacional. - Hay otro punto de corte dentro de S2 específico para una serie de proteasas celulares. El procesamiento, a cargo de unas u otras, es importante para que se lleve a cabo la fusión y la entrada de virus dentro de la siguiente célula. 14 Tan importante es para el tropismo del virus que las células expresen el receptor y los correceptores como que sinteticen las proteasas adecuadas (pues las proteasas no se expresan en todos los tejidos). En los tejidos en los que se expresa la proteasa TMPRSS2 puede haber fusión a nivel de MP, es decir, la liberación de genoma puede darse a nivel de MP. En los que tiene lugar la expresión de CTSL la entrada es por endocitosis y la fusión es a nivel de la membrana endosomal. Es decir, existen dos vías de entrada para el coronavirus en función del patrón de proteasas que se exprese en el tejido. Estrategia de expresión del genoma El genoma presenta una disposición similar a la de los Togavirus: 2/3 de los genes codifican para proteínas no estructurales: RNA polimerasa, enzimas de reparación de mutaciones por errores RNA polimerasa, proteasas víricas... Esto hace que dentro del grupo de los virus con genoma de ssRNA, los Coronavirus sean los que tienen el mayor tamaño. Cuando entra el genoma en la célula y se libera de la cápside (helicoidal), comienza la traducción y se pueden sintetizar dos tamaños de poliproteínas enzimáticas, una pequeña (pp1a) y otra mayor (pp1ab) que contiene la RNA polimerasa. Encontramos así un mecanismo de ahorro genético (ahorro de espacio de genoma): que se sintetice una poliproteína más pequeña o más grande depende del cambio en la pauta de lectura durante el proceso de traducción. Si reconoce el codón de terminación de la secuencia más corta, se sintetizará la poliproteína más pequeña y si no lo reconoce, se genera una poliproteína más grande (pues no para de traducir antes de llegar a ORF1b), regulando la cantidad de replicasa (RdRp, RNA dependent RNA polymerase) que se sintetiza frente, por ejemplo, a la cantidad de proteasa. Una vez que se produce el autoprocesamiento de las poliproteínas y la conformación del complejo de replicación/transcripción, se produce la replicación del genoma, generando primero cadenas negativas de diferente tamaño (cadenas completas y de tamaños diferentes 15 más pequeños) y luego positivas a partir de estas, entre las que encontramos los RNA mensajeros subgenómicos. Síntesis de mensajeros subgenómicos anidados El complejo replicación/transcripción empieza a transcribir (o a replicar por así decirlo) a partir del 3’. Delante de cada una de las grandes regiones ORF, hay una serie de secuencias repetitivas que son secuencias reguladoras de la transcripción (TRS). La RNA polimerasa empieza a transcribir y llegando a la secuencia TRS se descuelga y cambia de molde, anillando esta cadena con la secuencia TRS y copiando la secuencia líder (situada en el extremo 5’ del genoma, es no codificante, no se traduce nunca). Obtendremos una cadena negativa corta donde solo se copia el gen que se replica hasta la TRS, la TRS y la secuencia líder. Fruto de la cadena negativa, la replicación genera una positiva complementaria. Los diferentes tamaños de RNA subgenómico vendrán dados por los diferentes puntos en los que la RNA polimerasa puede descolgarse. Este mecanismo, asociado con la evolución por recombinación, es el que hace que cuando hay dos coronavirus diferentes en la misma célula de murciélago, en el proceso de cambio de molde, pueda hibridar con el genoma del otro coronavirus generando un genoma recombinante y una nueva especie. En los Togavirus, todos los RNA subgenómicos eran de la misma longitud y la traducción generaba una poliproteína que se autoprocesaba dando la misma cantidad de proteínas estructurales. En este caso, se generan mensajeros subgenómicos de diferente longitud, con diferente extremo 5’ pero el mismo 3’, por eso se dice que son mensajeros subgenómicos anidados en el extremo 3’. Esto nos puede servir para recordar que los coronavirus se encuentran dentro del orden Nidovirales. La traducción de los mensajeros anidados solo da una única proteína, la codificada por el gen del extremo 5’, pues el ribosoma solo traduce el primer gen. Además, en la traducción de los mensajeros anidados tenemos otro mecanismo de ahorro genético, basado en los diferentes codones de inicio de la traducción, el escaneo débil, laxo (leaky scanning, aparece en la figura del genoma): en lugar de reconocer un codón de iniciación se reconoce otro, sintetizándose, por ejemplo, diferentes isoformas de la proteína. Es un mecanismo que también aparece en células eucariotas, no es exclusivo del genoma viral. Aquí viene aquí viene muy bien explicado: https://viralzone.expasy.org/1976 Entre los genes que se expresan a partir de mensajeros anidados, tenemos las proteínas estructurales: entre ellas, la glicoproteína S con sus dos subunidades, las de la cápsida y las de la envuelta E y M. Las que tenemos en rosa (en la figura de la página anterior, del genoma) son proteínas accesorias, con distintas funciones que ayudan a que la infección vaya a más, 16 interaccionando muchas de ellas con el sistema inmune del hospedador. La proteína E es una proteína minoritaria de la envuelta con un importante papel en el ensamblaje de la progenie viral. Solo las cadenas que se repliquen de forma completa van a conformar el genoma de la nueva progenie viral. En la imagen tenemos el ciclo completo representado. Al tratarse de un virus de RNA, en la célula se generan vesículas derivadas del retículo endoplasmático que están asociadas al proceso de replicación del genoma del virus. Tras el proceso de entrada (por membrana plasmática o endosoma, dependiendo del patrón de proteasas que exprese el tejido), el genoma es traducido en 2/3 partes, hasta generar el complejo de replicación-transcripción que se asocia a las vesículas del RE, iniciando la síntesis de cadenas negativas completas y subgenómicas anidadas y sus correspondientes positivas. Solo las completas van a encapsidarse en la ruta secretora a nivel de RE y van a salir las nuevas partículas por la ruta secretora proveyendo de la membrana a nivel de la membrana plasmática. 5. Virus de RNA de polaridad negativa 17 5.1 Familia Orthomyxoviridae Se trata de una familia de virus de ARN que infectan a los animales e incluyen a los virus causantes de la gripe. Que como podemos observar hay de diferentes tipos: Influenza A, B y C. En 2009 hubo una de las epidemias más grandes de gripe donde murió bastante gente, sobre todo personas de riesgo, embarazadas y también gente joven. La gente joven está menos inmunizada, y a partir de esto se empezó a hablar de la gripe tipo A. En realidad se trataba de la misma gripe que la de todos los años, solo que era una especie que había surgido por recombinación de segmentos. La explicación a que había menos inmunidad por la gente joven se debe a que habían estado en menos contacto con la gripe y fue el factor clave que hizo que se desatara esta pandemia. Resaltar nuevamente que esta gripe tipo A es igual que la misma que había todos los años, aunque como hemos dicho surge por recombinación de segmentos, mientras que las otras gripes surgían por deriva genética y daban lugar a una gripe estacional que con su correspondiente vacuna se puede frenar una pandemia. Pero sí cabe destacar que la gripe tipo A es más grave que la que llamamos gripe tipo B. 5.1.1. Virus de la Influenza A. La partícula del virus de la gripe, podemos visualizarla por microscopía, es un poco pleomórfica y tiene membrana, una bicapa lipídica con dos glicoproteínas: - La hemaglutinina, HA: es la más abundante, se oligomeriza, se unen 3 unidades de esta glicoproteína y forman las espículas que interaccionan con el receptor. - La neuraminidasa, NA: también abundante, aunque algo menos que la anterior y está implicada en la salida de la progenie viral. Son los dos antígenos que definen el xerotipo de la gripe, es decir, cuando hablamos de H1N1 la proteína HA es la de tipo 1 y NA es de tipo 1. Como proteína integral que forma parte de la bicapa también tenemos la proteína N2, que es menos abundante y se trata de un canal de protones. Asociado estrechamente a la bicapa lipídica y a todas las glicoproteínas que hemos mencionado, por la parte interna, está la matriz N1 y asociada a esta matriz están las 8 ribonucleoproteínas, y cada una de ellas están conformadas por segmento RNA 18 monocatenario de polaridad negativa asociado estrechamente a la proteína de la nucleocápsida y en el extremo 3’ tiene unido un complejo polimerasa constituido por 3 enzimas que constituyen el complejo de transcripción-replicación, las proteínas PA, PB1 y PB2. Este es el primer virus que vemos con genoma ARN monocatenario de polaridad negativa. Se cumple lo que se establecía por la clasificación de Baltimore, que dice que aquellos que poseen genoma monocatenario de polaridad negativa de ARN van a tener que aportar en el virión el complejo enzimático implicado en la replicación de ese genoma. Tener presentes algunas estrategias de ahorro genético, por ejemplo: - El cambio de pauta de lectura que ya conocíamos, donde el ribosoma puede no reconocer el codón de terminación y cambiar la pauta de lectura generando a partir del mismo segmento diferentes proteínas con funciones diferentes. Ejemplo: La proteína PA que forma parte del complejo enzimático que se encarga de transcribir y replicar el genoma, en ese mismo segmento se puede sintetizar con esta estrategia una proteína diferente que se encarga de bloquear la respuesta inmune de la célula. Es decir, a partir de la misma secuencia podemos tener proteínas con funciones diferentes. - Algunos de los mensajeros, en concreto tenemos 3 segmentos, que pueden generar un mensajero que va a ser procesado por la maquinaria de procesamiento celular en el núcleo de la célula, generando proteínas diferentes. Ejemplo: El mensajero de la proteína M1 y M2, la M1 que es la de la matriz y la M2 que es el canal de protones localizada a la bicapa lipídica, ambas proceden del mismo segmento génico, pero M2 se sintetiza a partir del mensajero de M1 cuando se ha eliminado una región que se considera como un intrón. Este splicing o procesamiento lo realiza la maquinaria de la célula. 19 La maquinaria de procesamiento de mensajeros de la célula está en el núcleo, por lo que nos acordamos que el virus de la gripe a pesar de ser un virus de ARN va a desarrollar parte de su ciclo de multiplicación en el núcleo. Utilizando por ejemplo, esta maquinaria celular para procesar algunos de sus mensajeros. Ocurre lo mismo con el segmento de la siguiente imagen, que codifica para dos proteínas. Se genera a través de él un primer mensajero que da lugar a la proteína NS1 que posee varios papeles en el ciclo de multiplicación. Además, después del procesamiento de ese mensajero se sintetiza una proteína diferente que podemos encontrar en algunos textos como MS2 o quizás más habitualmente como NEP, que es la encargada de permitir la salida de la ribonucleoproteínas nuevas que se obtienen del núcleo al citoplasma. CICLO DE MULTIPLICACIÓN EN INFLUENZA A Unión para proceso de entrada del virus: El receptor del virus de la gripe son las moléculas de ácido siálico que hay unidas a unas glicoproteínas presentes en la superficie de algunas células del hospedador. Estas moléculas de ácido siálico se encuentran unidas a moléculas de galactosa en estas glicoproteínas. Estas glicoproteínas que llevan unido ácido siálico son bastante abundantes en nuestro organismo. Están presentes en las células del tracto respiratorio pero también en los enterocitos y también en los eritrocitos, lo que hace que cuando tengamos la gripe tengamos ese malestar general que hace que duela todo el cuerpo. También este malestar es como efecto de la fiebre por supuesto, por activación del sistema inmune. Pero en parte es porque está actuando el virus en distintos tejidos, por ejemplo, tenemos trastornos intestinales. Y el hecho de que pueda interaccionar con los eritrocitos es lo que permite su detección mediante pruebas de hemaglutinación o de inición de la hemaglutinación por tema de las células. El virus de la gripe aviar reconoce un receptor, estas moléculas de ácido siálico cuando se unen al carbono 3 de la galactosa forman un enlace del ácido siálico y la galactosa: alfa 2-3, mientras que en el caso de la gripe humana, reconoce las moléculas de ácido siálico que se unen en el carbono 6, formando enlaces alfa 2-6. Esta diferencia es lo que impide que el virus de la gripe aviar pueda transmitirse directamente a humanos, de manera directa, es decir, sin que haya ningún tipo de mutación. ¿Qué ocurre en el cerdo?¿Por qué es un buen reservorio para que tenga lugar la recombinación de diferentes cepas del virus de la gripe? 20 Pues en el cerdo están los dos tipos de uniones, hay glicoproteínas con enlace alfa 2-3 y alfa 2-6, con lo cual tanto la gripe aviar como la gripe humana pueden coincidir. Influenza A: Adsorción y entrada en la célula: En cuanto al procedimiento de entrada, la proteína HA que es la que interacciona con las moléculas de ácido siálico es la que está encargada de la interacción con el receptor. Esta proteína le pasa algo parecido como lo que ocurría con el coronavirus, que tenía dos subunidades S1 (interacciona con el receptor) y S2 (tiene el péptido fusión). Pues la HA, el dominio o la región HA1 (representadas por unas bolitas) son las que interaccionan con el receptor. Esta primera interacción del ácido siálico HA1 con el receptor lo que permite o induce es un proceso de endocitosis, se forma una vesícula que va a contener toda la partícula viral, no su membrana, es decir, que la fusión no tiene lugar ni tiene que ver en la membrana plasmática, sino que toda la partícula entra en el endosoma. ¿Qué ocurre en la ruta endocítica? A medida que avanza el endosoma, este se va acidificando. Por lo que esta acidificación es por una bajada del pH que tiene lugar dentro del endosoma, y activa a la proteína M2 del virus de la gripe, que recordemos que es un canal iónico, en concreto es un canal de protones. Dentro del endosoma se produce una bajada de pH y esto es natural, y ocurre en la célula. Esto provoca la activación del canal de protones de la proteína M2. Se abre el canal de protones y se deja pasar estos protones al interior de la partícula viral, y es esto lo que provoca un cambio conformacional en HA2, de manera que, se retira el dominio o la región HA1 y produce un cambio en la reestructuración de la región HA1, dejando libre o accesible el péptido señal, y provoque la fusión de la membrana del virus con la membrana del endosoma. 21 Es decir, resumidamente lo que ocurre es que el virus interacciona por HA1 con el receptor, entra por endocitosis, dentro del endosoma baja el pH, se activa el canal de protones M2, esa activación permite la entrada de protones dentro de la partícula viral produciendo la acidificación del interior de la partícula viral y esta bajada de pH provoca un cambio conformacional concretamente en HA2. Que lo que hace es inducir la fusión de la membrana del virus con la membrana endosomal, y la desorganización de la matriz de M1, de manera que libera y deja libres las 8 ribonucleoproteínas, entrando estas en el núcleo por una sencilla razón que ya vimos en la introducción del tema, pues la nucleoproteína que guía al ARN tiene señal de localización nuclear y es capaz de atravesar el poro nuclear y esto permite la entrada de las 8 ribonucleoproteínas en el núcleo de la célula. Dato: La mandarina es un compuesto antigripal, que se puede utilizar para frenar el virus de la gripe en el paciente, y lo que hace es inhibir a ese canal de protones M2 y por tanto, también inhibe el proceso de liberación de las ribonucleinas, inhibe la entrada pero a nivel de proceso de fusión. Cuando ya tenemos en el núcleo las 8 ribonucleoproteínas que son los 8 segmentos que llevan cada uno de ellos unidos el complejo polimerasa constituido por PB1, PB2 y PA, entran en el interior de este. Lo primero que va a ocurrir es la síntesis de ARN a partir de esos segmentos, lo que nosotros conocemos como transcripción, pero usando como molde el ARN, es decir, tienen que sintetizarse de cada segmento su correspondiente ARNm, pero la función que tiene la proteína PB2 concretamente es la de unirse a los ARNm de la célula a nivel del CAP, para que la proteína PA de un corte en el extremo 5’ liberando el CAP y poniéndolo a disposición de PB1, de manera que ese CAP de los mensajeros celulares, actúa como extremo 5’ de los mensajeros del virus. Es decir, el virus de la gripe (le llama “ladrón”) porque le está robando el CAP a los ARNm celulares. De las 3 enzimas la función que tiene PB2, es la de unirse a los mensajeros de la célula a través del extremo 5’ CAP. PA corta en ese extremo 5’ del mensajero de la célula, utilizando PB2 este extremo para que PB1 empiece a añadir ribonucleótidos de manera que se empieza a sintetizar el mensajero del virus, pero utilizando el extremo 5’ CAP del mensajero enzimático. PB1 sí se encarga de poner la cola de poliadenina (poliA) de los nucleótidos, la poliadenilación de los mensajeros víricos sí corre a cargo de PB1, pero el CAP es usado a partir de los mensajeros celulares. 22 Estos mensajeros del virus van a seguir la ruta normal que siguen los mensajeros de la célula, es decir, van a ser transportados de ahí la cola de poliA, al citoplasma, donde van a ser traducidos hasta proteína. Pero en el caso de aquellos mensajeros, aquellos segmentos que codifican para las glicoproteínas de la membrana HA, NA y M2, van a ser traducidos a través del retículo endoplasmático, pues las proteínas pasan al interior de este y van a seguir la ruta secretora hasta disponerse en la membrana plasmática de la célula. Es decir, que una célula afectada por el virus de la gripe, va a tener en su superficie glicoproteínas del virus, HA, NA y M2, que cuando son sintetizadas por la ruta secretora se disponen en la misma bicapa lipídica en la membrana plasmática celular. ¿Qué ocurre con el resto de proteínas del virus? La proteína de la matriz (M1), la proteína de la nucleocápsida que se une al ARN (NP), el complejo polimerasa (PA, PB1, PB2), la proteína S1 y NEP. Todas ellas, exceptuando esas tres que forman parte de la membrana y que van a la membrana plasmática, tienen señal de localización nuclear y vuelven a entrar en el núcleo. En algunos casos, como ocurre con la proteína MS1, va a tener una distribución bizona, es decir, va a haber proteína MS1 en el citoplasma, pero también va a haber proteína MS1 en el núcleo, dependiendo del estadio de la proteína más temprana o tardía, habrá más en un sitio u en otro. Hasta ahora estamos viendo transcripción, pero no a la que estamos acostumbrados, sino que estamos viendo que se obtienen ARNm víricos. Pero llega un momento en que esta 23 síntesis para, y empieza a replicarse el genoma, es decir, empiezan a sintetizarse cadenas positivas, que ya no van a salir al citoplasma, sino que van a servir para sintetizar cadenas alternativas que serán el genoma de la nueva especie vírica. Es decir, ese cambio de para la síntesis de cadena positivas que van a funcionar como mensajeros y empiezan a usar esas cadenas positivas para sintetizar nuevas cadenas negativas y en definitiva este es el proceso de replicación porque es el proceso que da lugar al genoma de la nueva progenie viral, ese cambio lo determina el nivel de proteína de la cápsida que se alcanza en el núcleo. En este caso, a medida que la proteína de la cápsida entra en el núcleo, empieza a acumularse y cuando alcanza un determinado nivel umbral entonces lo que ocurre es que se va a unir a esos ARNm que se están sintetizando, se van a empezar a unir de manera que va a indicar que el mensajero ya no va a seguir al citoplasma, sino que va a ser molde del proceso de replicación. La misma polimerasa concretamente la proteína PB1, se encarga de sintetizar mensajeros que van a ser traducidos y a los que les va a poner la cola de poliA, pero también se encarga de sintetizar las cadenas positivas que ya no van a ser mensajeros, y por eso antes hablamos de transcripción y aquí de replicación. Y lo hace la misma polimerasa, la proteína PB1. En el caso de la síntesis de los mensajeros que van a ser traducidos interviene PB2 y PA como ya hemos explicado, en el caso de la replicación solo PB1. ¿Qué es lo que hace que ya no entre en juego PB2 o PA? Proceso de salida: El nivel de proteína de la membrana celular, es decir, cuando alcanza ese nivel umbral NP se empieza a unir a la cadena que se está haciendo de polaridad positiva y ya no tenemos CAP. Y esa cadena se usa como molde para obtener cadenas de polaridad negativa. Estas cadenas tanto positivas como negativas van a llevar asociadas la proteína NP, la proteína de la nucleocápsida. Estas ribonucleoproteínas de nueva síntesis van a interaccionar con el complejo enzimático con una copia de PA, de PB1 y PB2. También van a interaccionar con M1, es decir, en el 24 momento en el que se sinteticen estas cadenas se va a producir una interacción física, una unión física, con una copia con cada una de las enzimas que se encargan de la transcripción, pero también con la proteína de la matriz. De manera que cuando empieza el proceso de replicación y se generan ribonucleoproteínas se inicia ya el ensamblaje de esas ribonucleoproteínas uniéndolas a ese complejo enzimático y a esa proteína M1. Y es la proteína NEP o NS2, la que reconoce a M1 y transporta todo ese complejo, todas esas ribonucleínas al citoplasma. Llevándolas al punto de la membrana en el que se encuentran localizadas o situadas las riboproteínas de la membrana, HA, NA y M2. De manera que el virus sale por exocitosis adquiriendo su envuelta. La proteína NEP o NS2, son la misma, es la que se encarga de exportar los genomas que se están sintetizando. Ya están asociados a esa proteína de la nucleocápsida, y van a quedar unidos a un complejo polimerasa PA, PB1, PB2. Estos 8 segmentos con esa configuración, es decir, esos 8 segmentos van a interaccionar con M1 y gracias a esa interacción NEP va a coger ese complejo nucleoproteico y lo va a transportar al citoplasma. Entonces es ahí donde van a ir dirigidos a la membrana y van a adquirir la envuelta. Ese proceso de salida además conlleva un reconocimiento específico de segmentos, es decir, que se ha visto que aunque puede, por ejemplo en un cerdo puede haber gripe A y gripe B, nunca puede haber recombinación de segmentos, dicho de otra manera, nunca puede haber recombinación de segmentos entre virus de géneros diferentes. Es decir, un virus de la gripe A no va a combinar sus segmentos con un virus de la gripe B dando lugar a un virus completamente distinto. Si puede haber combinación de segmentos dentro de cada género dentro del tipo A por ejemplo. Esto se sabe que es así y la explicación que se le da, por lo que se conoce, es una vez que esas ribonucleoproteínas son transportadas al citoplasma por la proteína MEC, se produce un reconocimiento entre los segmentos 2 a 2, por lo que ese reconocimiento nunca se va a dar entre virus de distinto tipo. Por lo que en el proceso de salida hay un reconocimiento de segmentos para impedir la recombinación entre dos géneros diferentes. Pero sí la hay entre dos del mismo género como hemos dicho. En estos virus monocatenarios de ARN de polaridad negativa en este proceso de salida del ciclo de multiplicación: La neuraminidasa está implicada en la salida de la progenie viral y lo que hace es cortar las moléculas de ácido siálico que hay en la membrana de la célula infectada para que no funcione como velcro, es decir, para que no se produzca un efecto velcro y para que las partículas de la progenie viral no queden retenidas a nivel de esa membrana. Lo que hace es cuando ya el ciclo de multiplicación prolifera y se ha conformado la progenie viral, las partículas van a salir por gemación, pero como el ácido siálico receptor es tan abundante en la membrana de esa célula, lo que ocurriría es que las propias partículas por la 25 hemaglutinina quedarían retenidas unidas a las moléculas de ácido siálico como si la célula fuera un velcro, y para que esto no pase y para que la progenie viral se libere, la neuraminidasa corta los residuos de ácido siálico. 5.2 Orden Mononegavirales Dentro del grupo de los virus de ARN monocatenario de polaridad negativa hay un grupo de virus que se incluyen dentro de un orden, que se llama orden mononegavirales (mono = porque todo su genoma es un único segmento, nega = porque es de polaridad negativa). Dentro de este grupo están distintas familias: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae,Pneumoviridae, Bornaviridae, Filoviridae… 5.2.1 Familia Rhabdoviridae Es la familia que vamos a ver más despacio, pero sin entrar en mucho detalle, e incluye el virus de la rabia o el de la estomatitis vesicular, este no causa enfermedades en humanos. - El virus de la rabia: Rhabdovirus, su nombre se debe a que su partícula viral tiene forma de bala. Es un virus que tiene su envuelta, su bicapa lipídica con la glicoproteína de su superficie que se oligomeriza y es una única glicoproteína G. Tenemos una matriz por debajo de la membrana y después asociada a la matriz estrechamente una ribonucleoproteína helicoidal (la simetría es helicoidal) donde está el genoma, de 26 polaridad negativa único, y asociado a la proteína M, que es la proteína de la nucleocápsida. En el extremo 3’ de este genoma, como tenemos un genoma de polaridad negativa, tiene que haber un complejo enigmático encargado del proceso de respiración y de expresión de ese genoma, ya lo lleva asociado al virus en el complejo 3’. Y además es la proteína L, y un cofactor muy importante de esa enzima es la proteína G. Es un genoma muy sencillo con un total de 5 proteínas básicamente. El orden que tienen esos genes en el genoma, pues el orden de esos genes en el genoma es lo que va a determinar la tasa en la que se transcribe cada uno de ellos. Y por lo tanto, la cantidad de cada una de las proteínas que se va a sintetizar. El gen que codifica para la proteína más abundante, la proteína de la nucleocápsida, está en el extremo 3’, es el primer gen que se transcribe. Y el gen de la enzima que se encarga de todo el proceso de transcripción y replicación, está en el extremo 5’. Las proteínas enzimáticas siempre se necesitan en menos cantidades. La proteína de la matriz se necesita en mayor cantidad, más que la de la nucleocápsida. La posición de estos genes determina la tasa de transcripción, por tanto, la cantidad de proteínas. Y esto es así porque en este proceso de expresión de este genoma que lleva a cabo la enzima, es un proceso en el que la enzima empieza a leer a partir del extremo 3’ pero se conoce como proceso de tartamudeo, es decir, empieza a leer, transcribe ese gen, puede descolgarse y empezar a transcribir o seguir transcribiendo el siguiente. Es decir, que en un número de veces o en un porcentaje de veces, la enzima se descuelga y vuelve a empezar. Mientras que en un número menor de veces continua y transcribe el siguiente. Esa síntesis de ARN por tartamudeo de la polimerasa es lo que controla digamos la tasa de transcripción. La polimerasa se encarga de poner el CAP, el extremo CAP y la cola de poliA, porque además a diferencia de lo que ocurría en el virus de la gripe toda su replicación, todo su ciclo, tiene lugar en el citoplasma, de hecho, las células (las neuronas) que están infectadas por este virus se caracterizan porque tienen cuerpos de Negri, que son las fábricas de síntesis de viriones a nivel del citoplasma de la célula. Todo el proceso de adenilación y de poner el CAP y todo esto está llevado a cabo por la polimerasa del virus. Este sistema de transcripción por tartamudeo lo vamos a tener también el Paramyxovirus, en Filovirus y en Pneumovirus. CREO QUE ES IMPT TENER EN CUENTA. La proteína P que actúa como cofactor de la enzima L es importante a la hora de (pasa lo mismo aquí que con el virus de la gripe), el nivel de concentración de la proteína de la cápsida es lo que determina el cambio entre transcripción y replicación. Esto es común para todos estos virus, es decir, es lo que mantiene digamos como un poco el virus de la gripe, 27 cuando esa proteína alcanza un nivel umbral determinado se une al ARNm de esta proteína en posición inicial y evita que ese ARN polimerasa se descuelgue, favoreciendo o haciendo que llegue hasta el final, de manera que ya no tenemos el aRNm sino una cadena completa de polaridad positiva que será molde para la síntesis de su cadena complementaria de polaridad negativa. Esto ocurre en todos estos, y ese cambio de la transcripción a replicación con el umbral de la proteína, es muy importante en la proteína P, que es cofactor de la ARN polimerasa. 5.2.2 Familia Paramyxoviridae Donde tenemos el virus del sarampión, o el virus de las paperas. Tienen una peculiaridad que hasta ahora no hemos visto y volvemos a tener virus envueltos, un genoma unido a una proteína de la nucleocápsida. En este caso ya tenemos varias glicoproteínas, donde tenemos una proteína de interacción con el receptor, de tipo hemaglutinina neuraminidasa (HN) y luego una proteína encargada de la fusión, que es como si esas dos funciones estuvieran separadas en dos glicoproteínas diferentes. En el proceso de expresión de genes, es similar al virus de la rabia, la fase de transcripción depende de su posición en el genoma, porque la enzima hace exactamente lo mismo. Mecanismos de ahorro genético: el hecho de que el ribosoma empiece en un codón de iniciación o en otro permite la síntesis de dos proteínas diferentes, la proteína C (es una proteína que bloquea entre otras cosas el sistema de defensa celular) y la proteína P (es cofactor de la enzima igual que en virus de la rabia). Se conocen como cofactores víricos. IMPT NUEVO; sale aquí y en los Filovirus: Un sistema de ahorro genético que hasta ahora no habíamos visto en los virus, y es la edición del ARNm, es decir, que en un punto de la transcripción de este gen se obtiene un ARNm que codifica para la proteína P. Pero justo en ese ARNm hay una zona que está compuesta por 6 adeninas y 6 guaninas, que si se añaden una guanina más daría una proteína diferente, que es otro factor vírico, y es lo que se conoce como edición del ARNm. Simplemente no se produce ese ahorro genético a nivel 28 de la traducción sino a nivel de la transcripción editando nuevamente ese ARNm, añadiendo un nucleótido. 5.2.3 Familia Pneumoviridae Inicialmente estaban metidos en los Paramyxoviridae, pero luego los sacaron. Y aquí tenemos el virus respiratorio sincitial. Que forman sincitios, igual que los Paramyxovirus, el virus del sarampión por ejemplo. 5.2.4 Familia Bornaviridae Tienen una peculiaridad y es que son virus que llevan a cabo parte del ciclo de replicación en el núcleo, como le pasaba al de la gripe. 5.2.5 Familia Filoviridae Tenemos el virus del ébola. Sigue básicamente lo mismo, las diferencias que podemos tener puede ser a nivel estructural en la membrana o matriz. Y tenemos en el virus del ébola un ejemplo de maduración que tiene lugar a nivel del Aparato de Golgi, a cargo de la furina celular. Ya reconoce una de las glicoproteínas de la superficie de la membrana procesándola y pega un corte que deja acceder a esa partícula infectiva. 29 5.3 VIRUS DE ARN BICATENARIO Esquema para comprender mejor su clasificación: 5.3.1 Familia Reoviridae Este grupo de virus recibe el nombre de Reovirus porque agrupaba especialmente virus que afectaban al tracto respiratorio y al tracto entérico provocando gastroenteritis. Pero también se metían aquí un grupo de virus que eran huérfanos, que no se replicaban en ninguno de estos. Todos ellos tienen en común que son virus segmentados, en células eucariotas. Aquí tenemos los Rotavirus, por ejemplo, que causan infecciones en el tracto intestinal. Peculiaridades de este grupo de virus: A parte de que tienen un genoma bicatenario segmentado, otra peculiaridad es que son virus desnudos que están formadas no por una única cubierta proteica, no por una única cápsula, sino por dos o tres capas concéntricas de proteínas. Es como si tuvieran varias envueltas, pero no son envueltas membranosas son cápsidas proteicas. La partícula digamos, puede pasar por distintas conformaciones, en función de que tenga todas esas cubiertas o carezca de una de ellas. La partícula completa, recibe el nombre de virión y suele tener entorno a tres capas de proteínas concéntricas. Esta partícula en el proceso de entrada en la célula va a sufrir una decápsidación, se va a despojar de algunas proteínas de la superficie más externa, pasando a ser una partícula subviral. Durante el proceso de entrada en el endolisosoma por acción de la endoproteasas celulares vamos a ver que sigue el proceso de decapsidación y lo que queda y se libera finalmente al citoplasma de la célula es una partícula con una cubierta interna y además otras proteínas, que recibe el nombre de core. Las tres, tanto el virión, como la partícula subviral, como el core, pueden entrar por sí solos en la célula. Pueden interaccionar con el receptor, o con un receptor en la membrana y entrar 30 en la célula. Si entra el virión se va a ir produciendo una decapsidación parcial hasta el core. Si entra la partícula subviral lo mismo. En cuanto al número de segmentos que integran el genoma oscila entre 10 y 12 dependiendo del virus en el caso de los Orthomyxvirus siempre dijimos que eran 8, pero aquí bailan un poco dependiendo de los virus, unos tienen 10, otros tienen 12, algunos codifican para más de una proteína, por tanto, entre 10 y 14 proteínas codificadas en este genoma. Como vemos tampoco son virus muy completos. Aquí ya tenéis también que podéis ver las estrategias de ahorro genético, que son las que ya hemos visto. Ciclo de multiplicación: Entrada: Estos virus pueden entrar tanto como partícula completa, como como partícula subviral parcialmente decapsidada, como en forma de core. El proceso de entrada si entra en forma de core el ciclo de multiplicación entra directamente al citosol. Si entra como partícula completa o subviral tiene lugar un proceso de endocitosis y ya en el endolisosoma es donde la acción de proteasas celulares endolisosomales producen una decapsidación hasta lo que es el core, que es liberado hasta el citoplasma de la célula. 31 Peculiaridades de este tipo de virus: IMPT TODO ESTO Estos virus al ser de ARN, al contrario que ocurría con los virus de la gripe, no van a ir al núcleo. Todo tiene lugar en el citoplasma. Además, hay una peculiaridad adicional. Sabiendo que tenemos virus que tienen segmentos de ARN bicatenario, lo primero que va a ocurrir es la síntesis de mensajeros a partir de la hebra de polaridad negativa. Pero la peculiaridad consiste en que esa transcripción tiene lugar dentro de core, es decir, la transcripción los segmentos bicatenarios de los reovirus nunca van a ser expuestos en el citoplasma, van a permanecer siempre encapsidados dentro del core. Y la ARN polimerasa vírica (que es el complejo polimerasa), es la que a partir de la cadena negativa va a sintetizar una copia de cada segmento de polaridad positiva, con CAP y cola de poliA. Y esos mensajeros sí que van a difundir hasta el citoplasma, donde van a ser traducidos por la maquinaria celular de traducción. Es decir, transcripción, dentro del core y además esa transcripción inicial, se llama transcripción primaria. En los reovirus existen dos tandas o dos tipos de transcripción: o Transcripción primaria: los mensajeros están modificados convenientemente con CAP y con cola de poliA. Una vez que empiezan a sintetizarse las proteínas, tanto estructurales como enzimáticas, en el citoplasma se genera una región, la factoría de viriones, que se trata de una zona en la que van a empezar a formarse cápsidas inmaduras, una zona densa que mediante microscopía electrónica se vería oscura. Y en ella, empiezan a conformarse cápsidas inmaduras, pero además en esas cápsidas van a quedar encapsidados una copia de mensajeros de cada segmento. Es decir, vamos a tener una serie de cápsidas inmaduras con una copia de ARNm de cada segmento. Con copias de la ARN polimerasa que se van a encargar de sintetizar dentro de esas cápsidas inmaduras la cadena negativa, volviendo a tener segmentos bicatenarios. Y ahora, esas cápsidas inmaduras, que tienen en su interior una copia de cada segmento en configuración bicatenaria pueden seguir dos destinos: - Madurar hasta conformar la progenie viral que va a salir de la célula. - O en algunas va a tener lugar la transcripción secundaria. o Transcripción secundaria: a partir de los segmentos bicatenarios nuevamente la ARN polimerasa que está encapsidada con ellos va a llevar a cabo la síntesis de mensajeros que van a salir para ser traducidos a proteínas. Y vuelve a empezar. 32 Salida: En algunos reovirus tiene lugar por lísis de la célula por desorganización de la membrana plasmática. Dependiendo de la posición que tengan esas procápsidas o cápsidas inmaduras en la región que se conoce como factoría de viriones: o Aquellas que están en la periferia van a ser las que van a salir de la célula. o Aquellas que están en la parte más central van a seguir la transcripción secundaria. IMPT TODO ESTO POSIBLE PREGUNTA DE EXAMEN: Todo el proceso de transcripción y de replicación tiene lugar dentro de una cápsida inmadura o el core. Pero nunca fuera de la cubierta proteica. En el proceso de encapsidación que vemos aquí hasta cápsidas inmaduras, es decir, cuando estos ARNm se encapsidan hasta cápsidas inmaduras tiene un papel muy importante el complejo de la ARN polimerasa del virus que reconoce secuencias en los extremos 5’ y 3’ de esos ARNm e inicia el proceso de encapsidación. Recordamos que el virus de la gripe uno de los mecanismos que tenía para evolucionar era la combinación de segmentos (llamado cambio génico), en ningún momento va a poder haber combinación de segmentos entre especies del género A y especies del género B, pero sí dentro del mismo género. Esto venía dado por la interacción que había dentro de esos segmentos durante el proceso de ensamblaje de la proteína viral. 33 Pues en este va a pasar una cosa parecida, todos los virus que tienen genoma segmentado están expuestos a esa evolución por combinación de segmentos, de manera que en el caso de los reovirus sin embargo, existe también un reconocimiento entre los segmentos que impide esa recombinación de segmentos al azar. Si dos virus coinciden dentro de la misma célula. RESUMEN DE LAS PECULIARIDADES DE ESTE TIPO DE VIRUS E IMPORTANTE TENER CLARAS PARA RECONOCERLOS: Descapsidación parcial, transcripción tiene lugar dentro del core y luego se formaban cápsidas inmaduras y algunas de ellas se volvía a repetir el proceso y entonces hablábamos de transcripción secundaria. 6. VIRUS CON GENOMA DE ARN MONOCATENARIO DE POLARIDAD POSITIVA. 6.1 Familia Retroviridae Los retrovirus conformaban un grupo independiente dentro de la clasificación de Baltimore, el grupo VI. Fue el primer grupo que se vió que utilizaba una transcriptasa inversa en su ciclo de multiplicación por retrotranscriptasa. Son virus que tienen genoma de ARN monocatenario de polaridad positiva peor el uso de esa retrotranscriptasa y como tiene lugar la expresión de su genoma lo colocan en un grupo independiente, el grupo VI. Dentro de esta familia retroviridae (muchos de los retrovirus infectan aves, otros infectan mamíferos, otros infectan humanos), se distinguen dos tipos de retrovirus: o Retrovirus simples: se denominan así por la estructura de su genoma mucho más simple, con menos genes que los complejos. o Retrovirus complejos o Lentivirus: se denominan así por la estructura de su genoma mucho más compleja, con más genes que los simples, pues estos poseen genes que codifican para proteínas accesorias. También se les denomina Lentivirus porque desarrollan infecciones de progresión lenta, de tipo persistente. Distinguimos por tanto entre: - Infecciones latentes: que son las lisogénicas en los bacteriófagos. - Infecciones persistentes o crónicas: en los bacteriófagos son como las del M13. Continuamente la célula está traduciendo virus, saliendo continuamente de la célula. No llevan a cabo una infección latente, aunque su genoma se integra dentro del genoma de la célula, peor la infección que desarrollan es persistente. 34  Dentro de este tipo de virus, Retrovirus complejos, tenemos el virus del SIDA (VIH), sus dos variantes: - La que causa la enfermedad más grave es el Tipo I. ⮚ VIRUS DEL SIDA (VIH): La progresión de esta enfermedad, que es una enfermedad que dura años y posee una fase aguda (provocada por Tipo I) que produce una bajada de linfocitos y vertiginosamente sube la cantidad de genoma viral, es decir, la cantidad de viriones medido en cantidad de genoma vírico. Esto se hace por RT- cuantitativa. Aquí va a haber una serie de síntomas y es cuando se diagnostica la enfermedad. Pero pasada esta fase aguda, aunque sigue bajando, básicamente se mantienen unos parámetros entrono a 400-600 aproximadamente de linfocitos, al igual que se mantienen también bastante estable la cantidad de virus. Teniendo hoy día esta enfermedad tratamiento, pudiendo mantener esta estabilidad en el paciente y pudiendo estar así toda la vida. Este es el mejor de los casos hoy día, que se mantenga crónica, pues cuando se detectó por primera vez esta enfermedad, muchos entraban en la fase de SIDA, que es una fase en la que ya el recuento linfocitario se desploma hasta 200 y sube nuevamente la cantidad del título de virus. Siendo la fase terminal. Que gracias a todo lo que se ha ido avanzando los pacientes no llegan a esta fase hoy día afortunadamente. Y ahora ya tenemos que no solo no llegan, sino que ya hay pacientes que se han curado. Estructura del virus del SIDA (VIH) a microscopía: 35 Se trata de una partícula que tiene una membrana y dentro hay un cono truncado y es que la cápsida del virus del sida tiene forma de cono truncado. Y es que si vemos este dibujo aparecen las partes bien delimitadas. Si vamos de fuera hacia dentro vemos que tiene la membrana con la bicapa lipídica y las licoproteínas pertinentes. Hay dos licoproteínas, que pasa lo mismo con los Paramyxovirus, donde la interacción con el receptor corre a cargo de una licoproteína, la SU o también conocida como GP120, es la parte de la estructura más externa. La que está más integrada en la membrana es otra licoproteína que es la GP41, que es la que llaman TM. Y esta tiene la función de la fusión. Entonces tenemos la membrana con estas dos licoproteínas principales implicadas en la entrada. 36 Después por debajo de la membrana tenemos una matriz de proteína y dentro está esta cubierta proteica que tiene forma de cono truncado y que contiene en su interior dos copias del genoma. El genoma es ARNss de polaridad positiva tiene dos copias, no es un genoma segmentado (recordamos que es cuando los genes están repartidos en distintos segmentos y la suma de todos ellos configura el genoma completo), es el concepto que podemos tener en la cabeza de un genoma diploide, porque hay dos segmentos que tiene cada uno de ellos todos los genes. A parte dentro de esa cápsida que tiene forma de cono truncado, que contiene el genoma, asociado a este van a estar las moléculas de transcriptasa inversa del virus, y a parte va a haber otras enzimas, como por ejemplo, integrasa vírica, también proteasas víricas y otras proteínas víricas que son accesorias, y también va a haber otras moléculas, como por ejemplo, moléculas que proceden de la célula hospedadora en la que se formó ese virión. Las moléculas de este hospedador son concretamente moléculas de Ciclofilina A, que son importantes para la decapsidación dentro de la célula y que el VIH utiliza para terminar de completar la entrada. Y moléculas de ARN transferente del hospedador, que el virus VIH utiliza en la retrotranscripción. En el caso de los retrovirus simples estas moléculas de ARN del genoma que está dentro de la cápsida tienen la estructura de un ARNm, son de polaridad positiva y tienen CAP en el extremo 5’ y tienen cola poliA en el extremo 3’. Pero luego si vemos dentro de esa molécula hay una secuencia repetida, que está en los dos extremos, la secuencia R, y adyacente a ella, en cada región o extremo una secuencia única, 37 no repetida (secuencia única del extremo 5’ y secuencia única del extremo 3’). Y esta secuencia repetitiva y esta secuencia única plantean toda la región que contienen los genes del virus. Se distinguen tres regiones dentro de ese genoma: - A unas se les da el nombre de CAP: porque codifica para la proteína de la matriz, la proteína de la nucleocápsida que es la que está asociada de manera helicoidal a esas moléculas de ARN, y la proteína de la cápsida del tronco truncado. - La región POL: está codificando las enzimas de la partícula. La proteasa (PR), la retrotranscriptasa (RT) y seguidamente la integrasa (IN). - La última región, ENV: que codifica para esas dos glicoproteínas de la superficie, SU y TM. En un retrovirus simple (tendremos genoma simple) como el del sarcoma de Rous, que es el primer virus oncogénico que se descubrió, que a parte de esas regiones hay incorporado un oncogén. Pero sigue siendo un retrovirus simple porque no hay ningún otro gen a parte de ese oncogén que codifique para ninguna otra proteína que las que ya acabamos de describir. Volvemos al apartado principal de LENTIVIRUS ¿Qué tienen que se les llama también retrovirus complejo? Que integrado en medio de las regiones POL y ENV, hay una serie de genes que codifican para proteínas accesorias. Que son: Vif, Vpr, Nef, etc; en el caso del VIH. 38 En estos retrovirus también debemos observar que en los dos extremos aparece una región única U3 R y R U5, y lo mismo en el extremo derecho. Esto se debe, a que en realidad, el genoma de los complejos dentro del virión, es exactamente como el de los simples solo que con la adición de los genes de las proteínas accesorias, manteniendo CAP en el extremo 5’ y cola de poli A en el extremo 3’, y estas regiones únicas que acabamos de mencionar. El dibujo corresponde a la configuración del genoma como ADN, no como ARN. NO CONFUNDIR CUANDO ESTEMOS ESTUDIANDO, TENER CLARO QUE ES EXACTAMENTE IGUAL QUE LA DE ARRIBA SOLO QUE CON LA ADICIÓN DE ESOS GENES QUE HEMOS HABLADO. Esto es el resultado de la retrotranscripción, donde se modifican los extremos. Algunas proteínas accesorias, tener en cuenta también cuando veamos Herpes virus, que las veremos, pueden estar arriba la molécula de ARN monocatenario. Al perder la molécula PBS, vemos ARN transferente que procedían de la célula, esas moléculas de ARN transferente, se usa como cebador en la síntesis de ADN, durante la retrotranscripción y vira con la región PBS y deja el extremo 3’ hidróxilo libre para que la retrotranscriptasa empiece a copiar ese extremo 5’. Copia ese extremo 5’ y lo que hace es pasar a la región repetitiva del extremo 3’ (cambia de molde) y entonces ya puede empezar a copiar esta. Es decir, que sintetiza la cadena de ADN y sobre esa empieza a copiar la otra. Usa como cebador inicial el ARNt y hay un cambio de molde a nivel de la región. El resultado final de la retrotranscripción: Es la molécula del genoma completo CAP, POL, ENV y genes accesorios, se han quedado en cada caso, con una copia de la región única U3, la región única U5 y de la repetición. Es decir, la región repetitiva ahora se hace más grande y se llaman regiones LTR, y son las zonas con las que se van a integrar en el genoma de la célula. Esta interacción está realizada por la integrasa vírica. En estas regiones LTR están los promotores que regulan la transcripción del genoma del virus. La región que se repetía en ARN era más pequeñita y en el ADN son más grandes. 39 ANEXO NO HA ACABADO DE DECIRLAS AL FINAL DE LA CLASE, PERO SUPONGO QUE SE REFIERE A ESTAS QUE TIENE MÁS ESCRITAS EN LAS DIAPOSITIVAS. En el caso de los retrovirus como el VIH, no quiere que memoricemos la función de las proteínas, solo los de estas: - La proteína: 40