TEMA 2 Mòdul 2: Gènica en Procariotes PDF

TEMA 2 ESPECIFICITATS DE LA REPLICACIÓ, TRANSCRIPCIÓ I TRADUCCIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES 1.Replicació gènica: com es repliquen els replicons procariotes? Replicació bidireccional a partir d’un únic ori Cromosomes circulars La major part...

TEMA 2 ESPECIFICITATS DE LA REPLICACIÓ, TRANSCRIPCIÓ I TRADUCCIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES 1.Replicació gènica: com es repliquen els replicons procariotes? Replicació bidireccional a partir d’un únic ori Cromosomes circulars La major part dels cromosomes en procariotes son circulars, i normalment només en tenen 1. Hi ha múltiples origens de replicació ja que només hi ha un cromosoma gros i si només hi hagués un origen de replicació tardaria molt en replicar-se i dividir- se. Té el nombre d’origens ideal per assegurar una replicació el màxim ràpida i efectiva possible. Com que les mides son diferents entre procariotes i eucariotes, hi haurà més o menys orígens de replicació. En procariotes s’ha seleccionat l’estructura inicial, 1 únic origen de replicació. La replicació de cromosomes circulars procariotes comença en un punt, però és bidireccional (hi ha 2 replisomes que funcionen en sentits oposats). Cada replisoma està format per 2 DNApol III, una va cap a la dreta i una altra cap a l’esquerra. La zona de terminació de la replicació és la zona TRZ. Replicació de cromosomes lineals En els cromosomes lineals tenim telòmers que es van escurçant amb el temps degut a l’envelliment. Per això hi ha investigadors treballant amb les telomerases per allargar l’esperança de vida. Es sap que hi ha 2 estratègies diferents per replicar cromosomes lineals en procariotes. Una de les causes de morir- se de majors és per culpa dels telòmers. 1 ori central. Protecció per loop de DNA terminal en 2 oris distals. Complexos similars a telomerases en Borrelia burgdorferi.: patogen humà que té com a vector Streptomyces que serveixen com cebadors de la replicació les garrapatas per exemple. Té un origen de replicació (Thr). No hi ha primasa central i a partir d’aquest punt es replica cap a la dreta i Streptomyces té un cromosoma lineal amb 2 orígens de cap a l’esquerra. Es forma un cromosoma circular i un replicació i els seus cromosomes es repliquen desde dedins enzim s’encarrega de resoldre els extrems. A la zona fins a defora. blava hi ha 2 repeticions invertides que formen un loop Streptomyces té una sèrie de proteïnes (unes 4 formant un que és molt estable i aquesta zona evita que apareixin complex) que actuen com un tap de l’extrem dels extrems 5’ – 3’ lliures i que s’hi enganxin exonucleases. cromosomes i impedint l’accés a les exonucleases. La Borrelia burgdorferi té origen de cromosoma circular, Protegeixen a l’acció de les exonucleases formant un tap però la seva trajectòria evolutiva va derivar en tenir un proteic. cromosoma lineal (aquests bacteris son molt eficaços). Una de les proteïnes presents en aquest bacteri té una Thr que és la que proporciona el primer grup hidroxil, i a partir d’aquí s’inicia la síntesi de la nova cadena de DNA. Els plasmidis es repliquen com els cromosomes, els plasmidis circulars es repliquen com els cromosomes circulars, i els plasmidis lineals com els cromosomes lineals. La replicació dels plasmidis sempre s’ha definit amb 2 estratègies: l’estratègia Theta bidireccional (clàssica dels cromosomes circulars) o la Theta unidireccional (un replisoma que replica tot). Com més petit és el plasmidi, menys esforç en replisomes es necessita per formar-lo / fabricar-lo en un temps prudencial. Els plasmidis han arribat als nostres dies perquè han aconseguit adaptar-se a les condicions ambientals (exemple: resistència a antibiòtics). No hi ha unidireccional en cromosomes. La majoria de plasmidis es repliquen mitjançant la theta bidireccional. El mecanismes de conjugació deriva de la replicació del cicle Rolling. Els plasmidis es poden replicar mitjançant teta bidireccional, i es poden conjugar pel cicle Rolling, poden presentar ambdós processos. Tots els plasmidis que es poden conjugar tenen una replicació per cicle rodant. El resultat final de tots aquests processos és el mateix, però la maquinària i el procés és diferent 2. Organització gènica i transcripció: com s’organitzen els gens per a la seva transcripció? Són els bacteris les maquinària perfectes? Si hi ha qualcú que s’acosti a la perfecció són els bacteris. No hi ha col·laboració entre els diferents bacteris. A la llarga hi haurà bacteris que desapareixeran i n’hi haurà altres que ocuparan el seu nínxol. A la imatge, els puntets vermells són els bacteris que s’han adaptat millor a les condiciones i per tant, són els que es dividiran. Els procariotes son màquines perfectes perquè estan sotmeses cada molt poc temps al procés de divisió i al de la selecció natural. Complexitat estructural de les cèl·lules procariotes Model estructural de Mycoplasma genitalium, 580 kb, 470 CDS. Bacteri no endosimbiont cultivable de genoma més petit. Paràsit humà. (té unes 500 proteïnes) Co-localització funcional d’operons, regulons i modulons L’estratègia més adequada serà tenir-ho tot condensat. Les NAPs no només importants per a la condensació, sinó també perquè aquesta condensació permet aproximar gens que son importants entre sí. És necessari que la transcripció de gens que estiran involucrats en un mateix procés es dugui a terme a la mateixa zona. El transport suposa una ineficiència, no hi ha transportadors concrets de proteïnes. Així que enlloc d’agrupar-los després de la seva síntesi, es sintetitzen a prop un dels altres. Si ubicam els gens on toca, tendrem els enzims on toca à això ho ha fet la selecció natural. Un altre fet important és l’acoblament de RNApol-ribosoma, això és característic de procariotes ja que el transcrit no ha acabat i els ribosomes ja estan sintetitzan les proteïnes. RNApol i ribosoma estan físicament units quan comença la transcripció. Quan el DNA es replica, es van desenrotllant i s’acumula tensió. Hi ha 2 enzims molt importants que treballen constantment damunt les molècules de DNA: la GyrAB i TopA (una relaxa i l’altra superenrotlla) La NAP ha de mantenir un cert grau de tensió o de cohesió, però quan la tensió és màxima, ha d’alliberar la molècula d’ADN. No tots els dominis d’interacció de la NAP estan ocupats per la mateixa NAP, perquè això generaria un cromosoma no funcional, molt condensat. Els nivells de NAP que es produeixen no son suficients per bloquejar tots els dominis específics, bloqueja o condensa uns dominis i en deixa d’altres lliures mentre que va rotant de manera dinàmica. L’estructura és dinàmica però restringida als macrodominis. Cada microorganisme ha de ser perfecte fent la feina que fa. No hi ha una única combinació gènica que fa que un microorganisme sigui perfecte. No hi ha organismes millors que els altres ja que tots han aconseguit perdurar a través dels anys fins a l’actualitat. 6 OPERONS: gens que es transcriuen a partir d’un promotor 3 metabòlics: genA, genBC, genDE à codifiquen per enzims, fan coses amb substrats. Cada enzim té la seva cinètica, i depenent de l’enzim anirà més ràpid o més lent en la transformació. Tot ha d’estar ajustat. S’han d’ajustar les cinètiques enzimàtiques perquè el procés de transformació de substrats sigui perfecte, és a dir, que NO s’acumuli res (no s’han d’acumular intermediaris). En procariotes, normalment, al costat de cada operó metabòlic tenim un operó regulador aprop del sistema que ha de controlar i normalment orientat en sentit contrari a aquest. 3 reguladors: genR1, genR2, genR3 2 REGULONS: conjunt d’operons controlats per 1 o diverses proteïnes reguladores específiques genAgenBC, regulat per ProtR1 genDE, regulat per ProtR2 1 MODULÓ: conjunt de regulons controlats per 1 o diverses proteïnes (de regulador global) ProtR3 regula tots dos regulons à el regulador global es poden regular amb el reconeixement de substàncies químiques o detectant canvis físics a l’entorn. Cada regulador global té la seva estrategia de control. Els gens relacionats amb un procés han d’estar agrupats gràcies a les NAPs o formant operons. L’operó és el conjunt del promotor i els gens. Cada regulador global té la seva estratègia de control. Hi ha espècies que han posat en marxa mecanismes per avisar a la resta de cèl·lules de la seva població de que algo va malament: quorom sensing (permet posar en marxa la cèl·lules abans de que el compost químic o la senyal química arribi a ella). L’operó procariota (sense introns, una o més CDSs): els procariotes NO tenen l’estructura promotor-gen- promotor-gen-promotor.... El lloc d’inici de la transcripció marca la referència del que és l’operó. Cadena avall d’aquest punt tenim els gens (pot a ver-hi 15-20 gens en 1 sol operó). Perquè hi ha sistemes genètics ubicats en un sol operó i d’altres en diversos operons? Per exemple, per sintetitzar una nitrogenasa activa són necessaris 18 gens metabòlics, que enlloc d’estar organitzats baix un sol promotor s’han dividit en 18. Això fa falta perquè hi ha d’haver un flux necessari de metabolits, s’han d’ajustar les quantitats d’enzim segons la cinètica enzimàtica. La regulació dels gens causa que l’expressió sigui ideal (que no màxima) per a competir amb els seus veïns. La cèl·lula sempre persegueix que el flux de metabòlits sigui ideal, és a dir, que no s’acumulin intermediaris i que no sobrin enzims. L’operó s’acaba quan acaba la transcripció, la qual acaba perquè la RNApol deixa de transcriure. Hi sol haver terminadors transcripcionals (estructures que bloquegen o dificulten l’avenç de la RNApol), però a vegades no n’hi ha. Per a un gen necessitam un codó d’inici (per a que s’incorpori una formilmetionina) i un codó de terminació. Lloc RBS (lloc d’unió al ribosoma): important per modular la quantitat de proteïna fabricada, és el lloc on realment s’iniciarà la transcripció. Tenim regions d’interacció amb els reguladors específics que activen o reprimeixen la transcripció. També tenim els dominis d’interacció dels reguladors globals. Per altra banda trobam les zones d’interacció de factors de transcripció que són d’ús genèric (relacionats amb la compactació del material genètic al cromosoma), aquestes proteïnes aconsegueixen que el promotor tengui la conformació adequada (per exemple, per a que la subunitat sigma de la RNApol s’ancli bé). Si hi ha diferents promotors per un sol propòsit es poden transcriure a taxes diferents segons les necessitats metabòliques de l’organisme, fent possible una regulació més fina. L’ARN polimerasa comença la transcripció gràcies al reconeixement de la subunitat sigma de seqüències consens a l’ADN. A les zones de seqüències reguladores s’hi uneixen les proteïnes reguladores. A nivell global, també hi ha reguladors globals que poden controlar un conjunt de gens destinats a un mateix propòsit com el metabolisme de sucres. Proteïnes amb la funció de la compactació de l’ADN al nucleoide també ajuden a moldejar l’ADN a una estructura adequada per a què s’hi adhereixi la subunitat sigma. Entre gen i gen, la distància intergènica és important perquè en ella es troba la zona RBS (seqüència on realment comença la transcripció). Cada gen té el seu RBS. El record de menor distància són operons que estan solapats entre ells. Els reguladors transcripcionals específics 10 gens essencials per obtenir energia. Els operons necessiten per a la seva expressió gens reguladors i aquests normalment solen estar juntament a l’operó que regulen i col·locats en sentit contrari. La selecció natural ha triat aquesta distribució gènica. La distribució típica d’un operó clàssic: gens metabòlics a la dreta i gens reguladors a l’esquerra del promotor. Això és degut a què la transcripció i traducció estan acoblades i es necessiten les proteïnes reguladores. Terminació transcripcional Tenim tots els gens necessaris per sintetitzar una nitrogenasa activa. Hi ha 18 gens metabòlics que son necessaris per fabricar aquest enzim. S’han dividit en 7 operons metabòlics. Aquesta és la distribució ideal per a aquest microorganisme en concret. Ideal= no s’acumula cap intermediari i no sobra cap enzim. Un terminador (es forma a l’interior de la RNApol) és un tros del RNA que quan es fabrica adquireix una estructura termodinàmicament molt estable i molt forta. La formació del terminador transcripcional ocorr dins de la RNApol. Quan la RNApol s’atura, es desfà i per tant, s’atura la transcripció. Els atenuadors transcripcionals es formen dins de la RNApol i la RNApol enlanteix el seu camí. Els atenuadors transcripcionals són més febles. Gràcies als atenuadors transcripcionals podem modular la quantitat de transcrit dels gens finals d’un operó a partir d’un sol promotor, no és necessari tenir 2 promotors. La RNApol ocupa aproximadament uns 100 nucleòtids, però polimeritza un a un. Per aturar aquest procés i que es rompin tots aquests enllaços en una molècula d’ARN cal formar una estructura molt forta, un atenuador (més fluix) o un terminador (més fort, atura la transcripció) transcripcional. El sistema de transcripció traducció el que fa és amplificar la senyal. La velocitat polimerització de la RNApol depèn de la quantitat de nucleòtids que li arribin. Si ens interessa baixar els nivells d’expressió en un cert moment, els atenuadors compleixen aquesta funció. Per acabar definitivament la transcripció en un punt determinat, els procariotes usen la proteïna rho. Per a que es posi en funcionament l’ARN polimerasa ha de transcriure la seqüència rut, i en aquest moment s’unirà amb la proteïna rho i formaran una unió molt forta. Això és un darrer recurs ja que requereix de molta energia, així que quan es pot els procariotes trien vies independents de rho. La proteïna Rho s’ancla específicament a la seqüència Rut que s’ha transcrit. Es forma una estructura molt forta i li lleva la cadena de mRNA a la RNApol, la qual no pot continuar polimeritzant. La terminació Rho dependent necessita ATP, i per tant, és un procés costós. Transcripció i traducció acoblada La transcripció i la traducció estan acoblades en procariotes. L’ARN polimerasa crea la cadena de ribonucleòtids i mentre creix s’hi ajunten un conjunt de ribosomes (polirribosoma) que tradueixen de manera co-transcripcional. L’expresoma és la RNApol unida físicament al ribosoma. La interacció entre ambdues està catalitzada per una altra proteïna. Es tracta d’un pont proteic que ancla el ribosoma amb la RNApol. Els poliribosomes és la manera més eficaç que han trobat els bacteris per fabricar gran quantitat d’enzim a partir d’un transcrit. Runaway transcription i Transertion Les proteïnes que normalment treballen en la perifèria del nucleoide son les que presenten acoblat l’expresoma. Les proteïnes necessàries a regions aprop de la membrana, és crucial que la seva traducció ocorri lo més allunyat del nucleoide, aprop de la membrana citoplasma. Les proteïnes que treballen a la perifèria de la cèl·lula no es tradueixen de manera acoblada a la transcripció, per lo que el RNA lliure arriba a la perifèria i allà s’enganxa a la subunitat petita del ribosomaà procés anomenat Runaway transcription Transertion: és la traducció de proteïnes que aniran a l’exterior cel·lular (o en el cas dels grams- a la membrana externa). És un acoblament entre dos sistemes: el ribosoma que tradueix i el sistema SEC: sistema de secreció de proteïnes (funciona acoblat al ribosoma). És clar, no podem fabricar proteïnes grosses del periplasma en el interior del nucleoide, ja que tendria un cost de transport molt elevat. Per aquests casos, hi ha proteïnes SecA acoblades al ribosoma, que s’ajunten amb proteïnes SecB que les dirigeixen fins la proteïna transportadora de la membrana. Regulació global: factors sigma i reguladors globals La regulació global comença amb la subunitat sigma de la RNApol. Les cèl·lules a les poblacions tenen 2 maneres molt diferents de viure: a la zona exponencial les cèl·lules creixen molt ràpidament a tota pastilla i a la zona estacionària on no hi ha nutrients suficients i l’espai és limitat, es necessiten recursos per sobreviure. El promotor: factor sigma i pribnow box Lo anterior explicat es controla gràcies a la subunitat sigma, que és diferent segons els gens que s’han d’expressar segons la zona (exponencial i estacionària). Hi ha subunitats sigma específica per gens que s’han d’expressar en fases estacionàries i d’altres específiques per fases de creixement exponencial. La subunitat sigma és una proteïna que reconeix el promotor. El més important és la seqüència d’interacció (marcat en vermell). Diferents unitats sigma tenen diferents seqüències consens. La seqüència consens no és la que genera una major transcripció, sinó que és la que més es repeteix (és la més usual en tots operons transcrits). Modulant la seqüència consens aconseguim major o menor transcripció d’un promotor utilitzant la mateixa subunitat sigma. El primer nivell d’ajust és modificar la seqüencia consens, que malgrat no sigui la que transcriu més la podem canviar perquè doni lloc a més o menys transcripció. El factor sigma: primer nivell de regulació (examen segur: no hi haurà trampa als parèntesis!!!) Hem de recordar 3 factors sigma de E.coli: -Sigma 70: s’utilitza per expressar els gens essencials en fase exponencial de creixement -Sigma 38: s’utilitza per expressar els gens essencials en fase estacionària de creixement -Sigma 54: és independent en la fase perquè és essencial per tot el que fa, està implicat en la gestió del nitrogen, ja que el nitrogen es necessita sempre i es difícil d’obtenir. Mecanismes reguladors globals: els modulons La proteïna reguladora global és aquella que controla l’expressió de tots els reguladors involucrats en un metabolisme complet. Proteïna activadora de catabolito, amb activitat Activator (CRP)à és la que hem de recordar!!! à EXAMEN Exemple de regulador global: la proteïna CAP/CRP i la gestió de les fonts d’energia Creixement diauxico de E.coli en glucosa/lactosa. Quan s’acaba la glucosa, i per conseqüència l’ATP, és quan s’activa la CRP. L’operó reconeix que no hi ha glucosa i s’activa la transcripció de la proteïna. Tots els operons de sucres funcionen d’aquesta manera. Amb 2 fonts de C diferents, si la segona té una pendent menor que la primera, vol dir que ha intervengut el regulador global. CAP actua de la mateixa manera en els operons mal, ara.... tots ells formen un moduló. Percepció i transducció de senyal: sistemes reguladors de 2 components S’han descrit quasi 50 sistemes de 2 components en E.coli. La membrana té un sensor quinasa que es fosforila quan detecta una senyal ambiental. Aquest grup fosfòric es transfereix al regulador de la resposta que transmet la senyal. Com major és el genoma, major nombre de sistemes de components tenen les cèl·lules. Sempre hi ha una proteïna a nivell de membrana, a l’exterior de la cèl·lula, que detecta algo. Aquesta proteïna sol ser una quinasa, la qual fosforila o desfosforila al regulador de resposta que està al citoplasma. Percepció i transducció de senyal: percepció de quòrum (quorum sensing) Així com els sistemes de dos components estan presents a tots els bacteris, el QS només el tenen l'elit, només uns pocs que han desenvolupat aquest sistema de comunicació. Fa referència a que quan un bacteri és capaç d’emetre senyals a la resta, es troba en condicions fisiològiques concretes, transmet el seu estat a la resta de components de la cèl·lula. Les cèl·lules amb QS produeixen senyals que amollen al medi molècules senyal que avisen a altres bacteris de que ha trobat aliment. Segons l’estat fisiològic del bacteri que rep la senyal, actuarà de forma atractiva o repulsiva. Sincronització de funcions entre cèl·lules d’una població atenent a la mida poblacional 3. Traducció: es tan important la traducció com la transcripció en l’ajustament fi de l’eficàcia biològica dels procariotes? Modulació traduccional: RBS/Shine-Dalgarno sequence El lloc RBS és aquella seqüència que apareix sempre davant el codó d’inici de cada gen i que permet que la subunitat petita del ribosoma s’ancli al RNAm, només s’ancla en aquest lloc i només si s’ancla aquí es produeix la traducció. Cadena adalt del codó d’inici hi ha entre 6-7 nucleòtids i després ve el RBS, el qual és complementari a l’extrem 3’ del rRNA que està a la subunitat petita del ribosoma. Això permet que el ribosoma s’ancli i que quan s’enssambla la subunitat gran del ribosoma, el codó d’inici quedi perfectament encaixat en el lloc A. El desplaçament del RBS cap a l’esquerra o cap a la dreta per l’aparició o desaparició d’un nucleòtid, dificulta la incorporació del primer aminoàcid. No vol dir que això no pugui ocórrer. Fent aquesta interacció més forta o més dèbil canviant els nucleòtids del RBS, podem incrementar o disminuir l’eficiència de la interacció, i per tant, incrementar o disminuir la traducció d’aquest mRNA. No és que hi hagi 1 únic RBS, el que si que és únic és 1 rRNA 16S. Pseudomonas tenen un RBS diferent perquè tenen l’extrem 3’ del rRNA 16S lleugerament diferent. L’ideal de Pseudomonas no és l’ideal de E.Coli. I finalment, algo sublime: el contingut en GC i la gestió de codons Aquest gràfic ens mostra el rang de % de G i C que té 1 genoma procariota relacionat amb la mida d’aquest genoma. El rang de % de G i C és molt variable. Hi ha una variabilitat immensa d’ús de codons. Per les procariotes, el fet de gestionar un rang ampli de G i C ha estat molt important per adaptar-se a l’ecosistema on han de viure. Tots els genomes petits tenen tendència a tenir % de G i C baixos. Modulació traduccional: contingut GC i ús de codons Quin és el nombre mínim de tRNA que ha de tenir una cèl·lula per ser funcional? 20, perquè hi ha 20 aminoàcids. Hi ha organismes que sembla que tenen menys de 20 tRNA, cosa que no és factible. Com que la notació és fa de manera automàtica, hi ha errors, no totes les molècules es revisen, per això hi ha organismes que sembla que tenen menys de 20 tRNA. És important gestionar correctament els tRNAs, ja que són els que introdueixen els aminoàcids. Els bacteris ajusten els nivells de tRNA a les seves necessitats. En un procés de transferència horitzontal, un gen de Mycoplasma arriba a Micrococcus.